Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка методических подходов к оценке иммунотоксилогических свойств пестицидов и коррекции их действия

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИИ ВОСТОЧНО-СИБИРСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ЖАМСАРАНОВА Сэсэгма Дашиевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ОЦЕНКЕ ЙШШОТОКСЙКО-ЛОГИЧЕСКЖ СВОЙСТВ ПЕСТИЦИДОВ И КОРРЕКЦИИ Ж ДЕЙСТВИЯ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Диссертация

на еоискание ученой степени доктора биологических наук

4г//9 У УХ*

а.

сЛ'ССО

Улан-Удэ-1994.

стр.

ВВЕЩЕНИЕ 5

1. ОБЗОР-ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Иммунотоконкологическая оценка пестицидов II 1.1.1,.Влияние пестицидов на иммунную систему организма 12

1.1.2.Разработка систем тестирования иммунотоксикологиче-ских свойств пестицидов 23

1.2.. -Иммунохимический метод выявления пестицидов и антител

к ним 31

1.2 Л.Иммуноферментные методы анализа пестицидов 32

I.2.2>Методологические аспекты иммуноферментного анализа

пестицидов 40

дКСШШШШШ ЧАСТЬ

2. МТЕРИАЛЫ И ИОДЫ 69

2.1.Объекты и с сл едования 39

2.2.Препараты 69

2.3.Методы оценки функционального состояния иммунной системы организма 70

2.4.Иммунохимические методы анализа 72

2.5.Статистическая обработка результатов 81

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВДОВАНИЙ 82

3.I.Влияние нестицидов (2,4-Д, карбофоса) на функциональные

показатели иммунной системы организма животных 82

3.1 Л.Оценка действия 2,4-Д и карбофоса на гуморальный иммунный ответ 82 3.1.2.Эффект, оказываемый пестицидами, на показатели клеточного иммунитета 88

3.1.3.Влияние пестицидов на функциональную активность макрофагов 94

3.1.4.Активность естественных киллерных клеток селезенки мышей при обработке их пестицидами 97

3.1.о.Оценка иммуномодулирующего действия 2,4-Д и карбофоса

в опытах ЮЗ

3.1.б.Влияние карбофоса на формирование поствакцинального

иммунитета 108

- з -

стр.

3.1.7.Влияние монооксигеназной системы организма на иммуно-токсичность пестицидов 112

3.1.8.Схема иммунотоксикодогического скрининга пестицидов и определение безопасных для организма концентраций пестицидов по показателям, характеризующим состояние иммунной системы 117

3.2.йммунохимическое изучение органов и тканей животных, подвергнутых воздействию гербицида 124

3.2.1.Образование аномальных антигенов и антител к ним в органах и тканях крыс, получавших 2,4-ДА 124

3.2.2.Выделение и иммунохимическая идентификация белков,связывающих 2,4-Д 131

3.3.Использование искусственного антигена инсектицид-белок при анализе иммунологической реактивности организма людей, контактирующихся с инсектицидом 134

3.4.Способы коррекции иммунодефицитных состояний и специфической защиты организма от острых отравлений, вызванных воздействием пестицидов 139

3.4.1.Влияние иммуностимуляторов на показатели иммунной системы организма животных, подвергнутых воздействию пестицидов 140

3.4.2.Специфическая защита организма от отравления гербицидом 2,4-Д ^(ав*^-фрагментами антител к ним.

З.о.Разработка иммуноферментных методов определения 2,4-Д

и карбофоса 157

3.о.I.Иммуноферментный метод определения карбофоса и его производных 158

3.5.2.Определение 2,4-дихлорфеноксиукеусной кислоты иммуно-

ферментньш методом 172

4. ЗАКЛЮЧЕНИЙ 179

ВЫВОДЫ 195

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТЗФЫ 197

2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота;

ЧСА - человечий сывороточный альбумин;

СИТ - соевый ингибитор трипсина;

ЭБ - эритроциты барана;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

К-ЧСА - коньюгат карбофос-человечий сывороточный альбумин;

2,4-Д-ЧСА - коньюгат 2,4-Д-человечий сывороточный альбумин;

2,4-ДА- аминная соль 2,4-Д;

РИГА- - реакция пассивной гемагглютинации;

РТПГА - реакция торможения пассивной гемагглютинации;

РСК - реакция связывания комплемента;

ФГА - фитогехмагглютинин;

ПДК - предельно допустимая концентрация;

ЕКК - естественные киллерные клетки;

РИА - .радиоиммунный анализ;

Шк - иммуноферментный анализ;

ёаяута ¿Сс/гАеаС Зплг1/г10<?огб£л1 &ШУ? - &пхуте. Ши&гр&ес!, УттипООЖа^

РНК - рибонуклеиновая кислота;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

Р'ГЩ - реакция "трансплантат против хозяина";

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность.

Широкое распространение иммунопатологических состояний, в частности, иммунодефицитов среди населения ставит исследователей перед необходимостью разработки специальной методологии раннего выявления заболеваний иммунной системы организма с целью их профилактики и своевременной коррекции болезни (Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н.,1990; Петров Р.В. и др.,1992).

По данным органов здравоохранения, выявлена взаимосвязь уров ней заболеваемости населения с экологической ситуацией в регионах, особое внимание обращается на возникновение вторичных имму-нодефицитных состояний в условиях длительного контакта с пестицидами. (Материалы МЗ СССР, подготовленные для Комитета Верховного Совета СССР по вопросам экологии и рационального использования природных ресурсов, по мерам защиты населения СССР от неблагоприятного воздействия нитратов и пестицидов при использовании их в сельском хозяйстве, 1990 г).

За последнее десятилетие накоплены данные, свидетельствующие о том, что пестициды, загрязняющие окружающую среду, способны нарушать функциональную целостность иммунной системы (Кенигсберг Э.Я. ,1981; Рузыбакиев P.M.,1986). ^----------

Возникла новая область науки - иммунотоксикология, объектом изучения которой является иммунная система как "мишень" воздействия ксенобиотиков.

Эксперты ВОЗ при формировании в 1989 г. в Лоцдоне "Международной программы сотрудничества в области иммунотоксикологии" (ICIP) в рамках "Международной программы по безопасности химических веществ" ( IPC.S ) признали актуальность и необходимость

исследований по следующим основным направлениям:

а) исследование иммунологических характеристик организма при воздействии пестицидов, включая резистентность организма хозяина;

б) изучение аутоиммунных реакций организма;

в) поиски иммунохимических методов защиты от отравлений и иммунокоррекции состояния организма, подвергнутого воздействию ксенобиотика;

г) внедрение аналитических иммунохимических методов в практику токсикологических исследований.

Возрастающий объем внедрения пестицидов в сельское хозяйство, изменение ассортимента препаратов требует определения уровней безопасного и эффективного их применения. При этом остро поднимается вопрос о критериях и методологии оценки иммунотоксично-сти пестицидов и применения принципов иммунобиотехнологии в организации массовых анализов остаточных количеств хими©препаратов .

Цель и задачи исследования.

Целью наших исследований явилось исследование иммунотоксико-логических характеристик пестицидов, определение степени специфичности изменений функций иммунной системы, а также поиски путей и способов специфической защиты и иммунокоррекции организма.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

- изучение функционального состояния звеньев иммунной системы организма животных, подвергнутых воздействию пестицидов;

- разработка схемы иммунотоксикологического скрининга пестицидов;

- количественная оценка безопасных уровней воздействия пестицидов на иммунную систему организма;

- разработка имщунохимических методов определения пестицидов.

Научная новизна.

1. Экспериментально изучено влияние 2,4-дихлорфеноксиуксус-ной кислоты и карбофоса на функциональные показатели иммунной системы организма. Показано, что воздействие данных пестицидов на организм животных вызывает иммунодефицитное состояние.

Исследование иммунотоксикологических свойств пестицидов позволило разработать схему скрининга, использование которой сможет исключить применение в сельском хозяйстве пестицидов, токсичных для иммунной системы организма.

Предложенная в работе математическая модель позволяет определить безопасные для функционирования иммунной системы организма уровни используемых пестицадов.

2.Впервые экспериментально доказана возможность образования аномальных антигенов пестицид-белок и антител к ним. Выделены и очищены белки печени, связывающие пестицид. Показана возможность использования искусственных антигенов пестицвд-белок для раннего доклинического выявления изменений, вызываемых пестицидами.

3. Впервые установлена возможность защиты организма от острых отравлений пестицидами ~ фрагментами антител против искусственных антигенов пестицид-белок. Экспериментально показана возможность иммунокоррекции организма, подверженного воздействию пестицидов, такими иммуностимуляторами как Т-активин, мие-лопид, спленин, левамизол.

4. Разработаны твердофазные иммуноферментные методы определе-

ния пестицидов, в частности 2,4-Д и производных карбофоса, в биологических жидкостях.

Приоритетность разработок подтвервдена авторскими свидетельствами на изобретения:

№1345399 "Способ иммунизации кроликов против сибирской язвы" от 15.06.87 г.

№1356288 "Способ иммунизации крупного рогатого скота против сибирской язвы" от 01.08.87 г.

№1501724 "Способ иммобилизации гаптенов" от 15.04.89 г.

№1545350 "Способ защиты организма от отравления гербицидом" от 22.09.89 г.

№1670608'\"Способ получения антигенов карбофоса" от 15.04.91г.

Практическая значимость работы.

Разработанные подходы и методы, а также результаты исследований по иммунотокеикологическому скринингу пестицидов использованы для подготовки и издания методического руководства "Иммуноток синологическая оценка пестицидов", Улан-Удэ, 1993, 103 е., утвер жденного секцией "Экспериментальная патология химической этиологии" Проблемной комиссии АМН СССР "Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс".

По результатам работы подготовлены и изданы методические реко мендации и. руководства:

- "Использование искусственного антигена карбофос-белок для раннего выявления воздействия карбофоса на иммунологическую реак тивность организма", Улан-Удэ, 1984 г., 15 е., утвержденные МЗ РСШСР;

- "йммуноферментный метод определения производных карбофоса", Улан-Удэ, 1989 г., 13 с., утвержденный Ученым Советом Института биохимии им.А.Н.Баха АН СССР.

Разработанный иммуноферментный анализ 2,4-Д позволяет определить не только свободную, но и связанную форму препарата, которая, по нашим данным, обладает определенным токсическим эффектом

Иммуноферментный метод определения производных карбофоса позволяет выявить основные метаболиты карбофоса в организме тепло-кровных-моно-, дималатионовые кислоты.

Предлагаемые методы анализа существенно дополняют используемые в настоящее время методы определения пестицидов и способству ют получению новой информации о биологической активности пестицидов.

- "Практикум по иммунологическим методам исследования". Улан-Удэ, 1987 г., 80 с.

- "Иммунотоксикологическая оценка пестицадов". Методическое руководство. Улан-Удэ, 1993 г., 103 с. Руководство утверждено секцией "Экспериментальная патология химической этиологии Проблемной комиссии АМН СССР" Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов,'полимеров и пластических масс".

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Анализ иммунотоксикологических свойств пестицидов

- установлено влияние пестицидов на функционирование иммунной системы организма;

- разработана система скрининга токсичных для иммунной системы организма пестицидов;

- показана возможность использования иммунологических критериев для расчета безопасных уровней пестицидов.

2. Продемонстрирована способность пестицидов связываться с белками органов и тканей и изменять их антигенную структуру. Изменение антигенной структуры иццуцирует процесс антителообразо-вания к аномальным антигенам.

3. Предложен новый метод иммунохимической защиты организма

от острых отравлений пестицидами, отличающийся высокой специфичностью. Доказана возможность коррекции иммунодефицитного состояния, вызванного пестицидами.

4. Разработан иммунофермецтный метод определения пестицидов : и их производных, в частности,связанные и свободные формы 2,4-Д и основные метаболиты карбофоса в организме теплокровных.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Иммунотоксикологическая оценка пестицидов.

Открытие пестицидов является выдающимся достижением современной науки. Их применение позволяет предотвращать потери 20-30% урожая от вредителей, болезней и сорняков на суммы, выражаемые миллиардами рублей в год. Комиссия Министерства здравоохранения, просвещения и социального обеспечения США (7?2гаА Е. ,1969) конста тировала, что "потребность в применении пестицидов и других хими катов для борьбы с вредными организмами будет возрастать в течение всего обозримого времени". Однако эта фактическая необходимость не дает права на использование пестицидов в бесконечно возрастающем масштабе, т.к. неизменный объем биосферы не способен выдерживать бесконечно ежегодное 10%-ное увеличение применения пестицидов. Загрязнение окружающей среды, рост за-болеваний животных, птиц, рыб, полезных насекомых и человека служит веским доказательством необходимости изменения стратегии и тактики борьбы с сорняками и паразитами.

Необходимо сделать упор на интегрированную борьбу с вредными организмами, включающую разные подходы, создание, отбор и исполь зование пестицидов более специфичных и, следовательно, менее ток сичных для других, не вредящих видов. Актуальными остаются вопросы изучения метаболизма и естественного распада пестицидов, их перемещения в окружающей среде и влияния на организм человека и животных.

Важнейшим принципом нормального функционирования организма является поддержание постоянства внутренней среды, которое дости гается деятельностью ряда систем, находящихся между собой в слож ных регуляторных взаимоотношениях. К числу таких систем относится иммунная система организма.

Интерес к изучению иммунной системы организма как "мишени" воздействия химических веществ, условий проявления их модифицирующего действия на иммуногенез значительно возрос в последние годы. Результаты современных исследований показали, что возрастающее число химических веществ действительно оказывает влияние на иммунную систему. Наибольшее внимание уделялось тем соединениям из окружающей среды, которые ослабляли иммунологическую реактивность и повышали восприимчивость к инфекции; меньше данных относительно тех веществ, которые повышали иммунную активность.

1.1.1. Влияние пестицидов на иммунную систему организма.

Иммунвдшгическая реакция является одним из чувствительных индикаторов состояния разнообразных физиологических функций организма и довольно просто определяется (в количественном отношении) рядом методов.

Отсюда всё более и более растущий интерес исследователей к оценке влияния пестицидов на целый ряд самых разнообразных аспектов иммунологических реакций (ало/ег- Ш3. 1980) Сюда можно отнести влияние на выработку антител, реакцию кожных покровов на специфические иммуногены, уровень иммуноглобулинов, восприимчивость к различным инфекциям, уровень комплемента, количество лимфоидных клеток, а также влияние, оказываемое на структуры лим-фоидных органов, которое можно установить гистологическими исследованиями.

€^¿3^,(1980) провели обширное исследование влияния самых разнообразных пестицидов на гуморальные и клеточные иммунологические реакции, которые возникают в ответ на четко установленные антигены. Выли проанализированы следующие препараты: диносеб, паратион, пентахлоронйтробензол, ресметрин, пиперо-

нилбутоксид, пиретрины, арохлор 1260. Полученные экспериментальные данные показали, что однократная доза <2^50 пестицида, введенного перорально, оказывает мощное, длительное влияние на иммунологическую реакцию. Наблюдаемый эффект может оказаться или стимуляцией, или угнетением, а может быть непосредственно направлен отдельно на клеточные или на гуморальные иммунологические реакции в зависимости от химической природы пестицвда и его свойств. Изучаемые клеточные и гуморальные показатели иммунологической реакции организма подавлялись под действием диносеба, паратиона, в то время как ресметрин вызывал раннюю, а в некоторых случаях даже весьма длительную стимуляцию клеточной иммунной реакции. Действие последнего из указанных препаратов вызывает значительный интерес и может дать в руки исследователей важный ключ, который позволит разработать действенные стимуляторы клеточных иммунологических реакций. А угнетение иммунных реакций, которое вызывали паратион и диносеб, приводит к тому, что организм становится менее устойчивым к различным инфекционным заболеваниям.

В результате проведенных исследований авторы приходят к выводу о необходимости изучения влияния пестицидов на иммунологические реакции; во-вторых, исследования должны проводиться не только на организменном уровне, но и на клеточном и молекулярном уровне активации Т-, В-клеток и макрофагов.

Серию экспериментов по влиянию разных доз лестицвдов:дихлор-фоса, ли