Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Влияние химических факторов на Corynebacterium pseudotuberculosis

На правах

Шадрин Андрей Викторович

Влияние химических факторов на Corynebacterium pseudotuberculosis

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОМСК 2005

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет»

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Беспалова Тамара Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Новицкий Алексей Алексеевич

доктор ветеринарных наук Бажин Михаил Аристоклевич

Ведущее учреждение: ФГОУ ВПО «Казанская государственная

академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»

Зашита диссертации состоится 23 декабря 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.050.03 при Омском государственном аграрном университете по адресу: 644122, г. Омск, ул. Октябрьская, 92, тел. 24-15-35, факс 23-04-67.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИВМ ОмГАУ

Автореферат разослан^^ ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук, доцент Н.П. Жабин

2006-4 llSMf 27 €st

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Успешное развитие одного из важнейших направлений животноводческой отрасли, каким является овцеводство, невозможно без искоренения такой широко распространенной хронической инфекционной болезни как казеозный лимфаденит овец.

Проблема ликвидации казеозного лимфаденита остается актуальной для большинства крупных овцеводческих хозяйств Западной Сибири, где продолжают регистрировать данное заболевание (Ощепков В.Г. и др., 1991; Трофимов И.Г., Колычев Н.М., 1993; Заболотных М.В., Крупко А.С., 1999; Беспалова Т.А. и др., 1999; Крупко А .С., 2003).

Работами многих исследователей (John G. et al., 1985; Заболотных А.В., 1993; Трофимов И.Г., Колычев Н.М., 1993; Колычев Н.М. и др., 2000) доказаны значительные сроки выживаемости возбудителя казеозного лимфаденита овец -Corynebacterium pseudotuberculosis во внешней среде, что затрудняет проведение оздоровительных мероприятий, способствует быстрому перезаражению животных, поддерживает возможность повторного возникновения данной болезни. Проблема осложняется также отсутствием средств специфической профилактики заболевания. В связи с этим возникает необходимость разработки дезинфекционных технологий, направленных на разрушение эпизоотического процесса. Наиболее приемлемым в условиях овцеводческого хозяйства является влажный способ дезинфекции. Однако вопрос, связанный с влиянием различных классов химических средств дезинфекции на С. pseudotuberculosis, остается недостаточно изученным.

Остается актуальной проблема обработки больших площадей с минимальными экономическими затратами и снижения вредного воздействия самих дезинфицирующих веществ как на объекты окружающей среды, так и на организм животных. Разработка оптимальных режимов влажной дезинфекции при казеозном лимфадените овец современными препаратами позволит увеличить эффективность производимой дезинфекции, снизить затраты, повысить производительность труда ветеринарных врачей, избежать возможного экологического ущерба, что и послужило основанием для выбора темы диссертационной

Цель нашего исследования - определить чувствительность С. pseudotuberculosis к ряду химических дезинфицирующих препаратов, разработать режимы инактивации возбудителя казеозного лимфаденита овец на объектах внешней среды. Задачи исследования:

- Установить чувствительность полевых культур и музейных штаммов С. pseudotuberculosis к дезинфицирующим препаратам бианол, виркон, глютекс, деохлор, ДП-2Т.

- Определить бактерицидную активность дезинфектантов в отношении С. pseudotuberculosis в присутствии высокомолекулярного белка (белковый индекс).

г

работы.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

- Выяснить степень изменения бактерицидной активности дезинфектантов в отношении С. pseudotuberculosis в зависимости от изменения температуры их рабочих растворов (температурный коэффициент).

- Установить дезинфицирующие свойства препаратов бианол, виркон, глютекс, деохлор, ДП-2Т в отношении возбудителя казеозного лимфаденита овец на поверхности тест - объектов из различных видов строительных материалов, разработать режимы влажной дезинфекции животноводческих помещений.

- Выявить субмикроскопические изменения, возникающие под влиянием химических средств дезинфекции в структурных компонентах клеток возбудителя казеозного лимфаденита овец;

Работа является самостоятельным разделом комплексной темы кафедры ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии ИВМ ОмГАУ «Разработка методов и средств диагностики, профилактики, меры борьбы с корине-бактсриозами сельскохозяйственных животных (№ гос. регистации 01.9.90000196).

Научная новизна работы. Впервые установлены бактерицидные концентрации новых химических дезинфицирующих препаратов бианол, виркон, глюгекс, деохлор, ДП-2Т в отношении исследуемых культур С. pseudotuberculosis. Определено, что устойчивость коринебактерий к дезинфектантам зависит от их диссоциативной формы: R- формы коринебактерий менее подвержены действию рекомендуемых препаратов, чем I - и S - формы. Полевые культуры коринебактерий, №2-R, №3-1, штамм 70-R и золотистый стафилококк более устойчивы к воздействию дезинфицирующих препаратов в сравнении с музейными штаммами С. pseudotuberculosis 50-S, 37-1, нолевой культурой №1-S и кишечной палочкой. В присутствии высокомолекулярного белка степень бактерицидного действия рекомендуемых дезинфектантов на коринебактерии снижается в различной степени. Активность всех исследуемых дезинфектантов увеличивается при повышении температуры их рабочих растворов. Разработаны режимы влажной дезинфекции при казеозном лимфадените овец препаратами бианол, виркон, глютекс, деохлор, ДП-2Т. Установлено, что воздействие бактерицидных доз дезинфицирующих препаратов вызывает различные проявления глубоких деструктивных изменений клеточных структур С. pseudotuberculosis, выявляемых на ультраструктурном уровне: утолщение клеточной стенки, нарушение ее целостности; утрата однородной структуры цитоплазмы, формирование в ней зернистых образований и вакуолей; уплотнение или вакуолизация нуклеоида.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты комплексного подхода по изысканию новых химических средств дезинфекции для уничтожения возбудителя казеозного лимфаденита овец, с учетом динамики гибели и субмикроскопических изменений бактерий под воздействием изучаемых препаратов, существенно дополняют теорию управления эпизоотическим процессом новыми научными данными, позволяют усовершенствовать режимы дезинфекции и, в целом, противоэпизоотические мероприятия при данном заболевании. Результаты исследований расширили представление об особенностях

воздействия различных химических факторов на структурные компоненты клеток коринебактерий, а также позволили разработать целенаправленные методы профилактики и борьбы с казеозным лимфаденитом овец

Внедрение результатов исследований. Практические предложения включены в методические рекомендации: «Дезинфекционные мероприятия при казеозном лимфадените овец» (Утверждены подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины СО РАСХН, протокол № 5 от 21 июня 2005 г.). Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедр ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии; эпизоотологии и инфекционных болезней животных, института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: межрегиональной научной конференции молодых ученых аграрных вузов Сибирского федерального округа «Аграрная наука России в новом тысячелетии, проблемы и перспективы» (Омск, 2003); ежегодных научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ОмГАУ (2003, 2004, 2005); научной конференции, посвященной 100- летию со дня рождения Н.Г. Кондюрина (Омск, 2004); VIII международном симпозиуме молодых ученых, аспирантов и студентов «Техника экологически чистых производств в XXI веке: проблемы и перспективы» (Москва, 2004); III конференции молодых ученых вузов ассоциации «агрообразование» Сибирского федерального округа «Инновационное развитие аграрного производства в Сибири» (Кемерово, 2005);

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в пяти печатных работах.

Объем работы и структура. Диссертация изложена на 143 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 20 фотографиями и содержит 48 таблиц. Список используемой литературы составляет 209 источников, из них 72 иностранных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Бактерицидные свойства препаратов бианол, виркон, глютекс, дп-2т, деохлор в отношении С. pseudotuberculosis.

2. Параметры влажной дезинфекции при казеозном лимфадените овец препаратами бианол, виркон, глютекс, ДП-2Т, деохлор.

Собственные исследования Материалы и методы исследования

Работа выполнена в течение 2002 - 2005 годов на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии, лаборатории электронной микроскопии института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ; в Омской областной ветеринарной лаборатории; в специализированном овцеводческом хозяйстве СПК племзавод «Москаленский» Москаленского района Омской области.

В исследованиях использовали паспортизированные музейные штаммы Corynebacterium pseudotuberculosis № 70-R; 37-1; 50-S (депонированные в

ВГНКИ в 1991г. Трофимовым И.Г., Колычевым Н.М., Заболотных М.В.) сохранявшиеся в лиофилизированном состоянии; полевые культуры коринебактерий выделенные от больных овец в овцеводческом хозяйстве. В качестве контроля, нами были использованы санитарно-показательные микроорганизмы St. aureus 209Р и Е. coli 147 (бактериологический музей кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ИВМ ОмГАУ). Видовую идентификацию коринебактерий осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями «Диагностика казеозного лимфаденита (псевдотуберкулеза) овец» (Трофимов И.Г., Заболотных М.В., Колычев Н.М., и др., 1990). Перед постановкой зкспериментов были изучены биологические, биохимические, культуральные и морфологические свойства у отобранных музейных штаммов и полевых культур коринебактерий. Для выделения и культивирования С. pseudotuberculosis использовали общеупотребительные и дифференциальные питательные среды: МПБ, МПА, КБА (коринебакагар) - среда для выделения коринебактерий с добавлением 2% теллурита калия. Биохимические свойства выделенных культур коринебактерий изучали на средах Гиса. Выделение St. aureus осуществляли на солевом 6,5% МПА, для индикации Е. coli использовали среду Эндо.

Бактерицидную активность дезинфицирующих препаратов, белковый индекс, температурный и фснольный коэффициенты, дезинфицирующие свойства в отношении С. pseudotuberculosis, St. aureus и Е. coli определяли в соответствии с действующими на момент проведения исследований методическими указаниями «О порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики)), утвержденными Г УВ АПК СССР 7 января 1987 г.

В экспериментах были использованы дезинфицирующие препараты, отвечающие современным санитарно-гигиеническим, экономическим и экологическим требованиям и имеющие необходимые технические условия и сертификаты соответствия. Глютекс - препарат, содержащий в своём составе три дезинфицирующих агента (глутаровый альдегид- 4%, гликосаль- 3,2%, хлорид дидециламмония 10%). Бианол, содержит в качестве активно действующих веществ глутаровый альдегид (4%), гликосаль (2,8%) и алкилдиметилбензилам-моний хлорид, а также добавки: поверхностно-активное вещество (ПАВ-неонол АВ) и краситель (метиленовый голубой). Виркон, содержащий в своём составе сбалансированную стабильную смесь перекисных соединений, поверхностно активных веществ, органических и неорганических буферных систем. Главным компонентом состава является калия персульфат (50%). Деохлор - действующее вещество натриевая соль дихлоризоцануровой кислоты, содержание активного хлора - 44%. ДП-2Т - дезинфицирующий препарат в таблетках, основное действующее вещество- трихлоризоциануровая кислота, содержание активного хлора не менее 32%.

Для изучения ультраструктуры клеток С. pseudotuberculosis после воздействия дезинфицирующих веществ готовили бактериальную взвесь, путем смыва двух суточной агаровой культуры с последующим центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляли, и к полученному осадку добавляли бактерицидные концентрации дезинфицирующих препаратов. После 30 минутного контакта клетки осаждали центрифугированием с последующей двухкратной

отмывкой осадка 0,1М фосфатным буферным раствором и фиксацией 2,5 % раствором глутарового альдегида. Отмытые в трех сменах фосфатного буферного раствора бактериальные клетки, подвергали лоплнительной фиксации 1 % раствором четырехокиси осмия и обезвоживанию в спиртах возрастающей концентрации. Проведенные через промежуточные смеси, образцы заключали в аралдит и подвергали полимеризации. Ультратонкие срезы, приготовленные на ультрамикротоме УМТП - 4, контрастировали 3 %-ным раствором уранилаце-тата и цитратом свинца по Reynolds E.S. (1963); Vanable Y.H., Coggeshale R. ("1965), с последующим исследованием в электронном микроскопе ЭМ-125 при ускоряющем напряжении 75 кВт.

С целью подтверждения достоверности по каждому варианту исследований проведено не менее трех повторов. Статистическая обработка дашгых была выполнена с использованием программы MS Excel.

Рис. 1 Схема проведения исследований

Результаты собственных исследований

Определение бактерицидных концентраций дезинфицирующих препаратов в отношении С. pseudotuberculosis в опытах на тканевых

тест-объектах

Определение бактерицидных концентраций препаратов бианол, виркон, дехлор, ДП-2Т, глкнекс в отношении полевых культур № I-S, № 2-R , № 3-1 и музейных штаммов 70-R, 50-S, 37-1 коринебактерий было проведено в сравнительном аспекте с культурами кишечной палочки и золотистого стафилококка. Эффективным считали наибольшее разведение препарата, в котором отмечали гибель культуры при наличии ее роста в контроле. Результата исследования бактерицидных свойств показали, что препараты всех групп химических соединений губительно действовали на возбудителя казеозного лимфаденита овен. Устойчивость коринебактерий к дезинфектантам зависела от диссоциативной формы бактерий: R- формы коринебактерий менее подвержены действию рекомендуемых препаратов, чем Г - и S - формы. Полевые культуры коринебактерий, № 2-R, № 3 -I, штамм 70-R и золотистый стафилококк более устойчивы к воздействию химических дезинфицирующих препаратов в сравнении с музейными штаммами С. pseudotuberculosis 50-S, 37-1, полевой культурой № I-S и кишечной палочкой.

Наиболее близок к коринебактериям по устойчивости к дезинфектантам золотистый стафилококк, что согласуется с данными А.В. Заболотных (1993). Этот факт необходимо учитывать в случае использования косвенного метода контроля качества дезинфекции при казеозном лимфадените овец.

Раствор бианола (рис. 2) в концентрации 18,0 мг/ШОмл полностью подавлял жизнедеятельность всех исследуемых музейных штаммов коринебактерий и Е. coli при экспозиции 30 мин. Для полной инактивации полевых культур необходима концентрация препарата бианол 35,0 мг/100 мл при 10 мин. экспозиции и 25,0 мг/100мл при 30 мин. экспозиции. При этом St.aureus полностью инактивировала концентрация раствора дезинфектанта 35,0 мг/100мл. при 30 минутной экспозиции.

шт 70R 1UT50-S шт 37-1 полевая полевая полевая культура культура культура

№1- S №2- R №3-1 Культуры С pseudotuberculosis

Рис 2 Бактерицидные концентрации препарата бианол в отношении С. pseudotuberculosis

Виркон (рис. 3) оказывал бактерицидное действие на все исследуемые штаммы в концентрации 18,0 мг/100мл при 30 мин. экспозиции. Причем наименее устойчивыми к данному веществу оказались штаммы С. pseudotuberculosis 50-S. 37-1 и кишечная палочка. Концентрация виркона 4,7мг/100мл подавляла жизнедеятельность бактерий этих штаммов при 30 мин. экспозиции и 6,50 мг/100мл при 10 мин. экспозиции. Наиболее устойчивой к препарату виркон оказалась полевая культура № 2-R и St.aureus, для их инактивации необходима концентрация 18,0 мг/100мл как при 10. так и при 30 мин. экспозиции.

шт 70-R шг 50-S шт 37-1 полевая полевая полевая культура культура культура №1-8 NB2-R N03-I

культуры С pseudotuberculosis

Рис. 3. Бактерицидные концентрации препарата виркон в отношении С. pseudotuberculosis.

Отмечена высокая чувствительность коринебактерий к препарату део-хлор, концентрация по активному хлору 2,8 мг/100мл которого оказывала бактерицидное действие на все исследуемые штаммы при 10 и 30 мин. экспозиции (рис. 4).

шт 70-R шт 50-S шг 37-1 полевая полевая полевая культура культура культура №1- S »2-R NS3-I

кугетуры С pseudotuberculosis

Рис. 4. Бактерицидные концентрации препарата деохлор в отношении С. pseudotuberculosis

Бактерицидная активность композиционной смеси ДП-2т зависела от диссоциативного варианта микроорганизма. Для штаммов 70-R, 50-S и 37-1 бактерицидной при 30 мин. экспозиции являлась концентрация активного хлора в препарате 1,4мг/100мл. Жизнедеятельность полевой культуры № 1-S и №2-R

подавляла концентрация препарата 1,0 мг/100мл; полевой культуры № 3-1 и стафилококк - 2,7мг/100мл (рис. 5).

шт 70-R шт 50-S ил* 37-1 полевая полевая полевая культура культура культура NS1-S №2-R №3-1

культуры С pseudotuberculosis

Рис. 5 Бактерицидные концентрации препарата ДП-2Т в отношении С. pseudotuberculosis

Результаты исследований бактерицидных свойств препарата глютекс (рис. 6) показали, что концентрация раствора в 25,0 мг/100мл вызывала полную задержку роста всех культур коринебактерий, кишечной палочки и золотистого стафилококка как при 10, так и при 30 минутной экспозиции. При снижении концентрации дезинфектанта до 18,0 мг/100мл отмечали незначительный рост полевой культуры № 2-R, № 1-S и St. aureus.

ил- 70R ил 50-S ил 37-! полевая полевая полевая культура культура культура N«1 S NB2- R N03-I

культуры с pseudotuberculoss

Рис 6. Бактерицидные концентрации препарата глютекс в отношении С. pseudotuberculosis

Определение белкового индекса

Микроорганизмы, находясь на объектах окружающей среды, защищены органическими загрязнениями белковой природы, которые могут в значительной степени снижать эффективность дезинфектантов (Арефьева Л. И., 1985; Абрамова И.М., Суакисян А.Н., Коламова А.И.,1986; Мачавариани Б.М.. 1988). С целью изучения влияния высокомолекулярного белка на бактерицидные свойства, дезинфицирующих препаратов в отношении коринебактерий был определен белковый индекс с использованием в качестве модели инактивиро-

ванной сыворотки крови крупного рогатого скота. В резулмате исследований установлено снижение бактерицидной активности дезинфицирующих веществ в присутствии сыворотки крови.

Влиянию белковых загрязнений наиболее подвержены дезинфектанты: бианол, виркон и глютекс, со средними показателями белкового индекса - 3,19; 2,03; 1,89. В меньшей степени в присутствии белка меняется активность хлор-содержащих дезинфектантов - деохлор и ДП - 2Т, средний показатель белково-i о индекса которых составил 1,66 и 1,55 соответственно, что следует учитывать при разработке режимов дезинфекции и при проведении дезинфекционных мероприятий.

Определение температурного коэффициента

Температура рабочих растворов дезинфектантов оказывает значительное влияние на их бактерицидные свойства. Как показали наши исследования, активность всех рекомендуемых дезинфектантов в отношении коринебактерий увеличивалась при повышении температуры их рабочих расворов. Из использованных трех температурных режимов (20°С; 30°С; 50°С) температурный коэффициент дезинфектантов в отношении коринебактерий наибольшие значения принимал при температуре 50°С. По показателю температурного коэффициента была изучена возможности применения горячих или теплых растворов дезинфектантов для практической дезинфекции. Выявленно (рис. 7), что повышение темперагуры до 30 °С не вызывало изменений бактерицидной акшвно-сти дезинфектанюв. TeMnepaiypa 40°С способствовала повышению бактерицидной активности препарата виркон (средний показатель ТК 1,49) и препарата ДП-2Т (средний показатель ТК 1,52). При температуре 50°С заметно усилились бактерицидные свойства препаратов виркон, ДП-2т и деохлор. Средний показатель температурного коэффициента при этом составил соответственно 1,72; 2,12 и 2,03.

£ *> -

204 ЛГС «К 5ГС

тотерапра рабочнч растворов препаратов

Рис. 7 Температурный коэффициент дезинфектантов в отношении С pseudotuberculosis

Определение фенольного коэффициента

Устойчивость коринебактерий к фенолу значительно выше, чем к рекомендуемым дезинфектантам. Средний показатель фенольного коэффициента составил: для бианола - 38,19: виркона - 78,93; деохлора - 601,6; ДП - 2Т -493,85; глютекса - 46,8.

Изучение дезинфицирующих свойств исследуемых препаратов при обеззараживании поверхностей из различных видов строительных материалов и разработка режимов влажной дезинфекции

При разработке параметров влажной дезинфекции на тест - объектах (дерево, бетой, железо) с биологической зашитой в виде стерильных фекалий овец была выявлена высокая степень бактерицидной активности всех рекомендуемых дезинфицирующих веществ в отношении музейных штаммов и полевых культур С. pseudotuberculosis.

Установлено, что степень бактерицидной активности препаратов при влажном методе дезинфекции зависит от характера обрабатываемой поверхности и диссоциативного вариант исследуемых культур коринебактерий. На пористых тест - объектах коринебактерии проявили большую устойчивость к воздействию химических веществ. Установлено, что полевые культуры С. pseudotuberculosis и варианты коринебактерий отнесенные по своим культу-ральным свойствам к R и 1 - формам, более устойчивы к воздействию дезинфицирующих веществ на поверхности тест - объектов. При разработке параметров дезинфекции устанавливали расход дезинфицирующих препаратов 0,5л/мг при экспозиции 60 минут и два часа.

Результаты испытания раствора препарата бианол 0,25% концентрации при 60 и 120 минутной экспозиции показали, что все культуры С. pseudotuberculosis, находящиеся на различных тест - объектах оставались жизнеспособными и при посеве на коринобакагар давали типичный для коринебактерий рост колоний. Повышение концентрации препарата до 0,5% обеспечило инактивацию коринебактерий: штамма 50-S - на всех видах тест - объектов; штамма 37-1 - на железном и деревянном тест - объектах; полевой культуры № 1-S - на железном тест - объекте. Штамм 70 - R, полевые культуры № 2-R и № 3-1 сохраняли жизнеспособность, однако отмечалась задержка их роста на питательных средах. Повышение концентрации дезинфектанта до I % обеспечило инактивацию коринебактерий на всех видах тест - объектов.

Как показали испытания препарата виркон при 60 и 120 минутной экспозиции раствор 0,15% концентрации обладал низкой бактерицидной активностью в отношении возбудителя казеозно1 о лимфаденита овец. При бактериологическом исследовании смывов с тест - объектов были выделены колонии всех исследуемых штаммов и полевых культур С. pseudotuberculosis. При увеличении конценграции раствора виркона до 0,3% удалось достичь инактивации С. pseudotuberculosis штамма 50-S на всех видах тест - объектов, а также штамма 37-1, находящегося на железном тест - объекте при 120 минутной экспозиции. Остальные исследуемые культуры коринебактерий сохранили жизнеспособное^ и при посеве смывов на коринобакагар формировали колонии, типичные для данного вида микроорганизмов. При повышении концентрации до 0,5% происходило обеззараживание всех видов тест - объектов как при 60, так и при 120 минутной экспозиции.

Опыты по определению бактерицидной активности раствора деохлора при расходе 0,5л/м2 показали, что после 60 и 120 минутной экспозиции и использования 0,1% концентрации коринебактерии, находящиеся на железных,

деревянных и бетонных тест-объектах оставались жизнеспособными и при посеве на коринобакагар давали типичный рост колоний от темно - серого до черного цвета. Повышение концентрации препарата до 0,2% вызывало инактивацию С. pseudotuberculosis: штамма 50-S, аплицированного на железном и деревянном тест-объектах при 60 и 120 минутных экспозициях, на бетонном тест -объекте при 120 минутной экспозиции; штамма 37-1 - при 60 и 120 минутах на железном тест-объекте, при 120 минутной экспозиции на деревянном тест-объекте; полевой культуры С. pseudotuberculosis № 1-S и полевой культуры С. pseudotuberculosis № 3-1, находящихся на железном тест - объекте, при 120 минутной экспозиции. Так как 0,2% (по активному хлору) концентрация деохлора не способствовала инактивации всех исследуемых тест - культур С. pseudotuberculosis в дальнейших исследованиях нами использовалась 0,3% его концентрация. Результаты испытания препарата в 0,3% (по активному хлору) концентрации показали, что на поверхности всех тест-объектов (железо, дерево, бетон) микроорганизмы были полностью инактивированы.

Концентрация раствора ДП-2Т в 0,5% (по активному хлору), при расходе 0,5л/м2 и экспозиции 60 и 120 минут, не обеспечила инактивации С. pseudotuberculosis. При увеличении концентрации по активному хлору до 0,6% отмечали тенденцию к снижению числа колониеобразующих единиц. При этом были полностью обеззаражены лишь тест-объекты, зараженные штаммами 50-S и 37-1. Обработка 0,7% раствором ДП-2Т, при расходе 0,5 л/м2, вызывала бактерицидный эффект на поверхности железных, деревянных и бетонных тест - объектов, зараженных всеми исследуемыми культурами С. pseudotuberculosis.

Результаты испытания раствора препарата глютекс, при расходе 0,5 л/м2, показали, что 0,3% его концентрация как при 60, так и при 120 минутной экспозиции, не оказывала бактерицидного действия на исследуемые культуры кори-небактерий, на поверхности тест-объектов. Повышение концентрации раствора до 0,5% обеспечивало обеззараживание железных и деревянных тест-объектов, контаминированных штаммами 50-S и 37-1 как при 60, так и при 120 минутной экспозиции, а также железных, деревянных и бетонных тест-объектов, зараженных полевой культурой № 1-S после 120 минутной экспозиции. Штамм 70-R, полевые культуры № 2-R и № 3-1 сохраняли жизнеспособность с задержкой роста на питательных средах. Полученные результаты дали основание к увеличению концентрации раствора глютекса до 0,7%. Данная концентрация раствора обеспечила обеззараживание поверхностей из дерева, железа, бетона. При этом все исследуемые культуры С. pseudotuberculosis утрачивали свою жизнеспособность.

Электрониомикроскопическое исследование коринебактерий после воздействия дезинфицирующих препаратов

Целью данного этапа исследований было подтверждение эффективности инактивации возбудителя дезинфицирующими препаратами. Изучение ультра-сгруктуры бактериальных клеток возбудителя казеозного лимфаденита после воздействия дезинфектантов позволило выявить ряд закономерностей. Характер субмикроскопических изменений не -зависит от принадлежности корине-

бактерий к штамму 70-R или полевой культуре № 2-R. Однако, у штамма 70-R, деструктивные изменения компонентов бактериальных клеток были выражены в большей степени, чем у полевых культур, что связанно с наличием более развитой микрокапсулы.

Бианол в бактерицидной концентрации нарушает ультраструктуру значительной части клетки. Обнаруживается разнообразие форм бактерий: встречаю-ся i рушевидные, треугольные, бобовидные клетки. Наиболее часто изменения зафагивают клеточную стенку. При этом происходит разрыхление ее поверхности, разрушение, разрывы, размывание или резкое утолщение. Эти дефекты могут быгь локальными, либо затрагивать значительную часть клеточной стенки и приводить к ее утрате. Через дефекты клеточной стенки происходит выход различных по величине фрагментов цитоплазмы.

Глютекс оказывал сходное с бианолом влияние на ультраструктурную организацию коринебактерий, связанное с преимущественным разрушением клеточной стенки. Размывание или разрушение клеточных стенок приводило к образованию зернистых бесструктурных форм и лизированных клеток.

При воздействии препарата виркон на С. pseudotuberculosis микроорганизмы сохраняли размеры, соответствующие норме и округлую первоначальную форму. Целостность клеточной стенки сохранена, хотя структура была выражена недостаточно четко. Основные изменения обнаруживали в цитоплазме. Цитоплазматический матрикс представлен однородным, плотным, зернистым осмиофильным материалом, нуклеоид не дифференцировался либо был представлен неструктурированной осмиофильной зоной. Все формы деления бактерий имели признаки деструкции и происходили путем образования центрально расположенной слоистой перегородки, эксцентричного врастания нескольких гомогенных узких перегородок, а также перетяжками. Деление клеток не было завершено, дочерние клетки не расходились.

В культуре, обработанной деохлором, клетки сохраняли размеры, соответствующие норме. Клеточная стенка чаще имела трехслойное строение, в ряде случаев обнаруживали ее локальные утолщения округлой формы. Цитоплазма содержала различной формы и величины зоны разряженности, либо была вакуолизирована и находилась в состоянии лизиса.

Изменения ультраструктуры коринебактерий в результате воздействия препарата ДП - 2Т были сходными с отмеченными при воздействии бактерицидных концентраций деохлора. Однако у ряда клеток на фоне локальных разрывов клеточных сленок в цитоплазме присутствовали электронноплотные образования окруженные осмиофобной зоной. Встречались клетки увеличенных размеров с утолщенной клеточной стенкой и лизированной цитоплазмой.

В результате исследования ультраструктуры коринебактерий после воздействия бактерицидных концентраций рекомендуемых дезинфектантов (бианол, виркон, дехлор, дп-2т, глютекс) установление, что они вызывают деструкцию жизненно важных структур клеток С. pseudotuberculosis, что приводит микроорганизмы к гибели.

Выводы

1. Бактерицидные концентрации растворов дезинфицирующих препаратов в отношении С. pseudotuberculosis составили: для бианола - 35,3мг/100 мл; для виркона - 18мг/100мл; для деохлора - 2,8мг/100мл (по активному хлору); для ДП-2Т - 2,8мг/100мл (по активному хлору); для глютекса - 25,2 мг/100мл.

2. Устойчивость коринебактерий к дезинфектантам зависит от диссоциативной формы бактерий: R- формы коринебактерий менее подвержены действию рекомендуемых препаратов, чем I - и S - формы. Полевые культуры коринебактерий, № 2-R, № 3-1, штамм 70-R и золотистый стафилококк более устойчивы к воздействию химических дезинфицирующих препаратов в сравнении с музейными штаммами С. pseudotuberculosis 50-S, 37-1, полевой культурой № 1-S и кишечной палочкой.

3. В присутствии высокомолекулярного белка степень бактерицидного действия бианола на коринебактерий снижается в 3,19 раза, виркона - в 2,03 раза, деохлора - в 1,66 раза, ДП-2Т - в 1,55 раза, глютекса - в 1,89 раза, что необходимо учитывать при разработке параметров дезинфекции.

4. Бактерицидная активность всех исследуемых дезинфектантов в отношении коринебактерий увеличивается при повышении температуры их рабочих растворов, что характеризуется температурным коэффициентом (ТК). При температуре 40°С наиболее значительно повышается бактерицидная активность препарата виркон (средний показатель ТК-1,49) и препарата деохлор (средний ТК- 1,36). При 50°С заметно усиливаются бактерицидные свойства препаратов виркон, деохлор и ДП-2Т, средние показатели ТК при этом составляют соответственно 1,72; 2,03 и 2,12.

5. Инактивирующие свойства фенола в отношении коринебактерий значительно ниже в сравнении с рекомендуемыми дезинфектантами. В отношении С. pseudotuberculosis дезинфицирующие препараты эффективнее фенола: биа-нолв38,19 раза, виркон - в 78.93 раза, деохлор - в 601,65 раза, ДП-2Т - в 493,85 раза, глютекс - в 46,8 раза.

6. Дезинфицирующие свойства препаратов в отношении С. pseudotuberculosis при влажном методе дезинфекции зависят от характера обрабатываемой поверхности: наибольшую устойчивость к дезинфицирующим веществам кори-небактерии проявляют на пористых материалах (дерево, бетон). Надежное обеззараживание различных видов строительных материалов (дерево, бетон, металл) при влажном методе дезинфекции достигается применением: 1% раствора бианола, 0,5% раствора виркона, 0,7% раствора глютекса, 0,3% (по активному хлору) раствора деохлора и 0,7% (по активному хлору) раствора препарата ДП-2'Г, при однокрагной двух часовой экспозиции, в дозе 0,5 л/м2.

7. Электронномикроскопическое исследование коринебактерий, подвергнутых воздействию бактерицидных концентраций дезинфицирующих препаратов (бианол, виркон, глютекс, деохлор, ДП-2Т) выявило различные проявления глубоких деструктивных изменений клеточных структур микроорганизмов, несовместимые с их жизнедеятельностью: утолщение клеточной стенки, нарушение ее целостности; утрата однородной структуры цитоплазмы, формирование

в ней зернистых образований и вакуолей; уплотнение или вакуолизация нук-леоида.

Практические предложения

Практические предложения включены в методические рекомендации: «Дезинфекционные мероприятия при казеозном лимфадените овец», утвержденные на заседании подсекции «Инфекционная патология животных в ре-шоне Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Рос-сельхозакадемии (протокол № 5 от 21 июня 2005 г.).

Материал диссертационной работы может быть использован: в научно-исследовательских лабораториях, занимающихся изучением вопросов дезинфекции, диагносшки, лечения и профилактики не только казеозного лимфаденита овец, но и других хронических инфекций; в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по микробиологии, эпизоотологии; практикующими ветеринарными врачами в овцеводческих хозяйствах.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Шадрин, A.B. Использование ряда дезинфектантов в комплексной системе мер профилакшки и оздоровления / A.B. Шадрин [и др.] // Аграрная наука России в новом тысячелетии: материалы межрегиональной науч. конф. молодых ученых аграрных вузов Сибирского федерального округа - Омск, 2003. -С. 213-217.

2. Шадрин, A.B. Эффективное использование новых средств дезинфекции при казеозном лимфадените овец / A.B. Шадрин, Т.А. Беспалова // эпизоотология, патология и ветеринарно-санитарные мероприятия при инфекционных болезнях животных: сб. науч. тр. - Омск, 2004. - С.204-206.

3. Шадрин, A.B. Влияние высокомолекулярного белка и температуры на бактерицидную активность дезинфицирующих веществ в отношении корине-бактерий / A.B. Шадрин, Т.А. Беспалова // Актуальные вопросы микробиоло! ии и инфекционной патологии животных: материалы научно-производственной конференции, посвященной 100-летию профессора Н.Г. Кондюрина,- Омск, 2004,- С. 336-342.

4. Беспалова, Т.А. Методологические подходы к поиску экологически безопасных средств дезинфекции при коринебактериозах сельскохозяйственных животных/ Г.А. Беспалова, Н.М. Колычев, A.B. Шадрин//Техникаэкологически чистых производств в XXI веке: Проблемы и перспективы: материалы VIII международною симпозиума молодых ученых, аспирантов и студентов. -Москва, 2004.-с. 180-182.

5. Шадрин, A.B. Изыскание дезинфектанюв и разработка режимов их применения в овцеводстве / A.B. Шадрин // Инновационное развитие аграрного производства в Сибири: сб. материалов третьей научн. конф. молодых ученых вузов ассоциации «Агрообразование» Сибирского федерального округа.- Кемерово, 2005. - С. 220 - 223.

Андрей Викторович Шадрин

Влияние химических факторов на Corynebacterium pseudotuberculosis

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Подписано в печать 21.11.2005 Формат 68x84 1/16. Гарнитура Times New Roman Печ. л. 1,0 (0,93). Печать оперативная. Тираж 100 экз.

Лицензия ЛТ № 020047

Отпечатано с оригинал-макета в типографии ООО «Вариант-Омск» 644099 г. Омск, ул. Коммунистическая, 45. Тел: 25-14-34,33-71-41

г í

\

I

»247 *t)

РНБ Русский фонд

2006-4 27656