Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Применение УФ-спектрофотометрии для идентификации и дифференциации микроорганизмов рода Сorynebacterium

РГ6 о»

1 2 ГгВ ';г-1

На правач рукописи

НОВАКОВСКИИ АНДРЕЙСТАНИСЛАВОВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ ДЛЯ

ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА СОКУМЕВАСТЕКШМ

16.00.(13 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОМСК - 2000

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии и инфекционных болезней сельскохозяйственных животных ИВМ ОмГАУ, в лаборатории физико-химических методов исследования ВНИИБТЖ и на кафедре биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук,

профессор И.Г Трофимов Научный консультант: доктор ветеринарных наук,

профессор В.И. Околелов

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

профессор В.Г. Ощепков доктор ветеринарных наук Ю.И. Смоляиинов

Ведущее учреждение: Новосибирский государственный arpapi

Защита диссертации состоится »Цчэ^с 2000 г. в Ю ч. на заседании диссертационного совета Д. 120. 48. U1 в институте ветеринарной медицины Омского государственного аграрного университета по адресу: 644007 г. Омск, ул. Октябрьская. 92

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВМ ОмГАУ Автореферат разослан « 21 » Л^х 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ¡

униветситет

доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Coiynebacterium pseudotuberculosis вызывает у животных хронически протекающую болезнь - казеозный лимфаденит. В последние годы появились факты, свидетельствующие о том, что данный микроорганизм обладает особым циклом развития и отличается от большинства микроорганизмов возможностью приспосабливаться к внутриклеточным условиям паразитирования. Казеозный лимфаденит широко распространен в странах с развитым овцеводством: Австралии, Новой Зеландии, США, Индии, Аргентине, Румынии, России ((H.R. Came (1932); H.R.Carne, С. Cramp (1932); C.V. Dayus, S.M. Hopkirk (1932); K.T. Maddy (1953); К.Ф. Ламихов (1954); M.M. Халимбеков и др. (1961); M.M. Далгат (1962, 1965); Э.А.Шегедевич (1968, 1969); И.Г. Трофимов (1981, 1984, 1988, 1990, 1993, 1994); Н.М.Колычев, И.Г. Трофимов (1993); М.В. Заболотных (1989, 1999), М.В. Заболотных., А.С. Крупко (1999)).

До настоящего времени, несмотря на длительный период изучения данного микроорганизма, нет достаточно надежных прижизненных методов диагностики и мер специфической профилактики казеозного лимфаденита. Это обусловлено тем, что С. pseudotuberculosis отличается широкой вариабельностью фенотипических и генотипических свойств. Известные методы идентификации коринебактерий различных видов весьма трудоемки и при изменчивости возбудителя мало эффективны. Поиск методов диагностики осложняется недостатком знаний об этиологии данной инфекции. В этой связи актуальной является разработка и внедрение в ветеринарную практику новых, более чувствительных методов идентификации коринебактерий, основанных на изучении структурных компонентов микробных клеток, обеспечивающих простоту исследований с высокой информативностью и автоматизацией процесса исследований.

Одним из таких методов является ультрафиолетовая спектрофотометрия ((М. Orcliin, Н.Н. Jaffe (I960), Ч. Кантор, П. Шиммел (1984), Л.В. Вилков, Ю.А. Пентин (1987)). Данный метод позволяет исследовать спектры поглощения бактерий в водных растворах, при этом сохраняется целостность клеток.

Тема диссертационной работы вошла самостоятельным разделом в комплексную тему ИВМ ОмГАУ «Разработка методов и средств диагностики, профилактики, меры борьбы с кори неба ктсри-озами сельскохозяйственных животных» и имеет номер государственной регистрации 01.9.90.000196.

Цель ii задачи исследования. Целью исследований является разработка методики идентификации и дифференциации

коринебактерий методом УФ-спектрофотометрии.

Для решения этой проблемы поставлены следующие задачи:

• разработка регламента исследования культур коринебактерий посредством УФ-спектрофотометрии и дальнейшая обработка результатов посредством регрессионного анализа;

• выявление характерных спектров поглощения коринебактерий для создания банка данных на ЭВМ;

• исследование воздействия у-излучения на различные феноти-пические формы (R-, 1-, S-) С. pseudotuberculosis, а также поиск оптимальной дозы, необходимой для полной инактивации микроорганизмов этого вида;

• нахождение зависимости между спектральными, геногипи-ческими и фенотипическими характеристиками С. pseudotuberculosis;

Научная новизна.

1. Методом УФ-спектрофотометрии впервые исследованы культуры разных видов коринебактерий. Выявлены оптимальные условия применения предлагаемого метода, установлены характерные линии спектров, посредством которых можно производить идентификацию вышеуказанных микроорганизмов.

2. Впервые изучено воздействие у-излучения на различные фенотипические формы (R-, 1-, S-) С. pseudotuberculosis, а также выявлена оптимальная доза, ведущая к их полной инактивации.

3. Установлена зависимость между спектральными, генотипичес-кими и фенотипическими характеристиками С. pseudotuberculosis .

Теоретическая и практическая значимость работы.

1. Установлена возможность применения УФ-спектрофотометрии для идентификации и дифференциации штаммов внутри вида С. pseudotuberculosis.

2. Изучено воздействие у-излучения на различные фенотипические формы (R-, 1-, S-) С. pseudotuberculosis.

3. Предложены методические подходы использования УФ-спектрофотометрии для изучения характеристик коринебактерий независимо от их морфологических и функциональных особенностей.

4. Разработаны тесты для индикации возбудителей казеозного лимфаденита в лабораторных условиях.

Апробация полученных результатов. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на юбилейной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава

и аспирантов ИВМ ОмГАУ (Омск, 1998); межрегиональной научно-практической конференции «Роль инноваций в развитии регионов» в рамках промышленно-инновационного форума «Промтехэкспо-99».(Омск, 1999); международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения члена-корреспондента ВАСХНИИЛ В.Т. Котова '{Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных» (Воронеж, 1999); международной научно-практической конференции «Проблемы стабилизации и развития сельскохозяйственного производства Сибири, Монголии и Казахстана в XXI веке (Новосибирск, 1999 г); межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения Д.Н. Фиалкова и 75-летию ВООП «Природа и природопользование на рубеже XXI века», (Омск, 1999).

Публикация полученных результатов. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 21 рисунком, 37 таблицами. Список литературы включает 192 источника, из них 87 - отечественных, 105 - зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Применение УФ-спекгрофотометрии для идентификации и дифференциации микроорганизмов рода Corynebacterium.

2. Определение зависимости между спектральными, генотипи-ческими и фенотипическими характеристиками С. pseudotuberculosis.

3. Воздействие -у-излучения на различные фенотипические формы С. pseudotuberculosis.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования

Работа проводилась в период с 1995 по 2000 годы на кафедре эпизоотологии ИВМ ОмГАУ, в лаборатории физико-химических методов исследования ВНИИБТЖ и на кафедре биофизики МГУ им. М.В. Ломоносова.

Материалом для исследования служил и культуры С.pseudotuberculosis шт. 70R, 74R, 209R, 146S (депонированные в ВГНКИ

М.В. Заболотных, Н.М. Колычевым, И .Г. Трофимовым), а также шт. 371, 50S, 214R, 404R, 410S, 405R, 425R, 1011, выделенные отбольных казеозным лимфаденитом овед в хозяйствах Омской области (И.Г. Трофимов, 1984; М.В. Заболотных, 1989), которые хранились в условиях музея НПЛ эпизоотологии казеозного лимфаденита овец (ИВМ ОмГАУ).

Кроме этого, изучались другие представители рода Corynebacterium: С. renale шт. 888, C.equi шт. 1, С. pyogenes шт. 3; микроорганизмы родов Mycobacterium (М. bo vis BCG, М. avium шт. 14, M.phlei шт.7, М. smegmatis), Brucella (B.abortus шт. 19, В. ovis шт. 282, 424/2). Все штаммы микроорганизмов первоначально получены из ВГНКИ.

Культивирование коринебакгерий осуществлялось на различных питательных средах: мясо-пептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА), сывороточно-теллуриговом агаре (СТА). Для изучения биохимических свойств использовали среды Гисса.

Для изучения биологических свойств культур С. pseudotuberculosis, находившихся долгое время в лиофильном состоянии (хранились в условиях холодильной камеры при +4°С в течении 9 лет), были взяты три представителя разных фенотипических форм (шт. 70R, 371, 146S), которые в последующем использовались для исследования спектральных характеристик.

Морфологические и тинкгориальные свойства изучали посредством приготовления мазков на предметных- стеклах, с последующей окраской по Граму и наблюдением под микроскопом, культуральные - на МПБ и СТА, биохимические - на средах Гисса. Патогенные и вирулентные свойства изучали на морских свинках (12 голов), которым вводили по 1мл 2 млрд. взвеси интраперитонеально. На каждую исследуемую культуру и для контроля было взято по 3 головы.

Культуры бруделл культивировались на МПБ и среде Сотона, а микобактерии на средах BKJ1, Сотона, Павловского.

Бактериальную массу собирали в стадии стационарного роста, трижды отмывали стерильным 0,85% физиологическим раствором, предварительно охлажденным до + 4° С, с промежуточным центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 минут. Осажденную бактериальную массу ресуспендировали 0,1М фосфатным буфером (рН=6,8).

Концентрацию микроорганизмов в образце доводили до 1 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГНИИСК им А. А. Тарасевича. Готовили по 3 мл каждой культуры.

Для обеспечения безопасности работы с патогенными микроорганизмами проводили их предварительную инактивацию у-излучением на установке "Исследователь" (источник Со60, мощность источника 4,3 кГр/ч) в дозе 10 кГр (килогрей).

Предварительно исследовали динамику воздействия данного излучения на различные фенотипические формы (^pseudotuberculosis (шт. 70R, 209R, 146S, 50S, 371, 1011) и устанавливали оптимальную дозу у-излучения, которая вызывает полную инактивацию коринебактерий.

Для проведения эксперимента предварительно готовили 10 миллионную суспензию вышеуказанных микроорганизмов в стерильном физиологическом растворе, далее взвесь помещали в стерильные флаконы по 3 мл в каждый и проводили обработку образцов у-излучением в следующих дозах: 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 кГр. После этого производили посев обработанных взвесей микроорганизмов на чашки Петри с СТА. Посев взвесей возбудителя (до облучения и после каждого облучения) осуществляли с помощью градуированной пипетки по 0,4 мл в каждую чашку Петри. Для повышения достоверности результатов суспензию микроорганизмов, обработанную соответствующей дозой у-излучения, высевали на три чашки Петри. Характер устойчивости коринебактерий к у-излучению изучали с помощью подсчета количества колоний, выросших на питательной среде.

. Для проведения- исследований методом УФ-спектрофотометрии-использовали установку Hitachi-557. Аппарат представляет собой двухканальный спектрофотометр с широким диапазоном длин волн (190-900 нм). Спектрофотометр совмещен с компьютером IBM PC на базе процессора Intel 486. Работу проводили в диапазоне длин волн от 190 до 305 нм.

Использовали математическое программное обеспечение, которое позволяет скорректировать зарегистрированные спектры, учесть и вычесть сигнал буферного раствора и следовых количеств питательной среды, на которой были выращены исследуемые культуры, а также сравнить полученные спектры со спектрами других культур, хранящихся в памяти ЭВМ.

Результаты исследований Идентификация и дифференциация микроорганизмов

методом УФ-спектрофопшетрпн Нами было проведено исследование некоторых представителей рода Corynebacterium, Mycobacterium, Brucella методом УФ-спектрофотометрии.

Данные, полученные на спектофотометре и обработанные компьютером, имели вид точек на координатной плоскости (К„огл - X) для каждого исследуемого микроорганизма. Коэффициенты поглощения были определены с шагом по длине волны равным 0,5 нм в диапазоне 190н-305 нм. Соответствующие штаммам отдельных микроорганизмов точки К( 7.) образовывали в совокупности спектральную кривую.

0.7

0.6 0.6 О 4 0 3 О 2 1 0 1 О

1

Рис. 1. Спектральная кривая на примере штамма 214R С. pseudotuberculosis Цифрами показаны: 1 - первый максимум; 2 - минимум; 3 - второй максимум

По результатам предварительного анализа спектральных зависимостей всех исследуемых микробов нами был сделан вывод о том, что все кривые имеют ряд общих признаков:

а) максимальные значения Кпогл расположены в левой части исследуемого диапазона;

б) на кривой имеются 3 экстремума (2 максимума и 1 минимум) (рис.1):

• 190-195 нм - 1-й экстремум (1-й максимум), в котором значения коэффициента поглощения достигают 0,25 для В. ovis шт. 424/2 и 0,68 С. pseudotuberculosis шт. 209R;

• 225-240 нм - 2-й 'экстремум (минимум), значения коэффициентов поглощения варьируют от 0,005 для М. smegmatis до 0,1.15 для С. rcnale шт. 888;

• 250-290 нм - 3-й экстремум (2-й максимум), значение коэффициентов поглощения в котором, для разных видов микроорганизмов, составили от 0,05 для М. smegmatis до 0,131 С. гепа-

Кпогл

-п

I Г0 ГБ

/ / —

90 200 210 220 230 240 250 • 260 270 280 290 300 Длина волны, нм

1ешг.888.

Координаты этих трех экстремумов индивидуальны для каждого исследуемого штамма микроорганизмов, поэтому мы использовали их как оценочные критерии сходства и различия отдельных испытуемых микроорганизмов, относящихся к разным видам и родам.

Экспериментальных данные, полученные нами, имели числовые значения в состав которых входила погрешность измерения. Ее величина, в соответствии с паспортными данными установки Hitachi-557, составляла ДКпигл=±0,003. Ниже представлен график регрессионной кривой на примере С. pseudotuberculosis шт. 146S для окрестностей точек второго максимума. Числовые данные на координатной плоскости показывают вычисленные значения максимума по длине волны и коэффициенту поглощения (рис. 2).

К,

погл

0 096

0.095

0.094

0.093

0.092

0 091

! 258.7 . L—

! Г 1 0 0949 '

/ > 1 1 1 1 ■1- -

У к 1 1 1 1 +-А +

/ 1 1 1

252 254 256 258 260 262 264 266

Длина волны, км

Данные

- Кривая апроксимации

Рис. 2. Кривая регрессии второго максимума дтя шт. 146S С. pseudotuberculosis

Систематизация данных по значениям Ктогл затруднена тем, что на величину коэффициента поглощения оказывает значительное влияние изменение концентрации бактериальных тел в буферном растворе,.поэтому при анализе спектральных данных мы использовали не абсолютное, а относительное значение коэффициента поглощения значение:

Кпогл0™=

Клс

Кпс

ср.ИНТ.

Кср,

hi

= _1ж_

К-К

где,

п

1

>.„ - длина волны начала диапазона (190 нм): /.,- - длина волны конца диапазона (305 ны); 1 - шаг по длине волны через который проводятся измерения; п - количество точек измерения.

Таким образом, полученные координаты (Кпоглотн, '/.) для трех характерных точек спектра являются индивидуальным "портретом" микроорганизма, чью принадлежность необходимо установить.

Точки первого максимума спектральной кривой всех исследуемых нами микроорганизмов показаны на графике (рис. 3).

а

о

к

р о

/

- ч\ N \ V ч \ \ * х\ \ V »

ч^ Ч ч \ V. \ ч v ч 1 1 1 1 * \ * L \/ N

\ - (в \ Ч о 1 1 Ьо о о ) \ > \

с

189 189.5 190 190.5 191 191.5 192 Ш.5 193 о S-формы Длина волны, ны

ООО R-формы У- С. pseudotuberculosis see I-формы J

ООО Другие виды коринебактерий XXX Микобактерии +++ Бруцеллы

Рис. 3. Координаты (Кпогп0™, А,) точки первого максимума спектральной кривой

График KIIornCTI-f(?i) в точке первого максимума содержит данные для трех исследуемых родов микробов (рис. 3). Из него видно, что точки, соответствующие коринебактериям, размещены компактно в области А,=191,3+193,0 нм, Кпогл=3,5+5,5, точки, соответствующие образцам микобактерий, находятся в области /„=190,5+192,0 нм, КПогл=4,5-г7,1; облако точек, характеризующих микроорганизмы рода Brucella, располагается в области 1=189,3+191,3 нм, Кпогл=4,5+5,8.

Таким образом, прослеживается обособленность групп точек, соответствующих разным родам, но присутствует их частичное взаимное проникновение.

0.7

| 06 О

3

0

1 05

ь

53 S

si 04

t

о

0 к

;S оз а

1'

1 0,2

0.1

200 210 220 230 240 250 260

->. Длина волны, им

о S-формы ООО R-формы?- С. pseudotuberculosis в в в 1-формьу

□□□ Другие виды коринебактерий XXX Мико бактерии +++" Бруцеллы

Рис. 4. Координаты (Кпог„0™, X) точки минимума спектральной кривой

График, приведенный выше, определяет исследуемые образцы микроорганизмов в зависимости от двух координат (Кпоглотн, X) для минимума спектральной кривой (рис. 4). Характерным является то, что точки, соответствующие роду Corynebacterium, как и при первом мак-

симуме, размещены в небольшой области, ограниченной координатами /.=227+242 нм, Кпогл=0,55+0,68. тогда как область распределения точек микроорганизмов рода Mycobacterium значительно шире: >.=208+250 нм, Кпогл=0,1+0,58, в целом она располагается ниже области значений, соответствующих коринебактериям. Точки, характеризующие образцы микробов рода Brucella, находятся в области >^=210,5+240,1 нм, КПОГл=0,47+0,66.

Это свидетельствует о значительном перекрытии областей расположения измеренных значении образцов коринебактерий и бруцелл в районе минимума спектральной кривой.

о

В

а 09

0.8

0.7

0.6

0.5

250

260

*» /

\i i Г-. i4 Oii •. 1 ч 1 •, 1 \ i i

1 А Ч '! ■. / V !\ 1 • i ч \

§ 1 1 \ 1 X X

ч ........

270

280

290

Длина волны, нм >- С. pseudotuberculosis

^ S-формы ООО R-формы в® ® 1-формы □□□ Другие виды коринебактерий XXX Микобактерии +++ Бруцеллы

Рис. 5. Координаты (Кпоглош, X) точки второго максимума спектральной кривой

Точки второго максимума (рис. 5) у микроорганизмов рода Corynebacterium располагаются на координатной плоскости К,,,,-,"1"-?. в узкой полосе, их величины значительно различаются по коэффициенту поглощения, и очень близки по длине волны (/.=256+259 им, КПОГЛ=0,585-И),8). Подобную форму разброса значений для разных образцов имеют микроорганизмы рода Brucella (А=259ч-263,5 нм, КПОГЛ=0,68+0,9), но облако их точек расположено выше и правее. В отличие от микроорганизмов, перечисленных выше, точки образцов представителей рода Mycobacterium имеют более широкую область рассеивания по длине волны (1=259+288 нм, Кпогл=0,59-г0,9).

Однозначное определение видовой принадлежности исследуемого микроорганизма с помощью трех характерных точек спектральной кривой затруднено. Этот вывод согласуется с данными И.Г. Трофимова, Н.М. Колычева (1993), которые свидетельствуют о том. что различия в генотипических свойствах отдельных видов Corynebacterium теряются на фоне разнообразия этих свойств среди отдельных представителей внутри вида.

Отличие вида С. pseudotuberculosis от других коринебактерий определяется, главным образом, смещением точек его образцов влево по оси длин волн для 2-го экстремума спектральной кривой (минимум) (рис. 4). S-формы С. pseudotuberculosis имеет большее сходство характеристик отдельных образцов в сравнении с R-формами (S-формы обладают меньшим разбросом значений и по относительному коэффициенту поглощения и по длине волны).

Как указывалось выше, использование только спектральных критериев для видовой и внутривидовой идентификации микроорганизмов недостаточно. Поэтому нами был предложен способ определения принадлежности микробов по нескольким генотипическим, фенотипическим и спектральным характеристикам. Для установления зависимости между генотипическими свойствами, а именно молярным процентом содержания гуанина и цитозина в ДНК (мол%ГЦ), фенотипическими и спектральными характеристиками были исследованы представители С. pseudotuberculosis.

В качестве зависимой (вычисляемой) переменной было взято значение мол%Г1Д. Данный показатель известен только у 10 исследованных штаммов. У штамма 425R мол%ГЦ не определен.

В качестве независимых (известных) переменных - различные комбинации фенотипических свойств и спектральные характеристики.

Для поиска наиболее оптимальной регрессионной модели нами обработано 40 различных комбинаций фенотипических и спектральных характеристик. Опираясь на полученные данные, нами были выбраны

восемь характеристик с наибольшим значением коэффициентов корреляции с мол.% ГЦ. Регрессионная зависимость, таким образом, определяла зависимый параметр - мол%ГЦ от восьми независимых (значения трех экстремумов по длине волны, трех абсолютных коэффициентов поглощения в точках экстремумов спектральной кривой, а также показателей расщепления коринебактериями мальтозы и сахарозы).

Уравнение многомерной линейной регрессии имело следующий

вид:

У = р0 + (31-х, + р2.х2 +...+ рп-Хи.+еь где

У - вычисляемое значение мол%ГЦ;

р,,... Рп - константы;

XI... хп - значение фенотипических свойств и спектральных характеристик;

с, - случайная независимая переменная.

Ро...рп - вычисленные константы (табл. 1).

Таблица 1

Значение коэффициентов

ро ßl ß2 рз Р4 р5 Р6 Р7 РВ

518,85 2,093 0,225 -3,334 -8,877 -753,6 431,04 -13,16 -6,605

Ниже представлены реальные и расчетные значения мол%ГЦ, а также значение абсолютной и относительной погрешности (табл.2).

Таблица 2

Зависимость мол%ГЦ от шести спектральных характеристик и расщепления мальтозы и сахарозы по 10 штаммам С. pseudotuberculosis

исследуемые штаммы значение мол%ГЦ погрешность

реальные* расчетные данные абсолют. относ., %

146 S 43,0 43,82 0,82 1,90

214 R 46,8 46,06 0,74 1,58

74 R 47,8 48,08 0,28 0,59

209 R 45,1 44,84 0,26 0,57

410 S 53,0 53,39 0,39 0,74

404 R 54,7 54,33 0,37 0,67

405 R 57,6 57,39 0,21 0,36

70 R 71.8 71.89 0.09 0,12

37 I 75.7 75.29 0.41 0,54

50 S 61,4 61,34 0,06 0,10

425R неизвестен 51,12 - -

* - данные взяты из работы И.Г. Трофимова, Н.М. Колычева (1993)

Данные (табл. 2) свидетельствует о том, что погрешность внутри выборки варьируется от 0,1% (шт. 50S) до 1,9% (146S). Посредством регрессионной формулы вычислен также показатель мол%ГЦ для штамма 425R (он равен 51,12). Достоверная разница, определяющая отличие между реальными и расчетными значениями мол%ГЦ, равна 0,99, что говорит о достоверности полученных результатов (Р>0,05).

При подстановке р-коэффициентов в уравнение много факторной регрессии мы получили следующую зависимость:

Мол%ГЦ = 518,85 + 2,093х?ч -I- 0,225хл.2 + 3,33+хХ3 - 8,877хК, -- 753,596хК2 + 431,038хК3- 13.156хМ, - 6,605хМ2, где

л31 - значение первого максимума по оси длин волн, нм;

Х2- значение минимума по оси длин волн, нм;

Х3- значение второго максимума по оси длин волн, нм;

К] - значение коэффициента поглощения первого максимума;

К2 - значение коэффициента поглощения минимума;

К3 - значение коэффициента поглощения второго максимума;

Mi - показатель ферментации коринебактериями мальтозы;

М2 - показатель ферментации коринебактериями сахарозы.

Эта формула позволяет определить основной показатель генотипа, а именно мол%ГЦ по известным спектральным характеристикам и показателям фенотипа (ферментация мальтозы и сахарозы).

Таксономия штаммов С. pseudotuberculosis по спектральным характеристикам

С целью систематизации исследуемых представителей С. pseudotuberculosis, по полученным спектральным характеристикам в диапазоне (190-305 нм), нами была проведена таксономия с использованием норм, применяемых в функциональном анализе: ||x||i -норма сумм модулей ординат спектральной кривой; ||х||2 - евклидова норма (корень из суммы квадратов показателей); ||у|| - норма Чебышева (максимальное значение ординаты).

Выше указанные нормы вычисляются по следующим формулам.

iwh-SM.

х=(хь х2, Хз,...хп) - вектор переменных;

х,- значение коэффициентов поглощения в точках измерения.

||у||= тах |.у,|: - норма, определяющая значение длины волны, которая соответствует максимальному значению коэффициента поглощения по всей выборке.

Таблица 3

Разделение штаммов С. pseudotuberculosis на группы по спектральным и генотипическим показателям

Группы Характеристики исследованных штаммов С. pseudotuberculosis

по нормам спектральных характеристик по генотипу*

Mli 1Mb 1 yll по ДНК-ДНК-гибридизации по мол%ГЦ

1 410S 410S 41 OS, 404R. 214R. 50S 70R, 371 70R, 371

2 2а 74R. 146S 2b214R. 404R 74R.146S 214R. 404R 146S. 209R, 425R. 405R 209R, 404R. 410S 50S

3 5 OS SOS 70R, 74R, 371 74R, 404R, 214R. 146S 405 R, 404R, 410S, 425R

4 209R 209R - SOS 74R.214R, 209R. 146S

5 405R.425R 405R. 425R - 405R.410R -

6 70R. 371 70R. 371 - -

* - данные взяты из работы И.Г. Трофимова, Н.М. Колычева (1993)

Как можно увидеть из (табл. 3), таксономия по спектральным характеристикам с использованием евклидовой нормы с некоторыми различиями согласуется с делением представителей С.pseudotuberculosis по генотипу [Б.А. Фомин и др. (1989), И.Г. Трофимов, Н.М. Колычев (1993)].'

Определение устойчивости различных фенотнпнческнх форм С. pseudotuberculosis к у-излученшо Изучение патогенных микроорганизмов связано с предварительной их инактивацией. Чаще применяют термические и химические методы, которые ведут к значительным структурным изменениям микробной клетки, что нежелательно при исследовании микроорганизмов методом УФ-спектрофотометрии. Одним из методов, не приносящих значительных изменений клетки, является обработка ее у-1гзлучением.

В опыте исследовались музейные культуры С. pseudotuberculosis, относящиеся к различным фенотипическим формам (70R, 209R, 146S,

50S, 371, 1011). Динамика воздействия гамма-излучения на указанные микроорганизмы представлена на гистограмме (рис. 6).

Действие у-излучения на исследуемые культуры неодинаково. Наименее устойчивыми к данному виду воздействия являются S-формы коринебактерий, причем микроорганизмы штамма 50S более резистентны, чем 146S. Далее по чувствительности идут I-формы (шт. 371 и 1011). Самыми стойкими к действию у-лучей были R-формы С. pseudotuberculosis (шт.7(Ж и 209R). Оптимальная доза, при которой наблюдается полное уничтожение коринебактерий, в независимости от их фенотипической формы, составляет 10 кГр (рис. 6).

250000-fl

70 R 209 R 371 . 1011 146 S 50 S

штаммы

■ контроль ПО,5 кГр 01,0 кГр Q2.0 кГр И5,0 кГр И10 кГр

Рис.6. Количество колоний С. pseudotuberculosis R-, 1-, S-форм образовавшихся на питательной среде после посева суспензии, обработанной соответствующей дозой у-излучения, в сравнении с контролем.

Изучение биологических свойств лпофплнзнрованных культур С. pseudotuberculosis

Перед нами была поставлена задача - исследовать воздействие длительного хранения в лиофилизированном состоянии на биологические свойства культур С. pseudotuberculosis, которые в последующем исследовались УФ-спектрофотометрией.

Для первичного посева исследуемых культур использовали Ml Lb. Рост культур наблюдался через 24 часа после посева.

Культуральные свойства С. pseudotuberculosis полностью остались прежними лишь у шт. 146, принадлежащего к S-формам.

LUt.70R после хранения приобрел свойство формировать пристеночное кольцо и вызывать помутнение среды, при первичном посеве на МПБ не образовывал пленки, хотя после пересева его на СТА и вторичном посеве на МПБ данное свойство восстановилось. Шт. 371 при первичном посеве не образовывал пристеночное кольцо и не формировал пленку, но после пересева на СТА и при дальнейшем посеве на МПБ эти свойства также были восстановлены.

Кроме того, было проведено изучение биохимических свойств данных микроорганизмов. Оно показало, что в основном исследуемые микроорганизмы сохранили свои первоначальные свойства, однако бактерии, относящиеся к штамму 371, не расщепляли глюкозу и галактозу, а микроорганизмы, относящиеся к штамму 146S, рафинозу.

В опыте по изучении патогенных и вирулентных свойств пала только одна морская свинка, зараженная С. pseudotuberculosis штамм 70R. У этого животного наблюдалась ярко выраженная картина казеозного лимфаденита. Остальные зараженные морские свинки не погибли, а были убиты по окончанию эксперимента, но подобных изменений у них не было выявлено, хотя исходная культура была выделена.

ВЫВОДЫ

1. Ультрафиолетовая спектро фотометрия в диапазоне 190^-305 нм позволяет с помощью полученных критериев дифференцировать исследуемые микроорганизмы на принадлежность к роду Corynebacterium.

2. Использование трех комплексных критериев, характеризующих УФ-спектр, а также найденная многомерная линейная зависимость позволяет определить принадлежность исследуемого микроорганизма к определенному штамму вица С. pseudotuberculosis.

3. Применение полученной для вида С. pseudotuberculosis многомерной линейной зависимости позволяет по шести спектральным и двум фенотипическим характеристикам с приемлемой точностью вычислить значение молярного процента содержания гуанина и цитозина в ДНК для исследуемого микроорганизма.

4. Таксономия микроорганизмов, принадлежащих к виду С. pseudotuberculosis, с использованием норм, применяемых в функциональном анализе, по спектральным характеристикам в целом согласуется с делением по генотипическим свойствам.

5. Данные УФ-спектрофотометрии не выявляют однозначных признаков отличия микроорганизмов внутри вида, которые позволили

бы объединить их в группы соответствующие формам существующей классификации по фенотипу.

6. Доза у-излучения, необходимая для полной инактивации возбудителей казеозного лимфаденита, принадлежащих к различным фенотипическим формам, составляет 10 кГр. При этом S-формы С. pseudotuberculosis наименее устойчивы к у-излучению, а R-формы проявляют наибольшую резистентность к данному виду воздействия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Материалы диссертации доложены на методической комиссии ИВМ ОмГАУ. Рекомендованы к производственным испытаниям.

2. На основании результатов проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Применение УФ-спек-трофотометрии для идентификации и дифференциации микроорганизмов рода Corynebacterium». Рекомендации рассмотрены и одобрены на заседании Ученого Совета ИВМ ОмГАУ от 4 апреля 2000 г., протокол №5.

3. Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии и инфекционных болезней с/х животных и микробиологии й вирусологии ИВМ ОмГАУ, НГАУ, Благовещенского СХИ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Новаковский А.С. Разработка нового физико-химического метода для диагностики экспериментального казеозного лимфаденита. // Актуальные проблемы инфекционных, паразитарных и незаразных болезней домашних животных и меры борьбы с ними: Тез. юбилейной науч.-произв. конф. сотрудников и аспирантов ИВМ ОмГАУ. - Омск,

1998. - С. 248-253.

2. Новаковский А.С. Воздействие у-излучения на различные фенотипические группы С. pseudotuberculosis. // Сб. тез. межрег. науч,-практ. конф. «Роль инноваций в развитии регионов» в рамках промышленно-инновационного форума «Промтехэкспо-99». - Омск,

1999. - С. 66-67.

3. Новаковский А. С. Применение УФ-спектроскопии для дифференциации микроорганизмов рода Corynebacterium, Mycobacterium, Brucella // Механизмы функциональной активности организма: материалы респ. науч.-практ. конф. поев. 75-летию кафедры физиологии человек! ОГМА. - Омск, 1999. - С. 83-87.

4. Новаковский А.С. Устойчивость С. pseudotuberculosis (R-, S-, I-форм) к у-излучению. // Механизмы функциональной активности организма.: Материалы республиканской научно-практической конференции посвященной 75-летию кафедры физиологии человека Омской государственной медицинской академии. - Омск, 1999. - С. 87-88.

5. Новаковский А.С. УФ-спектрофотометрия как метод диагностики казеозного лимфаденита. // Диагностика, профилактика и лечение заразных и незаразных болезней, вопросы токсикологии, анатомии животных и птиц. - Омск. - 1999. - С. 105-107.

6. Новаковский А.С., Шрайбер JI.3., Трофимов И.Г. Оценка спектральных характеристик штаммов С. pseudotuberculosis по их фено- и генотипическим свойствам. // Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных: материалы междунар. научн,-пракг. конф. поев. 100 летию со дня рождения чл.-кор. ВАСХНИИЛ

B.Т. Котова 19-21 мая 1999 года). - Воронеж, 1999. - С. 166-167.

7. Новаковский А.С., Шрайбер JI.3., Трофимов И.Г. Определение молярного процента гуанина и цитозина по известным спектральным характеристикам и фенотипическим свойствам штаммов

C. pseudotuberculosis. // Природа и природопользование на рубеже XXI века.: материалы межрег. науч.-практ. конф., поев. 90-летию со дня рождения Д.Н. Фиалкова и 75-летию ВООП. - Омск. - 1999. - С. 228230.

8. Околелов В.И., Трофимов И.Г., Новаковский А.С. Диагностика казеозного лимфаденита с помощью УФ-спектроскопии. // Проблемы стабилизации и развития сельскохозяйственного производства Сибири, Монголии и Казахстана в XXI веке. 4.2. Животноводство, ветеринария, кормопроизводство.: Тез. докл. междунар. науч.-практ. конф. (Новосибирск, 20-23 июля 1999 г.) /

Актуальность темы. Накопленный опыт в исследованиях кори-небактериозов предоставляет все больше данных о значительной роли ко-ринебактерий в инфекционных патологиях животных. Corynebacterium pseudotuberculosis вызывает у животных хронически протекающую болезнь - казеозный лимфаденит. В последние годы появились факты, свидетельствующие о том, что данный микроорганизм обладает особым циклом развития и отличается от большинства микроорганизмов возможностью приспосабливаться к внутриклеточным условиям паразитирования. Казеозный лимфаденит широко распространен в странах с развитым овцеводством: Австралии, Новой Зеландии, США, Индии, Аргентине, Румынии, России [H.R. Сагпе (1932); H.R.Carne, С. Cramp (1 932); C.V. Dayus, S.M. Hopkirk (1932); К.Т. Maddy (1953); К.Ф. Ламихов (1954); М.М. Халимбеков и др. (1961); C.Benham, A. Seman, М. Woodbim (1962); М.М. Далгат (1962, 1965); Э.А. Шегедевич (1968, 1969); A.J. Husband, D.L Watson (1977); И.Д. Головко, И.Г.Трофимов (1979); И.Г. Трофимов (1981, 1984, 1988, 1990, 1993, 1994); Н.М. Колычев, И.Г. Трофимов (1993); М.В. Заболот-ных (1989, 1999); М.В. Заболотных., А.С. Крупко (1999)].

Коринебактерии представляют потенциальную угрозу здоровью не только животных, но и человека, так как не исключено заболевание людей в результате их контакта с животными, пораженными данным микроорганизмом.

Вплоть до настоящего времени, несмотря на длительный период изучения данного микроорганизма, нет достаточно надежных прижизненных методов диагностики и мер специфической профилактики вышеназванной болезни. Поиск методов диагностики осложняется недостатком знаний, об этиологии данной инфекции. Это обусловлено тем, что С. pseudotuberculosis отличается широкой вариабельностью фенотипических и генотипических свойств. Известные методы идентификации коринебактерий различных видов весьма трудоемки и при изменчивости возбудителя мало эффективны. В этой связи актуальной является разработка и внедрение в ветеринарную практику новых, более чувствительных методов идентификации коринебактерий, основанных на изучении структурных компонентов микробных клеток, обеспечивающих простоту исследований с высокой информативностью и автоматизацией процесса исследований.

Одним из методов является ультрафиолетовая спектрофото-метрия [М. Orchin, H.H. Jaffe (1960); Ч. Кантор, П. Шиммел (1984); Л.В. Вилков, Ю.А. Пентин (1987)]. Данный метод позволяет наблюдать спектры бактерий в водных растворах, при этом сохраняется целостность и функциональные способности клеток.

В литературе по исследуемому вопросу описано, что с помощью УФ-спектрофотометрии изучались различные биополимеры, такие как нуклеиновые кислоты [С. Tanford et al. (1955)], аминокислоты [D.B. Wetlaufer (1962), H. Wemryb, К. Steiner (1971)], пу-риновые и пиримидиновые основания [D.Voet, et al. (1963), V. Bloomfield et al. (1975)], полипептиды [К. Rosenheck, P. Doty (1961), R. Marcus (1965), J.W. Dovan (1969), J. Birks (1970)].

Тема диссертационной работы вошла самостоятельным разделом в комплексную тему Института ветеринарной медицины ОмГАУ «Разработка методов и средств диагностики, профилактики, мер борьбы с коринебактериозами сельскохозяйственых животных» и имеет номер государственной регистрации 01.9.90.000196.

Цель и задачи исследования. Целью исследований является разработка методики по идентификации и дифференциации кори-небактерий методом УФ-спектрофотометрии.

Для решения этой проблемы поставлены следующие задачи:

• разработка регламента исследования культур коринебак-терий посредством УФ-спектрофотометрии и дальнейшая обработка результатов посредством регрессионного анализа,

• выявление характерных спектров поглощения коринебак-терий для создания банка данных на ЭВМ;

• исследование воздействия у-излучения на различные фе-нотипические формы (R-, 1-, S-) С. pseudotuberculosis, а также поиск оптимальной дозы, необходимой для полной инактивации микроорганизмов этого вида;

• нахождение зависимости между спектральными, геноти-пическими и фенотипическими характеристиками;

Научная новизна.

1. Методом УФ-спектрофотометрии впервые исследованы культуры разных видов коринебактерий. Выявлены оптимальные условия применения предлагаемого метода, установлены характерные линии спектров, посредством которых можно производить идентификацию вышеуказанных микроорганизмов.

2. Впервые изучено воздействие у-излучения на различные фенотипические формы (R-, 1-, S-) С. pseudotuberculosis, а также выявлена оптимальная доза, ведущая к их полной инактивации.

3. Установлена зависимость между спектральными, геноти-пическими и фенотипическими характеристиками.

Теоретическая и практическая значимость работы

1.Выявлена возможность применения УФ-спектрофотометрии для идентификации и дифференциации штаммов внутри вида С. pseudotuberculosis.

2. Изучено воздействие у-излучения на различные фенотипи-ческие формы С. pseudotuberculosis.

3. Предложены методические подходы использования УФ-спектрофотометрии для изучения характеристик коринебактерий независимо от их морфологических и функциональных особенностей.

4. Разработаны тесты для индикации возбудителей казеозно-го лимфаденита в лабораторных исследованиях.

Апробация полученных результатов. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на юбилейной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ОмГАУ (Омск, 1998), межрегиональной научно-практической конференции «Роль инноваций в развитии регионов» в рамках промышленно-инновационного форума «Промтехэкспо-99».(Омск, 1999), международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения члена-корреспондента ВАСХНИИЛ В.Т. Котова «Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных» (Воронеж, 1999), международной научно-практической конференции «Проблемы стабилизации и развития сельскохозяйственного производства Сибири, Монголии и Казахстана в XXI веке (Новосибирск, 1999 г), межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения Д.Н. Фиалкова и 75-летию ВО-ОП «Природа и природопользование на рубеже XXI века», (Омск, 1999). 8

Публикация полученных результатов. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, практических предложений, заключения и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 21 рисунком, 37 таблицами. Список литературы включает 192 источника, из них 87 - отечественных, 105 - зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Ультрафиолетовая спектрофотометрия в диапазоне 190,0ч-305,0 нм позволяют с помощью полученных критериев, дифференцировать исследуемые микроорганизмы на принадлежность к роду Corynebacterium.

2. Использование трех комплексных критериев, характеризующих УФ-спектр, а также найденная многомерная линейная зависимость позволяет определить принадлежность исследуемого микроорганизма к штамму вида С. pseudotuberculosis.

3. Применение полученной для вида С. pseudotuberculosis многомерной линейной зависимости позволяет по шести спектральным и двум фенотипическим характеристикам с приемлемой точностью вычислить значение молярного процента гуанина и ци-тозина для исследуемого микроорганизма.

4. Таксономия микроорганизмов, принадлежащих к виду С. pseudotuberculosis, с использованием норм, применяемых в функциональном анализе, по спектральным характеристикам вце-лом согласуется с делением по генотипическим свойствам.

5. Данные УФ-спектрофотометрии не выявляют однозначных признаков отличия микроорганизмов внутри вида, которые позволили бы объединять их в группы, соответствующие формам существующей классификации по фенотипу.

6. Доза гамма-излучения, необходимая для полной инактивации возбудителей казеозного лимфаденита, принадлежащих к различным фенотипическим группам, составляет 10 кГр. При этом S-формы С. pseudotuberculosis наименее устойчивы к у-излучению, а R-формы проявляют наибольшую резистентность к данному виду воздействия.

125

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Материалы диссертации доложены на методической комиссии ИВМ ОмГАУ. Рекомендованы к производственным испытаниям.

2. На основании результатов проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Применение УФ-спектро-фотометрии для идентификации и дифференциации микроорганизмов рода СогупеЬас1егшт». Рекомендации рассмотрены и одобрены на заседании Ученого Совета ИВМ ОмГАУ от 4 апреля 2000 г., протокол № 5.

3. Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии и инфекционных болезней с/х животных, микробиологии и вирусологии ИВМ ОмГАУ.