Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Ветеринарно-санитарный контроль остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения

На правах рукописи

003446427

Кальницкая Оксана Ивановна

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНЫЙ КОНТРОЛЬ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКОВ В СЫРЬЕ И ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

16.00.06 - Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

2 2 ГЕН 2008

Москва 2008

003446427

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

Научный консультант заслуженный деятель науки РФ, академик РАСХН,

доктор ветеринарных наук, профессор Б.В. Уша (ГОУ ВПОМГУПБ)

Официальные оппоненты доктор ветеринарных наук, профессор В.А. Долгов (ГНУ ВНИИВСГЭ)

доктор ветеринарных наук, профессор В.Е. Абрамов (ФГУ ВГНКИ)

доктор ветеринарных наук, профессор В.И. Белоусов (ФГУ ЦНМВЛ)

Ведущая организация Московская государственная академия ветеринарной

медицины и биотехнологии им. К И Скрябина

Защита диссертации состоится ¿У со 2008 г в часов на заседании Диссертационного совета Д 212 149 03 при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу 109316, г Москва, ул. Талалихина, 33

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ Автореферат разослан О/ 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, профессор / V / ИГ Серегин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Государственная политика, направленная на создание основ биологической безопасности России, передовая концепция здорового питания населения страны предусматривают совершенствование нормативно-методической базы государственного надзора за качеством сырья и продуктов животного происхождения Практические результаты в указанной области могут быть достигнуты при строгом соблюдении ветеринарно-санитарных требований, основанных на современных методах, обеспечивающих научное сопровождение получения высококачественного животноводческого сырья и биологически полноценных продуктов питания

Обеспечение населения доброкачественным продовольствием и здоровое питание - важная и актуальная задача государственного значения Без ее решения невозможна социальная стабильность в обществе и здоровье населения За последние годы в стране, в связи с изменением статуса отечественного рынка, приняты меры по интеграции российской экономики в мировую При решении этой важной государственной задачи учитываются требования экологического и санитарного контроля, возложенного на Россию странами - участницами Всемирной торговой организации Быстрый рост потребления продукции агропромышленного комплекса требует увеличения ее производства и снижения себестоимости, которые достигаются за счет рационального применения антибиотиков и стимуляторов роста (в животноводстве и птицеводстве), гербицидов, инсектицидов, фунгицидов (в растениеводстве)

Отечественные и зарубежные производители сельскохозяйственной продукции, использующие в соответствии со своими технологическими регламентами антибиотики, обязаны гарантировать безопасность полученной продукции для здоровья населения Остаточное содержание этих потенциально опасных химических соединений в готовой продукции не должно быть выше предельно допустимых уровней, определенных нормативной документацией

Снизить риск загрязнения продовольственного сырья и пищевых продуктов антибиотиками можно только при эффективной системе контроля на всех стадиях - от производства до реализации Вследствие этого к методам массового контроля вредных соединений в сырье и продуктах животного происхождения предъявляются жесткие требования - они должны обеспечивать высокую чувствительность, специфичность определения, достоверность и воспроизводимость получаемых результатов (Романенко Г.А., 2004, Донченко ЛВ, Надыкта ВД, 1999, ЕЬЬикЬ НА, 2002, НееБЛеп V/, БиЬгеп в, 1993)

Проблема загрязнения животноводческой продукции антибиотиками является предметом обсуждения, как в национальном, так и в международном масштабах В Российской Федерации действуют «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (СанПиН 2 3 2 107801), в которых регламентируется содержание ряда антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения Однако, несмотря на высокую

актуальность проблемы, комплексная оценка сложившейся ситуации носит фрагментарный характер, сведения о наличии токсикантов и контроль за ними недостаточен Поэтому в настоящее время требуется комплексный подход к решению проблемы получения доброкачественного животноводческого сырья и биологически безопасных продуктов питания

Исследования в данной области отражены в работах отечественных и зарубежных ученых (Дмитриева В.С, Семенов СМ, 1965, Дружинина ЕН, Суворкина ДВ, 1968, Карташова ВМ, 1980; Аксенов В.И, Ковалев ВФ, Виолин БВ, 1988, Демидова ЛД, 1997, Даниленко ВН, 2005, Пономарева Е А, Комаров А А , 2007, Hamann J, Tolle А, Heeschen W, 1975, 1979, Craven N, 1987, Elsheikh HA, Taha AA, Osman J, 2002), которые считают, что поступление в организм человека антибиотиков с пищевыми продуктами крайне нежелательно, поскольку они могут оказывать токсическое действие, приводить к возникновению аллергических реакций, дисбактериозов, циркуляции антибиотико-устойчивых штаммов и другим отрицательным для организма процессам

На сегодняшний день проблема безопасного питания в отношении содержания антибиотиков еще не решена Различия во взглядах на применение антибиотиков в животноводстве и ветеринарии, большое количество методических разработок, нормативных и подзаконных актов определяют важность этой проблемы В связи с этим единый подход к применению лекарственных препаратов, а также научно-обоснованная методология, позволяющая с высокой точностью, чувствительностью и

удовлетворительными метрологическими характеристиками обнаруживать остаточные количества антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения, призваны гарантировать выпуск доброкачественной и безопасной продукции в соответствии с требованиями действующих стандартов и других нормативных документов

Цель работы - усовершенствовать ветеринарно-санитарный контроль за содержанием антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения и предложить пути снижения их остаточных количеств.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи- провести мониторинг сырья и продуктов животного происхождения импортного и отечественного производства по содержанию антибиотиков с применением действующих методов контроля и определить наиболее часто встречающиеся антибиотики,

- подобрать чувствительные тест-культуры микроорганизмов к наибольшему числу антибиотиков, применяемых в ветеринарии и животноводстве;

модифицировать метод микробиологического определения антибиотиков в пробах мяса и молока с помощью чувствительных тест-культур микроорганизмов,

- усовершенствовать способ экстракции антибиотиков из мышечной ткани и молока,

- провести сравнительный анализ чувствительности лабораторных методов выявления антибиотиков в продуктах животноводства (ИФА, ВЭЖХ, микробиологический метод),

- предложить способы технологической обработки продуктов убоя животных и молока в условиях перерабатывающих предприятий с целью уменьшения содержания в них наиболее часто встречающихся антибиотиков,

- теоретически обосновать и разработать ветеринарно-санитарную оценку продукции животноводства при обнаружении остаточных количеств антибиотиков

Научная новизна работы состоит в том, что автором проведены мониторинговые исследования по частоте обнаружения различных антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения отечественного и зарубежного производства

Определены и предложены чувствительные штаммы микроорганизмов в качестве тест-культур для определения в субстрате основных антибиотиков, применяемых в современной ветеринарии и животноводстве

Разработан метод определения антибиотиков в биологических субстратах с использованием штаммов Вас subtihs L2 и Micrococcus luteus АТСС 9341, чувствительных к нескольким наиболее часто применяемым антибиотикам Модифицирована пробоподготовка продуктов животноводства для определения в них остаточных количеств антибиотиков

Изучена в сравнительном аспекте чувствительность методов иммуноферментного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии и микробиологического метода, позволяющих определять наличие антибиотиков в биологических субстратах

Установлена чувствительность микробиологической тест-системы Дельвотест-R (Нидерланды) к широкому ряду антибиотиков, встречающихся в молоке, и определена возможность ее использования при различных уровнях загрязнения молока антибиотиками

Дана научно обоснованная ветеринарно-санитарная оценка мяса и молока, содержащих остаточные количества антибиотиков

Практическая ценность и реализация результатов работы. На основе проведенных мониторинговых исследований выявлена частота обнаружения импортного и отечественного сырья и продуктов животного происхождения, не отвечающих требованиям СанПиН 23 2 1078-01 по содержанию остаточных количеств антибиотиков Материалы мониторинга использованы в плане мероприятий государственной ветеринарной службы г Москвы по исключению из оборота на потребительском рынке столицы животноводческой продукции, содержащей антибиотики

Предложен модифицированный микробиологический метод определения антибиотиков в мясе и молоке с использованием штаммов Bacillus subtihs L2 и Micrococcus luteus АТСС 9341, чувствительных к широкому ряду современных антибиотиков Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации «Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью

штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341» (2005 г) и «Подбор микробиологической тест-системы для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения» (2005 г)

Разработана и апробирована в условиях производственного предприятия ОАО «ТАМП» пробоподготовка продуктов животноводства для определения в них остаточных количеств антибиотиков

Определены антибиотики, которые могут быть обнаружены в молоке с помощью микробиологической системы Дельвотест-R в количествах, регламентированных СанПиН 2 3 2.1078-01. Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации «Чувствительность микробиологической тест-системы ДЕЛЬВОТЕСТ-R к антибиотикам, применяемым в животноводстве и ветеринарии» (2008 г)

Предложены научно обоснованные технологические режимы обработки сырья, обеспечивающие уменьшение остаточных количеств антибиотиков в мясе и молоке. Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации «Ветеринарно-санитарная оценка продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков» (2006 г) и «Снижение содержания остаточных количеств антибиотиков в молоке под действием режимов пастеризации, стерилизации и сквашивания» (2008 г) Материалы исследований рассмотрены Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор) и направлены в Минсельхоз России с рекомендацией включить в новую редакцию «Правил ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов»

Подготовлены и утверждены учебно-методическим объединением по образованию в области технологии сырья и продуктов животного происхождения учебные пособия «Ксенобиотики лекарственного происхождения в продукции животноводства» - М МГУПБ, 2006 - 93 с и «Методы лабораторного контроля животноводческой продукции, содержащей антибиотики» - М МГУПБ, 2006 - 98 с

Материалы диссертации используются в лекциях по курсу «Ветеринарно-санитарная экспертиза», «Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии пищевых производств» для подготовки студентов в МГУПБ по специальностям 11201 - «Ветеринария», 110501 - «Ветсанэкспертиза», 260302 -«Технология мяса и мясопродуктов», 240901 - «Биотехнология», 240902 -«Пищевая биотехнология», 200503 - «Стандартизация и сертификация в пищевой промышленности».

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР МГУПБ «Определение остаточных количеств антибактериальных веществ в продукции животноводства», регистрационный номер 7 - 3 - 06 Код темы по ГРНТИ 68 41 05,62 01 37

Апробация работы Результаты научных и экспериментальных исследований доложены на

- 2-ой научно-практической конференции «Новые фармакологические средства для животноводства и ветеринарии» - Краснодар, 2001,

- 4-ой и 5-ой Международных научно-практических конференциях «Пища Экология Человек» - М, 2001,2003,

- Международной научно-технической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях»-Воронеж, 2002;

- 4-ой и 5-ой Международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» - М , 2002, 2004,

- Международной научно-практической конференции «Состояние и проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в животноводстве» -Чебоксары, 2004;

- 12-ом Международном ветеринарном конгрессе - М, 2004,

- 8-ом Всероссийском конгрессе «Оптимальное питание - здоровье нации» - М,2005,

- Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» - Саратов, 2005,

- Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» - Санкт-Петербург, 2005,

- Международной научно-практической конференции «Пищевые технологии -2005» - Одесса, 2005,

- 3-ем съезде общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова -М, 2005,

- 4-ой Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» - М , 2005,

- Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» - Казань, 2005,

- Всероссийской конференции «Лекарственные средства для животных и корма Современное состояние и перспективы» - М , 2005,

- Симпозиуме «Научное обеспечение инновационных процессов в перерабатывающих отраслях АПК» - М, 2005,

2-ой Международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» - Санкт-Петербург, 2006,

- Международной конференции «Лекарственные средства для животных и корма Современное состояние и перспективы» - М, 2006,

- Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии» - М, 2006,

- 10-ом конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» - М, 2006,

- Международном симпозиуме «Агроэкологическая безопасность в условиях техногенеза» - Казань, 2006,

- Международной научно-практической конференции «Технология и продукты здорового питания» - М , 2006,

- 1-ом Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология проблемы и горизонты» - М , 2006,

- 2-ой Международной научно-практической конференции «Пищевые технологии - 2006» - Одесса, 2006,

- 6-ой Мевдународной научно-практической конференции «Качество, стандартизация, контроль теория и практика» - Ялта, 2006,

- 8-ой Международной научно-практической конференции «Интеграция в мясную промышленность России современных методов управления качеством и прослеживаемости» - М, 2006,

- 6-ой Мевдународной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» - М, 2007

Публикации результатов исследований По материалам собственных исследований опубликовано 46 печатных работ, в которых отражено основное содержание диссертации Из них 2 учебных пособия для подготовки студентов утверждены УМО по образованию в области технологии сырья и продуктов животного происхождения

Объем работы Диссертация изложена на 335 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и практических предложений. Содержит 40 таблиц, 14 рисунков Список литературы включает 286 источников, из них 138 отечественных и 148 зарубежных авторов Основные положения, выносимые на защиту.

• Результаты проведенного мониторинга по изучению частоты обнаружения сырья и продуктов животного происхождения импортного и отечественного производства, содержащих остаточные количества антибиотиков

• Результаты определения чувствительности четырнадцати бактериальных штаммов к девяти антибиотикам, применяемым в ветеринарии и животноводстве

• Научно обоснованная схема подбора микробных тест-культур для определения антибиотиков в продуктах животного происхождения

• Теоретическое обоснование методики определения концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus АТСС 9341.

• Модификация пробоподготовки мяса, молока, яиц для определения содержания в них антибиотиков, применяемых в ветеринарии и животноводстве

• Результаты сравнительной оценки чувствительности и специфичности методов ИФА, ВЭЖХ и микробиологического метода, используемых для определения остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения

• Научное обоснование методов снижения содержания остаточных количеств антибиотиков в мясе и молоке при их технологической обработке

• Ветеринарно-санитарная оценка продукции животноводства, содержащей остаточные количества антибиотиков

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы Работа проводилась в период с 2000 г по 2008 г на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы Московского государственного университета прикладной биотехнологии

Отбор образцов для проведения мониторинговых исследований по обнаружению остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения осуществляли на мясо- и молокоперерабатывающич предприятиях, в лабораториях, в торговой сети.

Пробы мышечной ткани и молока предоставлены ОАО «Таганский мясоперерабатывающий завод», ООО «Герсан» (г Солнечногорск), АО «Леггорн» (г. Тараклия), СХПК «ТОЙСИ» (Чувашская Республика), ООО «Продовольственная корпорация» (г Казань), Пятигорским мясокомбинатом.

Исследованию подвергали мышечную ткань и субпродукты птицы (РФ, Бразилия, Китай, Дания, Канада), крупного рогатого скота (Бразилия, Польша) и свиней (Германия), фарш куриный (Германия, Франция), яйца куриные (РФ), молоко и молочные продукты (РФ, Литва, Болгария), рыбу морскую (РФ) -всего 2075 образцов

Для объективности и полноты картины были проанализированы данные по обнаружению остатков антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения, предоставленные лабораторией санитарии молока и профилактики мастита ГНУ ВНИИВСГЭ, Московской городской ветеринарной лабораторией, ФГУ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве», ЗАО «РОСТЕСТ».

Содержание остаточных количеств антибиотиков определяли микробиологическим методом диффузии в агар (МУ 3049-84), экспресс-методом (МУК 4 2 026-95), методом иммуноферментного анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии (МУК 4 1 1912-04)

Штаммы микроорганизмов Вас subtilis штамм L2, штамм АТСС 6633, штамм 720, Вас pumilus штамм NCTC 8241, Вас cereus АТСС 11778, Вас mycoides 537, St aureus штамм АТСС 6538, штамм 209Р, Micrococcus luteus штамм АТСС 9341, штамм 8340, Micrococcus flavus АТСС 10240, Str thermophilus, Str.faecium, Ecoli АТСС 9637 были получены во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ «ВГНКИ»)

Определяли чувствительность четырнадцати тест-культур к бензилпенициллину, тетрациклину, стрептомицину, неомицину, гентамицину, левомицетину, линкомицину, гризину и бацитрацину Их содержание в животноводческой продукции регламентируется СанПиН 2 3 2 1078-01 и ФАО-ВОЗ

В опытах использовали бумажные диски, содержащие антибиотики, изготовленные из ватмана № 2 в 0,01 н растворе соляной кислоты из расчета 1000 мкг антибиотика в 1 мл (Егоров Н С , 1964)

При приготовлении питательных сред использовали пептон, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, 40 %-ный коммерческий раствор глюкозы («Реахим», Россия).

Питательные среды считали пригодными, если при культивировании получали четкие зоны ингибиции Всего было испытано 15 вариантов питательных сред

Экстракцию антибиотиков из отобранных проб проводили с помощью химических веществ и воздействия температуры Использовали пепсин, панкреатин, серную кислоту, реактив Карреза, ацетон, этилацетат и метанол.

Замораживали образцы мышечной ткани при температуре -18°С, размораживали при комнатной температуре

Сравнивали предложенный нами способ пробоподготовки образцов со способами, изложенными в «Методических указаниях по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства» (МУ 304984) и в методических указаниях «Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорачфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа» (МУК 41.1912-04)

Апробация методики определения концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus АТСС 9341 проведена комиссионно на производственном предприятии ОАО «ТАМП».

Для количественного определения левомицетина и тетрациклина в продуктах питания использовали метод твердофазного конкурентного ИФА на полистироловых планшетах Исследования проводили в условиях Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории МСХ РФ Измерения осуществляли на планшетном фотометре «Униплан» с использованием фильтра, соответствующего длине волны 450 нм Расчеты выполняли в полуавтоматическом режиме по программе «Photo Check».

Использовали тест-системы RIDASCREEN Левомицетин и RIDASCREEN Тетрациклин (ООО «Стайлаб» R-Biopharm) Образцами для определения левомицетина служили говядина жилованная 1 сорта, свинина жилованная 1 сорта, фарш для докторской колбасы высшего сорта, яйцо столовое 1 категории, полученные в СХПК «Тойси» Батыревского района Чувашской Республики Образцами для определения тетрациклина служили пробы молока, отобранные в Тукаевском филиале ООО «Продовольственная корпорация» Республики Татарстан и пробы молока и говядины, в которые искусственно вносили раствор тетрациклина, содержащий 50 мкг/л активного антибиотика

Содержание остаточных количеств левомицетина и тетрациклина в продуктах животного происхождения определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (МУК 41 1912-04) с последующим количественным определением на жидкостном хроматографе с УФ-детектором, обеспечивающим измерение при длине волны 278 нм для левомицетина и 355 нм для тетрациклина Исследования проводили в Московской городской

ветеринарной лаборатории Обработку цифровых данных осуществляли методом корреляционного анализа (Чарыков А К , 1984)

Пробы мяса отбирали по ГОСТ 7269-79 «Мясо Методы отбора проб для органолептического исследования» Всего в экспериментах по определению левомицетина и тетрациклина использовано более 500 образцов животноводческой продукции

Для определения влияния температурной обработки на разрушение антибиотиков в мясе исследовано 140 образцов мышечной ткани крупного рогатого скота, свиней и птицы, полученных в АО «Леггорн» г Тараклия

Убой опытных животных и птицы проводили в различные сроки после введения левомицетина, тетрациклина, гризина, бацитрацина Отбор образцов тканей проводили по ГОСТ 26668-85 Содержание антибиотиков определяли по МУ 3049-84.

Для термической обработки применяли режимы и параметры, утвержденные «Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (1983) Мясо убойных животных проваривали кусками массой не более 2 кг в течение 3 ч при достижении температуры внутри куска не менее 80°С Тушки птицы разрубали вдоль позвоночного столба на две половины и проваривали при 100°С в течение 1 ч

После проварки образцы повторно исследовали на содержание остаточных количеств антибиотиков Исследованию также подвергали бульон, полученный после варки

Для изучения влияния режимов варки колбасных изделий на снижение концентрации антибиотиков в готовой продукции в условиях ОАО «ТАМП» был изготовлен опытный образец колбасы «Закусочной» согласно ГОСТ Р 52196-2003 Говядину для фарша получали от животного, которому при жизни был введен препарат «Тиакат-и» Препарат разработан ВИЭВ и изготовлен на основе окситетрациклина Препарат вводили животному внутримышечно из расчета 0,5 мл на 10 кг живого веса Для изготовления образцов колбасной продукции использовали также говядину жилованную, которую предварительно инъецировали растворами левомицетина, бензилпенициллина, стрептомицина, тетрациклина

С целью изучения влияния промывания и замораживания мяса на снижение в нем остаточных количеств антибиотиков, куски говядины промывали под проточной водой и замораживали в морозильной камере в течение 48 часов при температуре -12°С Говядину предварительно обрабатывали по методу Me Ñamara Р (2002) введением растворов антибиотиков в лимфатические узлы и орошением поверхности Использовали растворы хлортетрациклина в концентрации 10 мг/л, 50 мг/л и 100 мг/л, а также раствор, содержащий 100 мг/л хлортетрациклина и 200 мг/л нистатина (Стекольников ЛИ, 1984) Остаточные количества антибиотиков определяли на поверхности куска, на глубине 1 и 3 см

Для выявления антибиотиков в молоке использовали микробиологическую тест-систему Дельвотест-R (Нидерланды)

Пробы молока были подвергнуты длительной (63-65°С в течение 30 мин), кратковременной (75-80°С в течение 15-20 с) и мгновенной (80-90°С без выдержки) пастеризации каждая в объеме 50 мл, а также кипячению (100°С в течение 3 мин) и промышленной стерилизации Стерилизацию образцов проводили в условиях Юрьев-Польского молочного завода (Владимирская обл) Молоко сначала нагревали паром до 75°С, потом в инжекторе за несколько секунд до 140°С и в течение последующих 4 с выдерживали под высоким давлением.

Для изучения влияния сквашивания на уменьшение содержания остаточных количеств антибиотиков образцы молока сквашивали ацидофильной закваской, после появления сгустка подвергали исследованию

Количественные показатели результатов исследований подвергали вариационно-статистическому анализу с помощью пакета программ Microsoft Excel (2003), Statgraf, Statgraf Plus Достоверность различий устанавливали по методу Стьюдента-Фишера (Плохинский Ш А, 1970)

Результаты исследований получены лично автором Участие соисполнителей отражено в списке опубликованных работ Всех соисполнителей настоящих исследований автор искренне благодарит

Особую благодарность автор выражает научному консультанту за неоценимую помощь в выполнении данной работы

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Частота обнаружения остаточных количеств антибиотиков в животноводческой продукции отечественного и импортного происхождения

Большинство специалистов связывают попадание антибиотиков в пищевые продукты с широким применением лечебных, лечебно-профилактических и ростостимулирующих средств для сельскохозяйственных животных и птицы, а также с несанкционированным использованием антибиотиков для удлинения сроков хранения продуктов питания В настоящее время большую актуальность приобретает вопрос о безопасности животноводческой продукции Исследования показывают, что пищевые продукты в зависимости от качества сырья и технологии его переработки могут содержать различные ксенобиотики, в том числе антибиотики

Во исполнение п 17 постановления Правительства города Москвы № 59-ПП «Об основных направлениях укрепления продовольственной безопасности города Москвы на дальнейшую перспективу» с 2002 по 2005 год нами проводились мониторинговые исследования по обнаружению антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения (табл. 1)

Таблица 1

Частота обнаружения остаточных количеств антибиотиков в продуктах

животноводства

Количество Из них положительных

Объект исследования Антибиотик исследованных

%

проб кол-во

Грудки куриные Тетрациклин 76 14 18,5

Печень куриная Тетрациклин 76 20 26,3

Желудки куриные Тетрациклин 76 46 60,5

Гризин 2 2,6

Фарш куриный Тетрациклин 12 4 33,3

Левомицетин 1 8,3

Мышечная ткань индейки Тетрациклин и 8 72,7

Яйца куриные Тетрациклин 60 17 28,3

Стрептомицин 2 3,3

Левомицетин 1 1,6

Мышечная ткань Тетрациклин 400 32 8,0

крупного рогатого скота

Печень Тетрациклин 400 42 10,5

крупного рогатого скота Левомицетин 3 0,08

Почки Тетрациклин 400 51 12,6

крупного рогатого скота Левомицетин 7 1,8

Мышечная ткань свиней Тетрациклин 160 27 16,9

Печень свиней Тетрациклин 160 27 16,9

Почки свиней Тетрациклин 160 31 19,4

Левомицетин 6 3,8

Молоко Тетрациклин 34 6 17,6

Стрептомицин 12 35,3

Пенициллин 5 14,7

Сметана Тетрациклин 17 4 23,5

Стрептомицин 2 11,8

Пенициллин 2 11,8

Десерт творожный Тетрациклин 8 8 100,0

Сыр твердый Тетрациклин 12 2 16,6

Левомицетин 3 25,0

Стрептомицин 1 8,3

Рыба морская Тетрациклин 13 5 38,8

Всего 2075 391 18,8

Из 2075 исследованных проб в 391 случае (18,8 %) были обнаружены антибиотики, из них тетрациклин - в 344 случаях (16,6 % от всех исследованных образцов), левомицетин - в 21 случае (1,0 %), стрептомицин - в 17 случаях (0,8 %), пенициллин - в 7 случаях (0,3 %), гризин - в 2 случаях (0,01 %). То есть в 88 % случаев обнаружения антибиотиков был выявлен тетрациклин, в 5,4 % - левомицетин, в 4,3 % - стрептомицин, в 1,8 % -пенициллин, в 0,5 %-гризин (рис 1)

907060-вО-К 40т 30-

20У~ 10' 0-

Лз

,- Г^^У,....., ■ ,-

□ % от к-ва выявленных случаев

И % от к-ва всех исследованных проб

тетрациклин левомицетин стрептомицин пенициллин

Рис. 1. Частота обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения в количествах, превышающих МДУ

В продуктах убоя птицы (Бразилия, Китай, Дания, Канада, Германия, Франция, РФ) обнаруживали тетрациклин: в 72,7 % случаев в мышечной ткани индейки, в 18,5 % - в куриных грудках, в 26,3 % - в печени, в 63,1 % - в желудках, в 33,3 % - в фарше. Левомицетин был выделен из фарша куриного в 8,3 % случаев, гризин - из желудков куриных в 2,6 % случаев. Всего в 251 пробе продуктов убоя птицы выявлено 95 случаев превышения допустимого содержания антибиотиков, что составило 37,9 % от числа исследованных проб.

При исследовании 60 шт. яиц куриных (РФ) тетрациклин обнаружили в 17 яйцах (28,3 %), стрептомицин - в 2 яйцах (3,3 %), левомицетин - в 1 яйце (1,6 %). Итого, в 33,2 % случаев яйца куриные содержали антибиотики, несмотря на то, что их не должны получать куры-несушки.

Наибольший удельный вес тетрациклина, возможно, обусловлен тем, что его продолжают давать птице для стимуляции роста, нарушая требования инструкции по применению антибиотиков в ветеринарии.

Мышечная ткань крупного рогатого скота (Бразилия, РФ) содержала тетрациклин в 8 % случаев, печень (Польша) - в 10,5 % случаев, почки (Польша) - в 12,6 % случаев. В печени и почках крупного рогатого скота также был обнаружен левомицетин в 0,08 и 1,8 % случаев соответственно. Всего нами было исследовано 1200 образцов продуктов убоя крупного рогатого скота, из них в 135 образцах (11,2 %) были обнаружены тетрациклин и левомицетин в количествах, превышающих МДУ.

Для исследования продуктов убоя свиней были отобраны 480 проб, в 91 пробе (19,0 %) были обнаружены антибиотики в количествах, превышающих МДУ. Мышечная ткань свиней (Германия, РФ) содержала тетрациклин в 16,9 % случаев, печень (Германия) - в 16,9 % случаев, почки (Германия) - в 19,4 % случаев. Кроме того, в почках свиней был обнаружен левомицетин в 3,8 % случаев.

В 23 пробах молока (РФ) (67,6 %) были обнаружены антибиотики. В 14,7% случаев МДУ превышало содержание пенициллина, в 17,6 % -тетрациклина, в 35,5 % - стрептомицина.

В сметане (РФ) из 17 исследованных образцов в 8 случаях (47,6 %) были выявлены антибиотики, из них в 23,5 % - тетрациклин, в 11,8 % -стрептомицин, в 11,8 % - пенициллин

Десерт творожный (Литва) содержал тетрациклин во всех исследованных пробах - в 100 % случаев

Сыр твердый (Болгария, РФ) содержал в 25,0 % случаев левомицетин, в 16,6 % - тетрациклин, в 8,3 % - стрептомицин Всего в 50 % отобранных образцов отмечено содержание остаточных количеств антибиотиков

В рыбе морской (РФ) был обнаружен тетрациклин в 38,8 % отобранных образцов

На рис 2 отражена степень загрязнения различных продуктов животноводства антибиотиками, наиболее часто применяемыми в ветеринарии и животноводстве.

яянн 100 |

■н яша ■167,6 I

вшш он 50 I

тяшш 047,6

яшшш 388 I

ш^ш ¡7,9

■в 33 3

19

1%отк-ва исследованных проб

20

40

60

80

100

120

Рис. 2. Частота загрязнения сырья и продуктов животного происхождения остаточными количествами антибиотиков

Таким образом, импортное и отечественное сырье и продукты животного происхождения характеризуются различным содержанием антибиотиков - от невыявления до 100 % положительных проб Кроме того, в продуктах обнаруживаются все антибиотики, остаточные количества которых нормируются СанПиН 2 3 2 1078-01

Как видно из таблицы 2 и рисунка 3, антибиотики обнаруживаются и в отечественной, и в импортной продукции Частота загрязнения отечественных и импортных образцов мяса птицы, субпродуктов птицы и мяса свиней сопоставима Отечественная говядина содержит антибиотики в 4 % случаев, импортная в 9,3 %. Отечественный сыр твердый содержит антибиотики в 25 % случаев, тогда как импортный - в 100 %

Таблица 2

Частота обнаружения антибиотиков в животноводческой продукции отечественного и импортного происхождения

Вид продукции Отечественная продукция Импортная продукция

Всего исследовано, проб Загрязненных, проб п % Всего исследовано, проб Загрязненных, проб %

Мышечная ткань пгицы 16 2 ¡2,5 60 12 20

Субпродукты ггтицы 40 17 42,5 112 51 45,5

Мышечная ткань крупног о рогатого скота 100 4 4 300 28 9,3

Мышечная ткань свиней 40 6 15 120 21 17,5

Сыр твердый 8 2 25 4 4 100

ПТИЦЫ

Рис. 3. Частота обнаружения антибиотиков в животноводческой продукции отечественного и импортного происхождения

Установлено, что во всех пробах остаточные количества антибиотиков в несколько раз превышали МДУ, который определен СанПиН 2.3.2.1078-01, тогда как, согласно инструкциям по применению антибиотиков, не разрешается добавлять антибиотики в корм коровам, племенному скоту, курам-несушкам. Кроме того, инструкциями установлены сроки прекращения введения или дачи с кормами антибиотиков за 3-30 суток перед убоем животных. Молоко от коров, которых лечили антибиотиками, не должно поступать в реализацию.

Тот факт, что остаточные количества антибиотиков обнаруживаются в сырье и продуктах животного происхождения, может свидетельствовать о нарушении существующих инструкций по их применению. Проследить причины попадания антибиотиков в импортную продукцию не представляется возможным.

При анализе данных городских лабораторий выявлено 114 случаев превышения содержания антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения (табл 3)

Таблица 3

Антибиотики, обнаруживаемые в продуктах животного происхождения в количествах, превышающих требования СанПиН 2.3.2.1078-01

Объект исследования Страна происхождения Антибиотик Количество положительных проб Место проведения исследований

Грудки куриные Китай Канада Тетрациклин Стрептомицин 33 1 Горветлаборатория

Печень куриная РФ Тетрациклин 14 Горветлаборатория

Фарш куриный Германия Франция Тетрациклин Стрептомицин 3 1 Горветлаборатория ЦГСЭН

Яйца куриные РФ Тетрациклин Стрептомицин 2 2 Горветлаборатория

Яичный порошок Бразилия Тетрациклин Стрептомицин 3 3 РОСТЕСТ

Говядина Бразилия Тетрациклин 10 ЦГСЭН

Печень крупного рогатого скота Бразилия Левомицетин 5 ЦГСЭН Горветлаборатория

Свинина Германия Тетрациклин 16 Горветлаборатория

Говядина б/к замороженная Польша Гризин Бацитрацин 5 1 ЦГСЭН

Молоко РФ Пенициллин Стрептомицин Тетрациклин 3 3 1 РОСТЕСТ

Брынза Болгария Пенициллин Стрептомицин Тетрациклин Левомицетин 2 2 2 2 РОСТЕСТ

Всего 114 случаев

В 14 случаях печень куриная отечественного производства содержала тетрациклин, в 33 случаях грудки куриные (Китай) содержали тетрациклин, в одном случае-стрептомицин

При исследовании фарша куриного в трех случаях обнаружен тетрациклин (Германия), в одном - стрептомицин (Франция)

Яйца куриные отечественного производства содержали тетрациклин в двух случаях и стрептомицин в двух случаях Эти же антибиотики обнаружены в яичном порошке (Бразилия)

В говядине и печени говяжьей (Бразилия) обнаруживали тетрациклин (10 образцов) и левомицетин (5 образцов) В говядине безкостной замороженной (Польша) - гризин (5 образцов), бацитрацин (1 образец) В свинине (Германия)

выявлено 16 случаев содержания тетрациклина в количествах, превышающих МДУ

Молоко отечественного производства содержало пенициллин, стрептомицин, тетрациклин. В брынзе (Болгария) были обнаружены остаточные количества пенициллина, стрептомицина, тетрациклина и левомицетина

Анализ представленных лабораториями данных показывает, что чаще всего остаточные количества антибиотиков обнаруживаются в продуктах убоя птицы импортного и отечественного производства, в говядине и свинине импортного производства, а также в молоке отечественного производства Преобладающее большинство исследованных проб продукции животноводства содержало тетрациклин Реже в образцах продукции обнаруживали остаточные количества левомицетина, стрептомицина, пенициллина, гризина, бацитрацина Результаты проведенного мониторинга по выявлению животноводческой продукции, содержащей антибиотики, показали необходимость совершенствования методологии обнаружения антибиотиков в продуктах убоя, расширения перечня выявляемых антибиотиков и обоснования ветеринарно-санитарной оценки сырья и продуктов животного происхождения, содержащих остаточные количества антибиотиков

Подбор микроорганизмов для определения антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения

Большинство современных микробиологических методов ориентировано на определение антибиотиков, МДУ которых нормируется СанПиН -пенициллин, тетрациклин, левомицетин, стрептомицин, гризин, бацитрацин, в то время как в современном животноводстве и ветеринарии используется около 50 антибиотиков и их миксов

Мы изучили чувствительность микроорганизмов к основным антибиотикам, используемым в ветеринарии и животноводстве, с целью подобрать унифицированные тест-культуры к наибольшему количеству антибиотиков Показателем чувствительности микроорганизма к антибиотику служил диаметр зоны задержки микробного роста вокруг бумажного диска

Тестирование четырнадцати микроорганизмов дало возможность обозначить наиболее чувствительные виды и штаммы по отношению к изучаемым антибиотикам (содержание активного вещества 0,1 мкг/мл)

Штамм В виЬЫ« Ь2 оказался высокочувствительным ко всем антибиотикам (диаметр зоны 17 мм и более), за исключением левомицетина (14 мм) и бацитрацина (13 мм) Штамм В виОДк АТСС 6633 проявил высокую чувствительность к тетрациклину, неомицину, гризину, бацитрацину (диаметр более 19 мм) и меньшую чувствительность к бензилпенициллину, гентамицину, линкомицину, левомицетину (13-14 мм) Аналогична чувствительность к антибиотикам и у штамма ВвиЬЫк 720 Штамм Всегеш АТСС 11778 высокочувствителен к тетрациклину, левомицетину, гризину (диаметр зоны 22 мм), но к остальным изученным антибиотикам менее чувствительный Штамм

В mycoides 537 оказался умеренно чувствительным ко всем используемым антибиотикам Штамм В pumilus NCTC 8241 проявил среднюю чувствительность (диаметр зоны 16-20 мм) Оба штамма S aureus 209-Р и АТСС 6538 одинаково высокочувствительны к концентрации изучаемых антибиотиков, содержащейся в бумажных дисках (16-20 мм) Три изученных штамма М luteus - АТСС 9341, АТСС 10240, 8340 незначительно различались по чувствительности к антибиотикам, но самым высокочувствительным оказался М luteus АТСС 9341 (19-24 мм) Зоны задержки роста вокруг дисков, пропитанных антибиотиками, у штаммов стрептококков Str thermophilus и S faecium примерно одинаковы (14-20 мм) Грамотрицательный штамм Е coli АТСС 9637 малочувствителен к таким антибиотикам, как бензилпенициллин (диаметр зоны 9 мм), линкомицин (9 мм), бацитрацин (9 мм)

Исходя из полученных результатов, для дальнейших исследований были использованы штаммы со стабильной высокой чувствительностью к антибиотическим препаратам Пределы чувствительности изученных микробных культур к девяти антибиотикам, наиболее часто применяемым в ветеринарии и животноводстве, представлены в таблице 4

Таблица 4

Нижний предел чувствительности микробных культур к антибиотикам

Антибиотик Концентрация антибиотика в питательной среде, ед/мл, мкг/мл

В suMis L2 В m>coidcs 537 В pumilus NCTC «241 S aureus 209 P S aureus ATCC 6338 M luteus ATCC 9341 Str leirath philus Str faecium

Пенициллин (не допускается)» 0,01 1 0,5 0,1 0,1 100 0,1 1

Тстршжклнн (не допускается) 0,01 5 0,1 0,1 0,5 0,1 5 100

Неомицин (0 5 мг/кг) 0,1 0,1 0,5 0,5 1 1 100 5

Гектамнцин (0 1чг/кг) 0,01 1 001 5 5 0,5 1 100

Стрептомицин (не допускается) 0,1 1 0,1 0,1 0,5 1 5 10

Левочицстнн (не допускается) 0,1 0,1 0,1 10 10 0,01 0,01 0,1

Ликкочкшш (0 1 иг/кг) 0,1 5 100 10 100 1 100 100

Гриэнн (не допускается) 0,1 1 05 10 10 100 10 100

Бацитраш« (не допускается) 0,5 1 0,5 5 10 0,01 100 100

» В скобках указаны максимальные уровни остатков антибиотиков, допускаемые в продуктах убоя согласно СанПиН 2 3 2 1078-01 и рекомендаций ФАО- ВОЗ

Штамм В зиЫПгс Ь2 является одновременно чувствительным к наличию в среде предельно допустимых количеств тетрациклина, неомицина, гентамицина, стрептомицина, линкомицина, бензилпенициллина и гризина, охватывая, таким образом, достаточно широкий спектр антибиотиков Таким образом, штамм В зиЬЫгс Ь2 может быть использован в качестве тест-культуры для обнаружения перечисленных антибиотиков Для определения наличия в

субстрате левомицетина и бацитрацина может быть использован штамм М Iuteus АТСС 9341, как наиболее чувствительный У остальных изученных микроорганизмов степень чувствительности ниже требуемой

Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения микробиологическим методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus АТСС 9341

На основании данных, полученных при изучении чувствительности различных штаммов микроорганизмов к нарастающим концентрациям изучаемых антибиотиков, разработана методика, позволяющая определять антибиотики в продуктах животного происхождения

Сущность метода заключается в том, что адсорбирующие бумажные диски, смоченные изучаемым субстратом и растворами антибиотика различной концентрации, размещаются на поверхности агаризированной питательной среды, содержащей тест-культуру к изучаемому антибиотику Рост тест-культуры при термостатировании приводит к помутнению агара Отсутствие помутнения вокруг диска с изучаемым образцом (зона отсутствия роста, зона задержки роста) свидетельствует о наличии в изучаемом субстрате антибиотического вещества Размер зоны отсутствия роста сравнивается с размером зоны отсутствия роста вокруг дисков, содержащих различные концентрации антибиотика

Для обнаружения в субстрате тетрациклина, неомицина, гентамицина, стрептомицина, линкомицина, гризина, бензилпенициллина был использован штамм В subtilis L2 Штамм М luteus АТСС 9341 был использован для обнаружения левомицетина и бацитрацина

Для построения стандартных кривых и расчета концентрации антибиотиков составлена таблица роста штаммов В subtilis L2 и М luteus АТСС 9341 вокруг бумажных дисков, содержащих различные концентрации антибиотиков (табл 5)

Таблица 5

Рост штаммов В эиЬЫю Ь2 и М.Ыеив АТСС 9341 вокруг бумажных дисков, пропитанных различными концентрациями антибиотиков

Диаметр зоны задержки роста штаммов, мм

Антибиотик 0,001мкг/мл 0,01мкг/мл 0,1мкг/мл 1,0мкг/мл

В subtilis L2

Бензилпенициллин 9,2 ± 1,0 10,3 ±0,8 17,5 ±0,6 24,3 ± 0,7

Тетрациклин 9,3 ± 1,0 17,2 ±0,5 23,5 ± 0,4 23,5 ± 0,4

Неомицин 9,5 ±0,5 18,3 ±1,0 20,0 ±0,6 22,2 ± 0,9

Гентамицин 9,3 ± 0,5 14,3 ± 0,3 18,5 ±0,9 21,4 ±0,3

Гризин 10,2 ±0,5 14,3 ±0,6 20,3 ± 0,2 22,5 ± 0,6

М luteus АТСС 9341

Левомицетин 10,5 ± 0,6 18,6 ±0,5 21,1 ±0,2 26,2 ± 0,2

Бацитрацин 10,1 ±0,3 17,5 ±0,2 21,3 ±0,5 27,2 ± 0,5

На основании измерений диаметров зон задержки роста тест-культур построены стандартные кривые для определения концентраций бензилпенициллина, тетрациклина, неомицина, гентамицина, левомицетина, гризина, бацитрацина с помощью штаммов В БиЬЫ^ Ь2 и М 1и1еиз АТСС 9341 (рис 4,5)

- Беюмпленициллин

- Тетрациклин

—Ж— Гризин

Содержание антиоиотика в растворе мкг/мл

Рис. 4. Стандартные калибровочные кривые роста штамма В.БиЬЫк Ь2 в присутствии различных концентраций антибиотиков

-Леаомицетин

-Бацитрацж

Содержание антибиотика в растворе икг/ил

Рис. 5. Стандартные калибровочные кривые роста штамма М.Шеш АТСС 9341 в присутствии различных концентраций антибиотиков

Стандартные кривые роста штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus АТСС 9341 рекомендованы нами для определения концентрации антибиотиков в изучаемом субстрате

Результаты исследований по определению концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus АТСС 9341 апробированы в условиях производственной лаборатории Таганского мясокомбината (акт исследований от 27 03 05)

Сравнительный анализ и совершенствование пробоподготовки образцов

мышечной ткани

Для выбора наименее трудоемкого и наиболее быстрого способа извлечения антибиотиков было изучено влияние различных химических веществ на мышечную ткань Для этого образцы мышечной ткани, полученный от опытных животных, которым вводили известный антибиотик, подвергали воздействию различных химических веществ и температуры и проводили сравнительный анализ Степень извлечения антибиотиков определяли по диаметру зоны задержки роста тест-культур вокруг бумажных дисков, пропитанных элюатами С целью исключения влияния самих химических веществ на рост тест-культур ставили контрольные опыты, в которых воздействию химических веществ подвергалась мышечная ткань, свободная от антибиотиков

Сначала сравнивали действие буферного раствора и дистиллированной воды, а также выдержки проб в термостате при 37°С и интенсивного встряхивания в шуттель-аппарате

Установлено, что степень диффузии антибиотика в агар не изменялась при добавлении дистиллированной воды, которой заменили буферный раствор Также не установлено значительной разницы в степени извлечения антибиотиков из проб мышечной ткани, если заменить термостатирование образцов в течение 90 мин при температуре 37°С на интенсивное встряхивание в течение 10 мин в шуттель-аппарате

С целью депротеинизации к мышечной ткани добавляли пепсин, для разрушения мышечных волокон пробы подвергали заморозке и оттаиванию. На извлечение антибиотиков большее влияние оказывало добавление 2 %-ного раствора пепсина, чем заморозка до -8°С. Возможно, после оттаивания проб какая-то часть антибиотиков удаляется с мышечным соком

С целью увеличения экстракции антибиотиков к образцам мышечной ткани добавляли серную кислоту, реактив Карреза, ацетон и метанол

Установлено, что добавление 1 %-ного раствора серной кислоты привело к уменьшению степени диффузии всех антибиотиков в агар По сравнению с образцами, которые не подвергались воздействию кислоты, диаметр зоны задержки роста тест-культур уменьшился для тетрациклина приблизительно на 5%, левомицетина - на 6 %, неомицина - на 6 % По-видимому, экстракция антибиотиков из мышечной ткани протекает лучше в щелочной и нейтральной среде, чем в кислой

Добавление к образцам реактива Карреза привело к незначительному увеличению диффузии антибиотика в агар и увеличению диаметра зоны задержки роста тест-культур (на 5 %).

Добавление к гомогенизату ацетона в соотношении 1:1 привело к увеличению диаметра зоны задержки роста тест-культур для тетрациклина с 23,5±0,5 мм до 27,5±0,2 мм («17%), для левомицетина - с 23,5±0,3 мм до 26,9±0,5 мм («15%), для неомицина-с 20,0±0,0 мм до 22,3±0,0 мм (11,5%).

Добавление метанола в соотношении !:! практически не изменило степень диффузии антибиотиков в агар.

При исследовании контрольных образцов, которые не содержали антибиотиков, задержки роста тест-культур вокруг дисков не наблюдалось.

Таким образом, опытами установлено, что характер предварительной обработки образцов мышечной ткани оказывает влияние на степень извлечения антибиотиков. Наибольшее извлечение антибиотиков наблюдалось при добавлении к образцам ацетона в соотношении 1:1, наименьшее - при добавлении 1%-ного раствора серной кислоты и при заморозке образцов в течение 12 ч при температуре -8°С (рис. 6).

Термостатирование образцов при 37°С в течение 90 мин, добавление 2%-ного раствора пепсина, реактива Карреза и метанола незначительно влияло на степень извлечения антибиотиков из мышечной ткани и диаметр зоны задержки роста тест-культур.

Ндистил.вода Озамораж.

Рис. 6. Влияние предварительной обработки образцов мышечной ткани на степень извлечения антибиотиков

Исходя из полученных результатов, нами предложен метод пробоподготовки образцов мышечной ткани, который заключается в следующем: пробу без предварительного нагревания необходимо

гомогенизировать в ступке, добавить дистиллированной воды в соотношении 1 2 и перемешать в шуттель-аппарате в течение 10 мин Для более полного экстрагирования добавить к пробе ацетон в соотношении 1 1 и подвергнуть повторному встряхиванию в шуттель-аппарате в течение 10 мин. Затем пробу необходимо центрифугировать при 3000 об/мин в течение 10 мин После испарения ацетона полученная проба (водная фаза) готова к исследованию

При сравнении результатов, полученных методом иммуноферментного анализа, концентрация левомицетина в образцах, подготовленных по методике, разработанной нами, составила в говядине 0,06310,002 мг/кг, свинине -0,06510,002 мг/кг, фарше - 0,062+0,003 мг/кг, яйцах - 0,051+0,004 мг/кг Концентрация левомицетина в образцах, подготовленных по МУК 4 1 1912-04 составила соответственно 0,064Ю,002, 0,068Ю,002, 0,062Ю,001, 0,0510,003 мг/кг

Аналогичные результаты были получены при исследовании методом ИФА проб молока и говядины, в которые искусственно вносили раствор тетрациклина, содержащий 50 мкг/л активного антибиотика Концентрация тетрациклина в образцах, подготовленных по МУК 4 1 1912-04, составила в говядине 0,04410,001 мг/кг (степень извлечения антибиотика 88 %), в молоке -0,043Ю,002 мг/кг (86 %), а при пробоподготовке, разработанной нами, соответственно 0,041Ю,002 мг/кг (82%) и 0,04610,002 мг/кг (92%)

Результаты, полученные с использованием обоих методов пробоподготовки, сопоставимы Это позволило предположить, что для постановки ИФА возможно применение пробоподготовки, разработанной нами Кроме того, следует учитывать, что подготовка проб по МУК 4 1 1912-04 более трудоемкая, дорогостоящая и длительная, тогда как разница в полученных результатах незначительная

При определении левомицетина и тетрациклина методом ВЭЖХ с использованием пробоподготовки образцов по МУК 41 1912-04 были получены более высокие результаты (в среднем выше на 20 %), чем при использовании пробоподготовки, разработанной нами По-видимому, исключение некоторых этапов экстрагирования и обезжиривания привело к тому, что содержание антибиотиков в образцах, которые готовились к исследованию по методике, разработанной нами, оказалось ниже Это позволяет сделать вывод о том, что пробоподготовка, разработанная нами, менее эффективна при определении антибиотиков методом ВЭЖХ

При определении антибиотиков микробиологическим методом результаты, полученные с использованием пробоподготовки, разработанной нами, практически не отличались от результатов, полученных при обработке образцов с применением пробоподготовки по МУК 3049-84 (табл 6) Следовательно, разработанная нами пробоподготовка не уступает по эффективности методике, рекомендованной МУК 3049-84, может быть использована для определения антибиотиков микробиологическим методом, кроме того, позволяет экономить время и реактивы

Таблица 6

Содержание левомицетина и тетрациклина в образцах продукции

Образец А Б Концентрация антибиотиков, мг/кг (М±ш)

ИФА ВЭЖХ Микробиологический метод

1 2 1 2 1 2

Говядина л 0,064±0,002 0,063±0,002 0,071±0,001 0,051±0,004 0,07010,003 0,05810,003

Свинина Л 0,068±0,002 0,065±0,002 0,06510,001 0,050±0,002 0,06010,003 0,05010,006

Фарш Л 0,06210,001 0 062±0,003 0,067±0,003 0 052±0 001 0,05010,004 0,05010 006

ЯпЦО Л 0,05010,003 0,051±0,004 0,055±0,001 0,045±0 003 0,05010,006 0,04010,008

Молоко № 1 т 0 15010,001 0,170±0,002 0,25510,002 0,15010,005 0 22010,007 0,20010,003

Молоко № 2 т 0,043±0,002 0,046±0,002 0 047±0,002 0,04010,002 0,04010,002 0,04 (НО 004

Говядина искусственно загрязненная т 0,044±0,001 0,041±0,002 0,04510,003 0,04110 003 0,04010,003 0,05010,002

1 - подготовка образцов к исследованию по МУК 4 1 1912-04 и 3049-84

2 - подготовка образцов к исследованию по методике, разработанной нами Л — левомицетин, Т-тетрациклин

Статистическая обработка данных позволила определить, что отличия в концентрации антибиотиков, полученные с помощью различных методов, не превышают 10%-ный уровень То есть, совпадение результатов при использовании изученных методов очень высокое

Следует отметить, что на сегодняшний момент методом ИФА и ВЭЖХ возможно определять только остаточные количества левомицетина и тетрациклина, тогда как на практике применяется около 50 антибиотиков и их миксов Преодолеть эти недостатки позволяет микробиологический метод, для которого нами усовершенствована пробоподготовка, занимающая 1,5 - 2 часа, и с помощью которого можно определять методом подбора тест-культур остаточные количества любых антибиотиков, в том числе современных

Определение остаточных количеств антибиотиков методом иммуноферментного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии и микробиологическим методом в сравнительном аспекте

Разработка новых и модификация существующих методов определения антибиотиков, пригодных для массовых исследований, необходима для более полного изучения содержание антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения, сопоставления данных, полученные в разных лабораториях, оценки существующей проблемы и принятия мер, обеспечивающих сохранность здоровья населения

Для сравнения чувствительности методов ИФА, ВЭЖХ и микробиологического метода изучению на содержание остаточных количеств антибиотиков подвергались образцы молока, искусственно загрязненные различным количеством левомицетина и тетрациклина (от 0,00001 мг/кг до 1,0 мг/кг)(табл 7)

Таблица 7

Частота обнаружения различными методами остаточных количеств левомицетина и тетрациклина в искусственно загрязненных образцах

молока

Пробы молока Количество положительных проб

Количество внесенного антибиотика, мг/л Количество исследуемых образцов ВЭЖХ ИФА Микробиологический метод

Л Т Л т Л т

0,000001 10 - - - - - -

0,00001 10 - - 10 10 - -

0,0001 10 - . 10 10 . -

0,001 10 4 5 10 10 1 3

0,01 10 10 10 10 10 10 10

0,1 10 10 10 10 10 10 10

1,0 10 10 10 10 10 10 10

Л - левомицетин, Т - тетрациклин

Как видно из таблицы 7, предел чувствительности для метода ВЭЖХ и микробиологического метода составляет 0,01 мг/кг, а для метода ИФА -0,00001 мг/кг антибиотика, что совпадает с данными большинства литературных источников

С помощью метода ВЭЖХ только в 4-х образцах из 10-ти (40 %) был обнаружен левомицетин и в 5-ти образцах из 10-ти (50 %) тетрациклин в концентрации 0,001 мг/кг С помощью микробиологического метода левомицетин в концентрации 0,001 мг/кг был обнаружен в 1-ом образце из 10-ти (10 %), а тетрациклин в 3-х образцах из 10-ти (30 %) Более низкие концентрации левомицетина и тетрациклина с помощью этих методов не обнаруживались

Следовательно, ВЭЖХ и микробиологический метод определения остаточных количеств антибиотиков могут быть использованы для определения левомицетина и тетрациклина в концентрации, обусловленной требованиями СанПиН 2 3 2 1078-01 Пограничное содержание левомицетина и тетрациклина в концентрации ниже 0,01 мг/кг может быть определено с помощью метода ИФА Микробиологический метод определения антибиотиков, как наиболее доступный, может использоваться для скрининговых целей

Ветеринарно-санитарная оценка продуктов убоя, содержащих антибиотики

«Правила ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (1983 г.) не содержат рекомендаций по ветсанэкспертизе продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков Даны лишь следующие указания запрещается

отправлять на убой животных, которым применяли антибиотики, в течение срока, указанного в наставлениях по применению их в ветеринарии (п I 4) В случае вынужденного убоя животных, подвергшихся отравлению ядовитыми веществами химического происхождения, решение о возможности использования в пищу мяса от таких животных принимается в каждом отдельном случае, с учетом степени и клинических признаков отравления животных, токсичности и остаточного количества яда, вызвавшего отравление (п 91)

В таких случаях бактериологические и физико-химические исследования не способны решить вопрос о дальнейшей реализации продуктов убоя Необходимо определять остаточные количества антибиотиков (их МДУ нормируются СанПиН 2 3 2 1078-01), а также принимать решение об использовании продуктов убоя, полученных от таких животных

Нами исследованы 140 образцов мышечной ткани крупного рогатого скота, свиней и птицы по следующей схеме введение антибиотиков опытным животным, птице согласно наставлениям по применению препаратов -» убой опытных животных, птицы в различные сроки после введения препарата, отбор образцов по ГОСТ 26668-85 -» исследование образцов на содержание антибиотиков по МУ 3049-84 —> термическая обработка образцов —» повторное исследование на содержание антибиотиков образцов и бульона, полученного после варки Результаты исследований представлены в таблице 8

Таблица 8

Содержание антибиотиков в мышечной ткани животных и птицы до и

после проварки

Вид животно* Го Антибиотик Содержание в сырой мышечной ткани (100%) Содержание в мышечной ткани после варки (М±ш) Содержание в бульоне (М±т) Разрушено (М±т)

иг/кг мг/кг % мг/кг % %

Крупный рогатый скот Тетрациклин п=8 0,4±0,12 0,04±0,01 9,2±3,1 0,28±0,05 70,0±2,9 20,8±4,0

Левомицетин, п=6 0,3±0,05 0,03±0,01 11,3±2,9 0,21 ±0,03 67,5±3,0 21,2±3,9

Свиньи Тетрациклин п=10 0,98±0,05 0,01 ±0,001 8,9±2,6 0,72±0,07 71,3±4,0 19,8±3,3

Левомицетин, п=6 0,65±0,04 0,08±0,005 12,0±3,0 0,45±0,04 70,0±1,1 18,0±5,8

Птица Тетрациклин, п=30 0,5±0,01 0,045±0,01 9,0±2,6 0,36±0,04 71,2±2,9 19,8±4,1

Левомицетин, п=30 0,5±0,02 0,055+0,01 11,7±1,9 0,34±0,03 69,0±1,5 19,3±2,0

Гризин, п=30 0,25±0,05 0,01 ±0,0 5,9+1,6 0,17±0,03 76,0±3,4 18,1±2,8

Бацитрацин, п=20 0,2±0,04 0,015±0,0 7,3±3,0 0,15±0,03 78,2±2,2 14,5+2,1

В результате термической обработки в мышечной ткани животных и птицы значительно снижается содержание антибиотиков В основном из мышечных волокон антибиотик вместе с мясным соком переходит в бульон, часть препарата разрушается под действием высоких температур

По сравнению с исходным количеством в мышечной ткани после варки остается от 5,9 % (гризин в мясе птицы) до 11,7 % (левомицетин в мясе птицы) антибиотиков В бульон переходит около 70 % первоначального содержания антибиотиков Приблизительно 20 % разрушается в результате проварки, либо переходит в соединения, которые микробиологическим методом не определяются

Для определения влияния процесса изготовления колбас на содержание антибиотиков в готовом продукте в условиях ОАО «ТАМП» был изготовлен опытный образец вареной колбасы «Закусочной» (ГОСТ Р 52196-2003) из говядины, в 1г которой содержалось 1,0+0,006 мкг окситетрациклина, что в 100 раз превышало требования СанПиН 2 3 2 1078-01 В сыром фарше содержание окситетрациклина составило 0,73+0,01 мкг/г. Уменьшение количества антибиотика в фарше по сравнению с говядиной объясняется разбавлением мышечной ткани шпиком, крахмалом и другими ингредиентами, добавляемыми по рецептуре

В готовой колбасе «Закусочной» содержание окситетрациклина после варки равнялось 0,65±0,009 мкг/г, что составило 89 % от исходного содержания в фарше Таким образом, снижение концентрации антибиотика в готовом изделии оказалось незначительным

Для изготовления образцов колбасной продукции использовали также говядину жилованную, которую предварительно инъецировали растворами следующих антибиотиков левомицетина, бензилпенициллина, стрептомицина, тетрациклина

Образцы продуктов были подвержены всем технологическим операциям, которые используются для изготовления колбас вареных В таблице 9 отражено содержание антибиотиков в фарше и опытных образцах, изготовленных из него

Таблица 9

Влияние технологических параметров варки на снижение антибиотиков в готовом изделии (п=6)

Объект исследования Содержание антибиотиков, мкг/г, (М±ш)

Левомицетин Бензил-пенициллин Стрептомицин Тетрациклин

В сыром фарше 1,00+0,02 0,6510,01 0,70±0,05 1,5010,01

В готовом изделии 0,92+0,07 0,58±0,02 0,6410,08 1,3210,04

В % к начальному содержанию 93% 89% 90% 89%

Во всех образцах колбасных изделий содержание антибиотиков не опускалось ниже 89 % от исходного содержания в фарше. Полученные данные позволяют предположить, что варка колбасных изделий с использованием горячего пара в термических камерах не приводит к значительному разрушению антибиотиков и не может быть рекомендована для использования мышечного сырья с содержанием антибиотиков в концентрациях, превышающих предельно допустимые. В отличие от проварки мышечного сырья кусками в ваннах или автоклавах, при изготовлении вареных колбас не образуется бульон, в который могла бы уходить большая часть антибиотиков

Для изучения влияния промывания, замораживания и оттаивания мяса на снижение содержания антибиотиков мы воспроизводили методику Me Ñamara Р (2002) и вводили в лимфатические узлы говядины сразу после убоя растворы хлортетрациклина и нистатина различной концентрации Этими же растворами орошали говядину. В каждом куске обработанной говядины определяли содержание остаточных количеств антибиотиков (табл 10)

Таблица 10

Остаточные количества антибиотиков в говядине охлажденной

Концентрация раствора вводимого антибиотика Остаточные количества антибиотиков, мг/кг, (М±ш)

Введение в лимфоузлы Орошение куска

Хлортетрациклин, 10 мг/л 0,76 ±0,003 0,5 8 ±0,010

Хлортетрациклин, 50 мг/л 4,45 ± 0,050 4,21 ±0,020

Хлортетрациклин, 100 мг/л 8,94 ±0,010 7,62 ± 0,090

Нистатин, 10 мг/л 0,64 ±0,017 0,57 ±0,024

Нистатин, 50 мг/л 4,12 ±0,060 4,00 + 0,003

Нистатин, 100 мг/л 6,90 ± 0,030 5,77 ±0,015

X + Н, 100 мг/л + 200 мг/л 24,03 ±0,210 20,12 ±0,050

При применении раствора с концентрацией активного антибиотика 10 мг/л в охлажденной говядине содержалось 0,76 ± 0,003 мг/кг (при введении в лимфоузлы) и 0,58 ± 0,01 мг/кг (при орошении) хлортетрациклина, что превышало требования СанПиН 2 3 2 1078-01 При применении более высоких концентраций растворов антибиотиков (50, 100, 200 мг/л) остаточные количества превышали допустимые показатели в сотни и тысячи раз

После промывания проточной водой в кусках говядины, которые обрабатывались введением раствора хлортетрациклина (концентрация 10 мг/л) в лимфатические узлы, содержание антибиотика было выше, чем в кусках, которые орошались раствором К аналогичным результатам привело замораживание кусков (рис 7)

После промывания говядины, обработанной введением раствора антибиотика в лимфатические узлы, содержание хлортетрациклина снизилось на 12 % В говядине, которую орошали раствором антибиотика, содержание хлортетрациклина снизилось на 25 %

После замораживания

Рис. 7. Динамика снижения хлортетрациклина в говядине после промывания и замораживания

После замораживания содержание антибиотиков снизилось на 23 % в говядине, обработанной введением раствора антибиотика в лимфатические узлы, и составило 0,44±0,003 мг/кг хлортетрациклина, и на 21 % в говядине, которую орошали раствором антибиотика, и составило 0,40+0,040 мг/кг хлортетрациклина.

Таким образом, последовательное промывание, замораживание и оттаивание говядины позволили снизить в ней исходное количество хлортетрациклина на 34-46 % в зависимости от способа взедения антибиотика.

Ветеринарно-санитарная оценка молока, содержащего антибиотики

Для обнаружения в молоке и молочных продуктах остаточных количеств антибиотиков наиболее широкое распространение получил тест-микроб Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C-953, который используется в тест-системе под названием Дельвотест-R (Нидерланды). Однако в наставлении по применению указана чувствительность тест-системы только к пенициллину, в то время как на практике применяется около 20 антибиотиков.

Для расширения возможностей использования тест-системы Дельвотест-R мы определяли чувствительность культуры Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C-953 к различным антибиотикам.

Результаты определения нижнего уровня чувствительности Дельвотест-R к антибиотикам отражены в таблице 11.

Таблица 11

Нижний предел чувствительности Дельвотест-R к антибиотикам

Антибиотик Нижний уровень чувствительности, мг/л

Левомицетин 0,5

Пенициллин 0,002

Тетрациклин 0,01

Линкомицин 0,04

Эритромицин 0,01

Олеандомицин 0.6

Полимиксин 0,1

Рифамицин 0,08

Неомицин 0,007

Гентамицин 0,005

Стрептомицин 0,04

Как видно из таблицы 11, тест-микроб Bacillus stearothermophilus var calidolactis C-953 высокочувствителен к наличию в молоке пенициллина, неомицина, гентамицина, тетрациклина, эритромицина

К остальным антибиотикам Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C-953 проявил среднюю (линкомицин, рифамицин, стрептомицин) или низкую (олеандомицин, полимиксин, левомицетин) чувствительность В их присутствии тест-система Дельвотест-R изменяет цвет при концентрациях антибиотиков, в несколько раз превышающих максимально допустимые уровни Чтобы учесть следовые количества таких антибиотиков в молоке, результаты, полученные с помощью тест-системы Дельвотест-R, должны подтверждаться дополнительными методами

С целью изучения влияния температурных режимов на уменьшение содержания антибиотиков в молоке использовали образцы с естественным фоном загрязнения антибиотиками и с искусственным внесением пенициллина, тетрациклина, стрептомицина и левомицетина

Пробы молока были подвергнуты длительной, кратковременной и мгновенной пастеризации После охлаждения в каждой пробе определяли остаточное количество антибиотика и сравнивали с первоначальным содержимым в сыром молоке Результаты проведенных исследований представлены в таблице 12

Как видно из таблицы 12, пастеризация оказывает незначительное разрушительное действие на содержание антибиотиков в молоке После нее в молоке остается 74-100 % от исходного содержания антибиотика Максимально снижается количество антибиотиков при режиме длительной пастеризации (63 -65°С в течение 30 мин) - на 14-26 %, при использовании кратковременной (75 -80°С в течение 15 - 20 с) и мгновенной (80 - 90°С без выдержки) пастеризации исходное количество антибиотиков снижается на 0-20 %

Из-за частичного свертывания белков и образования солей на поверхности чанов образуется осадок - молочный камень (пригар) Возможно, его образование и способствует уменьшению остаточных количеств

антибиотиков в молоке, которые частично денатурируют и образуют белково-солевые комплексы, оседающие на стенках

Таблица 12

Влияние режимов пастеризации на снижение количества антибиотиков в

молоке

Пробы молока Исходное содержание антибиотиков,мг/л Остаточное содержание антибиотиков в молоке

Длительная пастеризация Кратковременная пастеризация Мгновенная пастеризация

мг/л (М±ш) % мг/л (М±ш) % мг/л (М±т) %

Естественный фон,п=15 0,009±0,0002 0,00710,001 77,7 0,00910,010 100 0,009Ю,001 100

Пенициллин, п=10 0,100±0 003 0,08010 005 80 0 080Ю 002 80 0,09010,003 90

Тетрациклин, п=10 0,500±0,002 0,37010,010 74 0,42010 020 84 0,40010,010 80

Стрептомицин, п=10 0,05 0±0,002 0,03910,008 78 0,04110,005 82 0,04010,010 80

Левомицетин, п=10 1,00010,005 0,860М,005 86 0,90010 010 90 0,90010,002 90

Снижается при режимах 14-26% 0-20% 0-20 %

Результаты статистической обработки данных по содержанию остаточных количеств антибиотиков в образцах молока, подвергнутых кипячению и стерилизации, представлены в таблице 13

Таблица 13

Влияние кипячения и стерилизации на снижение количества антибиотиков в молоке

Образец молока Исходное содержание антибиотика, мг/л (М±ш) Содержание антибиотиков после обработки

Кипячение Стерилизация

мг/л (М±ш) % мг/л (М+т) %

Естественный фон, п = 15 0,009 ± 0,0002 0,0086±0,010 95 0,008510,004 95

Пенициллин, п = 10 0,10010,003 0,090+0,001 90 0,100+0,050 100

Тетрациклин, п = 10 0,500 ± 0,002 0,4б5±0,020 93 0,500 ±0,002 100

Стрептомицин, п= 10 0,050 1 0,002 • 0,045+0,003 90 0,04610,005 92

Левомицетин, п= 10 1,00010,005 0,910+0,040 90 0,94510,030 95

Снижается при режимах 5-10% 0-8%

Кипячение и стерилизация не влияют на содержание антибиотиков в молоке. После кипячения в молоке остается от 90 до 95 % исходного количества антибиотиков, то есть разрушается от 5 до 10 % их количества. После стерилизации в молоке остается от 92 до 100 % исходного количества антибиотиков. Такие данные позволяют сделать выводы о непригодности параметров кипячения и стерилизации для разрушения антибиотиков в молоке.

При сквашивании молока незначительно уменьшается исходное количество изучаемых антибиотиков. В готовом продукте остается в среднем 90,4 % от их исходного количества.

На рис. 8 диаграммами отмечено влияние различных параметров технологической обработки образцов молока на разрушение в них антибиотиков.

Остаток, % Разрушено, %

Рис. 8. Влияние технологической обработки на содержание остаточных количеств антибиотиков в молоке

Таким образом, наибольшего снижения количества антибиотиков в молоке удалось достичь при применении режимов длительной пастеризации.

ВЫВОДЫ

1. Сырье и продукты животного происхождения импортного и отечественного производства, отобранные на мясо- и молокоперерабатывающих предприятиях и продовольственных рынках г.Москвы, могут содержать остаточные количества антибиотиков.

Антибиотики в количествах, превышающих МДУ, встречались в мышечной ткани индейки в 72,7 % исследованных проб, в грудках куриных - в 18,5 %, в печени куриной - в 26,6 %, в желудках куриных - в 63,1 %, в фарше

курином - в 41,6 %, в яйцах куриных - в 33,2 %, в мышечной ткани крупного рогатого скота и свиней соответственно в 8 и 16,9 %, в печени крупного рогатого скота и свиней соответственно в 10,6 и 16,9 %, в почках крупного рогатого скота и свиней соответственно в 14,4 и 23,2 %, в молоке и молочных продуктах - от 47,6 до 100 % проб, в рыбе морской - в 38,8 % проб

В 12,5 % образцов мяса птицы отечественного производства и 20 % образцов импортного производства установлено превышение МДУ по содержанию антибиотиков. В субпродуктах птицы эти показатели составили 42,5 и 45,5 %, в мясе свиней соответственно - 15 и 17,5 %, в говядине - 4 и 9,3 %, в сыре твердом - 25 и 100%

2. Из 2075 исследованных проб сырья и животноводческой продукции в 391 (18,8 %) были обнаружены антибиотики, из них тетрациклин - в 344 пробах (16,6 % всех исследованных образцов), левомицетин - в 21 пробе (1,0 %), стрептомицин - в 17 пробах (0,8 %), пенициллин - в 7 пробах (0,3 %), гризин -в 2 пробах (0,01 %)

88 % случаев выявления антибиотиков составил тетрациклин (превышение МДУ в 10-70 раз), 5,4 % - левомицетин (в 2-10 раз), 4,3 % -стрептомицин (в 1,5-2 раза), 1,8 % - пенициллин (в 5-10 раз), 0,5 % - гризин (в 3 раза)

3 Определена чувствительность бактериальных штаммов В subtilis L2, В mycoides 537, Bpumilus NCTC 8241, S aureus 209-P, S aureus ATCC 6538, M luteus ATCC 9341, Str thermophilus, Strfaecium к следующим антибиотикам бензилпенициллину, тетрациклину, неомицину, гентамицину, спектиномицину, левомицетину, линкомицину, гризину и бацитрацину Установлено, что штаммы В subtilis L2 и М luteus ATCC 9341 являются чувствительными к наибольшему количеству исследованных антибиотиков

4 С помощью штамма В subtilis L2 по диаметру зоны задержки роста вокруг бумажного диска, пропитанного экстрактом мышечной ткани или молока, можно определить в субстрате наличие тетрациклина, неомицина, гентамицина, стрептомицина, линкомицина, гризина, бензилпенициллина С помощью штамма М luteus ATCC 9341 - наличие левомицетина и бацитрацина Эти данные позволили модифицировать микробиологическую методику определения антибиотиков в мясе и молоке

Оптимальной средой для культивирования штаммов В subtilis L2 и М luteus ATCC 9341 является перевар Хоттингера с содержанием 120-140 мг% аминного азота с добавлением 1% глюкозы, рН среды 7,2-7,4 Плотность инокулюма для получения сплошного газона должна составлять 1 млрд бактериальных клеток в 1 мл культуральной жидкости Величина инокулюма -I мл на одну чашку Петри Температура культивирования - 35-37°С

5. Пробоподготовка для определения в мышечной ткани и молоке антибиотиков, которая заключается в гомогенизации пробы, экстрагировании

антибиотика ацетоном в соотношении 1 1 с дальнейшим центрифугированием экстракта при 3000 об/мин в течение 10 мин, обеспечивает максимальное извлечение антибиотиков, сопоставимое с существующим (МУК 4 1 1912-04 и МУ 3049-84), снижает затраты времени и средств

6 Модифицированный нами микробиологический метод и метод ВЭЖХ позволяют определять содержание антибиотика в диапазоне 0,01-100 мг/кг, иммунохимический метод твердофазного ИФА - в диапазоне 0,0001-100 мг/кг Коэффициент корреляции результатов определения концентрации левомицетина и тетрациклина в мышечной ткани и молоке модифицированным микробиологическим методом с методом ВЭЖХ составил 0,80, с методом ИФА - 0,92 Более чувствительный метод ИФА может использоваться для выявления проб с низким содержанием антибиотиков

7 Микробиологическая тест-система Дельвотест-Я чувствительна к присутствию в молоке пенициллина, неомицина, гентамицина, тетрациклина, эритромицина в количествах, регламентированных СанПиН 2.3 2 1078-01 В присутствии линкомицина, рифамицина, стрептомицина олеандомицина, полимиксина, левомицетина цвет тест-системы изменяется при концентрации активного антибиотика выше МДУ Чтобы учесть следовые количества таких антибиотиков в молоке, результаты, полученные с помощью тест-системы Дельвотест-Я, должны подтверждаться дополнительными методами

8 Проварка говядины и свинины кусками массой не более 2 кг в течение 3 ч в открытых котлах при достижении температуры внутри куска не менее 80°С, а тушек птицы - 1 ч позволяет снизить количество антибиотиков в мясе до уровня 10-15 % от исходного Около 70 % исходного количества антибиотиков переходит в бульон, 15-20 % переходит в соединения, которые не обнаруживаются микробиологическим методом

При изготовлении вареных колбас из сырья, содержащего антибиотики, в готовом изделии остается от 88 до 92 % исходного количества антибиотика

Промывание мяса приводит к снижению содержания антибиотика на 1225 % в зависимости от способа его введения После замораживания и оттаивания количество антибиотика снижается на 21-23 %

9 При обнаружении остаточных количеств антибиотиков, превышающих максимально допустимый уровень в 1,5-2 раза, мясо можно обработать промыванием с последующим замораживанием и размораживанием (мясной сок после размораживания не должен использоваться на пищевые цели) При более высоком содержании антибиотиков рекомендуется проварка мяса при общепринятых технологических режимах с последующим изготовлением низкосортных вареных колбас. Бульон после варки может быть утилизирован на технические или кормовые цели

10 При использовании режимов длительной пастеризации количество антибиотиков в молоке снижается на 14-26 % в зависимости от вида антибиотика При использовании режимов кратковременной и мгновенной пастеризации происходит снижение на 0-20 %, при кипячении - на 5-10 %, при стерилизации - на 0-8 %, при сквашивании - на 10 %

При обнаружении остаточных количеств антибиотиков олоко должно подвергаться разбавлению до безопасного уровня неконтаминированным молоком с последующей пастеризацией (63-65°С в течение 30 мин) и направляться на пищевые цели или использоваться в качестве кормового средства

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы по обоснованию способов снижения содержания антибиотиков в животноводческом сырье включены в рекомендации по совершенствованию ветеринарно-санитарного контроля сырья и продуктов животного происхождения, содержащих остаточные количества антибиотиков, и представлены в Департамент ветеринарии для рассмотрения (письмо Россельхознадзора № 02-04-07/574 от 10 07 2008)

Материалы мониторинга по изучению распространения сырья и продуктов животного происхождения, загрязненных остаточными количествами антибиотиков, использованы в плане мероприятий государственной ветеринарной службы г Москвы по исключению из оборота на потребительском рынке столицы животноводческой продукции, содержащей антибиотики (письмо Комитета ветеринарии г Москвы № Б/3-15/287/К от 19.02 2008)

Результаты работы могут быть использованы в практической деятельности научно-исследовательских учреждений и производственных лабораторий при определении качественных и количественных показателей содержания антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения и при решении вопросов об их дальнейшей реализации

Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации для специалистов научно-исследовательских учреждений и лабораторий, занимающихся вопросами ветеринарно-санитарного контроля мяса и мясопродуктов «Подбор микробиологической тест-системы для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения» (2005г), «Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus АТСС 9341» (2005г), «Ветеринарно-санитарная оценка продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков» (2006 г), «Определение антибиотиков в продуктах животноводства методом высоковольтного электрофореза» (2006г), «Чувствительность микробиологической тест-системы ДЕЛЬВОТЕСТ-R к антибиотикам, применяемым в животноводстве и ветеринарии» (2008 г), «Снижение

содержания остаточных количеств антибиотиков в молоке под действием режимов пастеризации, стерилизации и сквашивания» (2008 г.)

Изданы учебные пособия для студентов ветеринарных и технологических факультетов высших учебных заведений, курсов повышения квалификации и практических специалистов по ветеринарно-санитарной экспертизе «Методы лабораторного контроля животноводческой продукции, содержащей антибиотики» (2005), «Ксенобиотики лекарственного происхождения в продукции животноводства» (2005)

Материалы экспериментальных исследований используются в учебном процессе при подготовке ветеринарных и ветеринарно-санитарных врачей, технологов, специалистов пищевой биотехнологии, слушателей курсов повышения квалификации по курсам ветеринарно-санитарной экспертизы, производственного ветеринарного контроля, ветеринарно-санитарной экспертизы с основами технологии производства продуктов животного происхождения

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I Кальницкая О И Оптимальные среды и режимы культивирования микроорганизмов//Научный вестник ЛГАВМ - Львов, 2000 - С 112114.

2. Кальницкая О.И О качестве и безопасности пищевых продуктов // Материалы 4-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции». - М МГУПБ, 2002.-С 54-55

3 Кальницкая О И. Ветеринарно-санитарные требования к качеству продуктов убоя животных // Практик - 2003 - № 6

4 Кальницкая О И. Определение потенциально опасных химических соединений в продуктах убоя животных и птицы // Материалы 5-ой Международной научно-технической конференции «Пища Экология. Человек» -М МГУПБ, 2003 -С 244-245

5 Кальницкая О И Проблемные аспекты использования антибиотиков в ветеринарии и животноводстве // Материалы Международной научно-практической конференции «Состояние и проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в животноводстве» - Чебоксары, 2004. -С 4-8

6 Кальницкая О И Экспериментальное определение чувствительности споровых тест-культур к наиболее распространенным антибиотикам // Материалы Международной научно-практической конференции «Состояние и проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в животноводстве» - Чебоксары, 2004 -С 8-11.

7 Кальницкая О И. Антибактериальные препараты и их определение в животноводческой продукции // Материалы 5-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной

медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции».-М.,2004 -С 163-165.

8 Кальницкая О И Нитрофураны как ксенобиотики лекарственного происхождения // Материалы 5-ой международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» -М , 2004 - С 165-166

9 Кальницкая О И Подбор микробиологической тест-системы для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения методические рекомендации (Утв Отделением ветеринарной медицины РАСХН 11 05 05) - М МГУПБ, 2005 - 18 с

10 Кальницкая О И Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtihs L2 и Micrococcus luteus АТСС 9341 методические рекомендации (Утв Отделением ветеринарной медицины РАСХН 11 05 05) - М МГУПБ, 2005. - 6 с

11 .Кальницкая О И. Влияние остаточных количеств антибиотиков на результаты ветсанэкспертизы продуктов животноводства // Материалы 8-ого Всероссийского Конгресса «Оптимальное питание - здоровье нации» -М ГУ НИИ питания РАМН, 2005.-С. НО.

12 Кальницкая О И Использование антибиотиков в ветеринарии и животноводстве // Материалы Международной конференции «Лекарственные средства для животных и корма Современное состояние и перспеетивы» -М. ФГУ ВГНКИ,2005 -С 51-53

13 Кальницкая О И Новые направления использования антибиотиков в пищевой промышленности // Материалы Международной конференции «Лекарственные средства для животных и корма Современное состояние и перспективы» -М ФГУ ВГНКИ, 2005 - С 53-54

14.Кальницкая О И Определение остаточных количеств антибиотиков в мышечной ткани птицы // Мясная индустрия. - 2005. - № 12. - С 35-37

15 Кальницкая О И Проблема применения антибиотиков // Материалы Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» - Саратов ИБФРМ РАН, 2005 - С. 132-133

16 Кальницкая О И О необходимости ветеринарного контроля остаточных количеств антибиотиков в продукции животноводства / О И Кальницкая, А А Кунаков, И Г Серегин // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» - Санкт-Петербург, 2005 -С. 89-90

17 Кальницкая О И Антибиотики в мясных продуктах питания / О И Кальницкая, А П. Мулюкова // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» - Санкт-Петербург, 2005 -С 88-89.

18 Кальницкая О И Экологические аспекты производства пищевых продуктов // Материалы Международной научно-практической

конференции «Пищевые технологии-2005» - Одесса ОНАПТ, 2005 - С 130-131

19Кальницкая О И. К вопросу о безопасности питания // Материалы 3-го съезда общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова - М,

2005 -С 151

20 Кальницкая О И Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, применяемым в ветеринарии и животноводстве // Сборник научных трудов «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии».-М ВНИИВСГЭ, 2006 -Т 118 -С 149-155

21 Кальницкая О И Ксенобиотики лекарственного происхождения в продукции животноводства учебное пособие - М МГУПБ, 2006 - 93 с,

22 Кальницкая О И Методы лабораторного контроля животноводческой продукции, содержащей антибиотики- учебное пособие - М МГУПБ,

2006 -99 с

23 Кальницкая О И Нормативные акты в области обеспечения безопасности сырья / О И Кальницкая, М А Баранов // Материалы 4-ой Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» -М МГУПБ,2005 -С 199-201

24 Кальницкая О И. Лекарственные средства как возможные контаминанты продукции животноводства // Материалы Международного симпозиума «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» -Казань. ФГУ ФЦТРБ-ВНИВИ, 2005 - С 165-169.

25 Кальницкая О И Методы определения антибиотиков в продуктах животноводства // Сборник трудов, посвященный 75-летию ВНИИМП им В М Горбатова «Научное обеспечение инновационных процессов в перерабатывающей отрасли» -М, 2005 - С 19-21

26 Кальницкая О И Современные методы определения антибиотиков // Ветеринария -2006 -№6 - С 54-56

27 Кальницкая О И Гигиенические аспекты проблемы использования лекарственных препаратов в животноводстве // Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии» - М ВИЭВ, 2006 -С. 608-609.

28 Кальницкая О И. Нормативная база по организации питания детей // X Конгресс педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» - М, 2006 - С 239

29.Кальницкая О И Влияние канцерогенных веществ на качество сельскохозяйственной продукции и здоровье человека / О И Кальницкая, А Г Ильина // Материалы Международного симпозиума «Агроэкологическая безопасность в условиях техногенеза» - Казань, 2006 - С 41-47

30 Кальницкая О И Ветеринарный контроль остаточных количеств антибиотиков в животноводческой продукции / О И Кальницкая, А Н Мулюкова//Эффективное животноводство -2006 -№5 -С 17-18

31 Кальницкая О И Контроль безопасности пищевых продуктов с помощью современных методов исследования / О И Кальницкая, Г.В. Иванова // Материалы Международной научно-практической конференции «Технология и продукты здорового питания». - М МГУПП, 2006 - С 28-31

32 Кальницкая О И Уровень обнаружения антибиотиков в продуктах убоя, полученных из отечественного и импортного сырья /АН Туник, Б В Уша, О И Кальницкая//Ветеринария -2007 -№4 -С 48-53

33 Кальницкая О И Особенности регионального мониторинга продуктов ЕН Кипин // 1-й Всероссийский съезд диетологов и нутрициологов «Диетология, проблемы и горизонты».-М, 2006 - С 44-45.

34 Кальницкая О И Законодательное обеспечение работ в РФ по недопущению в пищу продовольственного сырья, содержащего ксенобиотики / О И. Кальницкая, Е.И Петрова // Материалы 6-ой Международной научно-практической конференции «Качество, стандартизация, контроль теория и практика» -Ялта, 2006 - С 57-60

35.Кальницкая О И Влияние антибиотиков, обнаруженных в продуктах животноводства, на здоровье человека / О И Кальницкая, Е И Петрова // Материалы 6-ой Международной научно-практической конференции «Качество,стандартизация, контроль теория и практика».-Ялта, 2006 -С 60-63

36 Кальницкая О И Оценка степени риска при применении антибиотиков в пищевой промышленности / О И Кальницкая, А А Кунаков, И Г Серегин // Материалы 8-ой Международной научно-практической конференции «Интеграция в мясную промышленность России современных методов управления качеством и прослеживаемое™» - М ВНИИМП,2006 -С 67-68

37 Кальницкая О И Влияние остаточных количеств антибиотиков на безопасность продуктов животноводства / Е А Чубарова, О И Кальницкая // Материалы 6-ой Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М МГУПБ, 2007 - С 233-234

38 Кальницкая О И. Влияние способов пробоподготовки на степень извлечения антибиотиков из биологических субстратов // Ветеринария -2008 -№ 1 -С 58-60

39 Кальницкая О И Ветеринарно-санитарная оценка продуктов убоя животных, содержащих остаточные количества антибиотиков-методические рекомендации (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.10 06) / О.И Кальницкая, Б В Уша // Ветеринарный консультант -2007 -№3(142) - С 11-14

40 Кальницкая О И. Определение антибиотиков в продуктах животноводства методом высоковольтного электрофореза методические рекомендации (Утв Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 10 06) / О И Кальницкая, Е И Петрова // Ветеринарный консультант -2007 -№6(145) -С 7-10

41 Кальницкая О И Чувствительность микробиологической тест-системы ДЕЛЬВОТЕСТ-И. к антибиотикам, применяемым в животноводстве и ветеринарии. методические рекомендации (Утв Отделением ветеринарной медицины РАСХН 06 02 08) // Ветеринарный консультант -2008 -№6(169) -С 8-9

42 Кальницкая О И Снижение содержания остаточных количеств антибиотиков в молоке под действием режимов пастеризации, стерилизации и сквашивания методические рекомендации (Утв Отделением ветеринарной медицины РАСХН 06 02 08) // Ветеринарный консультант -2008 -№6(169) -С 9-11

43.Кальницкая О И Характеристика антибиотиков, попадающих в молоко и молочные продукты // Молочная промышленность - 2008 - № 6 - С 8283.

44 Кальницкая О И Влияние параметров термической обработки мяса на уменьшение в нем остатков антибиотиков // Ветеринарная патология. -2008 -№2(25).-С 73-75

45 Кальницкая О И Подбор микробных тест-культур к антибиотикам // Ветеринарная патология.-2008 -№2(25) - С 70-73

46 Кальницкая О И Ветеринарно-санитарная оценка мяса животных и птицы, содержащего антибиотики // Аграрный вестник Урала - 2008 -№7 -С 50-53

Подписано в печать 03 07 08 Уел печ л 2,75 Тираж 100 экз Заказ 03/90 МГУПБ 109316, Москва, ул Талалихина, 33 ООО «Полисувенир» 109316, Москва, ул Талалихина, 33 Тел 677-03-86

Результаты работы могут быть использованы в практической деятельности научно-исследовательских учреждений и производственных лабораторий при определении качественных и количественных показателей содержания антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения и при решении вопросов об их дальнейшей реализации.

Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации для специалистов научно-исследовательских учреждений и лабораторий, занимающихся вопросами ветеринарно-санитарного контроля мяса и мясопродуктов: «Подбор микробиологической тест-системы для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения» (2005); «Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus АТСС 9341» (2005); «Ветеринарно-санитарная оценка продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков» (2006);

Определение антибиотиков в продуктах животноводства . методом высоковольтного электрофореза» (2006); «Чувствительность микробиологической тест-системы ДЕЛЬВОТЕСТ-Ы. к антибиотикам, применяемым в животноводстве и ветеринарии» (2008); «Снижение содержания остаточных количеств антибиотиков в молоке под действием режимов пастеризации, стерилизации и сквашивания» (2008).

Изданы учебные пособия для студентов ветеринарных и технологических факультетов высших учебных заведений, курсов повышения квалификации и практических специалистов по ветеринарно-санитарной экспертизе: «Методы лабораторного контроля животноводческой продукции, содержащей антибиотики» (2005); «Ксенобиотики лекарственного происхождения в продукции животноводства» (2005).

Материалы экспериментальных исследований используются в учебном процессе при подготовке ветеринарных и ветеринарно-санитарных врачей, технологов, специалистов пищевой биотехнологии, слушателей курсов повышения квалификации по курсам ветеринарно-санитарной экспертизы, производственного ветеринарного контроля, ветеринарно-санитарной экспертизы с основами технологии производства продуктов животного происхождения.