Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усоврешенствование лабораторной диагностики энтерококковой инфекции птиц

Иващук Марина Александровна

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭНТЕРОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ ПТИЦ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва-2006

Работа выполнена на кафедре ветеринарной патологии Российского университета дружбы народов.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.В.Макаров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е.Г.Волина кандидат ветеринарных наук С.К.Старов

Ведущее учреждение:

Всероссийский НИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии, г.Москва

Защита состоится 2 июня 2006 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета К 212.203.02 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, корп.2, аграрный факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан "Ж" апреля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

В.Н.Гришин

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Птицеводство — наиболее наукоемкая и динамичная отрасль мирового и отечественного сельского хозяйства. В условиях экономической реформы в агроценозах повышается риск возникновения и распространения инфекционных и, в частности, бактериальных болезней птиц. Наличие их в хозяйстве негативно сказывается не только на эпизоотической ситуации, но и на экономике предприятия. Возбудители бактериальных инфекций в отдельности или в ассоциации оказывают существенное влияние на падеж птицы при остром и подостром течение заболеваний (пастереллез, колибактериоз, стафилококков и другие). При хронических, вялотекущих болезнях бактериальной этиологии отмечают неравномерный или низкий прирост массы бройлеров, повышенную чувствительность птицы к стрессам, снижение яйценоскости и выводимости цыплят, ухудшение биологических качеств эмбрионов, низкую конверсию корма, снижение поствакцинального противовирусного иммунитета (Борисенкова А.Н., 2001; Cardona С. et al., 1993; Chadfield М. et al., 2005).

Одной из особенностей бактериальных болезней на современном этапе является широкое распространение в популяциях промышленной птицы факторных инфекций, таких как колибактериоз, энтерококковая инфекция. Микроорганизмы, вызывающие эти инфекции, постоянно присутствуют в организме птицы, являясь комменсалами желудочно-кишечного тракта, и вызывают заболевания только при определенных условиях - стрессах, несоответсвии микроклиматических условий содержания зоогигиеническим нормам, погрешностях в кормлении и т.п. (Decrise L. et al., 1993).

В системе контроля бактериальных болезней своевременная и качественная диагностика, безусловно, имеет приоритетное значение. Диагностика болезни — понятие широкое, включающее комплекс данных: эпизоотологических, клиническую картину, патслогоанатомические изменения. Одним из составляющих диагностического комплекса является бактериологическое исследование. Лабораторная диагностика энтерококковой инфекции птиц осуществляется в соответствии с действующими на сегодняшний день Методическими указаниями по лабораторной диагностике стрептококкоза животных (М., 1990), которые имеют ряд недостатков.

В связи с вышеизложенным усовершенствование лабораторной диагностики энтерококковой инфекции птиц является объективной необходимостью.

Цель и задачи исследований.

Целью настоящих исследований явилось усовершенствование бактериологической диагностики энтерококковой инфекции птиц.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

- провести анализ эпизоотической ситуации по бактериальным болезням птиц в России за 2000-2004 гг.;

- осуществить мониторинговые исследования по выделению бактерий рода Enterococcus из патологического материала от промышленной птицы;

- дать сравнительную оценку двух коммерческих питательных сред для селективного выделения энтерококков;

- изучить антибиотикочувствительность энтерококков и эшерихий;

- изучить тип взаимоотношений между Е. coli и Enterococcus spp.;

- изучить патогенность бактерий рода Enterococcus на моделях белой линейной мыши и куриного эмбриона.

Научная новизна.

Впервые проведены мониторинговые исследования по выделению энтерококков из патологического материала от промышленной птицы, определено количественное содержание энтерококков в помете кур. Получены данные об антибиотикочувствительности энтерококков, выделенных то патологического материала от промышленной птицы, о патогенности бактерий видов Е. faecalis, Е. faecium. Доказан факт, что белая линейная мышь не может быть использована в качестве модели при проведении биопробы для определения патогенности энтерококков, выделенных из патологического материала от птиц. Предложена новая биологическая модель - куриный эмбрион.

Практическая ценность работы. Определена целесообразность мониторинга, направленного на выявление энтерококковой инфекции в популяциях промышленной птицы, для оценки эпизоотической ситуации в хозяйствах и планирования профилактических мероприятий.

Разработаны Методические указания по лабораторной диагностике энтерококковой инфекции птиц, которые могут быть использованы в работе врачами-бактериологами лабораторий птицефабрик и бактериологических отделов ветеринарных лабораторий.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании сотрудников кафедры ветеринарной патологии аграрного факультета РУДН (2003-2006) и в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории (2005).

Публикации. Материалы диссертации отражены в пяти опубликованных печатных работах.

Основные положения, выносимые на защиту:

• отработка оптимальных условий для выявления энтерококков из патологического материала от птиц;

• результаты мониторинга и эпизоотическая ситуация по энтерококкозу птиц в РФ;

• антибиотикорезистентность энтерококков и их патогенноегь..

Структура и объем работы. Диссертация изложена в одном томе на 140 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы. приложения. Работа иллюстрирована 34 таблицами, 11 диаграммами и 4 графиками. Список использованной литературы включает 140 источников, в том числе 78 иностранных авторов.

Азтор выражаег благодарность научному руководителю доктору биологических наук, профессору В.В. Макарову, сотрудникам кафедры ветеринарной патологии Российского университета дружбы народов, сотрудникам Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории МСХ РФ М.В. Калмыкову, Витковой О.Н., Карабанопой О.В. за неоценимую научную, методическую и практическую помощь в выполнении диссертационной работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в период с 2003 по 2006 гг. на кафедре ветеринарной патологии Российского университета дружбы народов и в ФГУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория МСХ РФ. При анхшзе эпизоотической ситуации по бактериальным болезням использованы данные, полученные из официальной отчетности ветеринарных служб административных единиц РФ по форме X» 4-вет за 2000-2004 гг.

При проведении мониторинга по выделению энтерококков материал для бактериологического исследования поступил из 19 птицеводческих хозяйств различного технологического направления. Всего бактериологическому исследованию подвергли 563 пробы патологического материала, среди которых 142 материала от индеек и 421 - от кур. В работе для выделения и идентификации микроорганизмов были использованы общепринятые микробиологические методики с применением простых, дифференциально-диагностических питательных сред и биохимических тестов.

В опытах использованы референтные шчаммы Е. coli, Salmonella enteritidls, Staphylococcus aureus. Streptococcus pneumoniae, Pseudonionas aeruginosa, Proteus mirabilis из музея бактериальных культур ЦНМВЛ.

В работе оценипали две коммерческие селективные плотные питательные среды для выделения энтерококков: питательную среду для выделения энтерококков и полимиксиновую среду. Оценку сред проводили с целью выбора наиболее оптимальной, которая использовалась бы в дальнейших исследованиях. Питательные среды сравнивали по следующим показателям: скорости роста, чувствительности питательной среды, выходу бактериальных клеток на 1 мл среды, селективным свойствам среды, сохранению стабильности биохимических свойств культивируемых микроорганизмов.

Общее количество бактериальных клеток устанавливали при помощи стандартов мутности (5 и 10 единиц) ГНИИСК им. Л.А.Тарасевича и нефеломегрнчески, используя калибровочную кривую.

При изучении антибиотикочувствительности энтерококков и эшерихий объектами для исследования служили 55 изолятов Enterococcus faecalis, 39 изолятов Enterococcus faecium и 39 изолятов E.coli, выделенных из патологического материала от птиц. Чувствительность к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков • с амикацином, ампициллином, фуразолидоном, фузидином, оксациллином, эритромицином, стрептомицином, канамицином, карбенициллином, левомицетином, тетрациклином, полимиксином и доксициклином на среде АГВ.

Количество жизнеспособных бактериальных клеток при исследовании бактериальных суспензий и помета птиц определяли методом посева в серийных десятикратных разведениях исследуемого материала на плотные 11 и та rej I ь н ые с ред| -I.

Изучение типа взаимоотношений между бактериями рода Enterococcus и Е. coli осуществляли двумя способами: in vivo наблюдали за микрофлорой кишечника птиц в динамике (определяли число КОЕ энтерококков и эшерихий в 1 г помета), in vitro проводили культивирование энтерококков и эшерихий в жидкой питательной среде в виде чистых и смешанных (Entcrococcus faecalis + Е. coli) культур, изучали и сравнивали динамику нарастания биомассы исследуемых микроорганизмов в аксенической и смешанной культурах.

Патогенность энетерококков изучали в биологической пробе на белых линейных мышах и куриных эмбрионах.

Полученный цифровой материал обрабатывали, используя общепринятые методы математической статистики (Ашмарин И.П., Воробьев А. А., 1962).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Эпизоотическая ситуация в России по стрептококковой инфекции

птиц

Как показали исследования, самой распространенной бактериальной инфекцией у продуктивной птицы является колибактериоз. На это заболевание приходится в среднем 50,3% всех положительных случаев. Стрептококкоз занимает пятое место (5,8%), уступая сальмонеллезу (14,7%), псевдомонозу (6,5%) и пуллорозу (6,5%) (рисунок 1). Доля стрептококковой инфекции от общего числа случаев выделения возбудителей бактериальных болезней птиц с 2000 г. по 2004 г. варьирует от 5,1% до 7,3%.

Рисунок 1.

Анализ эпизоотической ситуации но бактериальным болезням птиц (по России)

о к 5 3

16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

и ■ ■

* * - - —{

* * * -

--3— 1 Л*

2000

В Колибактериоз Н Пуллороз ■ Стрептококкоз

2001 2002 Год □ Пастереллёз В Саль м о неллёз

2003

2004

□ Псевдомоноз 11 Стаф ило ко кко з

2.2.2. Сравнительная оценка ростовых свойств двух коммерческих плотных питательных сред для выделения энтерококков

В сравнительной оценке доступных для диагностических лабораторий коммерческих плотных питательных сред для выделения энтерококков с целью выбора наиболее оптимальной, которая была бы пригодна в дальнейших исследованиях, испытывали две среды: питательную среду для выделения энтерококков (эктерококкагар) (Государственный научный центр

прикладной микробиологии, г. Оболенск) и полимнксиновую среду для обнаружения энтерококков (Центральная лаборатория микробиологии ВНИМИ, г. Углич). Результаты исследований показали, что обе среды обеспечивают сохранение стабильности биохимических свойств Enterococcus faecalis, Entrococcus faecium и Enterococcus durans. По остальным показателям энтерококкагар имеет несколько лучшие показатели, чем полимиксиновая среда.

Скорость роста определяли по минимальному времени, необходимому для появления на поверхности питательной среды макроскопически видимых изолированных колоний энтерококков. На энтерококкагаре такие колонии сформировались на 1-2 ч раньше, чем на полимиксиновой среде.

Чувствительность питательных сред изучали мегодом посева последовательных разведений суспензии бактерий на испытуемые среды с последующим подсчетом числа выросших колоний для определения количества КОЕ в 1 мл исходной суспензии. Обе питательные среды проявляют почти одинаковую чувствительность в отношении Enterococcus faecalis, но в отношении Enterococcus faecium для энтерококкагара эти показатели несколько лучше: при культивировании на энтерококкагаре количество КОЕ в исходной суспензии составило в среднем на 8,74% больше, чем при использовании полимиксиновой среды.

Выход бактериальных клеток на 1 мл питательной среды определяли методом посева 0,1 мл исходной суспензии бактерий газоном на чашки Петри с испытуемыми питательными средами. После термостатирования бактериальную массу смывали одинаковыми объемами физиологического раствора и нефелометрически устанавливали количество бактериальных клеток в полученной суспензии. Затем расчитывали выход бактериальных клеток на 1 мл питательной среды. Исследования показали, чго для энтерококкагара этот показатель больше на 81,25% (для Enterococcus faecalis) и на 170,6% (для Enterococcus faecium).

Селективные свойства питательных сред изучали методом посева гетерологичных видов микроорганизмов Е. coli, Proteus mirabilis, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae. Исследования показали, что энтерококкагар, в отличие от полимиксиновой среды, ингибирует рост Proteus mirabilis.

Кроме того, использование энтерококкагара позволяет выявить у бактерий рода Enterococcus способность к редукции 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида, что имеет значение в видовой дифференциации энтерококков. Таким образом, более предпочтительным является использование в наших исследованиях энтерококкагара.

2.23. Мониторинговые исследования по выделению энтерококков из патологического материала от птиц

' В связи с тем, что судить о роли энтерококкоза в инфекционной патологии птиц по отчетам лабораторий невозможно, перед нами была поставлена задача проведения мониторинговых исследований по выделению энтерококков из патологического материала от птиц. В период с 2003 по 2005 гг. было исследовано 563 пробы патологического материала от промышленной птицы: 142 материала от индеек, что составляет 25% от общего числа проб, и 421 материал от кур - 75%. За одну пробу принимается патологический материал (внутренние органы) от 1 трупа птицы. Характеристика патологического материала приведена в таблице 1.

Таблица 1.

Видовая и возрастная характеристика патологического материала.

Коли- Коли-

Вид Возрастная группа чество материалов Вид Возрастная группа чество материалов

Инкубационное яйцо 5 Инкубационное яйцо 50

Эмбрионы задохлики 15 Эмбрионы задохлики 155

M « 1> ч Индюшата (1-2 сут.) 35 3 Цыплята (1-2 сут) 75

Индюшата (3-7 сут.) 3 а. Цыплята (3-7 сут.) 41

33 S Индюшата (8-30 сут.) 67 Цыплята (8-30 сут.) 41

Индейка (1-6 мес.) 17 Цыплята (31-60 дн.) 49

Куры (старше 2 мес.) 10

Всего 142 Всего 421

В 49% случаев (277 проб патологического материала) возбудителей бактериальных болезней не выделено.

Из 137 проб патологического материала (24,33%) были изолированы микроорганизмы рода Етегососсив. В качестве единственного возбудителя (моноинфекция) энтерококки выделены только в 48 случаях (35 %), в 89 (65 %) - совместно с другими микроорганизмами (смешанная инфекция) (таблицы 2 и 3).

Как показывает мониторинговое исследование, энтерококкоз является одной из самых распространенных бактериальных инфекций промышленной птицы. Заболеваемость энтерококкозом и эшерихиозом находится примерно на одном уровне. В большинстве случаев энтерококковая инфекция протекает в форме смешанной. В качестве сопутствующей микрофлоры чаще всего выделяется кишечная палочка.

Таблица 2.

Количество случаев выделения возбудителей бактериальных болезней из патологического материала от птиц.

Количество В %к

Микроорганизмы случаев количеству

выделения материалов

Enterococus spp. 137 24.33

сем. Enterobacteriaceae

Е. coli 122 21.66

Salmonella spp. 21 3.73

Proteus spp. 12 2.13

Pseudomonas aeruginosa 41 7.28

Staphylococcus spp. 35 6.21

Streptococcus spp. 25 2.66

Таблица 3.

Смешанная микрофлора, выделенная из патологического материала от птиц.

Enterococcus spp. + сопутствующая флора Количество случаев

Enterococctts spp.+ сем. Enterobacteriaceae Enterococcus spp.+E. coli Enterococcus spp.+Salmonella spp. Enterococcus spp.+Proteus spp. Enterococcus spp.+ Enterobacter cloacae Enterococcus spp.+E. coli.+Salmonella enteritidis Enterococcus spp.+E. coli+Proteus vulgaris 59 1 4 1 3 1

Enterococcus spp.+ Staphylococcus spp. 8

Enterococcus spp.+ Pseudomonas aeruginosa. 10

Enterococcus spp.+ E. coli+ Pseudomonas aeruginosa 2

2.2.4. Изучение антибиотикочувствительности энтерококков и эшерихий, выделенных от промышленной птицы

Многочисленные исследования, проведенные в области медицинской бактериологии, свидетельствуют о полирезистентности энтерококков (Бухарин О.В. и др., 2002;, Седов В.И., 1983-1993), а сведения об антибиотикоустойчивости энтерококков, выделенных от животных, крайне скудны. Существенен факт, что технологической особенностью птицеводческих хозяйств являются сравнительно частые мероприятия по антибиотикопрофилактике и антибиотикотерапии, следствием которых может быть появление высокорезистентных штаммов эшерихий, энтерококков и других микроорганизмов, населяющих желудочно-кишечный тракт.

Чувствительность к антибиотикам энтерококков и эшерихий характеризовали но трем показателям:

• чувствительности изолята к антибиотику — диаметр зоны задержки роста ">" или' —" показателю для чувствительных штаммов;

• способности антибиотика задерживать рост бактерий - наличие зоны задержки роста вне зависимости от ее диаметра;

• абсолютной устойчивости изолята к антибиотику - отсутствию зоны задержки роста.

Результаты определения чувствительности Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и E. coli к антибиотикам представлены на рисунках 2, 3 и 4.

Рисунок 2.

Чувствительность Enterococcus faecalis к антибиотикам.

■ Процент изолятов, проявивших чувствительность к антибиотику □ Процент

изолятов, давших зону задержки роста

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

I

¡я я аз s я о

ш

га

ц

гн §

аз к аз SP®

К К! Я

Рисунок 3.

Чувствительность Enterococcus faecium к антибиотикам.

■ Процент изолятов, проявивших чувствительность к антибиотику

П Процент изолятов, давших зону -задержки роста

Чувствительность Е. coli к антибиотикам.

Рисунок 4.

■ Процент изолятов, проявивших чувствительн ость к

антибиотику

□ Процент изолятов, давших зону задержки роста

2.2.5. Исследование помета птиц 2.2.5.1. Высеваемость энтерококков из содержимого кишечника птиц

Исследовано 52 пробы кишечного содержимого. Результаты исследования показали, чго во всех пробах обнаружены бактерии рода ЕшегососсиБ, т.е. высеваемое гь энтерококков составила ' 100%. Следовательно, можно утверждать, что энтерококки являются обязательными представителями микрофлоры кишечника птиц.

2.2.5.2. Количественное исследование помета птиц

Исследовано 15 проб помета от кур: 5 групповых проб из хозяйства по производству мяса бройлеров, 5 проб от кур частного сектора и 5 проб от петухов вивария ЦНМВЛ. Вся птица была клинически здорова. В исследованиях использовали только с веже выделенный помет.

Количественное исследование проводили методом серийных десятикратных разведений (10'1 — 10"'°) с последующим высевом на плотные питательные среды - среду Эндо (для подсчета колоний БГКП) и энтерококкагар (для подсчета колоний энтерококков).

Количество бактерий группы кишечной палочки в исследованных пробах помета составило в среднем 60,9x10Ч, энтерококков - 21,9x10*. В 7 случаях из 15 (46,7%) число энтерококков в 1 г помета преобладало над числом БГКП. Таким образом, энтерококки являются обязательными представителями микрофлоры кишечника птицы и составляют весомую часть от общей биомассы бактерий кишечного содержимого.

2.2.5.3. Изучение типа взаимоотношений между бактериями рода Е1иегососси& и эшерихиямн

Наблюдение за микрофлорой кишечника лтиц в динамике

На данном эгяле работы исследовали помет от петухов, пробы помета отбирали с интервалом в 3 дня.

Для выявления взаимосвязи между двумя показателями рассчитывали коэффициент корреляции (г). Найденное значение г = 0,623 (для объекта № 1) указывает на умеренную степень прямой связи. Для оценки достоверности связи между изучаемыми показателями сравнивали рассчитанную величину г с минимальной величиной гп,1п = 0,589 (для уровня вероятности 95%). Поскольку найденное по экспериментальным данным абсолютное значение г превосходит г,™, корреляцию можно считать достоверной с вероятностью 95%.

Для объекта № 2 коэффициент корреляции г = 0,553. Сравнив его с rmin = 0,589, можно сделать вывод о том, что между изучаемыми признаками существует прямая связь умеренной степени, но вероятность корреляции в данном случае меньше 95%.

Изучение антагонистического действия Е. coli на бактерии рода Enterococcus in vitro

С указанной целью штамм Enterococcus faecalis засевали в виде чистой культуры и в сочетании с Е. coli в жидкую питательную среду - мясо-пептонный бульон. В процессе культивирования, через 3, 5, 7, 9, 24, 48 и 72 ч производили подсчет жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц — КОЕ) Enterococcus faecalis в чистой и смешанной культурах. Соотношение КОЕ Enterococcus faecalis в чистой и смешанной культурах в динамике роста отражены на рисунке 5.

Рисунок 5.

Влияние Е. coli на рост Е. faecalis в жидкой питательной среде

0

К

ш

я üj

1 ш

Изучение антагонистического действия бактерий рода Enterococcus на Е.

coli in vitro

В следующем опыте испытывали влияние Enterococcus faecalis на рост Е. coli в жидкой питательной среде. Исследование проводили аналогичным образом, только в качестве чистой культуры засевали штамм Е. coli. Результаты исследования представлены рисунке 6,

Как видно из данных рисунков 5 и 6, динамика нарастания и снижения количества КОЕ/мл энтерококков и эшерихий в питательной среде

одинакова н чистой и смешанной культурзх. В связи с этим можно слслль вывод о том, что Е. соН и бактерии рода Елиегососсив не оказывают друг на друга антагонистического действия. Меньшая биомасса энтерококков и эшерихий в смешанных^ культурах по сравнению с аксспическими обусловлена конкурирующим действием ассоцилнта за питательные вещества сроды.

Рисунок 6.

Влияние E.faecaUs на рост Е. coli и жилкой питательной среде

ш

5

UJ

О itf

3 5 7 9 24 48 72

Время культивирования, ч

IKOE E.coli в чистой культуре

□ КОЕ Е. coli в смешанной культуре

2.2,6. Изучение патогенных свойств культур энтерококков, выделенных из патологического материала от птиц

Для исследований было отобрано 24 изолчта. Идентификацию выделенных энтерококков до вида осуществляли с использованием биохимических тестов API 20 Strep (BioMeriex, Франция). В качестве дополнительных тестов определяли устойчивость микроорганизмов к теллурнту калия и способность редуцировать 2,3,5-трнфенилтетразолиП хлорид.

По результатам идентификации 12 изолятов отнесены к Entcrococcus faecal is. 10 изолятов — к Entcrococcus faccium и 2 иэолята — к Entcrococcus durans. Патогенные свойства исследуемых изолятов изучали на моделях внутрибрюшинного заражения белых линейных мышей и заражения куриных эмбрионов 9 дней инкубации в хорио-аллантоисную полость.

2.2.6.1. Шучение патогенпости энтерококков

на белых линейных мышах

При исследовании каждого изолята использовали четырех мышей: трех заражали испытуемой культурой, одной вводили стерильный физиологический раствор (контроль). За зараженными и контрольными животными наблюдали в течение 5 суток. Исследования Показали, что ни один из исследуемых изолятов не вызывал гибели мышей.

2.2.6.2. Изучение патогенности энтерококков

на куриных эмбрионах

При исследовании каждого изолята использовали по четыре куриных эмбриона: трем вводили испытуемую культуру, одному - стерильный физиологический раствор (контроль). Наблюдение за зараженными и контрольными эмбрионами осуществляли до окончания инкубации (в течение 12 суток). Овоскопию проводили 1 раз в сутки, жизнеспособность эмбриона определяли по его подвижности и наполненности кровеносных сосудов. Гибель и задержка развития у контрольных эмбрионов не наблюдались.

Павшие эмбрионы подвергали бактериологическому исследованию с целью выделения чистой культуры тестируемого изолятз. Во всех случаях из павших эмбрионов была выделена чистая культура бактерий рода Ег^егососсиБ. Эмбрионы-задохлики (эмбрионы, в которых зародыш погиб в период вывода) также подвергали бактериологическому исследованию. Материалом служил головной мозг. Во всех случаях была выделена чистая культура энтерококков.

Как показали исследования, изоляты, вызывавшие гибель 100% зараженных эмбрионов, не вызывали гибели мышей. Следовательно, белые линейные мыши не являются моделью для выявления патогенных свойств энтерококков, выделенных из патологического материала от промышленной птицы. В качестве такой модели возможно использование куриных эмбрионов.

3. ВЫВОДЫ.

1. Энтерококки являются обязательными комменсалами кишечника кур и индеек. Их количество достигает 109 КОЕ в 1 г помета.

2. Энтерококкоз является одной из самых распространенных бактериальных инфекций промышленной птицы. Его удельный вес составляет 36% от всех бактериозов. В 65% случаев энтерококки выделяются в ассоциации с другими микроорганизмами в качестве смешанной инфекции. Ведущую роль в качестве сопутствующей микрофлоры играет Е. coli.

3. Для выделения энтерококков оптимальной является "Питательная среда для выделения энтерококков сухая" Государственного научного центра прикладной микробиологии (г. Оболенск).

4. Энтерококки и эшерихии, выделенные от промышленной птицы, обладают высокой антибиотикорезистентностью; 38,2 % исследованных изолятов Enterococcus faecalis (21 из 55), 46,1 % изолятов Enterococcus faecium (18 из 39), 38,5 % изолятов Е. coli (15 из 39) проявили устойчивость к 12 антибиотикам, по отношению к которым определялась антибиотикочувствительность. Enterococcus faecalis и Е. coli проявили абсолютную устойчивость в отношении оксациллина. Наиболее эффективным антибактериальным препаратом в отношении энтерококков оказался ампициллин, в отношении Е. coli - левомицетин.

5. Белые линейные мыши не пригодны в качестве биологической модели для изучения патогенных свойств энтерококков, выделенных из патологического материала от птиц. В качестве такой модели рекомендуется использование куриных эмбрионов.

6. Культуры Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium, выделенные из патологического материала от промышленных птиц, имеют различную степень вирулентности: встречаются как вирулентные, так и авирулентные штаммы. Вирулентные штаммы энтерококков отличаются способностью вызывать гибель эмбрионов в первые 3 суток после заражения.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Показана целесообразность мониторинга энтерококковой инфекции в популяциях промышленной птицы для оценки эпизоотической ситуации в хозяйствах и планирования профилактических мероприятий.

Разработаны и утверждены Проректором по НИР РУДН "Методические указания по диагностике энтерококковой инфекции птиц", которые могут быть использованы в работе лабораторий птицефабрик и бактериологических отделов ветеринарных лабораторий.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Виткова О.Н., Иващук М.А. Энтерококковая инфекция у птиц. //1 Международная конференция по птицеводству. М., 2005, с. 178-180.

2. Иващук М.А., Виткова О.Н. Энтерококки в патологическом материале, полученном от птиц. // Ветеринария в птицеводстве. — 2005. - № 2 (20).-С. 30.

3. Иващук М.А., Виткова О.Н. Выделение энтерококков из патологического материала от птиц. // Международный вестник ветеринарии. -2005. -№ 1,-С. 39-41.

4. Иващук М.А. Антибиотикочувствительность энтерококков и эшерихий, выделенных на птицефабриках. // Ветеринарный консультант. — 2005.-№21.-С. 23-24.

5. Иващук М.А. Сравнительная антибиотикочувствительность энтерококков и эшерихий, выделенных от промышленной птицы. // Ветеринарная патология. —2006. —№1. — С.111-118.

Иващук Марина Александровна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭНТЕРОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ ПТИЦ

Работа посвящена усовершенствованию лабораторной диагностики знтерококковой инфекции птиц. Для выявления роли данной инфекции среди бактериозов промьппленной птицы проведены мониторинговые исследования по выделению энтерококков из патологического материала от промышленных птиц. В работе изучали биологию возбудителя, его антибиотикорезистентность и патогенные свойства, Разработаны Методические указания по лабораторной диагностике знтерококковой инфекции птиц.

M.A. Ivashchuk

IMPROVEMENT OF LABORATORY DIAGNOSTICS OF ENTEROCOCCUS INFECTION OF POULTRY

The work is devoted to the upgrading of diagnostics of Enterococcus infection of poultry. To define the role of Enterococcosis among others bacterial infections of poultry the monitoring was conducted. The work deals with the study of biological characteristics of Enterococci its antibiotic-resistanse and pathogenicity. Methodical manual of laboratory diagnostics of Enterococcus infection of poultry was developed.

Отпечатано в ООО «Оргсервис-2000» Подписано в печать Объем ' ^ п.л.

Формат 60x90/16. Тираж /00 экз. Заказ № ¿.б/ОЧ'^Т, 115419, Москва, Орджоникидзе, 3