Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усовершенствование средств специфической профилактики некробактериоза крупного рогатого скота и копытной гнили овец

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Московская государственная академия ветеринарной медицины _и биотехнологии имени К.И. Скрябина_

На правах рукописи

ОД

ФЕДОСЕЕНКО ВЛАДИМИР АНАТОЛЬЕВИЧ

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И КОПЫТНОЙ ГНИЛИ ОВЕЦ

16.00.03- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

МОСКВА - 1998

Работа выполнена в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Научный руководитель - Лауреат премии Совета Министров СССР, доктор ветеринарных наук СИДОРЧУК A.A.

Официальные оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук, профессор Татаринцев А.Т.

2. Кандидат ветеринарных наук, доцент Костенко Т.С.

Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии.

Защита состоится "21 " мая 1998 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 120.36.05 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина, (Москва, 109472, ул. Академика Скрябина, 23.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии. Автореферат разослан "_"_1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Меньшикова З.Н.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность темы. Инфекционные болезни конечностей крупного и мелкого рогатого скота занимают одно из ведущих мест в патологии этик животных.

Некробактериоз КРС, широко распространившийся в нашей стране с середины 70-х годов, достиг своего пика заболеваемости к началу 90-х годов (Пыталев П.Н., 1996.) До настоящего времени является одной из важнейших болезней у этого вида животных в большинстве экономических районов России, Наметившийся на настоящее время некоторый спад заболеваемости, по мнению автора, связан с снижением поголовья, разукрупнением хозяйств и внедрением в практику средств специфической профилактики некробактериоза.

Копытная гниль по-прежнему остается одной из важнейших проблем инфекционной патологии овец. Ее доля в общей инфекционной патологии достигает 49%. Только по официальной, явно заниженной, статистике в период 1986-95 гг. ежегодно копытной гнилью заболевало до 190 тыс. голов овец (Шатохин Ю.Е., 1996).

При этих заболеваниях инфекционный процесс осложняется достаточно широкой ассоциацией микроорганизмов, и проявляется в виде гнойно-некротических поражений, локализующихся в области копыт. В последние годы в России разработаны и применяются вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота и копытной гнили овец. Однако имеющиеся на ветеринарном снабжении препараты еще не совершенны. Существует необходимость в повышении их иммуногепной активности, оптимизации антигенной структуры, усовершенствовании технологии изготовления самих препаратов. При инфекционных болезнях конечностей перспективными представляются препараты на основе включения в антигенный состав кроме специфических возбудителей, ряда других микроорганизмов: стафилококков, стрептококков, актиномицет, клостридий, учитывая большое количество исследований указывающих на полиэтиологичность этих болезней.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью ■ настоящей работы явилось усовершенствование ряда технологических приемов изготовления вакцин против некробактериоза и копытной гнили и изучение факторов патогенное™ возбудителя некробактериоза.

В соответствии с этим в задачи исследований входило:

1. Изучить некоторые биологические свойства (культурально-морфологические, дермонекротические, гемагглютинирующие свойства, фагоцитарную активность) культур возбудителя некробактериоза, используемых в качестве производственных штаммов.

2. Приготовить питательные среды на основе гидролизатов соевой муки и кормового концентрата лизина и оценить их ростовые свойства стандартными методами.

3. Испытать указанные среды в сравнении со стандартными, с целью получения антигенов для ассоциированных вакцин, на примере вакцины против некробактериоза.

4. Отработать режимы инактивации антигенов стафилококков в процессе промышленного изготовления вакцин.

5. Провести сравнительную оценку иммуногенности стафилококкового бактерина и анатоксина на лабораторных животных.

1.3. Научная новизна. Доказана пригодность в качестве основ питательных сред гидролизатов сои и сухого кормового концентрата лизина [СККЛ] для приготовления вакцин против некробактериоза КРС - "Нековак" и копытной гнили овец - "Овикон". Отработан ряд технологических параметров изготовления данных вакцин, режим инактивации и оценена иммуногенносТь различных антигенов из Б-аигеиз. Изучены биологические свойства культур Р.песгорЬогит и А.руо§епез для оценки культур в процессе отбора и селекции производственных штаммов и для оценки их иммуногенности.

Впервые проведены исследования по изучению фагоцитарной активности изолированных популяций нейтрофилов и лимфоцитов крови крупного рогатого скота и овец методами хемотаксиса и миграции в агарозе и установлен феномен коагуляции (аггрегации) нейтрофилов под воздействием культуры Р.песгорЬогит. Указанный феномен может служить одним из объяснений механизма патогенеза и иммуногенеза при некробактериозе.

1.4. Практическая значимость работы. Усовершенствована технология изготовления вакцин против некробактериоза КРС и копытной гнили овец. Предложены заменители мясных основ питательных сред для культивирования производственных штаммов - гидролизаты соевой муки и кормового концентрата лизина. Усовершенствована методика получения стафилококкового антигена для ассоциированной вакцины.

Результаты исследований использованы при переработке нормативной документации: "Инструкции по изготовлению и контролю вакцины против некробактериоза конечностей КРС - Нековак" и "Инструкции по изготовлению и контролю вакцины против заболеваний конечностей овец - Овикон".

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты изучения роста культур-продуцентов антигенов для ассоциированных вакцин на питательных средах на основе гидролизатов соевой муки и кормового концентрата лизина.

2. Усовершенствование режимов получения и оценка иммуногенности стафилококковых антигенов.

' 3. Изучение фагоцитарной активности изолированных лимфоцитов и нейтрофилов с использованием реакций хемотаксиса, миграции в агарозе и опсоно-фагоцитарной реакции (ОФР).

4. Изучение свойств культур Р.песгорЬогит и А.руо£епез с целью использования полученных результатов для оценки патогенеза и иммуногенеза некробактериоза.

1.6. Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены на научной конференции, посвященной 50-летию Воронежского ГАУ (Воронеж. 1996), 2-й международной научно-практической конференции "Актуальные

проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйствен-ной продукции (Москва, 1997), Ученых советах МГАВМиБ по итогам НИР в 1995-97 г.г., заседании Ветфармбиокомиссии при Департаменте ветеринарии МСХ РФ в 1997 г. и опубликованы в 4 научных работах (в т.ч. 1 - в печати).

1.7. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 стр. машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения.

Диссертационная работа иллюстрирована 25 таблицами и 1 рисунком. Список литературы включает 275 источников, в том числе 168 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы исследований.

Работа выполнена на кафедре Эпизоотологии и инфекционных болезней животных МГАВМиБ им. К.И.Скрябина и на Ставропольской биофабрике АО "Росагробиопром". „. ,

При проведении исследований использовано 272 белых нелинейных мышей, 12 морских свинок, 6 кроликов, 3 коровы и 3 овцы. В работе использованы 13 штаммов F.necrophorum, A.pyogenes, и S.aureus из коллекции кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней МГАВМиБ, хранившиеся в лимфолизированном состоянии. Для культивирования штаммов F.necrophorum использовали МППБ с кусочками печени, под вазелиновым маслом, тиогликолевый бульон производства НПО "Питательные среды" (г. Махачкала), бульон и агар из сердечно-мозгового экстракта (BHI, Difco, USA) и кровяной агар (КА). Для культивирования штаммов стафилококков и актиномицетов применяли мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ), бульон и агар из перевара Хотгингера, питательный бульон и питательный агар НПО "Питательные ' среды", а также BHI бульон и агар. При выращивании культур в аэробных и анаэробных условиях применяли традиционную технику.

Культурные свойства штаммов оценивали общепринятыми методами. Тинкториальные и морфологические свойства изучали при окрасках культур по методам Грама и Романовского-Гимза. Гемолитические свойства штаммов изучали при росте их на кровяном агаре в аэробных или анаэробных .условиях. Для изучения кератогенных и дермонекротических свойств использовали живые культуры и приготовленные из них антигены (корпускулярные и растворимые), которые наносили на конъюнктиву и вводили внутрикожно морским свинкам и кроликам. Гемагглютинирующие свойства штаммов F.necrophorum изучали по способности агглютинировать эритроциты коровы, овцы и морской свинки.

При изучении фагоцитарной активности, реакций миграции и хемотаксиса изолированных клеточных суспензий нейтрофилов и лимфоцитов крови крупного рогатого скота и овец использовали изоляцию популяций нейтрофилов крови методом лизиса (по Roth и Kaeberle, 1981). Выделение лимфоцитов проводили с помощью сепрацеля.

Для приготовления гидролизатов были использованы мука из соевых бобов «Purina»; сухой кормовой 30%-ный концентрат лизина (CKKJI), и говядина из торговой сети.

В качестве контроля применяли стандартные среды: МПА и МПБ, сухой питательный бульон, производства НПО "Питательные среды" (г. Махачкала), сердечно-мозговую среду - BHI, среду для стафилококков из серно-кислого гидрализата рыбной муки (ИПМ, г. Оболенск) и агар фирмы Difco (USA). Ростовые качества питательных сред на основе экспериментальных гидролизатов исследовали с использованием стандартных тест-штаммов: S.aureus, E.coli и B.subtilis, а также A.pyogenes.

В работе использованы следующие методики приготовления питательных сред и оценки их качества: получение перевара по Хоттингеру, получение кислотного гидролизата CKKJI, получение щелочного гидролизата СККЛ, определение аминного азота формольным титрованием, получение жидких и твердых питательных сред, оценка культурально-морфологических свойств микроорганизмов при выращивании на жидких и твердых питательных средах.

Ростовые свойства питательных сред оценивали по следующим показателям: определение степени накопления бактериальной массы с использованием оптического стандарта мутности (ГИСК им. Тарасевича); определение морфологии микроорганизмов и их отношения к окраске по Граму; определение морфологии отдельных колоний; определение скорости роста микроорганизмов.

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Морфологические свойства кулыур F.necrophorum и A.pyogenes при различных условиях культивирования. Традиционный метод окраски по Граму показал характерные изменения культур связанные с их возрастом и питательной средой. На жидкой среде культуры F.necrophorum и A.pyogenes быстро старели. Наиболее характерная морфология - наблюдалась у культур 1-2-суточных, в отличие от агаровых культур. Такая закономерность была отмечена при росте на всех 3-х средах. Окраска по методу Гимза хорошо демонстрировала полиморфность и неравномерность окраски, свойственную возбудителю некробактериоза как для молодых культур; так и старых.

Исследования показали пригодность использованных методов окраски фузобактерий и актиномицетов для оценки морфологии при росте культур, и соответственно оценки качества антигенов, которые ранее промышленно не культивировали.

2.2.2. Дермонекротические; и гемагглютинирующие свойства F.necrophorum. Для изучения дермонекротических свойств F.necrophorum (штамм 20.30 А) использовали следующие антигены: центрифугат жидкой 3-х-суточной культуры (1); дезинтегрированный антиген, из агаровой культуры (2); культура, инактивированная кипячением (3); живая культура (4). Для контроля использовали физиологический раствор pH 7,2. Реакция на антигены 1,2,3 и

контрольный отсутствовала. В то же время при введении живой, культуры (антиген 4) отмечали некрозы, развивающиеся через 8-14 дней, что соответствует свойствам вирулентной культуры Р.песгорЬогит.

Изучение гемагглютинирующих свойств культуры Р.песгорЬогит в отношении эритроцитов 3 видов животных показало, чтр эритроциты овцы агглютинировались практически полностью (на I 1 I I), эритроциты коровы несколько слабее (на 4-4-4-) и эритроциты морской свинки еще меньше (4-н), При этом в контроле гемаагглютинация полностью отсутствовала (-). ' ;

2.2.3. Фагоцитарная активность лейкоцитов кропи" п отношении Р.песгорЬогит. В качестве антигенов штамма, Р.пссгорНйгиш 203,ОА использовали: живую суточную культуру, выращенную на МППБ (1); смыв живой 3-х суточной культуры, на КПА или ВШ-агаре, 109 м.т./мл (2); фильтрат жидкой 2-3-х суточной культуры, выращенный на МППБ (3); жидкую суточную культуру, инактивированную кипячением (4); смыв культуры с плотной среды, инактивированной кипячением (5); дезинтегрированная культура выращенная на плотной среде (6). В качестве контрольных антигенов использовали также стерильную питательную среду -МППБ (7) и физиологический раствор рН=7,2-7,4

(ю. ■ , 7'

Для изучения влияния антигенов Р.песгорЬогит на функциональную (фагоцитарную), активность и подвижность нейтрофилов использовали методы оценки хемотаксиса, миграции в геле агарозы и ОФР с изолированными клетками крови. , "

Реакция хемотаксиса. Средние результаты двух опытов по реакции хемотаксиса показаны в таблице 1 .

Результаты этих исследований показали, что живая культура Р.песгорЬошт, выращенная на плотной питательной среде, полностью угнетает способность нейтрофилов крови рогатого скота (овец и коров) к положительному хемотаксису (захватывающей активности в отношении возбудителя). Другие антигены, в частности жидкая культура, гретый и дезинтегрированный антигены, обладают этим свойством в слабой степени, или не обладают совсем (Р>0,05).

,., Результаты реакции хемотаксиса. Таблица!.

Антиген Нейтрофилы

Овцы КРС

1. Живая жидкая культура 0,82+- 0,08 1,27+-0,27

2. Фильтрат жидкой культуры (экзотоксин) 1,054-0,17 1,634-0,36

3. Гретая жидкая культура 0,91+-0,11 1,174-0,26

4. Живая агаровая культура - -

5. Гретая агаровая культура 0,69+-0,09 1,054-0,21

6. Дезинтегрированный антиген 0,89+-0,19 1,134-0,24

7. Жидкая питательная среда 1,09+-0,22 1,564-0,48

8. Физиологический раствор 1,06+-0,23 ' 2,174-0,50 ■

Результат теста миграции в анаэробном состоянии._Таблица 2.

Антигены Нейтрофилы крови

Овца-1 Овца-2 КРС-1 КРС-2

1. Живая жидкая культура 4,31 4,97 5,9 7,53

2. Фильтрат жидкой культуры 7,14 6,45 7,57 7,52

3. Гретая жидкая культура 6,33 5,57 4,26 6,84

4. Живая агаровая культура - - - -

5. Гретая агаровая культура 4,84 4,98 4,1 6,48

6. Дезинтегрированный антиген 7,02 6,6 4,69 7,78

7. Жидкая питательная среда 5,53 6,6 6,02 6,78

8. Физиологический раствор 6,74 6,36 5,69 7,48

Реакция миграции в агарозе. Результаты опыта по тесту миграции в агарозе, при которых чашки Петри выдерживали в анаэробном состоянии представлены в таблице 2.

Установлено, что подвижность нейтрофилов под воздействием живой агаровой культуры также была существенно или полностью угнетена (в зависимости от условий инкубирования). Этим свойством обладали также в значительной степени гретый антиген и живая жидкая культура при инкубировании как анаэробном так и микроаэрофильном состоянии. Таким образом, оба метода характеризуются общими закономерностями при оценке подвижности и захватывающей (поедающей) способности нейтрофилов овец и КРС в отношении антигенов. В целом фагоцитарная способность нейтрофилов крови в анаэробных условиях была менее угнетена, чем в микроаэрофильных.

ОФР изолированных нейтрофилов и лимфоцитов в отношении живой культуры Р.песгорЬогиш. Проведено 2 серии опытов. Результаты опытов показали примерно одинаковые закономерности фагоцитоза у нейтрофилов и лимфоцитов коров и овец. Слабый фагоцитоз живых клеток возбудителя Б. песгорЬогиш имеет место, в первые 30 мин экспозиции, однако уже через 15 Мин часть лимфоцитов овец и 40-50% нейтрофилов подвергаются лизису, а в отношении клеток крови КРС гибель достигает 50-70%. Через 30 мин почти все овечьи и коровьи лимфоциты разрушились. Лизис нейтрофилов достигает 80% через 60120 мин. При этом клетки крови, особенно лимфоциты почти не прокрашены и на этом фоне хорошо заметна бактериальная культура. :

Во 2 опыте, где была взята свежая культура из термостата, феномен угнетения фагоцитоза был еще более выражен. При этом в суспензии нейтрофилы + культура визуально наблюдали своеобразную коагуляцию или аггрегацию (образование ватообразного сгустка) с полным просветлением остальной жидкости суспензии. Под микроскопом клетки крови были заметны только внутри этого сгустка. Через 15-30 мин нейтрофилы были еще частично живыми, но к 2 часам экспозиции большинство их разрушено, в мазке видно много свободных бактерий и оценить' ОФР не представлялось возможным. При оценке суспензии лимфоциты - культура такого феномена аггрегации или коагуляции не отмечено.

Таким образом, под воздействием живой культуры F.necrophomm фагоцитарная активность изолированных клеточных суспензий нейтрофипов и лимфоцитов резко угнетается. При этом. клеточная суспензия нейтрофилов крупного рогатого скота и мелкого рогатого скота под воздействием живой культуры- коагулировалась из свободного,, состояния, образуя склеенные скопления, причину которой еще предстоит выяснить. Во всяком случае, в доступной нам литературе описание подробного явления найти не удалось.

2.2.4. Приготовление, и испытание гндролизатов соевой муки и кормового концентрата лизина в качестве основ питательных сред. В процессе работы было приготовлено несколько видов гидролизатов: соевый ферментативный гидролизат, ферментативный гидролизат CKKJI, кислотный гидролизат СККЛ, щелочной гидролизат CKKJI.

Содержания аминного азота в полученных соевых гидролизатах составляло 300-850 мг% в зависимости от разведения муки и процента поджелудочной железы. Содержание аминного азота в щелочном и кислотном гидролизате СККЛ было низким (70-130 мг%), что соответствовало простому бульону из данного препарата. В то же время содержание аминного азота в ферментативных гидролизатах СККЛ ( при 5-10%-ной концентрации муки, взятой для гидролиза ) достигало 380-650 мг%, что было вполне удовлетворительным, поскольку в мясном гидролизате полученном в аналогичных условиях этот показатель составлял 540-830 мг%. Оптимальная концентрация поджелудочной железы для гидролизата соевой муки составляла 10-15%. Исходя из полученных результатов, целесообразно для проведения гидролиза использовать 3-5-кратные разведения соевой муки и 5 % взвесь СККЛ, при добавлении поджелудочной железы - 15% к объему. Из экспериментальных гидролизатов были приготовлены образцы жидкой и плотной питательной среды, которые испытывали на ростовые свойства с тест-культурами E.coli, B.subtilis и St.aureus. В качестве контрольных сред мы использовали МПА и МПБ. Опыт показал, что культуры E.coli, S.aureus и B.subtilis одинаково хорошо растут на всех образцах сред из соевых гидролизатов.

На следующем этапе были приготовлены 3 образца жидких и 3 образца плотных питательных сред (из мясного, соевого и СККЛ гидролизатов). Кроме этого, были приготовлены несколько образцов известных контрольных сред: питательный бульон и питательный агар, ВШ бульон и агар, среда для стафилококков (жидкая и плотная). Оценка свойств экспериментальных питательных сред с использованием тест-штаммов показала, что в экспериментальных жидких средах обнаруживается отчетливый рост тест-штаммов, засеянных в концентрации 102 кл/мл. Видимое помутнение сред, в которые были засеяны культуры в минимальной концентрации: 102 кл/мл, зафиксировали для S.aureus через 6 часов после посева, для B.subtilis через 7 часов, a E.coli - через 12 часов. Начало видимого роста тест-штаммов, засеянных в концентрации 107 и 10б кл/мл, было зафиксировано через 3 часа после посева и начала инкубации. Определение эффективности (выхода микробных тел с 1 мл среды) показало, что различия в концентрации микробных клеток в суточных культурах находятся в пределах одного порядка (101), хотя > исходные

концентрации различаются на 2Х3 порядка. Очевидно, концентрация выросшей культуры зависели' от ростовых особенностей штамма, а не от количества засеянных' клеток. Оценка микроскопией и морфологии колоний позволила установить,' что при выращивании E.coli, S.aureus и B.subtilis у этих микроорганизмов не возникает существенных морфологических изменений, что говорит о стабильности основных свойств. Для проверки сохранения культуральных свойств мы провели дополнительный трехкратный пересев культур на экспериментальных плотных средах (контроль на диссоциацию). В результате этого опыта появления R-форм колоний не выявлено.

" Ростовые качества экспериментальных жидких сред проверяли также ; с использованием тест-штаммов некоторых других родов и семейств бактерий, предоставленных нам кафедрой микробиологии и иммунологии (Streptococcus групп С И Д, Staphylococcus aureus, S. dullin, S. typhimurium, S. cholerae-suis, Eiherichia "coli, Klebsiella, Prpteus ). Рост всех указанных микроорганизмов на экспериментальных средах был интенсивнее, чем на контрольных средах. Концентрация микробных клеток в суточных'культурах составляла не менее 5х108 м.т./мл. Таким образом, можно считать, что на исследуемых средах культурально-морфологические свойства всех использованных тест-культур стандартны и устойчивы, характерные для данных видов микроорганизмов. В целом становится очевидным, что питательные среды на основе ферментативного соевого гидролизата и гидролизата CKKJI не уступают стандартным, широко используемым в лабораторной практике и производстве питательным средам и являются пригодными для культивирования различных родов микроорганизмов .

Сравнительная оценка ростовых свойств питательных сред, полученных на основе различных гидролизатов. для производственных культур S.aureus и А. pyogenes. Приготовлено 3 варианта плотных питательных сред на основе: перевара Хоттингера (АХ - агар Хотгингера), ферментативного гидролизата сои (СА - соевый агар), ферментативного гидролизата СККЛ (ККЛ-агар), со стандартным содержанием других компонентов. Всего изготовлено по 20 проб каждой среды в 0,5-литровых матрасах. На указанные среды засевали штаммы S.aureus А и' A.pyogenes 2334/4 (по 10 матрасов на штамм). В результате был установлен достаточно хороший рост культур и значительное накопления бактериальной массы (в среднем 0,9-1,45x1012 для S.aureus и 3,2-5,5x10" для A.pyogenes). При использовании в условиях биофабрики МПА (результаты по более чем 10 сериям культивирования) рост S.aureus составлял в среднем 5,6x10" A.pyogenes - 4,5-5,5x10'°, т.е. значительно ниже чем на испытанных средах. Таким образом, среды на основе соевого гидролизата по экономичности не уступают гидролизату Хоттингера и даже несколько его превосходят (особенно при выращивании A.pyogenes). Среда на основе ферментативного гидролизата СККЛ несколько уступает по питательности перевару Хоттингера но обе они превосходят обычную мясо-пептонную среду (МПБ и МПА).

2.2*5. Отработка некоторых параметров культивирования производственных культур. Была проведена оценка накопления бактериальной

и

массы стафилококков и актиномицетов в зависимости от соотношения поверхность/высота столба среды.

Как видно из таблицы 3, при росте в колбах не отмечено разницы в ростовых свойствах СБ и ВН1 сред. При росте в пробирках стафилококки росли лучше на ВШ-агаре чем на СА, в отношении актиномицетов . различий не. обнаружена. При культивировании в ВНЬбульоне рост культур , в колбах и пробирках был почти одинаков. То же самое отмечено при росте актиномицетов в СБ. Установлено, что только стафилококки в СБ вырастали в 2 раза более интенсивно в колбах, чем в пробирках. При использовании специальной среды для стафилококков расчеты показали, что при повышенном доступе воздуха (в колбах с тонким слоем среды) культура стафилококков накапливалась в концентрации в 2-2,5 раза больше, чем в пробирках (3,4 и 1,5 млрд/мл соответственно). Для А.руо§епе5 эти колебания были не существенные (2,5 и 2,0 млрд/мл соответственно). , ,''.'.

Кроме этого, изучали влияние перемешивания растущей культуры стафилококков различных штаммов. По результатам опыта установлено, что почти во всех пробах рост стафилококков при перемешивании был существенно интенсивнее (в 1,2-3,9 раз). Корректировка рН в процессе роста давала значительное увеличение (50-70%) накопления бактериальной массы стафилококков. На рост А.руг^епеБ это влияние было не существенное (10-25% прироста бактериальной массы).

Как видно из таблицы 3, при росте в колбах не отмечено разницы в ростовых свойствах СБ и ВШ сред. При росте в пробирках стафилококки росли лучше на ВН1-агаре чем на СА, в отношении актиномицетов различий не обнаружено. При культивировании в ВШ-бульоне рост культур в колбах и пробирках был почти одинаков. То же самое отмечено при росте актиномицетов в СБ. Установлено, что только стафилококки в СБ вырастали в 2 раза более интенсивно в колбах, чем в пробирках. При использовании специальной среды для стафилококков расчеты показали, что при повышенном доступе воздуха (в колбах с тонким слоем среды) культура стафилококков накапливалась в концентрации в 2-2,5 раза больше, чем в пробирках (3,4 и 1,5 млрд/мл соответственно). Для A.pyogenes эти колебания были не существенные (2,5 и 2,0 млрд/мл соответственно).

Кроме этого, изучали влияние перемешивания растущей культуры стафилококков различных штаммов. По результатам опыта установлено, что почти во всех пробах рост стафилококков при перемешивании был существенно интенсивнее (в 1,2-3,9 раз). Корректировка рН в процессе роста давала значительное увеличение (50-70%) накопления бактериальной массы стафилококков. На рост А.руо£епеэ это влияние было не существенное (10-25% прироста бактериальной массы).

Эксперименты по изучению влияния питательных добавок к среде включали добавки: 10% нормальной сыворотки КРС; 10% гидролизата казеина; 10% сыворотки + 10% гидролизата казеина. Отмечено, .что добавки сыворотки и

казеина увеличивали накопление бактериальной массы с 1,5-2,0 раза (особенно в среде для стафилококков), что может быть использовано для обогащения жидких, питательных сред при промышленном получении антигенов стафилококков и актиномицетов. Однако сыворотка предварительно должна быть проконтролирована на отсутствие ингибирующего действия на микроорганизмы.

Таблица 3.

Среды Емкость Штаммы M конц. (млрд/мл)

ВШ-бульон Колбы S.aureus Т-1 4,0

н ' S.aureus А 4,0

- S.aureus Т-3 3,25

V A.pyogenes 2,25

Среда для Колбы S.aureus Т-1 5,0

стафилококков , S.aureus А 3,5

S.aureusТ-3 4,0

A.pyogenes 1,5

ВШ-бульон Пробирки ! S.aureus Т-1 4,0

и S.aureus А 4,5

и S.aureus Т-3 4,5

A.pyogenes 2,0

Среда для 1 Пробирки S.aureus Т-1 2,25

стафилококов S.aureus A 2,5

1 S.aureus T-3 2,0

и A.pyogenes 1,75

Примечание: Соотношение поверхность/высота: пробирки - 1:10,5; колбы - 14:1.

2.2.6. Отработка режима инактивации антигена З.аигеив. В процессе изготовления вакцин было замечено, что культура стафилококков в высокой концентрации, после смыва с агаровой среды плохо инактивировалась формалином, применяемым в обычных концентрациях. При этом появлялась опасность недоинактивации возбудителя или значительно удлинялись сроки инактивации данного антигена, что нарушает технологическую схему при изготовлении вакцин "Нековак" и "Овикон".

В связи с этим нами была поставлена серия опытов по оптимизации режимов инактивации стафилококкового антигена. В процессе исследования использовали различные плотные питательные среды (МПА, питательный агар, ВН1-агар, соевый агар, агар Хоттингера), разные штаммы Б.аигеиз, концентрации антигена й формалина. Предварительные опыты показали, что основа питательной среды, на которой выращивали культуры, практического влияния на последующую инактивацию формалином не оказывала.

Скорость инактивации различных испытанных штаммов (0-15, А, Т-1 и Т-3) при одинаковых условиях несколько варьировала, но в целом несущественно. Основное влияние отмечали в системе; концентрация антигена (м.т./ мл суспензии) - концентрация формалина (%).

Культуры стафилококков выращивали в матрах, 1-2 суток на одной из твердых питательных сред (чаще всего агаре Хотгингера или МПА). Затем общий смыв проверяли на концентрацию микробных тел по ОС мутности, делали серийные разведения на физиологическом растворе в пробирки или флаконы и добавляли формалин в соответствующих концентрациях. Пробы помещали в термостат при температуре 37 °С для инактивации и ежедневно в течение 1-10 суток контролировали рост посевами на питательный бульон и агар, а также микроскопией на отсутствие загрязнения. Помутнение бульона или рост хотя бы одной колонии на чашке с агаром оценивали как положительный результат. Обобщенные данные по результатам 4 опытов показали, что для инактивации антигенов стафилококков оптимальными являются антигенные концентрации 10-20x109 м.т/мл по ОС и содержание формалина в суспензии 0,3-0,5%. Более высокие концентрации формалина также позволяют убивать культуры в приемлемые сроки (2-3 суток, что укладывается в технологию получения вакцин), но они не желательны из-за более жесткого воздействия на антиген.

В процессе экспериментов мы также установили, что при концентрациях антигенов менее 100x109 (100 млрд м.т./мл) сроки инактивации при температуре термостата (+37 °С) и комнатной (+20-22 °С) существенно не отличаются по времени (максимально не более чем на 1 сутки). Если учесть, что в процессе получения антигена стафилококка в условиях биофабрики формалин добавляется в физраствор до смыва культуры, то отработанный нами режим можно признать удовлетворительным.

2.2.7. Сравнительная оценка нммуногенных свойств бактернна и анатоксина S.aureus. В ассоциированных вакцинах "Нековак" и "Овикон" антигенная валентность стафилококков используется в виде бактерина цельных инактивированных клеток, выращенных на плотной питательной среде. Однако известно, что хороший иммунитет против стафилококковых инфекций создают анатоксины, которые применяются, в частности, в медицинской практике. В данном раздела исследований было проведено сравнение эффективности бактерина, анатоксина и бактерина+анатоксина на лабораторных животных.

Две опытные группы белых мышей вакцинировали бактериальным антигеном и смесью анатоксинов 5 штаммов S.aureus (А, 3, Т-1, Т-2, Т-3) в равных пропорциях, изготовленных по методике ИЭМ им. Гамалеи. Через 18 дней после вакцинации их, а также контрольную группу, заразили культурой штамма 0-15 в летальной дозе. В третьем опыте было проведено сравнительное испытание бактерин-вакцины, анатоксин-вакцины и комплексного препарата, содержащего оба антигена. Результаты контрольного заражения мышей в опытах 1, 2 и 3 представлены в таблице 4.

Таким образом, как видно из таблицы, в экспериментах на белых мышах установлена примерно одинаковая иммуногенность бактерина и анатоксина

Таблица 4.

Сравнительная иммуногенность вакцин из Б'.аигещ на белых мышах.

, NN , опыта Группа мышей Количество мышей в группе Результат заражения (пало в течение 7-10 дней)

1 иммунизированная бактерин-вакциной 19 7 Р<0,05

иммунизированная анатоксин-вакциной 20 4 Р<0.01

контрольная 19 15 •

2 иммунизированная бактерин-вакциной 1 20 Я'. 1 , , 4 ч'РО.05

иммунизированная бактерин-вакциной 'Л'15 3 Р<0,05

контрольная " 20 12

3 иммунизированная , бактерин-вакциной 15 3 Р<0,01

иммунизированная. анатоксин-вакциной 15 4 Р<0,01

иммунизированная . бактерин-анатоксин вакциной 20 5 Р=0,01

контрольная 18 16

полученных из культур стафилококков. Применение комплексного бактерин-анатоксин- препарата давало более выраженный защитный эффект. Однако, в целом уровень защиты по сравнению с усложнением технологии изготовления препарата экономически может быть не оправданным.

3. ВЫВОДЫ

; 1. В ^процессе культивирования производственных штаммов Р.песгорЬогит и А.руг^епез* на -, жидких питательных средах для получения антигенов для ассоциированных вакцин против некробактериоза и копьггной гнили сроки культивирования, данных штаммов не должны превышать 2 суток, с контролем роста по морфологическим параметрам.

. 2. Реакция гемагглютинации с эритроцитами животных (овцы, коровы, морской свинки) .' может служить критерием оценки патогенности культур Р.песгорЬогиш наряду с гемагглютинацией куриных эритроцитов.

3. Культура Р.песгорЬогиш полностью угнетает способность нейтрофилов крови крупного рогатого скота и овец к положительному хемотаксису (двигательной и захватывающей активности). Этим свойством, но 'в слабой степени,, обладают также, жидкая культура, гретый и дезинтегрированный антигены данного микроорганизма. .

4. Живая культура F.necrophorum существенно или полностью угнетает подвижность нейтрофилов в реакции миграции клеток в агарозе, в меньшей степени этим свойством обладает культура инактивированная нагреванием.

5. При фагоцитозе возбудителя некробактериоза нейтрофилами и лимфоцитами наблюдается его выраженное угнетение и быстрая гибель клеток-фагоцитов. При этом, под воздействием возбудителя отмечают феномен быстрой аггрегации (или коагуляции) нейтрофилов и их гибель при экспозиции в течение 15-30 минут.

6. Для культивирования штаммов S.aureus и A.pyogenes, входящих в состав ассоциированных вакцин против некробактериоза КРС и копытной гнили овец, можно использовать питательные среды на основе гидролизатов соевой муки и сухого кормового концентрата лизина, наряду с традиционными питательными средами на мясном сырье.

7. При выращивании тест-культур, а также производственных штаммов на питательных средах из гидролизатов сои и лизина - скорость роста, накопление бакмассы и стабильные морфологические свойства культур, - не уступают данным свойствам по сравнению с традиционно используемыми питательными средами.

8. Отработана технология выращивания культур S.aureus и A.pyogenes на жидких питательных средах, в том числе соевом бульоне, для реакторного производства взамен культивирования на матрасах с плотной средой. Изучено влияние поверхностного и глубинного культивирования, перемешивания среды и добавок, повышающих выход бакмассы.

9. Отработан режим инактивации культуры S.aureus в процессе получения антигена для вакцин. Оптимальный режим должен предусматривать инактивацию культуры концентрацией 10-20х109 м.т./мл 0,3-0,5%-ным формалином при температуре +20-22 °С в течение 2-3 суток, с последующим контролем полноты инактивации посевами на питательные среды.

10. Установлено, что бактерии и анатоксин из S.aureus обладает примерно одинаковыми иммуногенными свойствами для белых мышей. Совместное их применение увеличивает иммуногенность препарата.

4. СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Предложены технологические приемы усовершенствования производства инактивированной ассоциированной вакцины против некробактериоза конечностей КРС - "Нековак" и инактивированной ассоциированной вакцины против инфекционных заболеваний конечностей овец - "Овикон", а именно:

- среды на основе гидролизатов соевой муки и кормового концентрата лизина для замены мясных гидролизатов;

- методы культивирования S.aureus и A.pyogenes в реакторе на жидкой питательной среде;

- оптимальный режим инактивации стафилококкового антигена;

Указанные разработки внесены в "Инструкцию по изготовлению и

контролю ассоциированных вакцин против некробактериоза конечностей

крупного рогатого скота Нековак и Нековак-стимул", утвержденную директором Ставропольской биофабрики 04.11:97 г.; и будут внесены в "Инструкцию по изготовлению и контролю инактивированной, ассоциированной вакцины против инфекционных заболеваний конечностей овец Овикон" при ее переутверждении.

5. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

Результаты исследований по усовершенствованию технологии изготовления ассоциированных вакцин против болезней конечностей крупного рогатого скота и овец, в частности культивированию стафилококков и актиномицетов и применению питательных сред на основе гидролизатов соевой муки и CKKJI могут быть использованиы в биологической примышленности при изготовлении вакцин.

Материалы по изучению угнетения фагоцитоза при воздействии возбудителя некробактериоза, имеющие значение в патогенезе и иммуногенезе болезни, используются в учебном процессе на кафедре эпизоотологии и инфекционных болезней Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина. (МГАВМиБ им. К.И. Скрябина).

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Свдорчук A.A., Панасюк С.Д., Устинова Г.И., Кружнов H.H., Федосеенко В.А. Некоторые аспекты иммунопрофилактики некробактериоза конечностей крупного рогатого скота при использовании ассоциированной вакцины Нековак. // Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней животных: сб. науч. тр./ МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 1995. - С. 142-146.

2. Сидорчук A.A., Дриаева М.Д., Федосеенко В.А. Значение анаэробных микроорганизмов и их ассоциаций ' в норме и при патологии у сельскохозяйственных животных. // Новое в диагностике, лечении и профилактике болезней животных: Межвуз. сб. науч. Тр./ МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 1996. -С. 177-180.

3. Федосеенко В.А., Сидорчук A.A., Есепенок В.А. Применение гидролизатов соевой муки и кормового концентрата лизина в качестве основ питательных сред для культивирования микроорганизмов.// Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции.// Тез. Докл. 2 межд. Научно-практической конф./ Москва, 1997. - С.168-169.