Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усовершенствование состава питательной среды для культивирования микоплазм

УКРАГНСЬКА АКАДЕЛИЯ АГРАРНИХ НАУК 1НСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГ 1 КЛ1Н1ЧНОТ ВЕТЕРИНАРНОТ МЕДИЦИНИ

ргб оа

На правах рукопису

?

КАЛАШНИК НАТАЛ1Я ВАСИЛ1ВНА

УДОСКОНАЛЕННЯ СКЛАДУЖИВИЛЬНОГО СЕРЕДОВИЩА ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ М1КОПЛЛЗМ

16.00.03 — ветеринарна лпкробюлопя, в!русолопя, ешзоотолопя, мшолопя 1 ¡мунолопя

днссрташ'Т на здобуття наукового сгупеня кандидата ветеринарних наук

АВТОРЕФЕРАТ

Харюв — 1996

Днсертащею е рукопис.

Робота внконана в лабораторп вивчення хвороб молодняка 1нституту експериментально! 1 клшчно! ветерннарно! медицини,

Ыауксвий кер1вник — доктор ветеринар« их наук,

академге УААН ФУКС П. Г1.

ОфЫйш О'поненти: доктор ветеринарних наук,

К.ОНАРЖЕВСЫШИ К. Е.

доктор ветеринарии« наук,

скшщькии в. г.

Провина орга.шзащя — Харкгвський зоо'ветеринар'ний ¡нстптут

МСГ 1 продовольства Увраши, м. Хармв

Захмст в1дбудеться «А?» .сКМУ^ . 1996 року и а зась данш спещал1зовано! Вчено! Ради Д 02.32.01 при 1нсглтуп ек-сперименталыно! 1 клшчно! ветер ш ар но! медицин.и УААН: 310023, м. Харшв, вул. Пушкшська, 83.

3 дкеертащею можна ознайоматися у б1блттещ [нстктуту екслериизнтальяо! 1' клшчно! ветерннарно! медицташ (м. Харкш, вул. Пушкшська, 83).

Автореферат розклано «с//» . Ю96 р.

Вчений секретар спе1П2л1зовано! ВченоТ Ради, доктор ветеринарних наук ' Н. П. ЧЕЧОТК'НА

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуалыпсть теми та ступжь досл1ДЖсност1 тематики дисертаци

1нтенси'вне ведения твариншщтва на промисловш основ! ха-ра'ктеризуеться концентрацию значного погсшв'я тварин на об-межеш» територп. На крупних фермах 1 комплексах у тварин, злвезених ¡з р1зних щодо стзоотачно! ситуацп., господарств та роз,М1щених в иши умозд утрвмання, асощацп мшоплазм з умов-нопагогенннми ба!ктер1ями та вирусами викликають патолопчш змши дихальноУ та сечаво-статевоТ систем, враження суглобгв, молочноУ залози та ш. Мшотлазми в одних випадках служать першопричи'ною захворювания, в шших — 1х виявляють на фот патологичного процесу, який розвиваеться за рахунок шших причин. В зв'язку з цим, овоечасно 1 точно встановлений диагноз М1-к'оплазмозу е запорукою успеху при оздоровлент господзрств ввд ряду захеор гавань.

1з числа ввдомих методов д1агностики мгкоплазмозу иайбйьш перспектив'ними е мгеробюшотний та серолопчний, як! дозво-яяють своечасно встановити ;пагноз, а та кож проводит постшний конггроль за ¡мунолопчним станом оргаш'зму тварин.

Сл1д вгдзначити, що шсля шушзацп тварин м1коплазмови(ми антигенам!!, культури яких вирощували на живильних середош-щах, вм1-щуючих сироватку кровг коней або шших тварин, в ор-гашзап виробляються антилла на гетерогекш компонечти жод-зильнсго середовища, яю викликають неспециф1чш реокцн при лроведснш Центифшацм видшених культур мшоплазм ¡з досли-жуваного материалу за допомогою ¡мунних снроваток.

Для усуненмя небажандх наслщкш у живильних серсдовищах "етероггшшх компонентов сиро:вагки крош тварин Гаффаров X. 3., Боровик Р. В. (1977), Афанас'ев В. Н. (1982) пропонували об-эобку ¡мунно1 сироватки кров1 тварин, а також антигенов ¡му-юсорбентамп та ферментами.

Для того, щоб запоб1гти формування неспециф1чних антитсл, эекомендують вводит» у' склад живильних середовтц, в яких зирощують культури мжоплазм, вииовЦну гомолопчну сироватку кров!. Багаторазов1 в1дмивання суспензи мжоплазм не доз-золяють у повшй \iipi звшыиитися в1д бкткових компонентов кизильного середовища. За- допомогою" цих методт не вдаеться

за<поб1гти формування неспецлф1чних антит1л на гстерогенш б!лки снроватки кровт у тварин.

Внд!'ляти мжоплазми з д1аг-ноетнчною метою доснть складно Це обумовлено в значшй Mipi вщсутшстю випуску бюлапч'ногс иромисловктю УкраТни стандарттованИх живильних еередодаиш для ix культивування. Внгсгговлениям живильних середов'ищ, склад яких доснть складний, вимушеш займатися pÎ3Hi маугаво-дослиш установи, на що notpiöho багато часу та kouitîb.

Проблемою виготовлення нови* та удосконалення ¡снуючих живильних ссрсдовищ ззймэлося багато наукавшв (D. С. Edward ! 947, 1957; M. Hofstad, D. Doerr, 1956; КИепеberger-Nobel, 1962; L. Hayflik, К. Chanock, 1965, В. В. Кипрнч з ош'вавт., 1966, 1972, 1986; М. Т. Пракоф'ева, В. 1. Бобришев, 1972; В. А. Чиблзо-в, IP88, D. Taylor-Robinson, J. Benhke, 1987, L. M. Lee, R. E. Davis,, 1989; M. Graciela, P. Sotomayor, 1990; M. Sillis, 1993). Але, незважаючл на численность прсхпонованих проплав живильних середовищ, рекомендованных для ¡золяцп та культивування .\ii-коплазм, не створено живильного середовища, котре забезпечу-вэло б задов1льний розвиток ycix ¡снуючих вид1в цих мжроор-гашзмш.

У зв'язку з цпм розробка живильних середовищ для культивування \икоплаа.\1, а також отрицания антагешв, вкльнид В1д .гетерогенних бкткових комданен'т, е доснть актуальною проблемою.

Мета роботи

Основна мета роботи — розробити жмнильне середопшце для культивування мшоплазм а'льськогосподарських тварин.

ЗАВДАННЯ ДОСЛЩЖЕНЬ

1. Розробити cvxe живилынс ссредовище для культивування мшоплазм Ыльськогосподарськш тварин та лтищ.

2. Вивчити бюлопчю властивост1 мшоплазм, внрошених на про'понованнх середовищах.

3. Внтотовитн лпкоплазмош аотигени на розроблених живильних середовищах та ви'вчити ïx опец»ф1чгасть.

4. Розробити 3aci6 прискореного видшення мшоплазм i3 дос-^аджуваного матср1'алу.

Теоретична i практична ц!нн1сть досл!джень та ïx наукова новизна

ч Вперше запролановано сухе живильне ссредовище для культивування мшоплазм ci л ьськогоел од а р сь ки х тварин, а також для отримання б1льш специф1ЧНого• та очийценого мшоплазмозного антигену.

Виконана робота дае змогу:

— пропонувагги кро:во.за1м1ндак геосен, який не мае антиген-ни« властивостей, як компонент, що часткшо замЬнюе сироватку кров1 коней у живильному середовиой для культивування м1го-плазм.

— налагодпти сершне про'М.исловс ви-робни.цтво сухих жи-вильнпх середови.щ для культивування мжаплазм с1льсько>госпо-дарських тварин.

Встановлсно внсоку якк-ть сухого живильного середовшца, що вмпцу£ уел необхщш шгредкнти для життед1яльносп мгко-нлаам. Ж'ивилыне середовшце забезпечуе типов1сть росту, збе-реження культуралвно-бюлопчшк властивостей i високу «уро-жайшеть» контрольных шталив мшоплазм. При ви'рощуваши на живи'льних серодовищах ¡з сухоТ основ» накопи.чення бактериальны 01 маси референтных штжшв хикоплазм було у 1,3—1,7 ради б1лыд|1М, шж на ссредовищах Едварда та В1ЕВ.

Розроблено наб1р тампоненгпв живильного оередовища для культивування мшоплазм альс^когосподарських т,варил (НТД затверджено ГУВМ з Держветшспекщею МСГ та йродоволь>-ства Украшн).

I

Р|вень реал!зац!'1 та впровадження наукових розробок

I

Основш результата до.елтджень впроваджеш в практику у вигляд!' «1нструкцп по виготовленшо 1 контролю набору компонент живильтгих середовищ для культивуваздня мжоплазм, 130-льованих шд птиц! та альськогосподарськжх тварнн», «Техшч-чих умов ТУ У 00497081.029-94 н'а наб]р компонентов живильиих середо'вищ для культивування мшоплазм, ¡зольованих ви птиш та альськогосподарських тварин», «Настанови по застосуватаню набору компонент живилши>х середовищ для культивування шкоплазм, ¡зольовани'х В1Д птнщ та альськогосподарських тва-рш», затвердж^них Головним управлтням ветеринарно! медицина з Д срж вст¡аспскцIею МСГ та проиовольства Укр атни 25.01.94 р.

Отримана приоритетна доводка, на ви'нахвд нового живильного серАдоеиш-а для культивування мгкоплазм (Л« 187! 9 в 1 д 20.12.95 р.).

Апробац!я та публ!кац!я результатов дослщжень

Основш' положения диссрта{щйно'1 рсботи були почиомл>е'ш 1 обговорип на зв1тних зборах ВченоУ Ради 1ЕКВМ (м. Харкт, 1993—1995), 2-й реслублшансьюй науково-виробндаий кочферен-Ш1 молодих учен.их \ спецкшспв (м' Хармв, 1986—1988), нау-ково-вир обличит конференци «Збереженшсть молодняка с.-г. тварин—запорука розвитку тварияшщтва Украши» (Б1ла Церква,

б

1994), Республ5кансъкш науково-лрактичшй конференцп по тва ри'нництву i ветеринарнш медицин! (BireöcbK, 1994), М'жнарод Н1й науково-практи'чнш конф^ренци «Общая эшсзоотоло! ия, им уунология, экологические и методологические проблемы» (XaipKiE

1995). За темою дпсертаци.стублаковамо '6 наукових праць. .

Структура та обсяг дисертацм

п ■ •• г - I/O .

Дисертацшна робота викладена на сторшках машинописно« тексту i м ¡стать встуш, огляд Л1ге|ратури, власш дослшження, об го-ворення' результат дослЦжснь, внсновкн та практичш пропо зпцп. Робота ¡люстрована таблицями та рисунками. Список л1 тератури складаеться ¡з 297 джерел, з них 208 шоземннх. До да тки на $ сторЬгках.

Особливий внесок дисертанта у розробку наукових результате, що виносяться на захист

Особлашнй внесок дисертанта полягае в повшстю самоспйно му ви конами всього обсягу методично!', експериментальноТ робот», нроведе-ши серолопчних та мжробтлопчних досл1джень. статистичнш обробш отриманих даних -та i'x ощнщ.

На шдстав1' анал!зу результат експернменлв та ствстав-ленмя i'x з да.нн-ми л1'тератури дисерта'нтом сформульоваш таю положения, що виносяться на захист:

— технолоичнт параметра отримання i контролю якосп сухого живил ьи ого середовнща для кулытивувакня мшскплаэм пльськогосподарських тварин i птиш;

— удосконашення живил ыно>го середовища шляхом зменшекня вмтсту гетерогснних 6iлkib сировапжн крош i введения кровоза-уинника reo сену;

— влечения бюлоп'чних • власти в о стой р сферой гн их шта-шв мжаплазм при культивуванш i'x «а розроблених живилышх се-редовищах; -

— виготовлення «¡коилаэмових антигенов на розробленмх жн-вильннх середовища,х та визн.ачення i'x специфичность

. — культмвувамня мшоплазм на живилших еередовшдах з додава'нням суспензн чутливих культур клгош з метою приско-рення ix росту для шдвшцения чутливост! мжробтлопчного методу.

Методолог!« та .методи дослщжень

Робота виконувалась в лаборатори вивчення хвороб молодо няка 1нституту екопериментально! i клшчно! ветеринар«о! ме1 днцини УААН в пер ¡од з 1993 по 1996 piK.

й

Для ощнки якосп жиаиПьних середовищ вйкористовували 5ульйонэд культур» мжоплазм рефсреитних штамв М. bovis, VI. bovirhinis, М. bovigenitaliurn, М. gallisepticum, Л'\. - gramula-тт, M. ariritidis, M. arginini, M. hominis ¡з музею IEKBM.

1нтенсившсть росту шкоплазм визначали колорн>мстрично за допомогою приладу ФЕК. 56 ПМ (довжина хвнл! 420 нм,ф1'льтр :шньофю,яетовий). Контролем буди живил ьш середовшца без <ультур мшоплазм. Чистоту i типовкть росту визначали виа'ва-ли культур ,на просп жнвильш середовища (МПБ, МПА, М'ППБ, :усло-агар).

Морфолопю мшоплазм вивчали MiKpocKonieio мазю'в, виго-:овле»их ¡з З-добовоУ культур» мшоплазм та пофарбованих за методом Романовського-Пмза, з викорнстацшям мшроокопу ИБi-3. Характер росту колол!» м!'коплазм, виршцуваних на тверда жпвильних ссредовшца х вивчали »¡д мшроскопам Л\БС-2.

Ашншш азот визначали шляхом формольного титрування за ,гето.дом ЗеренсенТа.врилова (1927).

Концентрацда водневих тшв визначали потенцюметрично за 10ПОМОГОЮ гари ладу рН-метр мшвольтметр-121, зпдно з «Мето-цтонодл рекомендациями по ф^знко-хЬшному i б1*атог1чкому ^оит/ролю бикових пдрол1зат1в для бактертолопчн'Их жпвильних :ередовищ» (М. 1983). Контролем служили прототипы! живмльш :ередовища Едварда та BIEB.

У процеа викоман'ня робот» для частковоГ замжи сироваггки ;ров! у живильному середовищ! використовували кровозамшнм'к сосен, який виготовляеться медичною промисловтстю. Мшробю-. :опчна оидкка якост! доелвджува'них живильних середовищ про-юдилась зпдно з «Методичными рекоадендащямп по контролю кивильнтах середовищ на основ! параметре росту мшрооргашз--lie в npomeci ix культивування» (М., 1980).

Мшоплазмош антиген» виготовляли зпдно з методикою Афа-¡ас'ева В. Н. (1*982). Ьмушзацда крол1в проводили за методи-;ою Фукс П. П. (1991).

Реакт'ю аглюгинацп ставил,!!' мшрометодом за дсломогою [або'ру Такач1 у oo'ewi 0,025 мл. Готували cepiiini дво!кратн1 роз-¡едендя досупджуваних сироваток в1д 1:2 до 1 :256 у ф1зюло-•¡чному розчиш хлористого HaiTpiro 0,85 % pH 7,2. Контролем 5ули ф1зюлопчний розчин з амтигеном та нормальна кроляча :иро>ватка з антигеном.

BioxiMi4m властиюосп мшоплазм вивчали зпдно ■ загально-¡рийнятпх у мшробюлогп методик (Edvard D. G., 1950; Deibel Н., •vans J., 1960; Антонов Б. I., 1986).

Суспензш культур'и кл^тин Tipa-xei теляти використовували '.пдио з «Методичными рекомендащями по крюконсервуванию i ¡.итолопчному контролю якост! культур кл1тнн та фрагмент •катим» (1981). Шдрахунок клттин суспензй' прахе! проводили у iaaiepi Горяева шд мшроскопом'МБЬЗ,

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛЩЖЕНЬ

Розробка технологи отримання сухого живильного середовища для культивування мжоплазм

Мифобюлопчний метод мае особливе значения у систем! ла-боратарно! диагностики ]'нфокщйних захворювань тварин. За йог о результатами вдаеться .визначити причину захворювання, а також в ид цпит:и збудника шфекци i провести його ¡дснтифжацпо. На шдстав1 отриманих результат створюеться можлшнсть розро-бити систему лгкуваль:но-проф!ла«тич,них заходгв, спрямованих на Л1кввдац1ю данаго захворювання.

Проблема забезпечення д1агностичннх лабораторш стандартизование середавищами для -культивування мжоплазм слльсь'ко-господарськнх тварин i птиш е досить актуальною. У зв'язку з вгд-сутшстю випуску бюлопчною лромисловютю Украши вишовщшх живильних середовищ ускладшоеться мшробюлапчна д!агноотика «а мвкоплазмоз. До того ж, ipum живилшп сере(Довища не стандартна не стшк! при зберiratrai, незручж при транспортуванш.

3 метою отримання сухого живильного середовища для куль-тивуваи-гня м ¡к о,плазм сгльськогоаподарських тварин нами було ©наготовлено рщке живильне середовище за ■ методикою Кт'при-ча В. В. (1972).

До складу редкого живильного середовища входили триштич-ний пдрол1зат ;м'язо,вих бшк!в велико!' рогато! худоби ¡з влпстом амшного азоту 180—200 мг%, пептон ферментативний (0,5%), натрш фосфорнокислий двозамшений (0,5%), шатрш хлор истин (0,3%), глюкоза (0,5%), кислотний пдрол!зат. печшки (10%). Пгсл-я разчинания комланенгпв, встановлення концентр a uii водне-В'Их ¡ошв (8,0—8,2) живильне середовище фшьтрували та розлива ли у 0,5 лггрсш окляш флакони по 250 мл. Шсля дього його аиддзвали пристенному заморожуванню при темшератур! Mi'Hyc 30° С i швидкосп обертання флакошв 30 об/хв. Пот1м флакони розмидувалм у камеру люфшыюго приладу ТГ-50 i замарожуваля протягом 4—5 годин три температур! Mi ну с 50—60° С. Люф1льие сушишя проводили на протяз1 42—48 годи-н при поступовому гад-'вшданш температури у nepaiii 12—14 годин на 1—2° С за годин} та ва.куум1 не больше 30 Па. Потш температуру тдвищували на 2—3°С за годину протягом 12—14 годик три вакуум1 4 Па до температури 0° С. У послтдуючий период сушшня .температуру пщвтацували до 22—24° С при тиаку не бшыле 4 Па. Шсля лю-фшзацц у камеру триладу поступово впускали по.в!тря, поки тиск у KaiMepi не зр!внюваюся з атмосфериим. Флакона ¡з сухим се-редовищем укупорювали гумавим-и пробками.

Сухе живильне середовище являе собою суху аморфну або др!б-ноиристалину масу темшо-жовтого кольору, у якш не допускаеться

наявшсть стороншх домшок. Розчиншстъ сухого сервдов'шца три-вае 1—5 хвилнн. Масова частка вологи доргвнгое 1—3 %.

При випробуваиш розройленого сухого живильного середовигца було встановлено, шо культура мшошлазм М. bovis, М. bovirhinis,' М. gallisepticum -культивувались на льо!му краще, шж на конт-ролышх середовищах BIEß та Едварда. Показникн сумар-но! оптично! ншьносл культур мшоплазм, що вивчаються, дослвджу-вачшх проб булн у 1,3—1,7 рази biíuíí, 'Шж у контрольких, а оп-тнчиа щиьшсть цих же культур мгвдплазм, отриманих на сухому та натшвному живильному середовищ!, практично не вгд-р-1энялась.

Зниження вМ1Сту (гегерогенних 6ukíb у живильному середовищ» ¡з триптичного пдрол1зату

До складу живильних середовищ для культивування míko-плазм входить гетерогенш компоненти сироватки кровi, як!, адсор-буюгься на Лх мембранах, що i е причиною вмикнення антил'л в сироватаах тварин при Тх шушзаци. Це значно ускладнюе роботу з. рефрентшрми штамами збудника i ¡дентифгеащю видьлених культур мшоплазм.

Проведет дослвдження по зменшенню BMicTy сироватки кровх коней у живильному середовищ! в!'д 18 до 2 % та замши íí кро-возаадтнмком геосенам в!дпаввдно bU 2 до 18 %•

Прл випробуванш сами референтлих ¡лталп'п ликоплазм на живилыних середовищах Í3 додава'нням кровозамшника, а також сироватки кров i у р!зних епшвтдношеннях встановлено, що через 96-годин культивування найкращий picT .культури М. bovis був на середовищт !з триптичного пдрол!зату, яке вмодувало 15—18% кровозамшиика та 5—2 % выловшю сироватки KpoBi, оптична щиьшсть дорГвнювала 0,121 ±0,0010 нм — 0,130±0,0013 нм. Кон-центращя мшробних ioítiih станавпла ви 300 до 320 млн. На живильних середовищах Едварда ,та BIEB за цей час культивування оптична щиьшсть не леревшцувала значения 0,07± 0,0011 — 0,09±0,0005 нм, а концентрация мшробних клшгн була значно менщою i дорганювала 220—260 млн.

На живилыному середовищ! ¡з bmíctom 20 % сироватки кров1 picT М. bovis через 96 годин культивування був аналопчним росту на середовигш, яке вмщувало 18 % кровозамшника та'2% сироватки кров!. Оптична шнш'сть доргвнювала 0,122±0,0010 нм.

Щодо культур мшоплазм М. bovirhinis, М. arginini, М. bovige-nitalium, М. hominis, М. granularum, то на живильному середовищ! Í3 триптичного пдролиату, яке м!стило' 2—5 % сироватки кров! та 18—15% геосену, оптич на щиьшсть шел я 96 годин ix культивування доргелювала в!д 0,081 ± 0,0010 «м до 0jl3±0,0012 нм, а у культури М. artritidis — 15—18 % 'кровозамшника та 5—2%

сироватки Äpoßi через 96 годин оптична гц!льшсть становила в'щ 0,09 до 0,15 нм, що складало в!д 260 до 300 млн. мжробних т!л.

Кровозам1нйик геосен вмодуе yci незамшш Bi.ibHi i зв'язаш аминокислота, серед яких i триптофан. В\пст' б{лка у цьому препарат! окладае 4,0—4,5 %, загального азоту 640—720 мг%, азот вшьшх аминокислот дор!внюе 76—90 мг%. Елоктрофоретично ней препарат являе собою однокомпонентний гомогенний балок, я кип мае pyxoMicTh, аналопчну глобулшам сироватки кровь Вщомо, що сироватка Kpoai дорого коттуе, мютить гетерогенш б!лки, а також за дани ми деяких автор ¡в волод!е мншплазм а цидним и властивостями. Препарат кровозаеишник геосен стандартизований, б!лок Я'Кого не волод1е антигенными властивостями.

Отримаш результата свгдчать про те, що часткова замша сироватки KpoBi у живильиому середовитш кровозамгиником геосеном, не виклмкала !стотних змгн у швидкост1 та ¡нтенсивност1 росту культур мжоплазм, як\ вивчалися.

Проведен! дослч'ди дозволили виготовити сухе живильне сере-довище ia триптичного пдрол!зату, до складу якого входи® кро-аоза;м!нйик геосен у юлькост! 15—18%. Люфшзашю проводили за розробленою нами та описаною вище технолопею. .. При культивуван'Ш мгкаплазм М. bovis, М. bovirhinis на вад-новлених живильних середовищах, вмпцуючих 15 та 18% крово-зам1«'ника з додава'иням 2—5 % сироватки «poei, встановлено, що picT культур мжоплазм, яш вивчаються, на натиюному та сухому Ж'ивильних середовищах не в!др!знявся. Оптична гщльшсть у до-слщних пробах була у 1,5 раз'и бьчьша, н!ж на середовищах BIEB та Еяварда.

Таким чином, варто* ввддати перевагу кровозамшнику геосему як стандартизаваному .препарату, який можна стер,ил!зуват,и авто-клаиуеаииям, його вживаиня у живильиому соредов'иод не виклм-■ка-е нег.атив!них результат при культипувашп мшоплазм.

Вивчення морфолопчних та 61ох1м1чних властивостей культур мшоплазм, культивованих на модиф!кованих середовищах

Вивчення ■морфолопчних та бюхМчних " властивостей м1ко-плазм при культивувашп ix на удосконалених живиль*»их середовищах проводили з викаристанням референших штамьв мшоплазм М. bovirhinis, М. bovigenitalium, М. arginini. Нами встановлено, що сахарол1тнчна активность, виявлялась тшьтси у шта-ма М. bovirhinis. Зшну кольору бульйомиоТ культур и в!д черво-ного до жавтого через оранжевий визначали в культурах М. bovirhinis на 3—5 добу на середовшщ, яке вмщувало глюкозу, ман-нозу, фруктозу, галактозу, мальтозу. В середовищах, як! вмвдували манст, сорбп-, незважаючи на явний р!ст мгкаплазм на про-тяз1 10 д1б, змши «ольору не вадзначено. (Таблица 1).

Таблица 1

Результата вивчення бюлопчних властивостей и!коплазм

Властявосп, ях) вивчалися Штами мшоплазм

Xs л/п М. bovige miaYmm 1 М. bovi-1 rhinis | M. arginini

. Ь ПдролЬ apriiiiiiy, або сечовиян — — +

2 Розщеллеиня глюкози — + —

3 » маннози — — —

4 » фруктози — + —

5 » галактози — + —

о » мал'ьтозя

7 'Вщновлення тетразолЬо. хлорту . .

а) ,у аеробних умовах

б) у анаеробннх умовах

Э Утворення плшок

9 Вйшовлення теллуриту кал|'ю

Ю Шрол1з желатину

lili Фоефатазна активккть

1(2 Каталазна активтсть

13 Оксдазна актившстъ

114 Вшювленкя метиленового ctrHboro

а) у аеробних умовах

б) у акаеробних умовах

15 Гемсшз аритроттв барана

+

+ Р

+ + +

+

+

+ а

н

Випробування на пдролгз aprrainy i сечовини дало можли-В1сть визначити таку властив1сть у М. arginini. Повний розпад цих речовин виявляли на 3 добу по smíhí кольору середовища.

Реакщя вшювлення тетразсшю хлориду була позитивною для М.. bovigenitalium, М. bovirhinis, М. arginini у анаеробних, а для М. bovirhinis — також i у аеробних умовах.

На пвердих живильних серодовищах, у як i nocí я ¡г i культур и мшоплазм зазначених вище штам!в, феномен утворення пл5вок-шсля 3—4 aims ¡вкубацп не в и являл и.

yci дослвджуваш штами м5коплазм не утворювалп eipnoBo-день. Вйдновления метилено-вого оннього yeiMa трьома шта'мами шкоплазм проходило т5льки у анаеробних умовах.

Культура М. bovigenitaiium давала повний лвис еритроттв барана (Р-1гамол!з), культури М. arginini та М. bovirhinis давали зеленувате забарвлення зони навколо колонш («-гемол!з).

Таким чином, результати вивчення 6íoxímí4hhx властивоетей мконлаэм -гари дослщженш ix у р!зних пробах з використання'м удосканалених живильних середовищ (показали, що ui властн-boctí зберьгаються шсля проведения шлькох пасаж^в. TaKi жм-вильш середовища збер1гають ochobhí властивост! мшрооргашз-

míb.

Виготовлення шкоплазмових антигешв та вивчення ,Тх специф|'чност!

3 метою утворення антатл у тварпн на сироватку Kpoei коней i'í вводили кролям триразово ком б шов а ним способом. Через 42 дш в!д початку ¡мун!зацп кролш знакровили, щоб одержати ¡'мунну сироватку кров i.

Дослгдну сироватку иереагряли у реакцн аглютинацп з отри-маним'и мнкоилазмовими антигенами, культури яких вирощувал^ на живильних середовищах ¡з piaurni bmíctom сиров а тки кров! коней та геосену. У результат! випробувань ви.значено, що в реак-цп агл юти наци з антигеном М. bovirhinis, одержат»! на живиль-ному середовищ! ¡з триптич'ного пдрол!зату, BIEB та Едварда з додавання'м 20 % сироватки Kpoei, i ¡мунною сироваткою Kpoei крол!в аититша виявлялися у титрах 5,0—5,5 log2 (Таблиця 2).

При використанш антигену М. bovirhinis, отриманого на жи-вильному середовтш Í3 триптичного пдрол^зату з bmíctom 5 % сироватки repoBi та 15 % кровозам!нника у РА, Í3 ¡мунною сироваткою кровь виявляли титр антити на piBHi 1,25±0,25 logs, який не був д1'агностич№И(м.

Виготовлений антиген М. bovirhinis на живильному середови-iui ¡3 триптичтого пдрол!зату, ¡котре м!стило 2 % сироватки i 18% юровозамшника, у РА ¡з ¡мунною сироваткою крол1в титров антитш не дадаав.

THtpa aHTHtifl y PA ao CHpOBaTOMmix ÖUKiß tcpOBt Koneii, log2

TaQjiHitK 2

Aoc.iiiÄHt

ciipobatkh

il a 3 b a a h t ii r e h f b

,M. bovirhinis

m %

gSg

3 m tä

S 0 CQ

«3 o- o o ^ o. H. s

sr,

s«

% S ä

f- a

P> K

ra «

^ H

3 ö «

3 ® fl

=5 O O

m a. o.

o a es ^ °

öoö^

U —<M

•9

F-

n 5

H

v fS 3 o

s

03 X O ü

A a

u cm

ca in

CO

ä o

CL d> U

ä

u 3

m o

a. i> O

M. bovigenitaüum

M. bovis

§ „ ¡S £

fe s -

m'S's

" !J Ä

SS«

3 « « s o o «fttt öss

<3 w

OJ ^o CL° ^O

W

.2 1 §

gl 8

§ i-f et o cu ^p ts.3-.jg

<J — C<1

s £

«

ucn

3

3

ix 03

0i u

s

w

<a

o

e.

ts U

m S S

— fti Ü

... ^ H

a O ra

3 ra n

a P 3

in a &

0 W —

CJ — LO

© Kl

S1 «

£ 5 £ g

m £ X aj irf

3 ö a loo n s- o.

o ^ s « W

32;

f',

c,

öS : o <

CQ

s

3

<s

so

3

e,

ra CQ

y W

5

K PO

o

s

6

¡1 IwyHHa

2 Hqp.Majibna

1,25± 0,25

0,r)

0,98

5,0 T-

0,25

5,5 ± 0,25

0,5 ± 0,28

0,25 j 0,13

■3 KoiiTpo/ib QA

1,25. 0,25

HCl'.

•1,5± 0,25.

5,25 + 0,18

1,25 +

0,25

1,5 J: 0,25

Her.

4,25 ± 0,28

6,25 ± 0,25

0,25 + 0,18

1,5 ± 0,25

1,25± 0,25

Her.

5,0

1,5± 0,25

1,25+ 0 0,25

¡¡er.

1

4,75 ± 0,18

5,75 ± ■0,25

0

1,5+ 0,25

6,0

1.5±

0,25

1,25 ± 0,18

iilpuMiTKa: uer. — iißratiiBinitii po3y^btaT

0

1

Her.

uer

ncr.

uer.

uer.

Алалопчш результата одержат при використанш у реакцп аглютинаци актигешв М. bovis, М, bovigenitalium i негативш в контрольных про'бах.

Таким чинам, додаваиия дс» живильного сарвдовшца ¡з триптич-ного пдролг'зату кровозампншка, що не мае антиген них власти-востей, дало змогу отриматн очищеш антигени М. bovis, М. bovir-hinis, М. bovigenitalium, KOTpi при вишробуванш у реакцп аглютинаци ¡.з досладними снроватками кpoлiв не давали неапециф1ч-них реакцш. Це дозволяе одержатн антигени в1льш вщ гетероген-них бЬчкових комшонентьв жэдвильлих середовшц.

Культивування мткоилазм на живильних еередовищах, якi не мктять гетерогенннх бл1к!в, та ¡муш'защя ними тварин дозволяе отримувати ¡MViUii сироватки кр о в i, використання яких при ¡ден-тифкаци культур мшоллазм не викликае появи неспецифтшх реакщй.

Використання суспензй культури ештел1альних юптин трахе! теляти при культивуванш лпкоплазм

ВЦомо, що для адаптаци мшоплазм до умов культивування norpioHo провестн 4—5 послщовних насадив, що ускладнюе i затрммуе в'идалення чисто!' культури та встановлення диагнозу \иконла;змозу.

Мшоплазм«, адаптоааш" тривалий час до умов метаболизму в орга,шзм1 тварии, мають тюний контакт з клгтннами.

У ята'сно шших умовах метаболгзму — безкл1'тинному живиль-иому середовищ!, затримуеться ix розвиток, збЬтьшуеться строк ¡н дика ui Т.

У зв'язку з цим нами проведено дослцщ по ви корн стал ню 3-добовоТ суспензй культури клтш трахеУ теляти як додатково-го компонента живильного середовища. В ста нов л ей о, то дода-ваган я до живильного середовища гид 5 до 20 % суспензй чут-ливоТ культури клтш ТТр у концентр ацхi 830 «л/мл сприяе в1дновлен«ю люфшзованих культур мколлазм М. bovis, М. Ьо-virhinis, М. arginini ш'сля проведения 2—3 поопдовних па-сажгв. В той же час, додавання 1—2,5 % суспензй' кл1гинно! культури недостатке i потребуе проведения не менше 4--5 посль довних пасаж1в, як i у контрольных еередовищах без клтшно! культури.

Таким чином, внесения до живильного середовища суспензй культур клгпш трахе!" теляти дозволяе ш'двищити чутливють ■ммеробюлопчного методу при культивуванш мшоплазм та при-скорити ¡золяцш мшоплазм ¡з патолопчного материалу.

висновки

1. BticywiicTh випуску б^олопчною промисловютю стандарт,и-зованих жмвшшних" серед овшц для культ,ивування мшоплаам ускладнюе диагностику мжоплазмоз1в с i л ь с ь ко гос и од а р сь к и х тва-рин i птицк Витотовлсння живильних середовищ по ¿снуючщм ирописам »вляеться склэдним, вони багато коштують i неспан-дартш.

2. Розроблена технология вмготовлення сухого t жквильного ое-редовища ¡з прип-тнчного пдрол1заггу м'язових б1'лкгв велико! рогато! худоби для культмвування мшоплазм, штенсившсть росту яких у пор^внямш з ростом на середовищах Едварда та BIEB у 1,3—1,7 рази вшце.

3. Встановлено, що у гшергмуиних сироватках до референции« штамш м-жоллазм, яш використовуються для ¡донтифжацн вщиленнх культур мткоплаам ¡з патолопчного материалу, Mic-тяться ататитша на быкош компонента жнвильного середовища у татрах в1д 4,0 log2 до 6,0 log2.

4. Удосконалено живильне оер^доаище i3 триптичного пдро-л^зату м'язових бшкгв велико! рогато! худоби шляхом введения до його складу нового компоненту кровозамшника геосену, я кий не мае антигешшх властивостей. Використання такого жив ильного середовища для культивуваиня мшоплазм не викликае формуваиня неспец>иф{чнпх алттл у сироватках Kposi при 1му-Hiaauii тварин.

5. Кудьтивува-ння мшоплазм на пропонованому живильному середовихщ, яке проводилось на протяз! не манше 5—6 пасажга, не викликае змш !х морфолоНчнкх та бюхшдчних властивостей, дае змогу твид те проводили тдентифшацт вииЬтених культур мшоплазм, а також одержуэати амтигеии, тлынг в1д гетероген-них б1'лшв:их компонентов жив-ильного середовища.

6. Додаткове введения до складу живилшого середовища сус-neHoi't чу-тливих культур ¡штий Tip, до яких мжоплазми мають трошзм, скорочуе строк !х адаИ1т:ац1 V. Для интенсивного накоии-чення бюмаеи мшоплазм доспаггаьр проводити 2—3 пасаж1", тод! ж на контроль'них живилших еер'едовищах необх1дно проводить

не менше 4—5 послщов-ннх падажгв.

i

ПРАКТИЧН1 ПРОПОЗИЦН

, I

Основы! результатй Дослкжень впроваджеш у практику у виглядк

1. 1нструкцГ1 по виготовлемшо i контролю набору компонен* tie сухого живмль-ного середовища для культивуваннм мшо-плазм, ¡зольаваннх вщ альськогосподарських тварин га птнш.

I

2. Т-ехшчних умов ТУУ 00497081.029-94 по виготовленню i контролю набору компоненте сухого ж ив ильного сер&довища для культивування мшоплазм, гзольова«их вщ альськогосподаф-ських тварии i птищ.

3. Наста нови по 'викори-стаиню набору компонент сухого жиаилвного середовища для культивування лнкоплазим, 1зольо»а-них в1д ciльськогосподареьких гва-рин i птищ (НТД затв'ерджш! Головним Уцравлтнмйм ветеринарно; медици'ни з Держветшспекць ею МСГ та тродовольства Украши 25 С1чня 1994 року № 15—14./5).

СПИСОК РОБ IT, ОПУБЛВДОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦ»

li Деревянко И. П., Калаитик Н. В. Приготовление сухой основы жидкой и плотной питательной сред для выращивания микоплазм // Материалы 2-й республиканской научно-производетвеиной конференции молодых ученых « спе-циаиистов.' — 'Харьков, 1.98(6. — С. 100—101.

¡2L (Приготовление опьпшо-ярамьшлешшх серий таборов компонентов питательных сред для культивирования микоплазм, изолированный от птиц / В. В. Киприч, Т. Ю. Т|руокава, Т. И. Зубова, Н. ;В. Калашник, Ю. В. Родии/I/ ■Материалы Решучбликашжо« научной конференции «Состояние, и перспективы развитая биотехнологии в животноводстве». — Харьков, 1>9&8. — С. 235—йЭЭ.

3. Фукс П. П., Калашншс Н. В. Удооконалекня лабораторию! дтпностики лпкоплазмгау // Ма.тер1'али науково-практично! кокференци «Збережешсть молодняка с.-г. тварии — запцрука розвитку твариншвдгва Украши», м. Б. Церква, Ш4. — Харйв, 1(994. — С. 65—66,

4. Фукс П. П., Калашник Н. В. Усовершенствование методов' выделения миколлаам // Материалы республиканской научно-лрактической конференции по животноводству ,и ветеринарной медицине — Витебск, 1994'. — С. 70/ .

¡5, Фукс П. П, Калашник Н. В., Гончарова Д. В. Влияние состава питатель-кон среды на активность диатностикума при мякоплазма-ннфекпдш // Материалы международной научной конференции «Общая эпизоотология: иммунологические и методологические проблемы». — Харьков, 19,9)5. — С. 35,5—358.

6. фукс П. П., Калашник Н. В., Герус Г. В. К Bonpdcy о лабораторной диагностике микоплазм озл // Материалы международной научной конференции «Общая эпизоотология: тгму л о лютейшим; и методолотические проблемы». — Харьков, 1995. — С. 2S3—256. , ■ ,

Калашник Н. В. Усовершенствование состава питательной среды для культивирования микоплазм. /

Диссертация л Ш1де рукописи на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 — ветеринарная мшробиолопня, вирусология, эпизоотология и иммунология. : '

Институт экспериментальной и клинической ветедтшарУой медицины УЛАН, Харьков, (1(9196.

.Защищаются результаты Исследования по разработке териологии приготовления сухой питательной бреди из ирштачеМйго лидролюй-та мышечнш белкой крупного рогатого скота для кулшшройашя микоплазм сельскохозяйственных животных. Определены технологические параметры получения сухой питательной среды из трштгчеакого тидролйаата мышечных белков крупного ригатого скота. Установлено,. что разработанная питательная среда по качественному составу, значительно превосходит контрольные питательные среды

ВИЭВ п Эдварда и обеспечивает в 1,3—'1 ^Т раза большее накопление бактериальной маосы др!г кульгивпровамвн .референтных штаммов микоплазм.

Д'авление к разработанной питательной среде кровезаменителя геосена в качестве 'компонента, частично заметающего сыворотку крови лошади, способствует получению более чистого и специфичного мнкоплазменнаго антигена, а также не вызывает выработку в организме животных антител на сывороточные компоненты питательной среды. Этот препарат выпускается биоиромыш-ленностью, стандартизован.

•Представляется возможным использование в питательной среде в качестве одного из компонентов суспензии чувствительные клеток культур ткани, что позволяет повыШть чувствительность микробиологического метода путем сокращения времени адаптации микоплазм к условиям хультивиржания на бос-клег очных питательных рредал.

Kalashnik N, V. Improvement of mycoplasma culture medium composition.

Manuscript of thesis for candidate's degree (veterinary medicine) in specialised fields 16.00.03 — veterinary microbiology, virology, epizootology, mi-cology and immunology.

Institute of experimental and clinical veterinary medicine of the Ukrainian Academi of Agrarian Sciences, Kharkov, 1996.

The results of investigation aimed at development of technology of preparation of dry culture medium of tripsinized hydrolyzate of bovine muscle proteins for farm animal mycoplasma, cultivation. Technological parameters of production of dry cultural medium of tripsinized hydrolyzate of bovine muscle proteins have been determined.

The geossen blood-substitute, added to the developed culture medium favours obtainment of more pure and specific mycoplasma antigen and does not bring about generation of antibodies to the serum components of culture medium in animals.

К.иочош слова: живильщ середовища, сироватки .кров!, кровозамшник, ре-ферентш штами мисотлазм, ферментатавний пдоол)зат.

Здано до набору 4.06,96. ГОдписано до друку 5Л6.96. Формат бОХ^'/щ. Зам. № Тчр. 100 прим.

Друкарня фшалу Кшшково! палата Украши. ЗЩ(ХЩ Харш, «ууг, Артема, 31.