Усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител

Тимиргалеев, Руслан Владимирович

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Тимиргалеев, Руслан Владимирович Казань 2006 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител

На правах рукописи

ТИМИРГАЛЕЕВ Руслан Владимирович

□030544Э0

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА БЕШЕНСТВА И ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ

АНТИТЕЛ

16.00.03

03.00.07

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Казань - 2006

- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

- микробиология

003054490

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

Научный руководитель: доктор биологических наук

Хисматуллина Наиля Анваровиа

Научный консультант: доктор биологических наук

Гилыиутдннов Рустам Якубович Официальные оппоненты: -доктор ветеринарных наук, профессор

Госманов Рауис Госмановнч -'доктор ветеринарных наук, профессор Фаизов Тагир Хадиевич Ведущая организация: ФГУ «Всероссийский государственный

Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

Защита состоится « /Г» А/Ле/Л 2007 г. в Ус? часов на заседании диссертационного совета Д - 220.034.01 при ФГОУ ВПО "Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана'' (420074, г. Казань, ул. Сибирский тракт, 35).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО "Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана".

Автореферат разослан <<_ /// » 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

и»——М.С. Ежкова

1 .ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Бешенство - острое вирусное заболевание общее для животных и человека, характеризующееся признаками полиэнцефаломиелита с летальным исходом (Авилов В.М. и соавт., 1994; Селимов М.А., 1998; Груздев К.Н. и соавт., 2001).

Сложная эпидемиологическая и эпизоотическая ситуация по бешенству наблюдается более чем в 110 странах мира (Ведерников В.А. и др., 2005), от него ежегодно погибают свыше 50 -70 тыс. человек, более 1 млн. животных и эти цифры постоянно растут. В работах H.A. Хисматуллиной, А.Н. Чернова, Р.Х. Юсупова и др. (1999-2006) установлено отличие степени патогенности эпизоотических изолятов, циркулирующих на территории Республики Татарстан, индекс инвазивности для которых колеблется в пределах 0,9-2,3. До сих пор, однако, не ясно, в каких отношениях находятся антигенные структуры гликопротеинового и нуклеопротеинового компонентов вакцинных штаммов и уличных изолятов рабического вируса.

В целом диагностические препараты на основе поликлональных антител, обеспечивая установление диагноза бешенства, не выявляют межштаммовые различия рабического вируса. Моноклональные антитела, обладая узкой специфичностью, позволяют идентифицировать штаммы рабического вируса, в частности, дифференцировать серотипы группы бешенства (Ботвинкин А.Д. и соавт., 1989-2004; Селимов М.А. и соавт., 1982-1998; Lafon М., 1996; Okoh A.E.J., 2000 и др.).

Не менее актуален вопрос контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных, в особенности диких плотоядных, при оральной иммунизации.

Традиционно используемая реакция вирусной нейтрализации для выявления антирабических антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях (Webster L.T., Dawson J.R., 1935; Briggs D.J. et al., 1998) трудоемка и требует длительного наблюдения. Имеющиеся разработки

метода ИФА для ускоренного определения титра антирабических антител в сыворотках крови людей и животных (Ботвинкин А.Д. и соавт., 1986; Сазанова Э.Я. и соавт., 1991; Хисматуллина Н.А.И соавт., 1989, 2000; Barton L.D., Campbell J.B. 1988; Elmgren L.D., Wandeler A.I. 1996; Atanasiu P. et al., 1977; Nicholson K.G., Prestage H., 1982) не вышли за рамки лабораторных исследований.

В связи с вышеизложенным, перспективным направлением в диагностике бешенства является применение моноклональных антител, а для контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства - метод ИФА.

Цель и задачи исследований. Целью работы явилось усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител. Для достижения данной цели решались следующие задачи:

1. Разработать технологию получения моноклональных антител к глико- и нуклепротеинам вируса бешенства для идентификации рабического вируса в патматериале.

2. Получить высокоактивный очищенный вирус бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ, выделить его структурные белки (глико- и нуклеопротеины), использовать их в качестве иммуногенов, а гликопротеин также - для иммуноферментного анализа активности антирабических сывороток.

3. Разработать схему гипериммунизации белых мышей линии BALB/c антигеном вируса бешенства для получения спленоцитов, секретирующих специфические к нему антитела.

4. Получить гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к глико- и нуклеопротеинам вакцинного штамма «Овечий» ГНКИ рабического вируса, и изучить антигенное соответствие некоторых циркулирующих на территории Республики Татарстан эпизоотических изолятов вируса бешенства вакцинному штамму.

5. Изучить возможность применения гликопротеина вакцинного штамма вируса бешенства для выявления антирабических антител методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна. На основании проведенных исследований впервые получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к возбудителю бешенства (штамм "Овечий" ГНКИ), и установлена возможность их применения в непрямом методе флуоресцирующих антител и сэндвич - варианте иммуноферментного анализа для выявления и идентификации возбудителя бешенства в патологическом материале. Показана возможность применения гликопротеина рабического вируса для выявления специфических антител в сыворотках крови животных, методом ИФА.

Практическая ценность. Установлена антигенная гомология эпизоотических изолятов, циркулирующих на территории Республики Татарстан, глико- и нуклеопротеинам вакцинного штамма вируса бешенства. Моноклональные антитела к глико- и нуклеопротеинам вируса бешенства рекомендуется использовать для идентификации возбудителя бешенства в патологическом материале. Выделенные структурные белки вируса бешенства (глико- и нуклеопротеины) могут быть применены в качестве антигенов для получения высокоспецифичных сывороток при создании более совершенных серологических тест-систем для диагностики и контроля вакцинопрофилактики бешенства.

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены директором ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" 2 инструкции и 1 наставление по применению.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

«Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (Покров, 2003); Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины УГСА «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Ульяновск, 2003); Всероссийской научно-практическй конференции посвященной 45-летию ВНИВИ (Казань, 2005); Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005); Всероссийской научно-практической конференции "Перспективы. агропромышленного производства регионов России в условиях реализации приоритетного национального проекта "Развитие АПК" (Уфа, 2006).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту:

1. Получение очищенного и концентрированного вируса бешенства и его основных структурных белков - глико- и нуклеопротеинов.

2. Оптимальная схема гипериммунизации белых мышей линии BALB/c антигеном вируса бешенства.

3. Идентификация эпизоотических изолятов вируса бешенства методами иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа на основе антинуклео- и антигликопротеиновых МКА.

4. Применение гликопротеина рабического вируса для определения специфических антител в сыворотках крови животных, вакцинированных против бешенства, методом ИФА.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 124 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 309 источников, в том числе 133 иностранных и 3 ссылки

на сайты internet) и приложения. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 5 рисунками.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2001 - 2006 гг. в лабораториях «Иммунологии» и «Культур клеток и гибридомных технологий» ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (№№ гос. регистрации 01200202602 и 01200202603).

Отдельные фрагменты работы выполнены с участием с.н.с., к.в.н. В.Г. Гумерова, м.н.с., к.б.н. Л.И. Зайнуллина и соискателя Т.А.Савицкой.

2.1.1. Материалы исследований ■

В опытах применяли 2 штамма вируса бешенства (ВБ): вакцинный -"Овечий" ГНКИ (линия штамма Pasteur) и стандартный — CVS.

В работе использовали: 4 овцы массой 40-45 кг, 25 белых крыс массой 20-25 г., 1000 белых мышей беспородных массой 6-7, г, и 100 - линии BALB/c - массой 12-14 г.

В опытах in vivo применяли клеточную культуру NGUK-1 (Авцын A.B. и соавт., 1984), перевиваемые миеломные клетки SP 2/0 - Ag 4.1. Для поддержания роста культуры клеток NGUK-1 использовали среды Игла-МЕМ и RPMI-1640, pH 7,2-7,4 с 3%-ным глютамином, 10 % фетальной сывороткой крови КРС. В культуральную среду добавляли пенициллин -100 ЕД/мл и стрептомицин - 1 мг/мл.

В экспериментах использовали калибровочный набор белков для электрофореза (Pharmacia Biotech, США) и блокирующий раствор "NEW LAV BLOT I R2", 5X ("Sanofi diagnostics pasteur ", Франция) и др.

Исследовано 12 проб патологического материала (головной мозг), из них 4 — от сельскохозяйственных, 3 - от домашних и 5 - от диких животных, поступившего в различные годы из неблагополучных по бешенству районов Республики Татарстан. В опытах исследовали также 77

образцов сывороток крови овец, иммунизированных антигеном возбудителя бешенства.

Контролем, в опытах служили суспензии головного мозга интактных белых мышей (контрольный отрицательный антиген), а также иммуноглобулины сывороток крови неиммунизированных животных. В качестве контрольного положительного антигена использовали мозг белых мышей, зараженных вирусом бешенства (ВБ), штамм «Овечий» ГНКИ, в качестве гетерологичного антигена — мозг мышей, зараженных вирусом болезни Ауески (ВБА), штамм ВГНКИ.

Образцы готовили в виде 10%-ной суспензии мозга на 0,85%-ном растворе ЫаС1 с добавлением пенициллина и стрептомицина. Антигены предварительно осветляли центрифугированием при 800 g в течение 15 мин, инактивировали при 56 °С в течение 30 мин.

В работе использовали диагностические наборы, разработанные во ВНИВИ (г. Казань): «Флуоресцирующий антирабический глобулин» (ТУ 9388-012-00492374-99) и «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)» (ТУ 9388-083-00008064-98).

В экспериментах применяли диагностические антитела против иммуноглобулинов барана и белой мыши, меченные пероксидазой и флуоресцинизотиоционатом, производства НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва).

2.1.2. Методы исследований

1. Получение и очистка антигена. Использовали метод накопления вирусного материала путем интрацеребрального введения 10%-ной вируссодержащей суспензии белым беспородным мышам массой 4-6 г -1000 голов и белым крысам массой до 40 г - 10 голов. Для получения культурального вируса бешенства, штамм "Овечий" ГНКИ, проводили заражение культуры клеток КОиК-1 путем внесения 10%-ной вируссодержащей суспензии мозга белых мышей в суспензию клеточной

культуры в концентрации 5х105 кл/мл в соотношении 1:1.

Освобождение вирусного материала от клеточного дебриса проводили по методу Н.А. Хисматуллиной, Р.Х. Юсупова (1998), с последующей очисткой в линейном градиенте плотности сахарозы (15-50%) - по B.Dietzschold (1996). В сравнительном аспекте проводили очистку и концентрирование вируса бешенства ацетатом цинка по F. Sokol (1975), а также 2,5 %-ным полиэтиленгликолем M 6000 по C.B. Кузнецовой и соавт.

(1974).

2. Методы вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и иммуноблоттинга. Степень очистки рабического вируса и его белковых фракций изучали методом диск-электрофореза в 12,5%-ном ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по U.Laemmli (1970) и B.Dietzschold (1996). Контролем служил набор белков стандартной молекулярной массы (94.0, 67.0, 43.0, 30.0, 20.1, 14.4 кД). Специфичность белковых фракций определяли иммуноблотгингом по H.Towbin et al. (1979).

3. Метод флуоресцирующих антител (МФА). В работе применяли прямой МФА и непрямой - НМФА на предметных стеклах по М.А. Селимову и соавт. (1964) с использованием флуоресцирующего антирабического глобулина, разработанного в ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань.

4. Реакцию нейтрализации (РН) проводили по Х.Н. Джонсону (1975) на белых беспородных мышах массой 4-6 г.

5. Реакцию длительного связывания комплемента (РДСК) с целью титрования специфических антител ставили в пробирках по схеме Е. Kuwert

(1975). Сыворотки прогревали перед опытом в течение 30 мин. при +56 °С. Фаза связывания комплемента составляла 18 ч при + 4 °С, фаза гемолиза — 20-30 мин. при +37 °С до полного гемолиза в контроле.

6. Биологическую пробу ставили на белых беспородных мышах согласно ГОСТу 26075 - 84.

7. Иммуноферментный анализ проводили на 96-луночных пластиковых

микротитрационных планшетах (ВНИИ медицинской техники, Москва). Для определения антигенов ВБ применяли сэндвич-вариант ИФА. Для обнаружения антител в сыворотках крови иммунизированных животных, а так же моноклонапьных антител к структурным белкам ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ, применяли непрямой вариант ИФА. Результаты оценивали на сканирующем спектрофотометре "Titertek multiskan" ("Flow laboratories", Финляндия) при длине волны 492 нм.

8. Иммунизацию мышей линии BALB/c проводили четырехкратно с интервалами в 30-, 5- и 20 суток антигеном ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ, в смеси с полным и неполным адъювантами Фрейнда (ПАФ и НАФ) в сочетании с внутрибрюшинным и подкожным введениями (Lafon M., 1985).

9. Для получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигену возбудителя бешенства, штамм "Овечий" ГНКИ, использовали перевиваемые миеломные клетки SP2/0 - Ag 4.1 и спленоциты белых мышей линии BALB/c в возрасте 4-6 недель, иммунизированных очищенными й концентрированными в градиенте плотности сахарозы антигенами ВБ (глико- и нуклепротеиновыми компонентами).

Выделение лимфоцитов и гибридизацию проводили по В.О.Херценбергу (1980) в соотношении 5:1.

Тестирование гибридных клонов осуществляли непрямым методом ИФА с применением гомологичных антигенов ВБ. В качестве конъюгата использовали диагностические антитела против Ig G мыши, меченные пероксидазой (НИИЭ и M им. Н.Ф. Гамалеи).

10. Криоконсервацию гибридных клеток проводили по А.А. Цуцаевой и Т.Ф. Петренко (1988). При этом использовали 24-36-ти часовые культуры гибридом, синтезирующие МКА и находящиеся в логарифмической фазе роста и образовавшие сплошной монослой.

11. Цифровой материал обрабатывали методами вариационной статистики с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel 2000.

2.2. Разработка диагностических препаратов для выявления и идентификации вируса бешенства на основе моиоклональных антител (МКА)

Получение МКА к антигену возбудителя бешенства проводили по следующей схеме: 1) подготовку и слияние иммунных спленоцитов и миеломных клеток; 2) тестирование гибридом с целью отбора клонов, продуцирующих антитела; 3) получение культур гибридомных клеток для накопления МКА; 4) использование МКА по целевому назначению.

2.2.1. Получение, очистка н концентрирование антигена вируса

бешенства

Для получения концентрированного вируса бешенства использовали культуральный вирус, титр инфекционности которого составлял не менее 105 Ь05о/мл. При этом чрезвычайно важным остается подбор оптимальных методов очистки и концентрирования, не вызывающих повреждение вирусной частицы с целью максимального сохранения протективнозначимых антигенных детерминант, расположенных на гликопротеине ВБ. Исходя из современных данных, для этих целей наиболее приемлемыми, на наш взгляд, являются три метода очистки и концентрирования: ацетатом цинка по F. Sokol (1975); 2,5 %-ным ПЭГ-6000 по C.B. Кузнецовой (1974) и ультрацентрифугированием (УЦФ) по В. Dietzschold (1996) с нашими модификациями, эффективность которых сравнивали между собой.

Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 1.

1. Сравнительный анализ эффективности методов очистки и

Методы очистки и концентрирования ВБ Титр инфекционности, LDso/мл Концентрация белка, мг/мл Титр антигена в ИФА (Кс„ >2,1), 1/п*

Исходный ВБ 10«4 6,0 + 0,3 128

Ацетатом цинка 10"'" 2,2 ±0,21 640

ПЭГ-6000 10,JW 2,1+0,20 640

УЦФ 10ьь 1,7 + 0,15 2560

Из данных табл. 1 следует преимущество метода УЦФ но В.01е1г5сЬо]с) (1996) с. нашими модификациями, применение которого повышало инфекционный титр в 45,7 раза, антигенную активность — в 20 раз, а содержание белка снижало в 3,5 раза. В последующих экспериментах для очистки и концентрирования вируса бешенства использовали метод УЦФ. Модификация метода заключалась в оптимизации режима УЦФ; 50 ООО % в течение 2-х ч. вместо 100 ООО ц в течение 1 ч ПО В^еЫзсЬоЫ (1996).

Параллельно проводили электрофоре гическое разделение ДСН-экстракта- виру ссодержащей культуральной жидкости, контролями служили: осадок клеток МСиК-1, питательная среда и контрольный положительный антиген из набора для ИФА (производство ФГУ «ФЦТРБ»).Специфичность полученных белковых фракций контролировали методом иммуноблоттинга. Результаты представлены на рисунке.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. Электрофоретическое разделение и иммуноблоттинг ДСН-зкстрактов концентрированного культурального вируса бешенства, штамм

«Овечий» ГНКИ.

Обозначения: 2, 4, 6 - иммуноблотты полипептидов треков 1, 3, 5 соответственно; 1 — интактная культура клеток ЫС1Ж-!; 3 — культуральная среда, содержащая ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ; 5 -очищенный и концентрированный культуральный ВБ штамм «Овечий» ГНКИ; 7 — маркерные белки (14,4; 20,1; 30,0; 43,0; 67,0; 94,0 кД); О, М, М,, Мг -обозначение основных структурных белков ВБ.

Из рисунка видно электрофоретическое разделение ДСН-экстракта очищенного и концентрированного вируса бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ, в 12,5 %-ном ПААГ (трек 4) на четыре группы мажорных белков (С - глико-, И- нуклео-, М1-фосфо- и М2-матричный протеины), что убедительно свидетельствует о высокой степени его чистоты. При этом трек №2 оказался чистым, что свидетельствует об отсутствии специфических белков ВБ в интактной культуре ЫОЦК-1.

2.2.2. Изыскание оптимальной схемы гипериммунизации белых мышей линии ВАЬВ/с антигеном возбудителя бешенства

Важным условием для получения антителопродуцирующих гибридом является изыскание оптимальных схем иммунизации доноров спленоцитов -линейных мышей, эффективность которых определяется, в частности, активностью и специфичностью иммунизирующего антигена.

При изыскании оптимальной схемы иммунизации доноров спленоцитов - линейных мышей линии ВАЬВ/с, в качестве антигена использовали очищенный и концентрированный ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ из расчета на одну инъекцию 10 мкг на мышь. Иммунизацию мышей проводили по 3-м схемам, отличия которых заключались в интервалах и способах введения антигена и сочетанием с полным и неполным адъювантами Фрейнда.

Сравнительный анализ схем иммунизации мышей линии ВАЬВ/с показал, что срок проведения иммунизации по 1-ой схеме наиболее длителен и составляет 46, по второй - 32 и по третьей - 31 суток, т.е. третья схема оказалась самой короткой. При этом активность сывороток крови была максимальной и соответствовала по НМФА 1:3200 и по ИФА 1:6400.

Таким образом, установлено преимущество иммунизации мышей по 3-ей схеме, которую и использовали в дальнейшей работе для иммунизации мышей линии ВАЬВ/с глико- и нуклеопротеиновыми компонентами вируса бешенства.

2.23. Получение гибридом, продуцирующих МКА к структурным белкам возбудителя бешенства ir изучение их свойств

При получении гибридом скрининг положительных клонов проводили методом непрямого иммуноферментного анализа. В качестве твердой фазы использовали полистироловые планшеты. Положительным считали результат, „более чем в 2,1 раза превышающий оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем (КсП >2,1).

В результате слияния B-лимфоцитов с клетками миеломы SP 2/0-Ag 4.1 получено 27,9% и 29,2% гибридом, положительно реагирующих соответственно на гликопротеиновый и нуклепротеиновый антигены вируса бешенства.

После отбора положительных клонов гибридных клеток, было проведено клонирование и реклонирование для выделения одиночных, стабильно продуцирующих клонов. Анализ позитивных клонов повторяли трижды для большей достоверности результатов.

Параллельно отбирали позитивные клоны для криоконсервации, установления специфичности и тестирования с эпизоотическими изолятами ВБ.

Для отбора положительных клонов сенсибилизацию планшетов проводили гомологичными белковыми антигенами: глико- и нуклеопротеинами рабического вируса, штамм «Овечий» ГНКИ. Всего в результате клонирования и реклонирования отобрано 13 стабильных клонов, продуцирующих моноклональные антитела к гликопротеину - 6 (25% от количества положительных клонов первичного скрининга) и нуклепротеину - 7 (26%). При этом активность МКА к гомологичным структурным белкам ВБ варьировала от 1:640 до 1:1280.

Часть культуры гибридных клеток, синтезирующих МКА, замораживали в жидком азоте или в рефрижераторе при -70 °С. Замораживали 24 - 36 часовые культуры, находящиеся в логарифмической

фазе роста и выросшие до сплошного монослоя.

Для изучения стабильности гибридом при хранении их в жидком азоте, через определенные сроки клетки размораживали и исследовали в непрямом ИФА. Результаты исследований показали, что гибридомы стабильно сохраняют свою активность при хранении в жидком азоте в течение 12 мес, в тоже время репродуцирующая активность гибридом, хранившихся в жидком азоте в течении 18 мес., снижалась и требовалось проведение большего количества пассажей после размораживания. Установлена также стабильность гибридом при хранении их в замороженном виде при -70 °С в течение 6 мес. с некоторым снижением активности к 12-ому месяцу хранения.

2.2.4. Идентификация полевых штаммов возбудителя бешенства с помощью МКА к глнко- и нуклеопротеннам рабического вируса методами иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа Результаты испытания МКА к структурным белкам возбудителя бешенства 12 проб патматериала от различных животных, доставленных для исследования на бешенство из различных районов Республики Татарстан представлены в таблице 2.

2. Анализ эпизоотических изолятов ВБ по МФА с использованием МКА

к глико- и нуклеопротеинам рабического вируса

Изоляты Источник выделения (мозг) Анализ отпечатков мозга по НМФ А с помощью Биопроба на белых мышах, инкубационный период, сут.

МКА к Поликло-нальной сыворотки

глико-протеину нуклео-протеину

1 2 3 4 5 6

Эксп. 3366 КРС + ++++ +++ 13...22

Эксп. 5312 + ++++ +++ 15...22

Эксп. 4688 + +++ ++ 14...20

Эксп. 3518 МРС + ++-Н- +++ 10...22

продолжение таблицы 2

1 2 3 4 5 6

Эксп. 2042 лиса отр. 1111 +++ 15...20

Эксп. 3121 лиса отр. -Н-++ +++ 14...20

Эксп. 4848 отр. ++++ +++ 12...20

Эксп. Л2 отр. отр. отр. отр.

Эксп. 5262 отр. ++++ +++ 15...23

Эксп. 5276 + ++4+ +++ 10...22

Эксп. 4765 собака отр. +++ +++ 15...21

Эксп. 2625 кошка отр. 1111 +++ 12...19

Эксп. . 3500 отр. ++++ +++ 16...21

Контроль ВБ, «Овечий» ГНКИ мышь + ++++ ++++ 5...6

Контроль ВБА, шт. ВГНКИ отр. отр. отр. 3...5

Из данных табл. 2 следует более четкое выявление антигена эпизоотических штаммов вируса бешенства в мазках-отпечатках с использованием МКА к нуклеопротеину рабического вируса, оцениваемое на 3 креста (экспертиза № 4688, 4765), а также на 4 креста (эксп. №№ 3366, 5312, 3518, 2042, 3121, 4848, 5262, 2625, 3500, 5276), тогда как с помощью поликлональной антирабической сыворотки положительная реакция оценивалась на 2-3 креста. В то же время с помощью МКА к гликопротеину возбудителя бешенства специфический АГ выявлялся лишь на 1 крест или вообще не выявлялся. При этом как положительные, так и отрицательные результаты анализа с помощью МКА полностью совпали с результатами классической биопробы на белых мышах. Однако время анализа проб по МФА занимало 5-6 часов, при этом для проведения биопробы требовалось до 26 суток наблюдения за подопытными животными.

В культуре клеток NGUK-1, зараженной эпизоотическими изолятами, выделенными из мозга КРС (эксп. 3366) и лисицы (эксп. 5262) антиген вируса бешенства с помощью МКА к белку N выявляли в НМФА в виде ярких желтовато-зеленых гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих 15-20 мкм диаметре. В контроле, где клетки NGUK-1 инкубировали с мозговой взвесью от интактных животных, и обработанные МКА к нуклеопротеину рабического вируса с дальнейшим окрашиванием флуоресцирующими антителами к Ig G белой мыши, специфических гранул не отмечено.

Таким образом, установлена антигенная гомология изученных эпизоотических изолятов . ВБ к нуклеопротеину вакцинного вируса бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ, и возможность применения МКА к нуклеопротеину рабического вируса для диагностики и идентификации возбудителя бешенства в патологическом материале непрямым МФА.

С помощью МКА к гликопротеину возбудителя бешенства специфический нуклеокапсидный АГ выявлялся слабо (лишь на 1 крест) или вообще не выявлялся, что свидетельствует об их специфичности. При этом они в реакции иммунофлуоресценции с использованием флуоресцирующего антивидового конъюгата окрашивают цитоплазматическую мембрану инфицированных клеток NGUK-1, нейтрализуют in vivo гомологичный штамм «Овечий» ГНКИ и эпизоотические изоляты с титром инфекционности 1,1-3,8 LDS0. Результаты РН, с использованием белых мышей, различных эпизоотических изолятов возбудителя бешенства моноклональными антителами к гликопротеину вируса бешенства, штамм «Овечий ГНКИ, представлены в таблице 3.

3. Результаты РН на мышах различных эпизоотических изолятов возбудителя бешенства с помощью МКА к гликопротеину вируса бешенства,

штамм «Овечий ГНКИ»

МКА к

Изоляты Источник выделения Титр вируса, Ig LD5o/0,03 мл гликопротеину,

(мозг) индекс

нейтрализации

Эксп.ЗЗбб 1,73 0,75

Эксп.5312 КРС 1,83 0,82

Эксп.5264 1,24 0,74

Эксп.3518 MPC 1,10 0,41

Эксп.2042 1,65 0,85

Эксп. 3121 1,23 0,45

Эксп. 4848 лиса 1,70 0,90

Эксп. 5262 1,14 0,34

Эксп. 5276 1,54 0,84

Эксп.4765 собака МЗ L 0,23

Эксп. 2625 • кошка 1,17 0,27

Эксп.3500 1,83 0,73

ВБ, «Овечий»

ГНКИ мышь 3,80 2,70

Серией экспериментов исследована возможность применения

моноклональных антител к структурным белкам (G и N) вируса бешенства в сэндвич-варианте ИФА для сенсибилизации планшета, контролем служил поликлональный антирабический глобулин. При этом для сенсибилизации планшета использовали МКА к гликопротеину (В 1; С 4) и нуклеопротеину (Е 2; F 3) отдельно и в смеси с активностью в ИФА 1:1280 (Ken > 2,1) и концентрацией по белку 5 мкг/мл. В качестве специфического иммуноферментного конъюгата использовали антирабический глобулин, меченный пероксидазой, взятого из «Набора...», разработанного в ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» (г. Казань). Результаты представлены в таблице 4.

4. Анализ эпизоотических изолятов рабического вируса в ИФА с использо-

ванием МКА к основным структурным белкам вируса бешенства

Титры антигена ВБ в ИФА, 1/п*, с помощью

Изоляты Источник выделения (мозг) МКА к гликопротеину МКА к нуклеопротеину МКА к глико- и нуклепротеинам 1 :1 Политонального антирабического глобулина

1 . 2 3 4 5 6

Эксп. 3366 КРС 20 20 40 40

продолжение таблицы 4

1 2 3 4 5 6

Эксп. 5312 40 40 80 80

Эксп. 4688 10 10 20 20

Эксп. 3518 МРС 40 40 80 80

Эксп. 2042 10 10 20 20

Эксп. 3121 20 20 40 40

Эксп. 4848 лиса 40 40 80 80

Эксп. 5262 10 10 20 20

Эксп. 5276 20 20 40 40

Эксп. 4765 собака • 10 10 . 20 20

Эксп. 2625 кошка 10 10 • 20 20

Эксп. 3500 40 40 80 80

Контроль ВБ «Овечий» ГНКИ мышь 160 160 320 320

Контроль ВБА, шт. ВГНКИ отр. отр. отр. отр.

Примечание: * - обратные значения титров антител к вирусу бешенства

Из данных табл. 4 следует, что наиболее приемлемым для сенсибилизации планшета является использование смеси МКА к глико- и нуклеопротеинам возбудителя бешенства. При этом титры специфического антигена ВБ в патологическом материале определяются тождественно при использовании поликлонального глобулина в пределах 1:20 - 1:320. МКА только к гликопрогеину или нуклеопротеину позволяют обнаруживать АГ в более низких титры в пределах 1:10 - 1:160. Поэтому в последующих исследованиях для сенсибилизации планшета использовали смесь МКА. Данные результаты объясняются тем, что смесь МКА к глико- и нуклеопротеинам. выявляет больший спектр антигенов в вируссодержащей суспензии, чем МКА к глико- и нуклеопротеинам в отдельности.

В дальнейшем нами была установлена возможность применения МКА к глико- и нуклеопротеинам рабического вируса для контроля антигенности антирабических вакцин. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии перекрестной реакции между МКА к белку-в и

нуклеопротеином и МКА к белку-N и гликопротеином. При этом титры антигенов вакцинных штаммов «Щелково - 51» и «РБ - 71» в ИФА с использованием МКА: к белку-G и к белку-N составил 1:256. В тоже время использование смеси МКА выявило антигенную активность вакцинных препаратов в титрах 1:512, т.е. двукратно превышающих таковые при использовании МКА к глико- и нуклеопротеинам в отдельности. Это связано с тем, что исследуемые вакцинные препараты являются цельновирионными.

Учитывая, что вируснейтрализующие антитела вырабатываются в ответ на гликопротеиновый компонент антирабической вакцины, МКА к гликопротеину вируса бешенства рекомендуем использовать для контроля антигенности вакцинных препаратов на всех стадиях технологического процесса при производстве антирабических вакцин.

2.2.5. Применение гликопротеина вируса бешенства для выявления антирабических антител методом ИФА

Целью дальнейших исследований явилось изучение возможности применения гликопротеина вируса бешенства для выявления антирабических антител в сыворотках крови иммунизированных животных, методом ИФА, а также проведение сравнительной оценки эффективности метода ИФА с РН и РДСК в лабораторных условиях.

Непрямым методом ИФА, а также в РН на мышах исследовано 10 проб сывороток крови овец, иммунизированных антигеном ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ. В РН применяли стандартный вирус бешенства, штамм CVS, в концентрации 500 LD50/0,03 мл.

Для сенсибилизации планшета использовали специфический антиген на основе гликопротеина вируса бешенства, штамм "Овечий" ГНКИ, активность которого в ИФА составила 1:1280 (КсП=2,1), в концентрации по белку - 5 мкг/мл. В качестве антивидовых конъюгатов использовали диагностические антитела против иммуноглобулинов барана и кроликов,

меченных пероксидазой, производства НИИЭ и М им. Н.Ф. Гамалеи, в рабочем разведении 1:4000.

Сопоставление полученных данных свидетельствует о прямой корреляции результатов титрования сывороток крови методом ИФА и РН на мышах (г = 3; Р < 0,05). По чувствительности метод ИФА превосходит реакцию нейтрализации.

Непрямым методом ИФА и параллельно в РДСК было исследовано 77 проб сывороток крови овец, иммунизированных антигеном вируса бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ.

В острых опытах установлено, что защитным титром специфических антител является разведение 1:800 и более.

Полученные результаты показывают, что, непрямой вариант ИФА с использованием гликопротеина ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ высокочувствителен и специфичен. Чувствительность его превосходит РДСК более чем в 100 раз. Таким образом, установлена возможность применения гликопротеина вируса бешенства, штамм "Овечий" ГНКИ для титрования антирабических сывороток методом ИФА.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствованы методы идентификации вируса бешенства с применением моноклональных антител (МКА) к глико- и нуклеопротеинам рабического вируса, определяющих его групповую принадлежность. Получены 13 клонов гибридом, стабильно продуцирующие специфические антитела, в том числе: 6 клонов — к гликопротеину и 7 клонов - к нуклеопротеину возбудителя бешенства, штамм "Овечий " ГНКИ.

2. Установлено преимущество метода ультрацентрифугирования для очистки и концентрирования вируса бешенства по сравнению с осаждением ацетатом цинка и ПЭГ 6000. При этом титр инфекционности вируса повышается в 45,7 раза, а антигенная активность - в 20 раз.

3. Получены очищенные глико- и нуклеопротеиновые компоненты вируса бешенства путем фракционирования в градиенте плотности сахарозы (15-

50%), высокая степень чистоты которых подтверждена электрофорезом в ПААГ, а специфичность - методами иммуноблоттинга, ИФА, НМФА и PH.

4. Изыскана оптимальная схема гипериммунизации белых мышей линии BALB/c, обеспечивающая максимальный выход спленоцитов, вырабатывающих антитела к антигенам вируса бешенства. Схема предусматривает пятикратное введение смеси антигена с полным адъювантом Фрейнда с интервалом в 7 суток и сочетанием внутрибрюшинных инъекций с подкожными.

5. Моноклональные антитела к гликопротеину вируса бешенства, штамм "Овечий" ГНКИ, в реакции иммунофлуоресценций с использованием флуоресцирующего антивидового конъюгата окрашивают цитоплазматическую мембрану инфицированных клеток NGUK-1, нейтрализуют in vivo гомологичный штамм "Овечий" ГНКИ и эпизоотические изоляты с титром инфекционности 1,1-3,8 LD50 и могут быть использованы для контроля антигенной активности антирабических вакцин.

6. Моноклональные антитела к нуклеопротеину возбудителя бешенства выявляют нуклеокапсидный антиген эпизоотических изолятов вируса бешенства в патматериале и культуре клеток NGUK-1, но не вступают в реакцию нейтрализации. Установлена большая специфичность МКА к нуклеопротеину вакцинного штамма рабического вируса, по сравнению с поликлональной сывороткой, проявляющаяся более выраженной флуоресценцией нуклеокапсидов эпизоотических изолятов, что свидетельствует об антигенной гомологии эпизоотических изолятов и нуклеопротеина вакцинного штамма рабического вируса.

7. Установлена стабильность гибридом, продуцирующих МКА к антигенам вируса бешенства при хранении в жидком азоте (-196°С) в течение 12 месяцев.

исследование проб сывороток крови животных в непрямом ИФА, РДСК и РН на мышах показало прямую корреляцию результатов серологических тестов и высокую чувствительность и экспрессность ИФА по сравнению с РДСК и РН.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты исследований вошли в следующие разработанные и внедренные в практику НТД:

1. "Наставление по применению набора препаратов для выявления антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства методом иммуноферментного анализа (ИФА)", утвержденное директором ВНИВИ 21.11.2003 г.;

2. "Инструкцию по применению моноклональных антител к нуклеопротеину рабического вируса для идентификации возбудителя бешенства методом иммунофлуоресценции, утвержденная директором ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ", г. Казань от 15.05.2006 г.;

3. "Инструкцию по применению набора препаратов на основе моноклональных антител к антигенам рабического вируса для идентификации возбудителя бешенства методом иммуноферментного анализа (ИФА), утвержденная директором ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ", г. Казань от 9.06.2006 г.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тимиргалеев. Р.В. Изыскание оптимальной схемы гипериммунизации белых мышей линии BALB/c антигеном вируса бешенства / H.A. Хисматуллина, Р.В. Тимиргалеев. В.Г. Гумеров, Р.Х. Юсупов, Р.Я. Гильмутдинов // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины». - Ульяновск, 2003. - Т.1. - С. 121-122.

2. Тимиргалеев. Р.В. Получение и применение моноклональных антител для идентификации возбудителя бешенства / H.A. Хисматуллина,

P.B. Тимиргалеев, В.Г. Гумеров, Л.И. Матвеева, Р.Я. Гильмутдинов, Р.Х. Юсупов // - Там же -Т. 1.- С. 142 - 143.

3. Тимиргалеев, Р.В. Получение гибридом, продуцирующих моноклонапьные антитела к гликопротеину и нуклеопротеину возбудителя бешенства / Р.В. Тимиргалеев, H.A. Хисматуллина, Р.Я. Гильмутдинов, Р.Х. Юсупов, В.Г. Гумеров // Материалы международного симпозиума «Научные основы обеспечения защиты от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных заболеваний. - Казань, 2005. - 4.2. - С. 333-338.

4. Тимиргалеев. Р.В. Иммуноферментный анализ патматериала с помощью моноклональных антител к глико- и нуклеопротеину вируса бешенства / Р.В. Тимиргалеев, H.A. Хисматуллина // Матер. Всероссийской научно-практической конференции "Перспективы агропромышленного производства регионов России в условиях реализации приоритетного национального проекта "Развитие АПК", 28 февраля-3 марта 2006 г.: Уфа, 2006.-С. 97.

5. Тимиргалеев. Р.В. Получение и применение концентрированного вируса бешенства и его структурных белковых фрагментов / Р.В.Тимиргалеев, Н.А.Хисматуллина, В.Г.Гумеров // - Там же-. - С. 97-98.

6. Тимиргалеев. Р.В. К вопросу диагностики бешенства с помощью моноклональных антител методом флуоресцирующих антител / Р.В.Тимиргалеев, Н.А.Хисматуллина //- Там же-.- С. 99.

7. Тимиргалеев. Р.В. Способ получения очищенного и концентрированного вируса бешенства и его структурных компонентов / Р.В.Тимиргалеев // «Учёные записки» Казанской государственной академии ветеринарной медицины. - 2006. -Т.183-С. 210-216.

Заказ №2. Подписано в печать 07.12.06. Формат 60x84 1/16. Усл. п. л. 1. Тираж 100 экз. Офсетный участок ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). Адрес: 420075, г. Казань, Научный городок-2.

Оглавление диссертации Тимиргалеев, Руслан Владимирович :: 2006 :: Казань

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика вирусов группы бешенства.

1.2. Методы лабораторной диагностики бешенства.

1.2.1. Методы обнаружения антигена возбудителя бешенства и специфических к нему антител.

1.2.2. Методы выделения вируса бешенства.

1.2.3. Идентификация штаммов вируса бешенства с помощью мо-ноклональных антител.

1.2.4. Методы обнаружения генома возбудителя бешенства.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1. Материалы исследований.

2.1.2. Методы исследований.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Разработка диагностических препаратов для выявления и идентификации вируса бешенства на основе моноклональных антител (МКА).

3.1.1. Получение очищенного и концентрированного вакцинного вируса бешенства и его основных структурных белков.

3.1.2. Изыскание оптимальной схемы гипериммунизации белых мышей линии ВАЬВ/с антигеном возбудителя бешенства.

3.1.3. Получение гибридом, продуцирующих МКА к структурным белкам возбудителя бешенства и изучение их свойств.

3.1.4. Идентификация полевых штаммов возбудителя бешенства с помощью МКА к глико- и нуклеопротеинам рабического вируса.

3.2. Применение гликопротеина вируса бешенства для выявления антирабических антител методом ИФА.

4. Обсуждение результатов собственных исследований.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Тимиргалеев, Руслан Владимирович, автореферат

Актуальность проблемы. Бешенство - острое вирусное заболевание общее для животных и человека, характеризующееся признаками полиэнцефаломиелита с летальным исходом (Авилов В.М. и соавт., 1994; Никишин И.В. и соавт., 1995; Селимов М.А., 1998; Груздев К.Н. и соавт., 2001).

Сложная эпидемическая и эпизоотическая ситуация по этой инфекции наблюдается более чем в 110 странах мира (Дрансейка A.JL, Таршис М.Г., 1987). Ежегодно в мире погибает свыше 50 -70 тыс. человек и более 1 млн. животных. Число заболеваний домашних и диких животных в ряде регионов растет и, наряду с типичной, регистрируются и атипичные формы течения болезни (Панкова Г.Е., 1984; http://Rabies - Wikipedia, the free encyclopedia, 2006).

Как известно, для возбудителя бешенства характерны выраженная вариабельность антигенной структуры и изменчивость (Таршис М.Г. и соавт., 1990; Селимов М.А., 1998; Груздев К.Н. и соавт., 2001; Nadin Davis et al., 1993 и др.). В работах H.A. Хисматуллиной, А.Н. Чернова, Р.Х. Юсупова и др. (1999-2006) установлено различие по степени патогенности эпизоотических изолятов, циркулирующих на территории Татарстана, индекс инвазив-ности для которых колеблется в пределах от 0,9 до 2,3. Однако до сих пор не ясно, в каких отношениях находятся антигенные структуры гликопротеида и нуклеокапсидного белка вакцинных штаммов и эпизоотических изолятов ра-бического вируса, циркулирующих на территории Республики Татарстан.

В целом применяемые в практике диагностические препараты на основе поликлональных антител, обеспечивая установление диагноза бешенства, не выявляют межштаммовые различия рабического вируса. Моноклональные антитела, обладая узкой специфичностью, позволяют идентифицировать штаммы рабического вируса, в частности, дифференцировать серотипы группы бешенства (Селимов М.А. и соавт., 1982-1998; Ботвинкин А.Д. и соавт., 1989-2004; Кузьмин И.В. и соавт., 1992; Кузьмин И.В., 1998; Wiktor Т.,

1975; Wiktor Т. et al., 1978-1981; Schneider L., et al., 1985; Lafon M., 1996; OkohA., 2000 и др.).

Не менее актуален вопрос контроля эффективности вакцинопрофилак-тики бешенства животных, в особенности диких плотоядных, при оральной иммунизации.

Традиционно используемая реакция вирусной нейтрализации (РН) для выявления антирабических антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях (Webster L., Dawson J., 1935; Briggs D. et al., 1998) трудоемка и требует длительного наблюдения.

Имеющиеся разработки метода ИФА для ускоренного определения титра антирабических антител в сыворотках крови людей и животных (Ботвинкин А.Д. и соавт., 1986; Сазанова Э.Я. и соавт., 1991; Хисматуллина Н.А.и соавт., 1989, 2000; Barton L.D., Campbell J.B. 1988; Elmgren L.D., Wandeler A.I. 1996; Atanasiu P. et al., 1977; Nicholson K.G., Prestage H., 1982) не вышли за рамки лабораторных исследований.

1. Разработать технологию получения моноклональных антител к глико-и нуклепротеинам вируса бешенства для идентификации рабического вируса в патматериале.

2. Получить высокоактивный очищенный вирус бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ, выделить его структурные белки (глико- и нуклеопротеи-ны), использовать их в качестве иммуногенов, а гликопротеин также - для иммуноферментного анализа активности антирабических сывороток.

5. Изучить возможность применения гликопротеина вакцинного штамма вируса бешенства для выявления антирабических антител методом иммуно-ферментного анализа.

Практическая ценность. Установлена антигенная гомология эпизоотических изолятов, циркулирующих на территории Республики Татарстан, глико- и нуклеопротеинам вакцинного штамма вируса бешенства. Моноклональные антитела к глико- и нуклеопротеинам вируса бешенства рекомендуется использовать для идентификации возбудителя бешенства в патологическом материале. Выделенные структурные белки вируса бешенства (глико- и нук-леопротеины) могут быть применены в качестве антигенов для получения высокоспецифичных сывороток при создании более совершенных серологических тест-систем для диагностики и контроля вакцинопрофилактики бешенства.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

Ежегодных отчетных научных сессиях ФГНУ «ВНИВИ» - ФГУ «ФЦТРБ» по итогам НИР за 2001 - 2005 гг.; Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию создания ВНИИВВиМ «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (Покров, 2003); Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины УГСА «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Ульяновск, 2003); Всероссийской научно-практическй конференции посвященной 45-летию ВНИВИ (Казань, 2005); Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от эко-токсикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005); Всероссийской научно-практической конференции "Перспективы агропромышленного производства регионов России в условиях реализации приоритетного национального проекта "Развитие АПК" (Уфа, 2006).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту:

2. Оптимальная схема гипериммунизации белых мышей линии ВАЬВ/с антигеном вируса бешенства.

Заключение диссертационного исследования на тему "Усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител"

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствованы методы идентификации вируса бешенства с применением моноклональных антител (МКА) к глико- и нуклеопротеинам рабического вируса, определяющих его групповую принадлежность. Получено 13 клонов гибридом, стабильно продуцирующих специфические антитела, в том числе: 6 клонов - к гликопротеину и 7 клонов - к нуклеопротеину возбудителя бешенства, штамм "Овечий " ГНКИ.

3. Получены очищенные глико- и нуклеопротеиновые компоненты вируса бешенства путем фракционирования в градиенте плотности сахарозы (15-50%), высокая степень чистоты которых подтверждена электрофорезом в ПААГ, а специфичность - методами иммуноблоттинга, ИФА, НМФА и PH.

5. Моноклональные антитела к гликопротеину вируса бешенства, штамм "Овечий" ГНКИ, в реакции иммунофлуоресценции с использованием флуоресцирующего антивидового конъюгата окрашивают цитоплазматическую мембрану инфицированных клеток NGUK-1, нейтрализуют in vivo гомологичный штамм "Овечий" ГНКИ и эпизоотические изоляты с титром инфекционности 1,1-3,8 LD50 и могут быть использованы для контроля антигенной активности антирабических вакцин.

6. Моноклональные антитела к нуклеопротеину возбудителя бешенства выявляют нуклеокапсидный антиген эпизоотических изолятов вируса бешенства в патматериале и культуре клеток КОЦК-1, но не вступают в реакцию нейтрализации. Установлена большая специфичность МКА к нуклеопротеину вакцинного штамма рабического вируса, по сравнению с поликлональной сывороткой, проявляющаяся более выраженной флуоресценцией нуклеокапсидов эпизоотических изолятов, что свидетельствует об антигенной гомологии эпизоотических изолятов и нуклеопротеина вакцинного штамма рабического вируса.

8. Использование гликопротеина рабического вируса, штамм «Овечий» ГНКИ, обеспечивает выявление антирабических антител в сыворотках крови животных методом иммуноферментного анализа. Сравнительное исследование проб сывороток крови животных в непрямом ИФА, РДСК и РН на мышах показало прямую корреляцию результатов серологических тестов и высокую чувствительность и экспрессность ИФА по сравнению с РДСК и РН.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В результате проведенных исследований разработаны:

1) Наставление по применению набора препаратов для выявления антира-бических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства методом иммуноферментного анализа (ИФА), утвержденное директором ВНИВИ, г. Казань от 21.11.2003 г.

2) Инструкция по применению моноклональных антител к нуклеопротеину рабического вируса для идентификации возбудителя бешенства методом имму-нофлуоресценции, утвержденная директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань от 15.05.2006 г.

3) Инструкция по применению набора препаратов на основе моноклональных антител к антигенам рабического вируса для идентификации возбудителя бешенства методом иммуноферментного анализа (ИФА), утвержденная директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань от 9.06.2006 г.

Моноклональные антитела к глико- и нуклеопротеинам вируса бешенства рекомендуется использовать для идентификации штаммов данного возбудителя. Выделенные структурные белки вируса бешенства (глико- и нуклеопротеины) могут быть использованы в качестве иммунизирующих антигенов для получения высокоспецифичных сывороток при создании более совершенных серологических тест-систем.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2006 года, Тимиргалеев, Руслан Владимирович

1. Оценка методом иммунопереноеа серологической активности белков Бру-целла абортус / B.C. Авилов, В.Н. Авилов, В.А. Седов и др.// Вопр. инфекционной патологии животных: Межвуз. сб. науч. тр. Казань, 1994. - С. 18-21.

2. Анкер, М.И. Реакция связывания комплемента при бешенстве и ее диагностическое значение / М.И. Анкер, В.В. Флоринский // Журн. микробиологии и иммунологии.- 1931.- №2. -С. 175.

3. Антигенная характеристика полевых штаммов вируса бешенства из различных районов СССР с помощью антинуклеокапсидных моноклональных антител / А.Д. Ботвинкин, М.А. Селимов, Е.В. Клюева, Л.Я. Грибанова, H.A. Хисма-туллина // ЖМЭИ. 1990. - №1.- С. 50-54.

4. Антигенные варианты вируса бешенства в Якутии / А.Д. Ботвинкин, Л.Я. Грибанова., В.Ф. Чернявский, А.Н. Барашков и др. // Вопр. региональной гигиены, санитарии и эпидемиологии: Сб. ст. МЗ Якут. АССР. Респ. санэпидстанция и др. Якутск, 1990. - С. 160-161.

5. Антигенные варианты вируса бешенства, связанные с заболеваниями людей в России и странах ближнего зарубежья / А.Д. Ботвинкин, М.А. Селимов, М.А. Штыкова, В.В. Хозинский // Тез. докл. науч. конф. «Современные проблемы рабиологии». М., 1998. - С.34.

6. Барановская, С.А. Экспериментальное бешенство белых мышей / С.А.

7. Барановская // Архив биологических наук. 1936. - № 4L - С.157-163.

8. Барсков, В.Г. Получение моноклональных антител и разработка на их основе средств диагностики классической чумы свиней: Дис. . канд. вет. наук: 16.00.03.-Казань, 1975.-157 е.: ил.

9. Бешенство животных в Российской Федерации / В.А. Ведерников, И.В. Балдина, A.A. Шабейкин, A.M. Гулюкин, A.A. Харкевич // www.privivka.ru. -2005.-1 с.

10. Бешенство среди диких животных / Н.Д. Анина-Радченко, Н.Д. Корчмарь, Л.В. Глушко, Н.Г. Касьян, Т.Н. Помирко // Ветеринария. 1970. - №10. -С. 64-65.

11. Бойко, A.A. Создание иммуноферментных препаратов / A.A. Бойко // Тез. докл. 3-ей Всесоюзн. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов». М., 1987. - С. 201-202.

12. Ботвинкин, А.Д. Обнаружение антител к вирусу бешенства в сыворотке крови людей с помощью иммуноферментного метода / А.Д. Ботвинкин, М.А. Се-лимов, Т.Н. Згурская // Вопр. вирусологии. 1986. - Т. 31, № 3. - С. 333-334.

13. Ботвинкин, А.Д. Обнаружение вируса бешенства в головном мозге и слюнных железах животных с помощью иммуноферментного метода / А.Д. Ботвинкин, С.М. Чернов, Л.Я. Грибанова // Вопр. вирусологии. -1987. № 6. -С.747-750.

14. Ботвинкин, А.Д. Особенности эпидемиологии гидрофобии и экология вируса бешенства в условиях преобладания очагов природного типа: Дис. . докт. мед. наук. М., 1992. - 58 с.

15. Ботвинкин, А.Д. Природные очаги бешенства в Российской Федерации / А.Д. Ботвинкин, Сидоров Г.Н. // Этиология, эпидемиология и диагностика инфекционных заболеваний Восточной Сибири. Иркутск, 1992. - С. 182-189.

16. Ботвинкин, А.Д. Современное состояние и эпидемиологическое значение природных очагов бешенства в Западной Сибири / А.Д. Ботвинкин, Л.Я. Грибанова, Г.Н. Сидоров // Природноочаговые болезни человека. Омск, 1988. -С. 111-113.

17. Бусыгин, К.Ф. Диагностика бешенства методом флуоресцирующих антител / К.Ф. Бусыгин // Тез. докл. Всесоюзн. конф. (КГВИ). Казань, 1985. -С. 136.

18. Бусыгин, К.Ф. Люминесцентная диагностика инфекционных болезней животных / К.Ф. Бусыгин. М.: Колос, 1975. - 160 с.

19. Бусыгин, К.Ф. Применение метода диффузной реакции преципитации в агар-геле для изучения специфичности иммунных сывороток / К.Ф. Бусыгин // Ученые записки КГВИ. 1964. - Т. 90. - С. 144-149.

20. Бучнев, К.Н. Методы диагностики бешенства. Сравнительная оценка / К.Н. Бучнев // Докл. совр. ученых. М., 1971. - С. 3-5.

21. Бучнев, К.Н. Специфичность и чувствительность реакции преципитации в агаровом геле при диагностике бешенства / К.Н. Бучнев, A.A. Росляков, Э.В. Ивановский // Труды науч.-контрол. института ветеринар, препаратов. М., 1968. -Т. 15-С. 30-35.

22. Вагапов, P.M. Вирусы группы бешенства / P.M. Вагапов, И.Ф. Баринский // Вопр. вирусологии. 1979. - № 5. - С. 451-457.

23. Ваненков, М.В. Диагностика и эпизоотология бешенства / М.В. Ванен-ков, Б.Л. Десятников // Ветеринария. 1962. - № 1. - С. 23-24.

24. Васильева, И.Г. Применение реакции диффузионной в геле для изучения свойств фиксированного вируса бешенства / И.Г. Васильева, Г.А. Ломакина // Матер. Межинститут, науч. конф. памяти A.A. Тарасевича. М., 1965. - С. 95-96.

25. Ведерников, В.А. Бешенство животных / В.А. Ведерников, В.А. Седов,

26. Э.В. Ивановский. M.: Колос. - 1974. - 112 с.

27. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В.Соловьев, Н.В.Фомина. М., ВНИТИБП. - 1998. - С. 304.

28. Вишняков, И.Ф. Иммуноферментный анализ / И.Ф. Вишняков, Л.Я. Цы-банова // Ветеринария. 1983. - № 9. - С. 68-70.

29. Волчкевич, Ж.А. Белковые спектры рода Pseudomonas в таксономическом аспекте: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1990. - С. 28.

30. Вуннер, В. Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов / В. Вуннер // Вирусология. Методы. 1988. - № 3. - С. 3-7.

31. Галиуллин, А.К. Оценка противосибиреязвенного иммунитета в имму-ноферментном и радиоиммунном анализе / А.К. Галиуллин, В.П. Коксин, K.M. Салмаков // Тез. докл. Республ. научно-производств. конф. Казань, 1992. -С. 20.

32. Глобенко, Л.А. Получение гибридом и моноклональных антител к вирусу везикулярной болезни свиней / Л.А. Глобенко, В.Ю. Фоменко, Ж.А. Шажко // Пробл. инфекц. патологии с.-х. животных. Владимир, 1997. - С. 115-116.

33. Горбачев, E.H. Выявление антител к антигенам коксиелл Бернета в им-муноферментном анализе / E.H. Горбачев, Н.К. Токаревич, Д.К. Федоров // Рик-кетсиозы. 1989. -Т. 66. - С. 127-136.

34. Горбачев, E.H. Обнаружение антигенов коксиелл Бернета иммунофер-ментным методом / E.H. Горбачев, Н.К. Токаревич, В.Н. Вербов // Твердофазный иммуноферментный анализ. 1988. -Т. 64. - С. 158 -161.

35. Грибенча, C.B. Получение и характеристика гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к структурным белкам вируса бешенства штамма Вну-ково-32 / C.B. Грибенча, О.В. Василенко, В.Н Фуралев // Вопросы вирусологии. -1991. Т. 36, №4. - С. 318-321.

36. Грибенча, C.B. Разработка в эксперименте принципов построения оптимальной схемы прививок инактивированной культуральной антирабической вакциной / C.B. Грибенча, И.Ф. Баринский // Вопросы вирусологии. 1987. - Т. 32, №4.-С. 487-492.

37. Грибенча, C.B. Современные аспекты биологии и профилактики лисса-вирусных инфекций (экспериментальное исследование): Дис. . докт. мед. наук. -М., 1993.-80 с.

38. Груздев, К.Н. Бешенство животных / К.Н. Груздев, В.В. Недосеков М.: Аквариум, 2001. - 303 с.

39. Гулиев, М.А. Применение флуоресцирующих антител и биопробы на новорожденных кроликах для ускоренной диагностики бешенства в Грузинской ССР: Автореф. дисканд. вет. наук. Тбилиси, 1966. - 18 с.

40. Дегтева, Г.К. Расследование пищевых токсикоинфекций стафилококковой этиологии с использованием сопоставления спектра внеклеточных белков выделенных возбудителей / Г.К. Дегтева, Т.В.Носова, Г.М.Казанская // ЖМЭИ. -1990.-№3.-С. 31-34.

41. Дегтева, Г.К. Сопоставление белковых спектров типичных и атипичных микобактерий методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле / Г.К. Дегтева, Г.И. Прейс, С.А. Голубева // ЖМЭИ. 1975. - № 3. - С. 23-26.

42. Джонсон, Х.Н. Реакция нейтрализации на мышах / Х.Н. Джонсон // М.М. Каплан, X. Копровски Методы лабоаторных исследований по бешенству. ВОЗ. -Женева, 1975.-С. 94-97.

43. Джупина, С.И. Роль диких животных в эпизоотологии классических инфекций с.-х. животных и меры контроля эпизоотологического процесса / С.И. Джупина // Болезни и паразиты диких животных. М., 1992. - С. 22-23.

44. Дзантиев, Б.Б. Современное состояние и перспективы развития иммуно-ферментного анализа / Б.Б. Дзантиев, А.М. Егоров // Журн. Всесоюз. химич. общества им. Д.И. Менделеева. -1982. -Т. 27. № 4. - С. 442^49.

45. Диагностика бешенства с применением реакции преципитации в агаровом геле / К.Н. Бучнев, М.М. Шахматов, В.Л.Титов, Л.Е. Меньшикова, Кривенко О.П., В.Н. Вовк, М.М. Лагишева, Г.В. Полубоярова // Ветеринария. 1963. - № 3. -С. 66-70.

46. Диагностика инфекционной агалактии авоц и коз методом иммунофер-ментного анализа / Х.З. Гафаров, Р.Г. Гизатуллин, М.В. Летова, Л.А. Жандарова // Вопр. инфекционной патологии животных: Межвузовск. сб. науч. трудов. Казань, 1994.-С. 13.

47. Дрансейка, А.Л. Системный анализ ситуации по бешенству / А.Л. Дран-сейка, М.Г. Таршис // Докл. ВАСХНИИЛ. 1987. - №6. - С. 40-43.

48. Живая культуральная вакцина против чумы плотоядных на основе перевиваемой линии клеток / И.Ф. Вишняков, Е.М.Хрипунов, В.Я. Савукова и др. // Пробл. инфекц. патологии с.-х. животных. Владимир, 1997. - С. 179.

49. Жукова, Г.И. Сравнительная характеристика общеклеточных белков гонококков как возможный эпидемиологический маркер: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Киев, 1988. - 26 с.

50. Иванов, B.C. Состояние и перспективы борьбы с бешенством животных и человека / B.C. Иванов, П.П. Кузнецов, Е.Э. Школьников // Вестн. РАСХН. -2000. -№3.- С. 51.

51. Ивановский, Э.В. Разработка и усовершенствование вакцин для специфической профилактики бешенства животных: Дис. . докт. ветер, наук. М., 1991.-95 с.

52. Игнатьев, C.B. Моноклональные антитела / C.B. Игнатьев // Ветеринария. 1990. -№ 8. - С. 27-29.

53. Идентификация вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции / М.С. Пантюшенко, М.А. Наумкина, В.В. Недосеков, И.Ф. Вишняков, С.Ж. Цыбанов // Тез. докл. науч. конф. «Современные проблемы рабиологии». М., 1998.-С. 25-28.

54. Иммуноферментный анализ / под ред. Г.Г. Нго, Г.М. Ленхофф. М., 1988.-243 с.

55. Иммуноферментный анализ при индикации вируса бешенства и определении уровня антител / Э.Я. Сазанова, C.B. Кузнецова, Е.В. Маслов, A.A. Бойко, B.C. Иванов, П.П. Кузнецов // Ветеринария. 1991. - № 8. - С. 62-64.

56. Индикация и дифференциация вируса болезни Марека методами ПЦР и прямого секвенирования / А.Г. Аминев, C.B. Полехин, В.Г. Андреев и др. // Пробл. инфекц. патологии с.-х. животных. Владимир, 1997. - С. 159.

57. Использование иммуноферментного анализа для диагностики хламидио-за свиней / Ф.М. Хусаинов, Р.Х. Хамадеев, А.З. Равилов, H.A. Хисматуллина // Тез. докл. всерос. научно-практ. конф. «Вирус, болезни с. х. животных».- Владимир, 1995.-С. 67.

58. Использование микрометода для определения инфекционной активности вируса бешенства / С.А. Дудников, С.Р. Кременчугская, И.Н. Селютина // Пробл. инфекц. патологии с.-х. животных. Владимир, 1997. - С. 172-173.

59. Исследование ИФА для индикации фузобактерий некроза в патологическом материале / Д.А. Хузин, Е.К. Акимов, H.A. Хисматуллина, Х.Н. Макаев,

60. B.B. Сабирова // Тез. докл. научно-практ. конф. «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний». Биотехнология. Ветеринария. -Киров, 1998.-С. 254.

61. К диагностике бешенства / Г.А. Коломакин, К.В. Иванова, М.С. Козина, М.М. Смирнова // Ветеринария. 1964. - № 10. - С. 90-91.

62. К эпизоотологии заразных болезней, распространяемых дикими животными / А.З. Равилов, Р.Х. Юсупов, В.А. Верхолетов, Р.Н. Ахметов // Болезни и паразиты диких животных: сб. трудов. М., 1992. - С. 27-32.

63. Клюева, Е.В. Иммунофлуоресцентный метод индикации антигена вируса бешенства, выращенного in vivo и in vitro: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -М., 1967.- 17 с.

64. Клюева, Е.В. Ускоренная диагностика бешенства с помощью метода флуоресцирующих антител / Е.В. Клюева, Е.В. Семенова, М.А. Селимов // Вопр. борьбы с бешенством. М., 1966. - С. 16-17.

65. Ковалев H.A. Радиоиммунологический метод определения напряженности антирабического иммунитета / H.A. Ковалев // Рекомендации МСХ СССР по внедрению достижений науки и передового опыта в производстве. М., 1980.1. C. 73-74.

66. Ковалев, H.A. Выделение вируса бешенства / H.A. Ковалев // Новые методы диагностики зоонозной инфекции. Минск, 1982. - С. 47-49.

67. Ковалев, H.A. Иммуноферментное исследование отпечатков роговицы при бешенстве / H.A. Ковалев, A.C. Шашенько // Ветеринария. 1970. - № 9. -С. 44-46.

68. Коломакин, Г.А. К вопросу серологической диагностики / Г.А. Кол омакин, М.С.Тимонина // Ветеринария. 1972. - № 5. - С. 105-106.

69. Колупаев, В.Е. Преимущества метода ПЦР в реальном времени (Real Time PCR) // Сб. тез. IV Всерос. научно-практ. конф. «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (22-24 октября 2002 г.). М., 2002. - С. 182-184.

70. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству: 8-ой докл. Женева. -1994. -ВОЗ.-118 с.

71. Комплексная диагностика бешенства животных в Казахской ССР / Г.А. Коломакин, М.Н. Коробченко, Г.А. Бельченко, М.С. Тимохина, В.В. Легкодимов, М.А. Смирнова, В.Б. Ивановский // Ветеринария. 1968. - № 6. - С. 98-99.

72. Крупальник, В.Л. Бешенство собак в Шри-Ланке и меры борьбы с ними / В.Л. Крупальник, С. Нагасингх // Актуальные Вопр. инфекц. и инвазион. животных. -1995. С. 130-131.

73. Кузьмин, И.В. Р-41 положительный штамм рабического вируса выделен от человека на Севере Красноярского края / И.В. Кузьмин, З.С. Лукашенко / / Тез. докл. науч. конф. "Современные проблемы радиологии". М., 1998. - С. 7-8.

74. Лакин, Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособ. для биологич. спец. ВУЗов / Г.Ф. Лакин. -М.: Высш. шк., 1980. 293 с.

75. Лиссавирус с необычной антигенной структурой, выделенный от летучей мыши на юге Кыргыстана / И.В. Кузьмин, А.Д. Ботвинкин, С.Н. Рыбин, А.В. Баялиев // Вопр. вирусологии. 1992. - № 5-6. - С. 256-259.

76. Лиссаподобный вирус Юли и идентификация его с помощью антинук-леокапсидных моноклональных антител (НК МКАТ) / М.А. Селимов, А.Г. Тата-ров, А.Д. Ботвинкин, Л.И. Куликова, Н.А. Хисматулина // Rabies information Exchange. -USA, 1987. P. 5 - 15.

77. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: справочник / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. М.: Агро-промиздат, 1986. - С. 82 - 278.

78. Михайловский, Е.М. Адаптация уличного вируса бешенства к первичной культуре ткани сирийского хомяка / Е.М. Михайловский, М.А. Селимов // Acta viral. 1966. - Т. 10, Вып. 4. - С. 373.

79. Михайловский, Е.М. Выращивание уличного вируса бешенства в культуре клеток различного происхождения / Е.М. Михайловский // Актуальные проблемы вирусных инфекций: 12-й науч. сессии ИПВЭ. М., 1965. - С. 361-364.

80. Мокроусов, А.К. Ускоренная биопроба при исследование на бешенство / А.К. Мокроусов, З.И. Титлова // Ветеринария. 1971. - № 2. - С. 99.

81. Моноклональные антитела к возбудителю хламидиозного аборта овец / P.A. Шафикова, Ф.Г. Нагиева, Р.Н. Сафин, А.З. Равилов, В.Г. Никулина, Н.И. Краснова // Первый съезд иммунологов России. Новосибирск, 1992. - С. 549.

82. Морфологические свойства культурального фиксированного вируса бешенства / Л.Г. Деметрадзе, Н.П. Николаева, Э.В. Ивановский, Ю.И. Могильный, Е.И. Скалинский//Ветеринария. 1990. - Т. 3. - С.24-25.

83. Наблюдение за циркуляцией госпитальной микрофлоры в ожоговом стационаре с помощью электрофоретического анализа белков / Г.К. Дегтева, С.И. Пылаева, И.В. Мусонова и др. // ЖМЭИ. 1994. - № 6. - С. 11-12.

84. Нго, Т.Т. Электрофоретический перенос в сочетании с иммунофермент-ным анализом / Т.Т. Нго, Г. Ленхофф // Иммуноферментный анализ. М.: Наука, 1987.-С. 341-350.

85. Недосеков, B.B. Контроль ннактнвированных антнрабическнх вакцин сэндвич-вариантом ИФА / В.В. Недосеков, И.Ф. Вишняков, A.A. Стрижаков // Матер. Междунар. научно-практ. конф., посвящ. 40-летию ВНИИВВ и М. Покров, 1998.-С. 245.

86. Некоторые общие соображения и предпосылки / В.В. Макаров, В.А. Ведерников, С.И. Джупина, И.В. Кузьмин // Ветеринарная патология. 2002. - № 1. -8 с.

87. Непрямой иммуноферментный метод для диагностики геморрагических лихорадок JIacca и Эбола / А.П. Иванов, Е.А.Ткаченко, Г. ван дер Грун, A.M. Бужено, O.K. Константинов // Вопр. вирусологии. 1986. - № 2. - С. 186-190.

88. Новый способ установления диагноза на бешенство / К.Н. Бучнев, М.М. Шахматов, В.Л. Титов, Л.Е. Меньшикова, О.П. Кривенко, В.Н. Вовк, М.М. Лаги-шева, Г.В. Полубоярова// Сельское хозяйство Казахстана. 1960. - № 12. - С. 78 -81.

89. Остерман, JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / Л.А. Остерман. М.: Наука, 1983. - С. 11 -25.

90. Очистка и концентрирование вируса бешенства полиэтиленгликолем / C.B. Кузнецова, П.И. Перецереев, П.П. Кузнецов, И.С. Игнатьева // Ветеринария. -1974.-№9.-С. 42-43.

91. Павловский, В.В. Специфическая профилактика бешенства / В.В. Павловский, Л.П.Семенова, Э.В. Ивановский // Тр. Всесоюзн. госуд. науч.-контрол. института вет. препаратов. М., 1975. - С. 35-40.

92. Панкова, Г.Е. Меры борьбы с бешенством животных / Т.Е. Панкова // ВАСХНИЛ Всесоюз. науч.-исслед. инст. информации и технико-экономич. ис-следов. по с.х.: Обзорная информация. М., 1984. - 51 с.

93. Папуниди, К.Х. Иммуноферментный метод для серологической диагностики ботулизма / К.Х. Папуниди, Г.Л. Адгамова // Рациональные методы профилактики, диагностики и терапии незаразных болезней животных: сб. науч. тр. КВИ. Казань, 1993. - С. 94-95.

94. Патоморфологические особенности экспериментальной инфекции у животных, зараженных вирусами антигенной группы бешенства / К.А. Ванаг, E.H. Бычкова, А.К. Шубладзе, В.А. Максимова // Вопр. вирусологии. 1979. - № 1.-С. 77-83.

95. Перадзе, Т.В. Иммунологическая диагностика вирусных заболеваний / Т.В. Перадзе, П. Халонена М.: Медицина, 1985. - 302 с.

96. Пиле, Э.Р. Лиссавирусы / Э.Р. Пиле // Вопр. вирусологии. 1996. - №1. - С. 2-6.

97. Полимеразная цепная реакция в диагностике цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов / В.И. Шахгильдян, Г.А. Шипулин, A.B. Кравченко, JI.B. Серебровская, В.В. Покровский // Вопр. вирусол. 1998. -№2.-С. 91-95.

98. Получение и характеристика моноклональных антител к структурным белкам вируса бешенства, штамм «ТС 80» / В.В. Недосеков, И.Ф. Вишняков, A.A. Стрижаков, А.Д. Середа, Т.Р. Кирюхина // Докл. РАСХН. - 1999. - № 4. - С. 38-40.

99. Получение сибиреязвенных диагностических препаратов на основе моноклональных антител / А.К. Галиуллин, В.П. Коксин, Н.И. Табакова и др. // Матер. Всерос. конф. Щелково, 1996. - С. 140.

100. Полюшкина, Г.С. Бешенство диких животных / Г.С. Полюшкина // Болезни и паразиты диких животных: сб. трудов. М., 1992. - С. 74-77.

101. Применение метода флуоресцирующих антител для индикации вируса бешенства на культуре ткани / М.А. Селимов, Е.В. Клюева, Е.В. Семенова, Л.И. Калинина, Т.А. Аксенова // Вопр. борьбы с бешенством. М.: Медицина, 1963. -22 с.

102. Применение ферментативной обработки препаратов из фиксированного формалином и глицерином головного мозга для люминесцентной диагностики бешенства / A.C. Шашенько и др. // Ветер, наука производству. - Минск, 1990. -С. 13-18.

103. Простяков, А.П. Фракционирование очищенных препаратов вируса ящура методами гельфильтрации и электрофореза / А.П. Простяков, А.Г. Лутош-ников // Ящур. Владимир, 1970. - Т. 1. - С. 40-45.

104. Равилов, Р.Х. Применение иммуноферментного анализа для диагностики хламидиозов у собак / Р.Х. Равилов, В.В. Герасимов // Матер, науч. произв. конф. по проблемам ветеринарии и животноводства. - Казань, 1994. - С. 25.

105. Разработка непрямых твердофазных иммуносорбентных методов для определения антигенов аденовирусов и антител к ним / А.П. Иванов, Г.В. Резап-кин, Т.К. Дзагурова, Е.А. Ткаченко. М., 1984. - С. 240-246.

106. Разработка пероральной вакцинации против бешенства / И.В. Никишин, И.Ф.Вишняков, Е.М.Хрипунов, Н.Б. Исакова, С.Д. Евсеева, В.М. Балышев, Т.Ф. Горшкова // Вирус, болезни с.-х. животных. Владимир, 1995. - С. 148.

107. Разработка технологии получения противобруцеллезных МКА, оценка их диагностической ценности / Апалькин A.B., Иванов A.B., Салмаков K.M., Плотникова Э.М. // Ветеринарный врач. 2005. - № 3. - С. 11 - 15.

108. Результаты использования метода ELISA при изучении клещевого энцефалита и бешенства / Л.С. Субботина, О.В. Новолохин, А.Д. Ботвинкин, Л.В.

109. Матюхина // ЖМЭИ. 1985. - № 1. - С. 73-77.

110. Росляков, A.A. Микропреципитационный метод обнаружения рабиче-ского антигена / A.A. Росляков // Вестник с.-х. науки. Алма-Ата. - 1964. - № 8. -С.93-97.

111. Садриев, А.Р. Иммунохимический анализ и геноидентификация хлами-дий: Дис. канд. биол. наук. Казань, 1999. - 137 с.

112. Седов, В.А. Важнейшие инфекции диких парнокопытных животных / В.А. Седов, С.А. Черниченко, В.А. Ведерников // Болезни и паразиты диких животных: сб. трудов. М., 1992. - С. 4 -11.

113. Седов, В.А. Наставление по применению вирус-вакцины антирабиче-ской сухой для пероральной иммунизации диких плотоядных. М., 1990. - 3 с.

114. Селимов, М.А. Новые данные о распространении Р-41 положительных штаммов рабического вируса в арктическом и внеарктическом регионах / М.А. Селимов, А.Д. Ботвинкин, В.В. Хозинский, Л.Я. Грибанова // ЖМЭИ. 1994. - № 2.-С.-53-56.

115. Селимов, М.А. Бешенство / М.А. Селимов. М.: Медицина, 1978.-336 с.

116. Селимов, М.А. Идентификация штаммов сильватического и арктического бешенства с помощью моноклональных антител / М.А. Селимов, А.Д. Ботвинкин, А.Г. Татаров // Вопр. вирусологии. -1983 № 2. - С. 243 - 244.

117. Селимов, М.А. К эволюции природных очагов рабической инфекции / М.А. Селимов / Актуальные проблемы медицинской вирусологии: сб. трудов. -М., 1985.-С. 164-166.

118. Селимов, М.А. Современная эпизоотическая ситуация и перспективы элиминации бешенства / М.А. Селимов // Вопр. вирусологии. 1998. - № 5. - С. 196-198.

119. Селимов, М.А. Современные достижения в области рабиологии / М.А. Селимов // Обзорная информация. М.: ВНИИМИ, 1987. - Вып. 4. - С. 35-40.

120. Селимов, М.А. Современные методы лабораторной диагностики бешенства / М.А. Селимов, Е.В.Клюева, Е.В. Семенова. М.: Медицина, 1964.- 58 с.

121. Семина, И.Э. Использование метода иммуноблотинга для идентификации индивидуальных белков в антигенных комплексах коклюшного микроба / И.Э. Семина, З.К. Янкина // ЖМЭИ. 1989. - № 3. - С. 79-81.

122. Сидоров, Г.Н. Роль диких собачьих (CANDIDAE) в поддержании эпизоотического процесса в природных очагах бешенства на территории России в связи с особенностями экологии этих животных: Автореф. дис. докт. биол. наук. Новосибирск, 1995. - 39 с.

123. Сологуб, Т.В. Выявление антител к вирусу бешенства методом ингиби-рования твердофазного ИФА / Т.В. Сологуб, В.Н.Никитин, Н.Ф. Вишняков // Вопр. ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Покров. -1992.-Ч. 2-С. 261-262.

124. Сонин, П.Ф. Лабораторная диагностика вирусных болезней у животных / П.Ф. Сонин Л., 1989.- 56 с.

125. Степанова, Г.С. Биодиагностика бешенства на белых мышах / Г.С. Степанова, И.М. Гороховатский // Тр. Украинского мечниковского института. -Харьков, 1940. № 5. - С. 233 - 286.

126. Тарасов, С.А. Патоморфологическая диагностика бешенства. Методические рекомендации Л., 1989. -17 с.

127. Тартаковский, А.Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих / А.Д. Тартаковский // Методы культивирования клеток. Л.:1. Наука, 1987. С. 44-63.

128. Таршис, М.Г. Бешенство животных / М.Г. Таршис, H.A. Ковалев, П.П. Кузнецов.-Минск, 1990.-С. 100-104.

129. Татаров, А.Г. Экспресс-диагнстика бешенства в линии клеток неврино-мы Гассерова узла крыса (NGUK 1) / А.Г. Татаров, М.А. Селимов, В.Я. Кармы-шева, H.A. Хисматуллина // Тез. докл. Всесоюзн. конф. - М., 1985. - С. 172-173.

130. Теория и практика иммуноферментного анализа: Учеб. пособие: Сост.: A.M. Егоров, Б.Б. Дзантиев, А.П.Осипов, Е.М. Гаврилова М.: Высш. шк., 1991. -288 с.

131. Топленинова, К.А. Применение метода флуоресцирующих антител для диагностики бешенства: Автореф. канд. мед. наук. Л., 1965. - 18 с.

132. Топленинова, К.А. Применение метода флуоресцирующих антител для обнаружения вируса бешенства / К.А. Топленинова // Матер. Второго Всеросс. съезда эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов. М., 1966. - С. 59-61.

133. Топленинова, К.А. Применение непрямого метода флуоресцирирую-щих антител для обнаружения вируса бешенства / К.А. Топленинова // Вопр. вирусологии. -1961. -№ 2. С. 174.

134. Флуоресцирующий глобулин для диагностики лихорадки Ку / H.A. Хисматуллина, И.А. Курбанова, И.З. Макачев, Р.Х. Юсупов // Вопр. инфекц. па-тол. животных. Казань. - 1994. - С. 41-43.

135. Фридлянская, H.H. Получение моноклональных антител / И.И. Фрид-лянская // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. - С. 194-205.

136. Фримель, Г. Иммунологические методы: перевод с нем. / Г. Фримель -М.: Медицин, 1987. С. 148-161.

137. Хазипов, Н.З. Достижения молекулярной биологии в животноводстве и ветеринарии / Н.З. Хазипов.- Казань: КГАВМ, 1997. С. 73-80.

138. Хазипов, Н.З. Молекулярная генодиагностика в ветеринарии: Монография / Н.З. Хазипов, А.Н. Аскарова. Казань: КГАВМ, 2002. - С. 79-97.

139. Хамзин, P.A. Модификация ИФА для выявления противотуберкулезных антител у крупного рогатого скота / P.A. Хамзин, М.А. Сафин, К.Г. Идрисова // Тез. докл. Респ. науч. произв. конф. - Казань, 1990. - С. 62.

140. Хисматуллина, H.A. Диагностика бешенства методом пирофосфатазно-го иммуноанализа / H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов // Болезни и паразиты диких животных: сб. трудов. М., 1992. - С. 84-88.

141. Хисматуллина, H.A. Лабораторная диагностика бешенства животных методом пирофосфатазного иммуноанализа / H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов // Вопр. инфекц. патологии животных. Казань. - 1994. - С. 35-40.

142. Хисматуллина, H.A. Получение диагностических сывороток при лихорадке Ку животных / H.A. Хисматуллина, И.А. Курбанова, И.З. Макачев // Рес-публ. научно-производ. конф. «Актуальные вопр. ветеринарии и зоотехнии». -Казань, 1992. С. 49.

143. Хисматуллина, H.A. Производство наборов препаратов для лабораторной диагностики бешенства / H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, И.А. Курбанова // Тез. докл. Всероссийской научно-практ. конф. Владимир, 1995. - С. 67.

144. Хисматуллина, H.A. Разработка и усовершенствование лабораторных методов диагностики бешенства: Дис. канд. биол. наук-Казань, 1988. 188 с.

145. Хисматуллина, H.A. Разработка средств и методов иммунологического мониторинга и мер борьбы при бешенстве и лихорадке Ку животных: Автореф. дисс. .докт. биол. наук. Казань, 2000. - 45 с.

146. Хисматуллина, H.A. Серологический контроль при антирабической вакцинации животных / H.A. Хисматуллина // Тез. докл. научно-практ. конф. «Проблемы инфекционных болезней в животноводстве на современном этапе».1. М, 1999. -С. 96.

147. Черкасский, Б.Л. Эпидемиология и профилактика бешенства / Б.Л. Черкасский.-М., 1985.-288 с.

148. Шафикова, P.A. Применение реакции энзим-меченных антител при диагностике хламидиозного аборта овец / P.A. Шафикова, Х.З. Гафаров, А.З. Рави-лов // Матер. Всесоюзн. конф. Львов, 1988. - С. 197-108.

149. Шашаенько, A.C. Распределение вируса бешенства в организме животных и прижизненное обнаружение его с помощью иммунофлуоресцентного исследования отпечатков роговицы: Автореф. дис. . канд. вет. наук. Минск, 1971.-21 с.

150. Электронномикроскопическое изучения вируса острого энцефаломиелита человека / А.К. Шубладзе, А.Ф. Бочаров, E.H. Бычкова, Л.И. Бодрина // Вопр. вирусологии. 1974. - № 7. - С. 201-203.

151. Эпитопная структура гликопротеина gB вируса болезни Ауески / М.М. Зарипов, О.С. Моренков, Б. Сиклоди и др. // Пробл. инфекц. патологии с.-х. животных. Владимир, 1997. - С. 131-132.

152. Юсупов, Р.Х. Иммунологический мониторинг в системе защиты животных от инфекционных болезней / Р.Х. Юсупов // Матер. Всероссийской на-учно-произв. конф. Чебоксары, 1994. - С. 499-500.

153. Юсупов, P.P. Очистка коксиелл Бернета в градиенте плотности сахарозы / P.P. Юсупов, Н.А. Хисматуллина, Э. А. Курбанова // Матер, научно-производ. конф. «Проблемы ветеринарии и животноводства». Казань, 1994. - С. 13-14.

154. Юсупов, Р.Х. Эпизоотическая характеристика и динамика заболеваемости животных бешенством в Татарстане / Р.Х. Юсупов, Н.А. Хисматуллина // Болезни и паразиты диких животных: сб. трудов. М., 1992. - С. 84-88.

155. Яковлев, А.Т. Иммуноферментный анализ в микробиологии / А.Т. Яковлев, Л.Ф. Зыкин, B.C. Рыбкин / под ред. Н.Г. Тихонова Изд. Сарат. универ. -1990.-112 с.

156. Amano, Т. Neurotransmitter syntesis by neuroblastoma clons / Т. Amano, E. Rioheison, M. Nirenberg // Proc. nath. Akaj. USA. 1972. - V. 69. - P. 258-263.

157. Allosteric binding properties of a monoclonal antibody and its Fab fragment / R.C. Blake, J.B. Delehanty, M. Khosraviani, H. Yu, R.M. Jones, D.A. Blake // Biochemistry. 2003. - V. 42, N. 2. - P. 497-508.

158. Atanasiu, P. Animal inoculation and the Negri body / P. Atanasiu // The Natural History of rabies. V. 1. Baer G.M. Ed. - Academic Press. - New York. -1975.-P. 373.

159. Atanasiu, P. Epreuve immunoenzymatique pour la diction rapide des anticorpus antirabiques / P. Atanasiu, V. Savy, P. Perrin // Ann. Microbiol. Inst. Pasteur. -1977.-V. 128.-P. 489-498.

160. Atanasiu, P. Etudes cinetique du virus rabique enculturede tissues al aide desanticorps fluorescent cents et des caepes ultra fines / P. Atanasiu, P. Lepine, P. Dragonas // Ann. Inst. Pasteur. - Paris. - 1963. - V. 105. - P. 813.

161. Babes, V. Sur certains caracteres des lesions histologiques de la rage / V. Babes // Ann. Inst. Pasteur. Paris. 1892. - V. 6. - P. 209.

162. Baer, G.M. The pathogenesis of street rabies virus in rats / G.M. Baer, T.R. Shanthaveerapa, G. Bourne // Bull. WHO. 1968. - V. 38. - P. 119.

163. Bingham, J. Ante mortem diagnosis of human rabies by the skin biopsy technique: three case reports from Zimbabve / J. Bingham // Cent. Afr. J. Med. - 1995. - V. 41, N. 8. - P. 258 - 260.

164. Blenden, D. Rabies in a litter of skunks. Predicated and Diagnosed by skin Biopsy / D. Blenden // J. of the American veterinary med. association. 1981. - V. 179,N. 8.-P. 789-791.

165. Bourhy, H. Rapid rabies enzyme immunodiagnosis (RPEID) for rabies antigen detection / H. Bourhy, P. Perrin // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva, 1996. - P. 105-112.

166. Breakfield, X.O. Neurobiasmitter metabolism in murin neuroblastoma cells / X.O. Breakfield // Life Sci. -1976. V. 18. - P. 267-278.

167. Characterization of rabies virus nucleocapsids and recombinant nucleocap-sid-like structures /1. Frederic, B. Annie, B. Florence, B. Danielle, W.H.R. Rob // J. Gen. Virol. 1998. - V. 79, N. 12. - P. 2909-2919.

168. Consales, C.A. Cytopathic effect induced by rabies virus in McCoy cells / C.A. Consales // J. virol. meth. 1990. - V. 27. - P. 277-285.

169. Crawford-Miksza, L.K. Molecular epidemiology of enzootic rabies in California / L.K. Crawford-Miksza, D.A. Wadford, D.P. Schnurt // J. Clin. Virol. 1999. -V. 14, N. 3. - P. 207-219.

170. Dean, D.J. The fluorescent antibody test / D.J. Dean, M.K. Abelseth // In: Laboratory Techniques in Rabies. Kaplan M.M., Koprowski H. Eds. WHO. - Geneva.- 1973. P.73 - 84.

171. Dean, D.J. The fluorescent antibody test / D.J. Dean, M.K. Abelseth, P. Atanasiu // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva, 1996. - P. 88-93.

172. Diagnosis of rabies by immunofluorescent stining of frozen sections of skin / W.B. Smith, D.C. Blenden, T. Fuk, L.L. Hiler // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1972. - V. 161.-P. 1495- 1501.

173. Dieckmann, W.A.O. Analysis of epidemiology and means of prevention of rabies in European countries (Poland) / W.A.O. Dieckmann, J. Szarek, M.Z. Khan // Veterinaria. 1992. -N. 20. - P. 73-85.

174. Dietzschold, B. Techniques for the purification of rabies virus, its subunits and recombinant products / B. Dietzschold // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva, 1996. - P. 175-179.

175. Engvall, E. Enzyime-linked immunosorbent assay (ELISA). Ill . Quantitation of specific antibodies by enzyme labelled antiimmunoglobulin in antigen coated tubes / E. Engvall, P. Perlmann // J. Immunol. - 1972. - V. 109. - P. 129-135.

176. Ertl, H.C. Induction of rabies virus specific T-helper cells by synthetic peptides that carry dominant T-helper cell epitopes of the viral ribonucleoprotein / H.C. Ertl // J. virology. 1989. - V. 63. - P. 2885-2892.

177. Ertl, H.C. New developments in the pre- and post-exposure treatment of rabies / H.C. Ertl, B. Dietzschold // C. R. I. 1991. -V. 10. - P. 427-439.

178. Experimental investigations into rage and Rabies of polar Foxes. Natural hosts of the infection / R.A. Kantorovich, G.V. Kanovalov, G.I. Buzinov, V.R. Riutova // Acta. Virol. Praque. 1963. - V. 7. - P. 554.

179. Francki, R.I.B. Classification and Nomencloture of viruses / R.I.B. Francki.- Vienna, Springer Verlag, 1991. - P. 239-262.

180. Furowicz, A.J. Monoclonal antibodies — selected problems / A.J. Furowicz,

181. J. Karakulska, A. Silecka // Adv. Agr. Sci. 2002. — V. 8, N. 1. - P. 59—68.

182. Gaudin, G. Low-pH conformational changes of rabies virus and their role in membrane fusion / G. Gaudin, H. Ruigror // J. Virol. 1993. - V. 67, N. 3. - P. 1365 -1372.

183. George, J.P. Description clinique de la rage du renard / J. George, J. Blan-cou, M.F.A. Aubert // Revue. Med. vet. 1980. - V. 131, N. 2. - P. 153 - 160.

184. Glick, M.C. Glicopeptides from surface membranes of neuroblastoma cells / M.C. Glick, Y. Kimhi, U.Z. Littaner // Proc. nath. Acad. Sci. (USA). 1973. - V. 70 -P. 1682-1687.

185. Goldwasser, R.A. Fluorescent antibody staining street and fixed rabies virus antigens / R.A. Goldwasser, R.E. Kissling // Proc. Soc. Exp. Biol. N.Y. - 1964. - V. 98.-P. 219-223.

186. Grasset, N. Etude de la diffusion en Gelose D'Antigenes de la rage fixe obtenus sur culture de Tissues / N. Grasset, P. Atanasiu // Ann. Inst. Pasteur.-1961. V. 1015.-P. 639-647. <

187. Hummeler, K. Electron microscopy / K. Hummeler, P. Atanasiu // In: Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva. -1975. -P.157-163.

188. Hummeler, K. Electron microscopy / K. Hummeler, P. Atanasiu // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. -Geneva, 1996.-P. 209-216.

189. Hunter, W.M. Radioimmunoassay / W.M. Hunter // In: Handbook of exper-mental immunology Ed. D.M. Weir. Oxford, Blackwell Scient, publ., 1978. - V. 1. -P. 141-140.

190. Immunohistochemical test for rabies: identification of a diagnostically superior monoclonal antibody / A.N. Hamir, G. Moser, Z.F. Fu, B. Dietzschold, C.E. Rup-precht // Veter. Rec. 1995. - V. 136, N. 12. - P. 295-296.

191. Improvement of monoclonal antibody production in hybridoma cells by dimethyl sulfoxide / Wai Lam W. Ling, Deng Liang, Lepore Joseph, Cutler Collette,

192. Cannon-Carlson Susan, Wang Yan, Voloch Marcio // Cell Culture Engineering Conference, Snow-mass, Colo, apr. 1—6,2002 / Biotechnol. Progr. 2003. — V. 19, N. 1. — P. 158-162.

193. Inhibition of HIV protease by monoclonal antibodies / P. Rezacova, J. Brynda, M. Fabry, M. Horejsi, R. Stouracova, J. Lescar, V. Chitarra, M.M. Riottot, J. Sedlacek, G.A. Bentley // J. Mol. Recogn. — 2002. V. 15, N. 5. — P. 272 - 276.

194. Isolation and assay of rabies serogroup viruses in CER cell / A.L. Smith, G.H. Tignor, K. Mifune, T. Motohaski // Intervirology. 1977. - V. 8. - P. 92-99.

195. Jorgenson, R.D. Experimental rabies in a great horned owl / R.D. Jorgenson, P.M. Gough, D.L. Graham // J. Wildl. Dis. -1976. V. 12. - P. 444.

196. Kantorovich, R.A. Natural foci of a rabies-like infection in the far north / R.A. Kantorovich // J. Hyg. Epidemiol., microbiol., immunol. 1964. - V. 7. - P. 100.

197. Kaplan, M.M. An intacerebral assay procedure in mice for chemical inacti-vation of rabies virus / M.M. Kaplan // Bull. WHO. 1966. - V. 34. - P. 293-297.

198. King, A. A. Cell culture of rabies virus / A. A. King // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva, 1996.-P. 114-130.

199. Kirkpatrik, A. Comparision of double-antibody RIA with Farr-technique RIA and double antibody enzyme assay for a-fetoprotein / A. Kirkpatrik, T.H. Wepsik, R.M. Nakamura // Clin. Chem. 1977. - V. 23. - P. 50-59.

200. Kissi, B. Genetic polimorphism in the rabies virus nucleoprotein gene / B. Kissi, N. Tordo, H. Borhy // J. Virol. 1995. - V. 209, N. 2. - P. 526-537.

201. Komarov, A. Diagnosis of rabies in dogs comparing smears, biological tests and fluorescent antibody staining / A. Komarov, R.A. Goldwasser // WHO.- Expert Committee on Rabies. Geneva, 1959. - V. 19. - P. 107.

202. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterization of monoclonal antibodies / M. Lafon // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. / Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva, 1996. - P. 133-144.

203. Lafon, M. Use of a monoclonal antibody for quantitation of rabies Vccine glycoprotein by enzyme immunoassay / M. Lafon // J. boil, standard. 1985. - V. 13. -P. 295-301.

204. Lepine, P. Gel-diffiission techniques / P. Lepine // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva, 1975. -P. 134-146.

205. Maggio, E.T. Enzyme immunoassay / E.T. Maggio // Florida, CRC Press, Boca Raton, 1981.-P. 23.

206. Marel, P. Quntative determination of rabies antigen by ELISA / P. Marel, A.L. Wazel // Develop biol. Standard. -1982. V. 50. - P. 267-275.

207. Marier, R. A new method for measuring antibody using radiolabeled protein A in solid phase RIA. / R. Marier, M. Jansen, U.T. Andriole // J. Immunol, methods. -1979.-V. 28.-P. 41-49.

208. Matsumoto, S. Electron microscopic studies on rabies virus multiplication and the nature of Negri body / S. Matsumoto, K. Miyamoto // Intern. Symph. an Rabies Tallores, 1965; Symp. Series immunobiol. Stand. 1966. - V. 1. - P. 45-54.

209. McQueen, T.L. Rabies diagnosis by fluorescent antibody. Its evaluation in a Public Health Laboratory / T.L. McQueen, A.L. Lewis, N.T. Schneider // WHO. Exp. Commit, on Rab. - Geneva, 1959. - V. 19. - P. 125.

210. Mebatsion, T. Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) using staphylococcal protein a for the measurement of rabies antibody in various species / T. Mebatsion, J.W. Frost, H. Krouss // J. veter. Med. Ser. B. 1989. - V. 36, N. 7. - P. 532-536.

211. Mechanisms of Rabies Virus Neutrolization by Glycoprotein / B. Dietzschold, M. Tollis, M. Lafon, W.H. Wunner, H. Koprowski // Specific Monoclonal Antibodies. Rabies Information on Echange. 1986. - V. 14. - P. 16-17.

212. Meslin, F.-X. An overview of laboratory techniques in the diagnosis andprevention of rabies research / F.-X. Meslin, M.M. Kaplan // In: Kaplan M.M., Ko-prowski H., Meslin F.-X. Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva, 1996.-P. 9-16.

213. Meslin, F.-X. Laboratory techniques in rabies / F.-X. Meslin, M.M. Kaplan, H. Koprowski // WHO 4-th ed. Geneva, 1996. - P. 476.

214. Monoclonal antibody lotentification of polar rabies virus isolayion form the Kolskiy Peninsula / M. Selimov, P.B. Dolzhanov, F.N. Bayluk et all. // This is 18 th issue if Rabies Information Exchange. -Moscow, 1989.-P. 1-10.

215. Morimoto, K. Syncitium formation is induced in the murine neuroblastoma cell culture which produce pathogenic type G proteins of the rabies virus / K. Morimoto, G.J. Ni, A. Kawai // J. Virol. 1992. - V. 189. - P. 203 - 216.

216. Mwari, I.A. Characterization of thirty six African and nine European (bat) "street" rabies virus isolates using monoclonal antibody technique / I.A. Mwari, A. King // Bull. Anim. Health and Prod. Afr. -1993. V. 41, N. 1. - P. 30-40.

217. Nadin-Davis, S.A. Identification of regional variants of the rabies virus within the Canadian province of Ontario / S.A. Nadin-Davis, G.A. Casey, A. Wandeler // J. gen. virol. 1993. - V. 74. - P. 829-837.

218. Nakajima, K. Identification of the cross-reactive antigens between Mareks disease virus and pseudorabies virus by monoclonal antibodies / K. Nakajima, C.H. Kweon, S.H. An // Avian Dis. 1990. - V. 34, N. 2. - P. 479 - 484.

219. Narayan, K. G. Laboratory diagnosis of rabies in animal in Ranchi (19831986) / K.G. Narayan, S. Kotwal // J. Veter. Med. 1989. - V. 66, N. 9. - P. 797 - 800.

220. Negri, A. Beitrag Zum Stadium der Aetiologie der Tollwuth / A. Negri // Zentrall. Hyg. Infect. 1903. - V. 43. - P. 507.

221. Ngo, T.T. Enzymeas versalite labels and signal amplifires for monitoring immunochemical reaction / T.T. Ngo, H.M. Lenhoff // Mol. cell. Biochem. 1982. -V. 44, N. l.-P. 3-12.

222. Nicholson, K.G. Enzym-linked immunosorbent Assay A Reaped Reproducible. Test for the Measurement of Rabies Antibody / K.G. Nicholson, H. Presteg // J.

223. Med. Virol. 1982. - V. 114. - P. 43-49.

224. Okoh, A.E.J. Anrigenic characterization of rabies vims isolates from vaccinated dogs in Plateau State. Nigeria / A.E.J. Okoh // Vet. Res. Commun. 2000. - V. 24, №3. p. 203-211.

225. Ouchterlony, 0. Antigen-antibody reaction in gels / O. Ouchterlony // Ark. Kemi Miner. Geol. 1949. - V. 26. - P. 507-524.

226. Ouchterlony, O. Methode d'analyse immunochemique par precipitation spécifique en milieu gelifie / O. Ouchterlony // C.R. Acad. Sci.-Paris. 1946. - V. 222. -P. 115-116.

227. Parker, C.W. Radioimmunoassay of biologically active compounds / C.W. Parker // New Jersey, Prentice-Hall Inc. Englewood Cliffs, 1976. P. 231 - 234.

228. Pastoret, P.P. Evolution of fox rabies in Belgium and the European Union / P.P. Pastoret // Bull. Mem. Acad. R. Med. Belg. 1998. - V. 153, N. 1. - P. 93-99.

229. Perrin, P. A modified rapid enzyme immunoassaya for the detection of rabies and rabies-related viruses: RREID-lyssa / P. Perrin // Biologicals. 1992. - V. 20.-P. 51-58.

230. Phosphorylation of rabies virus nucleoprotein regulates viral RNA transcription and replication by modulating leader RNA encapsidation / J. Yang, H. Koprowski, B. Dietzschold, Z.F. Fu//J.Virol.-1999.-V.73,N.2.-P. 1661-1664.

231. Portnoi, D. Use of Neuroblastoma cells (MNB) for the isolation of street rabies virus from field speciment / D. Portnoi, S. Favre, E.P. Surey // Departament of Health. S. Human Services Pullic Health Service Center for Diseas Control, 1982. P. 35-36.

232. Rage experimental du renard roux (Vulpes vulpes). Excretion du virus rabique après infection/ J. Blancou, L. Anral., A. Samudio, C.L. Silva // Revue. Med.vet. 1979. - V. 130, N. 11. - P. 1473 - 1482.

233. Reculard, P. Cell-culture vaccines for veterinary use // Laboratory techniques in rabies 4-thed. Geneva, 1996. -P.314-323.

234. Rossi, A.L. La Rabiy su control on Venesuela / A.L. Rossi // Ztschz. F. Tro-penmed u Parasist. 1957. - V. 8, N.l- 2. - P. 24-27.

235. Rudd, R.I. BHK 21 and Neuroblastoma cell Lines for the isolation of strain Rabies virus / R.I. Rudd, C.V. Trimarechi // Departament of Health. Human Services Pullic Health Service. - 1983 - V. 30. - P. 38-40.

236. Rudd, R.I. Tissue culture technique for routine isolation of street strain virus / R.I. Rudd, C.V. Trimarchi, M.K. Abelseth // J. Clin. Microbiol. 1980. - V. 12. - C. 590-593.

237. Rupprecht, C.E. Antigenic relationships of lyssaviruses / C.E. Rupprecht, B. Dietzschold, W.H. Wunner // In: Baer G.M. The natural history of rabies / Boca Raton, FL, CRC Press, 1991. P. 69-100.

238. Rupprecht, C.E. Current tissues in rabies prevention in the USA health dilemmas / C.E. Rupprecht, J.S. Smith, J.W. Krebs // Public. Health. Rep. 1996. - V. Ill, N. 5.-P. 400-407.

239. Sahasrabuddhe, M.G. Comparison of rapid rabies enzyme immunodiognosis (RREID) technique with routinely used tests / M.G. Sahasrabuddhe, A.A. Sherikar // Indian J. Anim. Sc. 1990. - V. 60. - P. 1271-1273.

240. Schall, R.F. Alternatives to RIA / R.F. Schall, H.J. Tenesco // Clin. Chem. -1981.-V. 27.-P. 1157-1164.

241. Schneider, L.G. Application of monoclonal antibodies for epidemiological investigations and oral vaccination studies. 1. African viruses. 2. Arctic viruses. 3. Oral rabies vaccine / L.G. Schneider // In: Kuwert E. Rabies in the tropics. Berlin,

242. Springer-Vergal., 1985. P. 47-59.

243. Schneider, L.G. The cornea test: a new method for the intravitam diagnosis of rabies / L.G. Schneider // Zbl. Vet.-Med. 1969. - V. 16. - P. 24-31

244. Sensitivity of different cell lines for rabies virus isolation / S.M. Tollis, C. Buonavoglia, L. Di Trani, E. Vignolo // J. Veter. Med. Ser. B. 1988. - V. 35, N. 7. - P. 504-508.

245. Skunk rabies / J. Charlton, W. Webster, Z. Cosey, C. Rupprecht // Rov. in-fec. diseases. 1988. - V. 10, N. 4. - P. 626-628.

246. Smith, J.S. Moleqular epidemiology of rabies in USA / J.S. Smith, L.A. Or-ciari, P.A. Yager // Semin. Virol. 1995. - V. 6, N. 4. - P. 387- 400.

247. Smith, J.S. Monoclonal antibodies for the identification of rabies and non-rabies lyssaviruses / J.S. Smith, A.A. King // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. // Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva, 1996. - P. 145-155.

248. Sokol, F. Techniques for the purification of rabies virus, its subunits / F. Sokol // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva, 1973. - P. 164 - 178.

249. Sureu, P. Epidemiologic analisis of antigenic variation of street rabies virus. Detection by monoclonsl antibodies / P. Sureu, P. Rollin, T.J. Wiktor // Amer. J. Epi-dem. 1983. - V. 117, N. 5. - P. 605 - 609.

250. Takashi, I. Studies on the different conditions for rabies virus neutralization by monoclonal antibodies 1-46-12 and 7-1-9 /1. Takashi, K. Akihiko // J. Gen. Virol.2002. V. 83, N. 12. - P. 3045-3053.

251. The specificity of rabies virus RNA encapsidation by nucleoprotein / J. Yang, D.C. Hooper, W.H. Wunner, H. Koprowski, B. Dietzschold, Z.F. Fu // Virology. 1998. -V. 242, N. l.-P. 107-117.

252. Thiery, G. Que peut-on atendre de la methode de precipitation en milieu gélifié pour le diagnostic de la rage dans la region de Dakar / G. Thiery // Rev. Elev. et med. veteran, pays. trop. 1960. - V. 13, N. 4. - P. 251-257.

253. Tierkel, E.S. Rapid microcopic examination for Negri bodies and preparation of specimens for biological test / E.S. Tierkel // In: Laboratory Techniques in Rabies. Kaplan M.M. and Koprowski H., Eds. WHO. Geneva, 1973. - P. 41.

254. Titrage imnuno-enzymatique de la dlycoproteine une technique in vitro pour l'appréciation de l'activité des vaccines antirabiques / P. Atanasiu, P. Perrin, J. Delag-neau et. al. // J. of Biol. Standartization. 1982. - V. 10, N. 4. - P. 289-293.

255. Tollis, S.M. Sensitivity of different cell lines for rabies virus isolation / S.M. Tollis // Zentralbatt fur Veterinarmedizini Reihi. 1988. - V. 35. - P. 504-508.

256. Tordo, N. Characteristics and molecular biology of the rabies virus / N. Tordo // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva, 1996. - P. 28-53.

257. Tordo, N. Structure of rabies virus / N. Tordo, O. Poch // In: Campbell J.B., Charlton K.M. Rabies. Boston. - Kluwer Acad. Publish., 1988. - P. 25-45.

258. Transmissiion of corneal graft. Cornea / M.A. Javadi, A. Fayar, S.A. Mirdehghan, B. Ainollahi // WWW. CDC. 1996. - V. 15. - P. 431.

259. Tsiang, H. Current concepys in in rabies / H. Tsiang, // Adv. Virus Res. -1995.-V. 2.-P. 2-3.

260. Tsiang, H. Neurotropismof rabies virus. An in vitro study / H. Tsiang, J.C. Guillon // J. neuropath, exper. neural. 1983. - V. 42. - P. 439-452.

261. Villemot, J.M. Precipitation specifique du virus rabique en milieu gelifie selon la methode d'Oudin-Ouchterlony (technique de Mansi) / J.M. Villemot, A. Provost // C.R. Acad. Sci. (Paris), 1958. p. 246.

262. Voller, A. Immunoassays for the 80-s / A. Voller, A. Barflet, D. Bidwell. // Baltimore: Univ. Park. Press. -1981. P. 68 - 74.

263. Voller, A. Immunoassays reactions in diagnostic medicine. The (theory and practice / A. Voller, D. Bidwell, A. Barkett // Bull. WHO. 1977. - V. 53, N. 1. - P. 38-48.

264. Walker, W.H.C. Theoretical aspects of RIA / W.H.C. Walker, P.M. Keane // In: Handbook of radioimmunoassay / Ed. G.M. Abraham. New York Basel, Marcel DekkerInc., 1977.-P. 87-130.

265. Walmsley, S. Long-Term Predictive Value of a Single Cytomegalovirus (CMV) DNA PCR Assay for CMV Disease in Human Immunodeficiency Virus-Infected Patients / S. Walmsley, T. Mazzulli, M. Krajden // J. Clin. Microbiol. 1998. -V. 36,N. l.-P. 281-283.

266. Webster, L.T. Early diagnosis of rabiesby mouse inoculation. Measurement of humeral immunity to rabies by mouse protection test / L.T. Webster, I.R. Dawson // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1935. - V. 32. - P. 570.

267. Webster, L.T. Virus isolation in neutroblastoma cell culture / L.T. Webster, G.A. Casey // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. // Laboratory techniquesin rabies Eds. WHO. - Geneva, 1996. - P. 96-101.

268. Webster, W.A. Miyor antigenic groups of rabies Virus in Canada determined by anty-nuoleocapsid monoclonal antibodies / W.A. Webster, A. Caseyc, K.M. Charlton // Comp. Immunol. Microbiol, infect. Dis. 1986. - V. 9. -N. 1. - P. 59-69.

269. Webster, W.A. Virus isolation in neuroblastoma cell Culture / W.A. Webster, G.A. Casey // In: Kaplan M.M., Koprowski H., Meslin F.-X. // Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. - Geneva, 1996. - P. 96-103.

270. Weemen, B.K. Immunoassay using antigen-anzyme conjugate / B.K. Wee-men, A.H.W.H. Schuurs // TEES letters. -1971.-V. 15.-P. 232-236.

271. Wiktor, T.J. A Radioimmune assay for rabies binding antibody / T.J. Wiktor // In: Kaplan M.M., Koprowski H. // Laboratory techniques in rabies Eds. WHO. -Geneva, 1975. - P. 182-185.

272. Wiktor, T.J. Antigenic variations of rabies virus "Replication Negative Stand Viruses antibodies"/T. J. Wiktor,//J. Immunol. 1972.-N. 109.-P. 404-407.

273. Wiktor, T.J. Cyclic appearance of viral ingibitor in tissue cultures chronically infected with rabies virus / T.J. Wiktor, H. Koprwski // Bacteriol. proceedings: 1967.-P. 166.

274. Wiktor, T.J. Monoclonal antibodies against rabies virus produced by somatic cell hybridization: detection of antigenic variants / T.J. Wiktor, H. Koprowski // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 75. - P. 3938-3942.

275. Wiktor, T.J. Radioimmunoassay procedure for rabies-binding antibodies / T.J. Wiktor, H. Koprowski, P. Dixen // J. Immunol. 1972. - N. 109. - P. 404-407.

276. Wiktor, T.J. Use of monoclonal antibodies in diognosis of rabies virus infection and differentiation of rabies and rabies-related viruses / T.J. Wiktor, A. Flamand, H. Koprowski // J. Virol. Meth. 1980. - V. 1, N. 1. - P. 33-46.

277. Wunner, W.H. Rabies virus pathogenesis and immunity / W.H. Wunner // In: Wagner R.R., Ed. The rhabdoviruses. -N.-Y., Plenum Press, 1987. - P. 361-426.

278. Wunner, W.H. The molecular biology of rabies viruses / W.H. Wunner // Review of infectious diseases. 1988. - V. 10. - P. 771-784.

279. WWW.CDC. Human to - human transmission of rabies via a corneal transplant. - France. - MMWR. - 1980. - V. 29. - P. 25.307. www.cdc.gov/ncidod/dvrd/rabies.

280. Zaidman, G.W. Corneal impression test for the diagnosis of acute rabies encephalitis / G.W. Zaidman // Ophthalmology. 1998. - V. 105, N. 2. - P. 249 - 251.

281. Zimmermann, Th. Zur Brauchbazkeit des cornea. Testes beider tollwutdiagnose / Th. Zimmermann // Berl. Munch, tierarztl. Eschr. 1971. - V. 84, N. 9. - P. 172174.

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител

Оглавление диссертации Тимиргалеев, Руслан Владимирович :: 2006 :: Казань

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Тимиргалеев, Руслан Владимирович, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител"

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2006 года, Тимиргалеев, Руслан Владимирович

Похожие научные работы

Каталог диссертаций