Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усовершенствование лабораторной диагностики гриппа лошадей в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

•Л

ГУСАКОВ Василь Володимирович

УДК 619:616-085.371

ВДОСКОНАЛЕННЯ ЛАБОРАТОРНОЇ ДІАГНОСТИКИ ГРИПУ КОНЕЙ В РЕАКЦІЇ ГАЛЬМУВАННЯ ГЕМАГЛЮТИНАЦІЇ (РГГА)

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті ветеринарної медицини УААН

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук Старчеус Анатолій Павлович, Інститут ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії вірусології

Офіційні опоненти : доктор ветеринарних наук, професор, академік Нью-Йоркської академії Рухлпда Валентин Васильович, Білоцерківський державний аграрний університет, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та зоології

кандидат ветеринарних наук Євтушенко Анатолій Федорович, Національний аграрний університет, доцент кафедри епізоотології

Провідна установа : Інститут експериментальної та клінічної ветеринарної медицини УААН, м. Харків

Захист відбудеться «,£'¥ » 2000 р.

о годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 в Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навч.-корпус 3, ауд. 65.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 11, навч. корпус 10.

Автореферат розісланий « @ 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

В.А.Бортнічук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За даними спеціалістів з Англійського центру здоров’я тварин, збитки від захворювання коней на грип у країнах з розвиненим конярством можуть сягати 20 млн. доларів на рік. Нині в нашій країні значними темпами розвивається конярство, особливо розведення бігових коней, для яких ірип є найактуальнішим захворюванням. Дослідження закордонних спеціалістів у галузі інфекційних захворювань верхніх дихальних шляхів свідчать, що вакцинація проти грипу коней не завжди забезпечує захист тварин від нього. Хоча віруси грипу мають видову специфічність, можливість ураження тварин вірусами іншого виду є. Питання циркуляції вірусів грипу в природі досі залишається мало вивченим. Головними методами боротьби із захворюванням є своєчасні карантинні заходи, належні умови утримання, а також ефективна діагностика.

Клінічно грип діагностують за сукупністю певних симптомів, але для встановлення діагнозу, а також для диференційної діагностики потрібні лабораторні дослідження. Епізоотологічні обстеження та вивчення імунітету до даного захворювання також потребують лабораторного ретроспективного аналізу. Для проведення таких досліджень слід мати спеціальний діагностичний набір. ІІині в нашій країні набори для діагностики грипу коней не виробляють. Лабораторії ветеринарної медицини, які досліджують сироватки крові коней на грип, користуються закордонними наборами. Однак внаслідок високої ціни придбати їх стало практично неможливо. Тому серологічні обстеження коней у господарствах України, які є необхідною умовою ефективної діагностики грипу коней і попередження захворювання, практично не виконують. Отже, в сучасних умовах для епізоотологічного обстеження господарств на грип коней, ефективної діагностики грипу коней та профілактики цього захворювання нагальною потребою є розробка та виробництво вітчизняного набору для діагностики грипу коней, який був би доступний для більшості лабораторій, що виконують такі дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами. Наша робота викопувалась в плані державного завдання 07.03. Інституту ветеринарної медицини УААН згідно тематики ІІДР : “Розробити засоби і методи діагностики та профілактики вірусного артеріїту, грипу і вивчити епізоотологію енцефаломієліту коней”. Роботу також виконано за темою «Епідеміологічний та вірусологічний нагляд за грипом в Україні» в розділі «Екологічні аспекти вірусу грипу людини» Київського науково-дослідного інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського (КНДГЕІХ).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було створення досконалої діагностичної системи для виявлення вірусів грипу двох підтипів та антитіл до них в сироватках крові коней.

Для досягнення мети були поставлені такі наукові завдання :

- відібрати штами вірусу грипу коней, придатні для діагностичних досліджень на грип;

- розробити методику отримання антигенів вірусу грипу коней та визначити оптимальні умови їх зберігання;

- отримати штамоснецифічні гіперімунні сироватки до антигенів вірусу грипу коней та контрольну негативну сироватку, визначити оптимальні умови їх зберігання;

- визначити оптимальний метод обробки нативних сироваток крові коней перед дослідженням в реакції гальмування гемаглютинації (РГТА), для усунення неспецифічних інгібіторів гемаглютинації;

- запровадити модифіковану РГГА для діагностичних досліджень на ірип коней;

- створити «Набір для діагностики грипу коней в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА)»;

- апробувати набір на практиці під час досліджень сироваток крові коней;

- вивчити можливість циркуляції вірусів грипу людини в популяції коней.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні був розроблений і апробований на практиці набір для діагностики грипу коней, впровадження якого в практику лабораторій ветеринарної медицини дасть змогу своєчасно виконувати серологічну діагностику ірипу коней, а також ідентифікувати віруси грипу коней за умови їх ізоляції від хворих тварин. Розробленні'! набір не поступається за якістю імпортному, але значно дешевший. Запропонована модифікована РГГА є високочутливою, специфічною та придатною для проведення масових досліджень на грип коней.

Одержано нові практичні дані щодо можливості інфікування коней вірусом грипу людини.

Вперше за останні ЗО років в Україні проведено серо-епізоотологічні дослідження щодо грипу коней.

Практичне значення одержаній: результатів. Модифікований метод діагностики в РГТА для діагностики грипу коней, затверджений Державним департаментом ветеринарної медицини згідно з актом від 12.12.96 р. про міжвідомче комісійне випробування цього методу. Він є сучасним, чутливим та придатним для широкого застосування в роботі ветеринарних лабораторій.

Відпрацьовано всі етапи технологічного процесу одержання Набору для діагностики грипу коней, що уможливить його серійний випуск.

Розроблено комплект нормативно-технічної документації на “Набір для діагностики грипу коней в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА)”, до якого входять: “Технічні умови на набір для діагностики грипу коней в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА)”, “Інструкція по

виготовленню та контролю набору для діагностики грипу коней в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА)” та “Настанова по застосуванню набору для діагностики грипу коней в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА)”. Ця документація затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства АПК України в 1999 році (ТУ У 46.15.372 -99).

Особистий внесок здобувача. Дисертант брав безпосередню участь у плануванні роботи, самостійно виконав експериментальну частину, літературний пошук, узагальнив та проаналізував отримані результати.

Публікації та апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені в чотирьох статтях, що опубліковані у фахових виданнях, та в п’яти тезах. Результати заслухані на міжнародній науково-практичній конференції “Розвиток ветеринарної науки в Україні : здобутки та проблеми” (Харків, 1997 р.); на координаційних зборах “Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных”(Воронсж, Росія, 19-23 травня 1997 р.), а також на ХІП з’їзді Українського паукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів (Вінниця, 1996 р.). Також результати нашої роботи періодично заслуховували на засіданнях Вченої ради в Інституті ветеринарної медицини УААНта в КНДІЕІХ ім.Л.В.Громашевського.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, експериментальної частини, аналізу результатів та висновків. Викладена на 127 с. друкованого тексту. Матеріали дисертації ілюстровані 19 таблицями та 7 рисунками. Робота містить 4 додатки. Бібліографічний список включає 150 робіт.

ОСНОВНА ЧАСТИНА РОБОТИ Матеріали га методи досліджень

Для виконання роботи було відібрано 3 штами вірусу грипу коней та 7 штамів вірусу грипу людини.

Віруси грипу коней та людини (еталонні штами):

- А(кінь) 1 /Кембрі дж/63 (ІІ7Ш) та А(кінь)2/Майамі/63 (НЗШ), одержано з Всеросійського державного науково-дослідного інституту контролю, стандартизації та сертифікації ветеринарних препаратів (Москва);

- А(кінь)1/Прага/56 (НШ1) одержані з Центрального ветеринарного інституту (Софія, Болгарія);

- А/Вікторія/36/88 (НІШ), А/Бейджінг/32/92 (НЗК2), А/Шангдонг/9/93 (№N2), А/Иогашіесбург/33/94 (НЗК2), АЛІанчанг/933/95 (НЗЫ2), ВЛГІанама/45/90, В/Квінгдау/102/91 одержано в КНДІЕІХ ім. Л.В. Громашевського.

У роботі використовували :

- антигени вірусу грипу коней штамів А(кінь)1/Кембрідж/63 та А(кінь)2/Майамі/бЗ, які отримали завдяки інактивації вірусів грипу коней відповідних штамів за допомогою формаліну згідно з методикою;

- штамоспсцифічні сироватки до штамів вірусу грипу коней А(кінь)1/Кембрідж/63 та А(кінь)2/Майамі/63 одержували згідно з патентом №2243 від 31.01.94 p., “Спосіб одержання антигрипозної сироватки”, Мухопад В.О., Ковтун В.Т., Сажок Р.А., Щербинська А.М.;

- негативну сироватку отримали способом знекровлення білих щурів, які були здорові та не заражені інфекційними хворобами;

- нативні сироватки крові коней, всього 526 зразків. Зробили 5 контрольних заборів проб крові коней (див. таблицю);

- забуферений фізіологічний розчин, pH 7,2;

- нсіірамінідазу пехолерних вібріонів;

- 1-%-иу суспензію курячих еритроцитів;

- планшети для імунологічного аналізу;

- мікропіпсткн на 0.05 та 0.1 см3;

- термостати на 24,33 та 36°С;

- центрифугу на 1 000 хв'1;

- холодильник з температурою в камері 2-4°С;

- морозильні камери з температурою -18... -20 та -75°С;

- сублімаційну установку марки ТГ-5.2.

Під час виконання роботи використали :

• 48 голів білих щурів;

• 120 мл крові 3-х півнів-донорів;

• 364 курячі ембріони.

Під час досліджень використано такі методики :

1. Культивування вірусів на курячих ембріонах 10-12 - денної інкубації.

2. Усунення неспецифічних інгібіторів гемаглютинації вірусів грипу в сироватках крові за допомогою обробки їх нейрамінідазою нехолерних вібріонів або прогріванням.

3. Інактивації вірусу грипу за допомогою формаліну та ультрафіолетового випромінювання, а також контролю інактивації способом інокуляції курячих ембріонів.

4. Отримання штамоспецнфічних гіперімунних сироваток до вірусів грипу на білих щурах.

Опис контрольних заборів проб крові коней

Г осподарство Кількість зразків Проби, досліджені 3 антигенами Примітки

СП “Літало” (Тернопіль) іподром “Гомао” (Київ) СП “Агротрейд” (с. Кожанка, Фастівського р-іп', Київської обл.) 7 10 63 Всього 80 зразків А(кінь)1/Кембрідж/63; А(кінь)2/Манамі/63; А/Шангдонг/9/93; А/Бейджінг/32/92; В/Папам а/45/90. Перед дослідженням в РГГА сироватки оброблені нейралгінідазою нехолершіх вібріонів згідно з методикою.

Київський державний іподром 7 А(кінь)1/Ксчбрідж/63; А(кінь)2/Майам і/63; А/Шангдонг/9/93; АЛІоі аннесбург/33/94; А/Вікторія/36/88; В/Квіигдау/102/91. Сироватки крові коней, що перехворіти на грип з клінічними проявами (лихоманка, температура тіла 39,5-40,9°С протягом 3-х і більше діб, кашель, слизові виділення з носа). Перед дослідженням в РГГА сироватки оброблені ненрамінідазою нехолерних вібріонів згідно з методикою.

Київський державний іподром 414 А(кінь)1/Кембрідж/63 - 414 з.; А(кінь)2/Майамі/63 - 414 з.; АДІ1ангдоиг/9/93 - 32 зразків; Л/Иоганнесбург/33/94 - 112 з. Перед дослідженням в РГГА 10 проб сироваток оброблено нсіірамішдазою нехолерних вібріонів, інші 404 проби оброблені прогріванням на водяній бані при 56"С протягом 60 хв.

Київський державшій іподром 10 А(кінь)1/Кембрідж/63; А(кінь)2/Майамі/бЗ; А/Йоганнесбурі/33/94; Л/Вікторія/36/88. Сироватки крові коней, які мали захворювання верхніх дихальних шляхів протягом останніх 3-х місяців Перед дослідженням сироватки оброблені прогріванням при 56°С протягом 60 хв.

Київський державний іподром 15 А(к інь) 1 Жембрідж/63; А(кінь)2/Мапамі/63; А/Йоганнссбург/33/94; А/Нанчаш/933/95. Сироватки крові коней Київського державного іподрому, що перехворіли запаленням верхніх дихальних шляхів. Перед дослідженням сироватки оброблені прогріванням при 56°С протягом 60 хв.

ВСЬОГО: 4 господар. 526 з 9 антигенами

б

5. Ліофілізації антигенів, штамоспсцифічних до еталонних штамів вірусу грішу коней та негативних сироваток.

6. Визначення антитіл до вірусу грипу в сироватках крові коней за допомогою модифікованої РГТА.

7. Статистичні методи обробки результатів дослідження - варіаційний та кореляційний аналізи за Д. Сипетлієвим (1968).

Експериментальна частина

Експериментальну частину роботи виконували на базі Інституту ветеринарної медицини УААН у лабораторії вірусології та в лабораторії грипу Київського науково-дослідного інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського МОЗ України.

Відбір штамів вірусу грипу коней для виготовлення антигенів. Підбір

методу отримання антигенів вірусу грипу коней та контроль інактивації одержаних антигенів

З вивченої літератури ми дізналися, що дослідження на грип коней здійсшоють у 18 країнах світу. Спалахи грипу коней виникають майже щороку. Особливістю вірусів грипу взагалі та вірусу грипу коней зокрема є наявність антигенної мінливості, що потребує постійного стеження за збудником. Розрізняють два підтипи вірусу грипу коней, головними з яких с штами : А(кінь)1/Кембрідж/63 для першого підтипу та А(кінь)2/Майамі/63 для другого підтипу. Саме ці штами відібрані нами для отримання антигенів вірусу грипу коней.

Під час культивування вірусу грипу коней двох штамів на курячих ембріонах 10-12 - денної інкубації нами було напрацьовано потрібну кількість вірусовмісної рідини з високою гемаглютинуючою активністю. Апробовано методи інактивації вірусів грипу формаліном та

ультрафіолетовим випромінюванням. Вони дають однакові позитивні результати, як в плані зберігання гемаглютинуючої активності, так і повноти інактивації.Однак метод інактивації формаліном простіший у використанні та не потребує спеціального обладнання.

Отримали антигени обробивши алантоїсну вірусомісну рідину формаліном згідно з методикою. Гемаглютинуюча активність цих антигенів становила : А(кінь)1/Кембрідж/63 - 1:128 ; А(кінь)2/Майамі/63 -1:256. Така гемаглютинуюча активність висока і достатня для подальшої роботи з цими антигенами.

Визначення оптимальних умов зберігання антигенів вірусу грипу коней

Наступним етапом роботи було визначення оптимальних умов зберігання антигенів, яке ми виконали порівнявши гемаглютинуючу активність антигенів у замороженому та ліофілізованому станах. Через кожні 6 міс досліджували 3 зразки кожного з антигенів для заморожених

антигенів та через кожні 4 міс - для ліофілізованих антигенів протягом 32 міс. Результати свідчать, що збереження антигенів вірусу грипу коней у ліофілізованому стані є ефективнішим (р<0,1). Наглядно результати цього досліду наведено на рисунках 1 та 2.

отримання

Рис.І. Гсмаглтотинуюча активність антигену вірусу грипу коней А(кінь)! ЛСембрідж/63 п зворотних величинах

Рис.2. Гсмаглютинуюча активність антигену вірусу грипу коней А(кінь)2/Майамі/63 в зворотних величинах

Отримання штамоспецифічних діагностичних сироваток до вірусів грипу коней та негативної (контрольної) сироватки. Визначення оптимальних умов зберігання, активності та специфічності отриманих сироваток Для проведення ідентифікації збудника грішу коней необхідною умовою є наявність штамоспецифічних діагностичних сироваток до штамів вірусу грипу коней. Ми одержали їх згідно з патентом №2243 від 31.01.94 р. «Спосіб одержання антигрипозної сироватки», Мухопад В.О., Ковтун В.Т., Сажок Р.А., Щербинська А.М. завдяки дворазовій імунізації імуногеном - концентратом вірусу грипу коней, інактивованим ультрафіолетовим промінням. Концентрацію вірусу грипу коней двох штамів виконували за допомогою методу сорбції-елюції на курячих

еритроцитах. Для отримання гіперімунних штамоспецифічних сироваток до двох штамів вірусу грипу коней було використано 36 білих щурів (по 18 голів на кожний штам вірусу). Одержано 74 мл штамоспецифічної сироватки (по 37 мл до кожного штаму вірусу грипу коней).

Також для постановки РГГА зі шгамоспецифічнимй сироватками для контролю слід мати негативну сироватку, яку ми отримали від білих щурів, що були здоровими і ніколи не хворіли на інфекційні хвороби. Для отримання нег ативної (контрольної) сироватки використано 22 білих щура. Одержали 45 мл нативної сироватки щурів.

У РГГА із специфічними антигенами отримані імунні сироватки реагували з гомологічними антигенами в розведені 1:320, тоді як з гетерологічними антигенами - в розведені не більше 1:20. Негативна сироватка не реагувала з обома антигенами в усіх розведеннях. Аналогічно антигенам ми виконали дослід з визначення оптимальних умов зберігання штамоспецифічних та негативної сироваток і визначили, що вони зберігають свою активність краще у ліофілізованому стані (заморожені антисироватки знизили свою активність з 1:320 до 1:160 через 12 міс, тоді як ліофілізовані - тільки через 24 міс).

Визначення мітаїивості використання розроблених діагностичних препаратів та модифікованої РГГА для виявлення антитіл до вірусу грипу коней у нашивних сироватках крові коней Після отримання діагностичних препаратів ми виконали лабораторні дослідження з визначення можливості використання цих препаратів для діагностики грипу коней, а також модифікованої РГГА, за якою здійснюють дослідження на ірип людини. Суть модифікації полягас у використанні мікрометоду, а також у стандартизації умов виконання і інгредієнтів реакції (оригінальний пропис забуференого фізіологічного розчину, температурний режим та час експозиції).

Ми дослідили 80 зразків сироватки крові коней КДІ і виявили антитіла до штаму вірусу грипу А(кінь)2/Маііамі/63 в 65 зразках у титрах : 1:40 - 21 зразок, 1:80 -15 та 1:160 - 29 зразків. До штаму вірусу грипу А(кінь)1/Кембрідж/63 антитіл виявлено не було. Результати цього попереднього досліду свідчать про придатність розроблених нами діагностичних препаратів та модифікованої РГГА для виконання досліджень на ірип коней.

Визначення оптимального методу обробки иативних сироваток крові коней для усунення неспецифічних інгібіторів гемаглютинації перед дослідженням в РГГА Для підвищення специфічності досліджень на грип коней ми визначали оптимальний метод обробки нативних сироваток крові коней перед дослідженням в РГГА для усунення неспецифічних інгібіторів гемаглютинації. Ми порівняли метод обробки нейрамінідазою нехолерних

вібріонів та метод прогрівання при 56°С протягом 60 хв. Досліджували 120 зразків сироватки крові коней КДІ в трьох групах (1- оброблені нейрамінідазою; 2- оброблені прогріванням; 3- не оброблені). Середні титри антитіл до А(кінь)2/Майамі/63 становили : І група -1:57 +9,01; II група - 1:51 ±8,07; III група - 1:82 ±12,9. Вірогідність відмінностей між середніми цих груп була : між І та III групами - 90%; між II та III - 95%; між І та II відмінностей не виявлено (рис.З)

1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320

■ Гемаглютинугочий титр

Рис. 3. Співвідношення кількості сироваток з певними титрами до антигену вірусу грипу коней А(кінь)2/Манамі/63 в трьох групах в залежності від методу обробки

В результаті дослідження, ми з’ясували, що обробка нейрамінідазою нехолериих вібріонів є ефективною, але обробка прогріванням при 56°С протягом 60 хв майже не поступається цій методиці. Тому ми вважаємо, що прогрівання при 56°С протягом 60 хв є ефективніш та достатнім для усунення неспецифічних інгібіторів гемаглютинації в сироватці крові коней під час дослідженім на грип копей, крім того придатнішим для масових обстежень на грип коней.

Випробування модифікованої РГГЛ та розроблених діагностичних препаратів для діагностики грипу коней

Згідно з наказу Головного державного інспектора ветеринарної медицини України № 41 від 28.11.96 р. про комісійне випробування методу лабораторної діагностики грипу коней, проведено дослідження 8 зразків сироватки крові коней, а також штамоспсцифічних гіперімунних та 2 контрольних (негативних) зразків сироватки. Під час цих іспитів було доведено чутливість та специфічність одержаних нами діагностичних препаратів та модифікованої РГГА, а також встановлено ідентичність результатів при порівнянні чутливості та специфічності розроблених нами діагностичних препаратів з закордонними (Російськими) аналогами (вірогідність відмінностей середніх титрів - менше 90%).

Результати визначення антитіл до вірусів грипу коней та людини в сироватках крові коней Під час апробації набору для діагностики на практиці було досліджено 526 зразків сироваток крові коней Київського державного іподрому (КДІ) та чотирьох інших господарств Київської області (див. таблицю). Виявлено антитіла до другого підтипу вірусу грипу коней штаму А(кінь)2/Майамі/63 (середній арифм. титр становив 1:126,3 ±5,43 (р<0,05)). У 67% досліджених титр був діагностичним (1:32) та вище, тоді як до першого підтипу вірусу грипу коней штаму А(кінь)1/Кембрідж/63 анти тіл не було. Ці дані підтверджують повідомлення про спалах захворювання верхніх дихальних шляхів серед коней КДІ у серпні 1995 р., коли було встановлено, що збудник - вірус грипу штаму А(кінь)2/Майамі/63.

Хоча віруси грипу мають видову специфічність, можливість ураження вірусами тварин іншого виду або вірусом грипу людини є. Питання циркуляції вірусів грипу в природі досі залишається мало вивченим, тому, досліджуючи нативні сироватки крові коней, ми також намагалися з’ясувати наявність антитіл у них до вірусів грипу людини. Ми дослідили 224 зразки сироватки крові коней з 7 штамами вірусу грипу людини, що були актуальні на час виконання досліджень. Було виявлено антитіла до вірусу грипу людини штаму А/Иоганнесбург/33/94 (середній арифм. титр становив 1:330 ±10,17 (р<0,01)). Антитіла в діагностичних титрах виявлені в усіх досліджених зразках (100%). До інших штамів вірусу грипу людини антитіла виявлені в незначній кількості (рівень нижче діагностичного). Це свідчить про те, що коні мали контакт з вірусами грипу людини (рис. 4).

Рис. 4. Співвідношення кількості сироваток з певним титром антитіл до різних штамів вірусів грішу коней та людини

Визначення антигенної спорідненості мілс вірусами грипу коней та

людини

Для з’ясування причини наявності високого рівня антитіл до вірусу грипу людини в сироватці крові коней ми вивчили антигенну спорідненість між штамом вірусу грипу коней А(кінь)2/Майамі/63 та штамом вірусу грипу людини А/Йогаішесбург/33/94 у перехресній РГГА із штамоспецифічними сироватками до цих вірусів. Результати свідчать, що такої спорідненості не існує. Тому ми припускаємо, що коні КДІ могли бути уражені вірусом грипу людини штаму А/Иоганнесбург/33/94. Особливу увагу слід звернути на те, що вірус грипу людини штаму ЛУИоганнесбург/33/94 епідемічного розповсюдження на той час у країні не мав.

ВИСНОВКИ

1. Відібрані та вивчені штами вірусу грипу коней А(кінь)1/Кембрідж/63 (Н7Ы7) та А(кінь)2/Майамі/63 (НЗШ), антигени яких придатні для діагностичних обстежень поголів’я коней на грип.

2. Розроблено методику отримання антигенів вірусу грипу коней, штамоспецифічних сироваток до них та контрольної (негативної) сироватки. Визначено, що найкращі умови зберігання цих діагностичних препаратів — ліофілізований стан.

3. Обробка сироваток крові коней з метою видалення неспецифічних інгібіторів гемаглютинації прогріванням при 56°С протягом 60 хв є ефективною і придатною під час масових досліджень на грип в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА).

4. Запропоновано модифіковану РГГА для діагностики грипу коней. Суть модифікації полягає у використанні мікрометоду та стандартизації умов виконання, а також інгредієнтів реакції (оригінальний пропис забуференого фізіологічного розчину, температурний режим та час експозиції).

5. Проведено дослідження сироваток крові коней Київського державною іподрому (КДІ) та чотирьох інших господарств за допомогою розроблених нами діагностиків. Зразки сироватки містили антитіла до другого підтипу вірусу грипу коней, а саме -до штаму А(кінь)2/Майамі/63 (середній титр становив 1:126,3 +5,43 (р<0,05)), і не містили антитіл до першого підтипу цього вірусу штаму А(кінь)1/Кембрідж/63. Ці дані підтверджують можливість використання розробленого нами набору для діагностики під час масових обстежень коней на грип.

6. Сироватки крові коней КДІ не містили антитіл до вірусів грипу' людини штамів : А/Вікторія/З6/88 (НШ1), А/Бейджінг/32/92

(НЗЫ2), А/Шангдонг/9/93 (НЗ^), А/Нанчанг/933/95 (ГІЗМ2), В/Панама/45/90, В/Квінгдау/102/91, але мали високий рівень антитіл до штаму А/Иоганнесбург/33/94 вірусу грипу людини (середній титр становив 1:330 ±10,17 (р<0,01)).

7. У перехресній реакції гальмування гемаглютинації із • штамоспецифічними сироватками до вірусу ірипу коней -А(кінь)2/Майамі/63 (НЗН8) та вірусу грипу людини -А/Йоганнесбург/33/94 (НЗЫ2) підтверджена відсутність антигенної спорідненості між ними, тобто одержано практичні дані про можливість інфікування коней вірусом грипу людини.

Практичні рекомендації

За результатами виконаної роботи пропонуємо:

• модифіковану РГГА, яка затверджена згідно з Наказом від 12.12.1996 р. Державним департаментом ветеринарної медицини для проведення діагностичних досліджень на грип коней.

• технологічну схему отримання та збереження антигенів вірусу грипу коней, діагностичних гіперімунних штамоснецифічних сироваток та негативної (контрольної) сироватки для створення “Набору для діагностики грипу коней в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА)”;

• «Набір для діагностики грипу коней в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА)», що дає змогу визначати антитіла до вірусу грішу коней у сироватках крові коней, а також ідентифікувати цей вірус за умови його виділення. До набору входять два антигени першого та другого підтипів вірусу грипу коней, штамоспсцифічні сироватки до них та контрольна негативна сироватка;

• розроблену та затверджену Державним департаментом ветеринарної медицини в 1999 р. нормативно-технічну документацію на «Набір для діагностики грипу коней в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА)» (ТУ У 46.15.372 -99).

Також за результатами виконаної роботи можна дати деякі практичні рекомендації, які істотно підвищать рівень лабораторних досліджень на віруси грипу коней взагалі, зокрема, діагностики грипу коней в РГГА, а також рекомендації щодо утримання коней в господарствах для профілактики захворювання на грип, а саме:

- нами доведено, що антигени вірусу грипу коней та штамоспецифічні сироватки до цих антигенів зберігаються краще у ліофілізованому стані;

- для підвищення чутливості, виявляючи антитіла до вірусів грипу коней, слід обробляти нативні сироватки прогріванням при 56 °С протягом 60 хв. Цей спосіб усунення неспецифічних

інгібіторів гемаглютинації в сироватках крові коней ефективний і достатній під час досліджень на грип коней;

- використання мікрометоду при постановці РГТА забезпечує ефективну та чутливу діагностику та дає змогу дослідити більшу кількість зразків сироваток. Потрібно використовувати забуфереиий фізіологічний розчин, який поліпшує облік реакції;

- для ефективної профілактики грипу коней слід враховувати можливість інфікування тварин вірусами грипу людини. Під час епідемії грипу не можна допускати хворих людей до тварин. Обслуговуючий персонал повинен забезпечити захист тварин від інфікування вірусом ірипу людини. Також слід враховувати можливість інфікування під час використання коней у межах господарства, а також за його межами. Тому треба суворо дотримуватися карантинних заходів, транспортуючи коней на змагання, де збираються тварини з різних регіонів.

СПИСОК ОСНОВНИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гусаков (Локота) В.В. Епізоотична ситуація щодо грипу коней на Київському державному іподромі з 1995-1996 рр. // Ветеринарна медицина України. - 1998. - № 10. - С. 32-33.

2. Гусаков (Локота) В.В. Щодо можливості інфікування коней вірусом грипу людини // Вісник аграрної науки. - 1999. - № 6. - С. 81-82.

3. Гусаков (Локота) В.В. Визначення оптимального методу обробки нативних сироваток крові коней перед дослідженням в РГГА на наявність антитіл до вірусів ірипу // Вісник Сумського державного аграрного університету. - 1999. - № 4. - С. 125-127.

4. Старчеус А.П., Міроненко А.П., Гусаков В.В. Результати вивчення гуморального протигрипозного імунітету у коней // Сб.: Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми. Матер, міжнар. науково-практичної конференції. - X., - 1997. - С. 143-144.

5. Гусаков В.В., Старчеус А.П., Мироненко А.П. Некоторые экологические особености возбудителя гриппа человека и лошадей. // Матер, междунар. координац. совещания “Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных” . -Воронеж, 1997. - С.64.

6. Гусаков В.В. Старчеус А.П. Иммунобиологические особености возбудителя гриппа человека и лошади // Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы. Матер, междунар. научной конференции. - Минск, 1997. - С. 43.

7. Міроненко А.П., Г уса кон В.В., Компанець Г.С., Курилов Є.М., Щербінська А.М. Етіологія епідемій грипу в Україні взимку 19951996 рр. та деякі її епідеміологічні особливості // Матер. XIII з’їзду Укр. пауков, товариства мікробіол., епідеміології та паразитол. — Вінниця, 1996.-С.134-135.

8. Старчеус А.ГІ., 1 усаков В.В., Міроненко А.П. Виявлення антитіл до вірусів грипу людини у коней // Там само. - Вінниця, 1996,- С.150.

9. Міроненко А.ГІ., Гусаков (Локота) В.В., Хмельницька Г.С.,

Падченко А.Г., Аронова М.М., Мухопад В.О. Епідеміологічна характеристика епідемій грипу в Україні в 1997-1999 рр. // 36.: Дитячі інфекції, 1999. -№ 26. - С.146-152.

Гусаков В.В. Вдосконалення лабораторної діагностики грнпу коней в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА). - Рукопис.

Дисертація на здобутгя наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. -Національний аграрний університет, Київ, 2000 рік.

Дисертація присвячена лабораторній діагностиці грипу коней, а саме, розробці та апробації на практиці ефективної вітчизняної діагностичної системи на грип коней.

У роботі розглянуто етапи отримання та контролю діагностичних препаратів, що дають змогу досліджувати на грип коней, а також визначено оптимальні умови їх зберігання. Розроблені діапюстикуми виявилися активними, специфічними та придатними для діагностичних досліджень на грип коней. Експериментально доведено, що діагностичні препарати краще зберігаються у ліофілізованому стані.

Запропонована модифікована РГГА для діагностики грипу коней, яка була затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини у 1996 р. Розроблено нормативно-технічну документацію на «Набір для діагностики грипу коней в РГТА», яка затверджена у 1999 р.

У процесі роботи визначено оптимальний метод обробки нативних сироваток крові коней перед дослідженням у РГГА для усунення неспецифічних інгібіторів гемаглютинації - це обробка прогріванням при 56°С протягом 60 хв.

Здійснено дослідження сироваток крові коней КДІ та чотирьох інших господарств (усього 526 зразків) за допомогою розроблених нами діагностичних препаратів. Виявлено антитіла до другого підтипу вірусу грипу коней штаму А(кінь)2/Майамі/63 (середній титр становив 1:126,3 +5,43). З усіх сироваток 256 зразків досліджено з 7 штамами вірусу грипу людини, актуальними на той час. Виявлено антитіла до штаму А/Иоганнесбург/33/94 вірусу грипу людини (середній титр становив 1:330 +10,17).

Титр антитіл у сироватках крові коней до вірусу грипу людини перевищував у 2,2 рази титр антитіл до вірусу грипу коней. У перехресній

РГГА із штамоспецифічними сироватками до цих штамів встановлено відсутність антигенної спорідненості між штамами вірусу грипу коней А(кінь)2/Майамі/63 та А/Йогаішссбург/33/94 вірусу грипу людини. Це свідчить про можливість інфікування коней вірусами грипу людини.

- Ключові слова : грип, реакція гальмування гемаглютинації, антигеин, штамоспецифічні сироватки, вірус, антитіла, антигенна спорідненість.

Гусаков В.В. Усовершенствование лабораторной диагностики гриппа лошадей в реакции торможения ге.магглютинации (РТГА). - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология и вирусология. - Национальный аграрный университет, Киев, 2000 год.

Диссертация посвящена лабораторной диагностике гриппа лошадей, а именно - разработке и апробации на практике эффективной отечественной диагностической системы на грипп лошадей.

В работе рассмотрены этапы получения и контроля диагностических препаратов, которые позволяют грипп лошадей. Они заключались в выборе штаммов вируса гриппа лошадей, пригодных для получения антигенов, в выборе оптимального метода инактивации живого вируса для получения антигена, а также определения оптимальных условий хранения полученных антигенов и штаммоспецифических сывороток. Путём сравнения двух методов хранения полученных антигенов и штаммоспецифических сывороток (лиофилизации и замораживания) выбран метод лиофилизации. Лнофилизированные препараты дольше сохраняли свою специфическую гемагглютинирующую активность, чем замороженные. Разработанные диагностикумы оказались активными, специфичными и пригодными для диагностических исследований на грипп лошадей как для идентификации выделенных вирусов гриппа лошадей, так и для определения уровня антител к ним в сыворотках крови лошадей.

Предложена модифицированная РТГА для диагностики гриппа лошадей, которая была утверждена Государственным департаментом ветеринарной медицины в 1996 г. Суть модификации состоит в использовании микрометода, благодаря чему появляется возможность исследовать большее количество сывороток (незначительные по сравнению с макрометодом затраты антигена и диагностических сывороток, использование микродозаторов ускоряет работу); использовании

забуферепного физиологического раствора, приготовленного по оригинальной прописи, обеспечивает стабильный pH растворов реакции; а также соблюдении температурного режима и времени экспозиции, что облегчает учёт реакции.

Разработана нормативно-техническая документация на «Набор для диагностики гриппа лошадей в РТГА», которая утверждена в 1999 г.

В процессе работы был определён оптимальный метод обработки нативных сывороток крови лошадей перед исследованием в РТГА для устранения нсспсцифических ингибиторов гемагглютинации путём сравнения метода обработки нейраминидазой нехолерных вибрионов и метода прогревания. Обработка прогреванием при 56°С на протяжении 60 мин является оптимальным методом для устранения нсспецифических ингибиторов гемагглютинации в сыворотках крови лошадей (более доступна и проста в исполнении, а также даёт идентичные результаты).

Проведено исследование сывороток крови лошадей КГИ и четырёх других хозяйств (всего 526 образцов) при помощи разработанных нами диагностических препаратов. Выявлены антитела ко второму подтипу вируса гриппа лошадей штамма А(лошадь)2/Майами/63 (средний титр составил 1:126,3 ±5,43). Из всех сывороток 256 были исследованы с 7 штаммами вируса гриппа человека, актуальными на то время, а именно -А/Виктория/36/88 (H1NI), А/Бейчжинг/32/92 (I13N2), А/Шангдонг/9/93 (H3N2), А/Йоханнесбург/33/94 (H3N2), А/Нанчанг/933/95 (H3N2), В/Панама/45/90, В/Квингдау/102/91. Выявлено антитела к штамму А/Йоханнесбург/33/94 вируса гриппа человека (средний титр составил 1:330 ±10,17).

Титр антител в сыворотках крови лошадей к вирусу гриппа человека превышал в 2,2 раза титр антител к вирусу гриппа лошадей. Для выяснения наличия антигенного родства между штаммами А(лошадь)2/Майами/63 (I13N2) и А/Йоханнесбург/33/94 (H3N2) нами были получены штаммоспецифические сыворотки к этим вирусам и исследованы в перекрёстной РТГА с этими штаммами. В результате проведённой перекрёстной РТГА со штаммоспецифическими сыворотками к этим штаммам было установлено отсутствие антигенного родства между штаммами вируса гриппа лошадей А(лошадь)2/Майами/63 и А/Йоханнесбург/33/94 вируса гриппа человека. Таким образом, наличие антител к штамму вируса гриппа человека в сыворотках крови лошадей не может быть объяснено антигенным родством между этими двумя штаммами вируса гриппа, однако это может свидетельствовать о возможности инфицирования лошадей вирусом гриппа человека.

Ключевые слова : грипп, реакции торможения гемагглютинации, антигены, штаммоспецнфические сыворотки, вирус, антитела, антигенное родство.

Gusakov V.V. Improvement of laboratory diagnostics of an influenza of the horses in hemaglytination inhibition test (HIT). - Manuscript.

The dissertation on reception of a scientific degree of the candidate of veterinary sciences on a speciality 16.00.03 - veterinary microbiology and virusology. - National agrarian university, Kiev, 2000.

The dissertation is devoted to laboratory diagnostics of an influenza of the horses, namely development and approbation in practice of effective domestic diagnostic system on an influenza of the horses.

In this work are shown stages of reception and control of diagnostic preparations on an influenza of the horses, and also definition of optimum conditions of their storage. The kits which were developed have appeared active, specific and suitable for diagnostic researches on an influenza of the horses. It is proved in experiments, that the diagnostic preparations in dry condition are better kept.

Is offered modified HIT for diagnostics of an influenza of the horses, which was authorized by State department of veterinary medicine in 1996. The nonnative-engineering specifications was developed on the «Set for diagnostics of an influenza of the horses in HIT » which was adopted in 1999.

During this work the optimum method of processing native of serums of blood of the horses before research in HIT was determined with the purpose of elimination not specific inhibition hemaglytination. It is the processing of warming at 56 °C during 60 minutes.

The research of serums of blood of the horses KGH and four other economy (only 526 samples) is carried out through the diagnostic preparations, developed by us. Was revealed antibodies to second subtype of a virus of an influenza of the horses strain A(horse)2/Mayami/63 (the average credit has made 1:126,3 +5,43). Also was investigated these serums with viruses of an influenza of the man, which were urgent on that time. Is revealed antibodies to the strain A/Johannesburg/33/94 virus of an iniluenza of the man (the average credit has made 1:330+10,17).

The credit of antibodies in serums of blood of the horses to a virus of an influenza of the man exceeded in 2,2 times a credit of antibodies to a virus of an influenza of the horses. In cross HIT with strainspecific serums to it strains established absence antigenic of relationship between the strains of a virus of an influenza of the horses A(horse)2/Mayami/63 and A/Johannesburg/33/94 virus of an influenza of the man, that gives evidens about an opportunity of infecting of the horses by a virus of an influenza of the man.

Key words: influenza, hemaglytination inhibition test, antigenes, strainspecific serum, virus, antibody, antigenic relationship.

Hi/W. HO lAJ^THp. (QD.

9MI1 "nomMej"

Kuiy, bv.t. rpymctfCbKoio, 7