Тестирование вирулентности синегнойной палочки, изолированной от песцов

Семикрасова, Алла Николаевна

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Тестирование вирулентности синегнойной палочки, изолированной от песцов

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Семикрасова, Алла Николаевна п. Родники, Московской обл. 2000 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Тестирование вирулентности синегнойной палочки, изолированной от песцов

- Российская академия сельскохозяйственных наук НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПУШНОГО

) < ' V*

ЗВЕРОВОДСТВА И КРОЛИКОВОДСТВА им. В.А. Афанасьева

- \ ч

V»

На правах рукописи

ОЮ/Зс^Л,; Х(Р<Р-0

Семикрасова Алла Николаевпа

Тестирование вирулентности синегнойной палочки,

изолированной от песцов

16.00.03-ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Российская академия сельскохозяйственных наук НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПУШНОГО ЗВЕРОВОДСТВА И КРОЛИКОВОДСТВА им. В.А. Афанасьева

На правах рукописи

Семикрасова Алла Николаевна

УЖ 636.93425/26 (619:616.9У0431

Тестирование вирулентности синегнойной палочки,

изолированной от песцов

16.00.03-ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Научно-исследовательском инстшуге пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева (НИИПЗК).

Научные руководители: доктор ветеринарных наук,

профессор Емельяненко П.А.,

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Литвинов О.Б.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Макаров В.В.

кандидат ветеринарных наук Кириленко А.И.

Ведущее учреждение: Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

сертационного совета К.020.90.02 при Научно-исследовательском институте пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева по адресу: 140143, Московская обл., Раменский р-н, пос. Родники ул. Трудовая дом 6.

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева.

. Автореферат разослан «¿2» М$>гт г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Защита состоится «25> ШСИУ2000 г. В 11

часов на заседании дис

кандидат биологических наук

Л.И. Давыдова

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. В производстве пушнины песцсводству придается важное значение прежде всего из-за сравнительно низкой себестоимости и высокой окупаемости шкурковой продукции. Однако сдерживающим фактором в его развитии является патология, ассоциированная с синегнойной палочкой. Она, по данным О.Б. Литвинова (2000), контаминирует воду, корма, предметы ухода за животными и, проникая в организм песцов, обусловливает бактерионосительство, заболеваемость и гибель животных. Из-за поражения гениталий нарушается эмбриогенез, происходят выкидыши и рождается ослабленный молодняк. В результате в зверохозяйствах формируется стационарное неблагополучие и снижается воспроизводительная функция животных.

Вакцины, используемые в норководстве, обладают слабой протектив-ной активностью при псевдомонозе у песцов, поскольку серологический профиль возбудителя болезни не совпадает с природными маркерами патогенно-сти микроба и защитной активности их для пушных зверей. Между тем этио-патогенетическую роль синегнойной палочки определяют главные и вспомогательные факторы внеклеточной локализации, однако тестирование выделенных от песцов культур синегнойной палочки по экстрацеллюлярным факторам патогенным еще не изучено.

Цели и задачи исследований. Основной целью нашего исследования является апробация современных методов тестирования вирулентности синегнойной палочки, изолированной от песцов, по внеклеточным факторам пато-генности. Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи.

1. Провести биотестирование вирулентности микробных изолятов на лабораторных животных.

2.Испытать ферментативный и иммунохимические методы определения экзотоксина А.

З.Исследовать возможность тестирования факторов распространения микроорганизмов с протеолитической активностью.

4.Определить адгезивную активность внеклеточных структур синег-нойной палочки.

5.Рассчитать корреляционную зависимость между факторами вирулентности возбудителя псевдомоноза песцов.

Научная новгона. Впервые проведено комплексное исследование возможности тестирования и уровня взаимодействия факторов патогенности строго идентифицированных клонированных культур синегнойной палочки, изолированных из патологического материала пораженных псевдомонозом песцов. На полевом материале апробированы современные способы тестирования главного фактора вирулентности по ферментативной и иммунохимиче-ской активности, адгезинов по прямой гемагглютинации и образованию экст-рацеллюлярной слизи, факторов распространения - по протеолитической способности щелочной протеазы и антигенной активности эластазы.

Установлена достоверная положительная корреляция между показателями биотестирования, адгезии, токсичности и протеолитической активности микроорганизмов.

Опытами по отмене адгезии микроба преинкубацией с антисыворотками показана обусловленность фиксации синегнойной палочки неполисаха-ридными структурами.

Сопряженность биосинтеза факторов патогенности с серологическим профилем синегнойной палочки экспериментально не подтверждена.

Практическая ценность. Для практической ветеринарии предложено биотестирование патогенности синегнойной палочки на белых мышах живой массой 18-20 г посредством внутрибрюшинного введения взвеси микроба в дозе 800*106 м.т./гол. Предложение вошло в «Методические рекомендации по выделению штаммов синегнойной палочки из организма песцов и лисиц и их

идентификация», ободренные секцией пушного звероводства Россельхозака-демии в 1994 г.

Для эпизоотологического анализа в зверохозяйствах (установление источника, распространения инфекции и рецепции возбудителя) предлагается определение экзотоксина А (в РПГА), адгезии (прямой гемагплотинацией эритроцитов кролика) и щелочной протеаэы (по расщеплению казеина).

Тестирование токсичных экзопродуюгов синегнойной палочки предлагается для отбора штаммов при изготовлении протективных препаратов, контроле их качества и защитной эффективности. Благодаря такому тестированию банк, вакцшгных штаммов синегнойной палочки НИИПЗК им. В.А. Афанасьева пополнен нами 13 возбудителями псевдомоноза песцов, что подтверждено патентами ВНИИГПЭ.

Апробация материалов диссертации происходила при ежегодном обсуждении планов, методик и отчетов по научно-исследовательской работе на методической комиссии № 4 и Ученых советах института в 1989-1999 годах, на секции пушного звероводства российской академт» сельскохозяйственных наук (1994), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию НИИПЗК им. В. А. Афанасьева (1997), на семинаре ветеринарных специалистов зверохозяйств на ВВЦ (1998), при обсуждении заявок в Роспатенте в 1999 году.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 109 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, сведений о практическом использовании результатов исследований и рекомендаций по использованию научных выводов, списка литературы, включающего 150 источников, в том числе 97 иностранных авторов и два приложения. Работа содержит J9. таблиц и 1 рисунок.

2. Материалы и методы исследований

Объектом исследований были трупы песцов, присланные в диагностическую лабораторию института на протяжении 1980-1998 гг. из 19 регионов бывшего СССР с подозрением на синегнойную инфекцию. Бактериологическому исследованию подвергали обычно трупы зверей, не леченых антибиотиками. В первый день из кровенаполненных внутренних органов трупа (сердце, печень, селезенка), из содержимого матки или из плодов делали посевы на 1,5 % МПБ или бульон Хоттингера, МПА и дополнительно селективную среду - цетримидный агар или агар с N-цетилпирндинием хлорида (ЦПХ-агар). На второй день регистрировали рост культур синегнойной палочки. На поверхности МПБ последние образуют серебристую сероватую пленку с одновременным окрашиванием среды в синий или зеленый цвет и появлением запаха жасмина. На МПА развивались колонии микроба различных морфологических типов: плоские неправильной формы или сходные с колониями эшерихий, складчатые в виде «цветка маргаритки», слизистые с зеленоватой окраской или карликовые. При окрашивании по Граму в поле зрения микроскопа синегнойная палочка красно-розового цвета и имеет длину 1-3 и ширину 0,5-1 мкм. После подкожного введения белым мышам живой массой 15-18 г 0,3 мл суточной бульонной культуры мыши гибнут на протяжении 6-12 часов.

При установлении на МПА ассоциаций различных культур отдельные колонии рассеивали в МПБ. Беспигментные колонии отсевали на среды Кинг Хью-Лейвсена или среду Гисса с глюкозой, на среды с желатиной, аргинином, нитратный или нитритный бульоны, ацетамидный агар и на обычные среды для выявления способности роста при температурах 42 °С и 5 °С.

На третий день оценивали результаты посевов. Культура синегнойной палочки расщепляет глюкозу с образованием кислоты без газа в аэробных условиях, разжижает желатину, образует аммиак из аргинина в аэробных уело-

виях, восстанавливает нитраты в нитриты и редуцирует последние до газообразного азота.

Культуры микроба характеризуются положительной цитохромоксидаз-ной активностью, растут при 42 °С и утилизируют ацетамид.

По гомологии нуклеиновой кислоты все выделенные культуры соответствовали Рб. аеп^поБа ДНК-группы РНК-секции 1, как описано в определителе зоопатогенных микроорганизмов (Сидоров, Скородумов, Федотов, 1995).

Совместно с О Б. Литвиновым выделенных возбудителей синегнойной инфекции клонировали и подвергали серотипированию.

Клонирование культур синегнойной палочки проводили по принятому в экспериментальной микробиологии методу (Мейнелл, Мейнелл, 1967) подсчета микроорганизмов посредством серийных разведений с учетом распределения Пуассона. Предварительно пластинчатый МПА в чашках разбивали на три сектора (по дну чашки карандашом чертили букву Т), а затем засевали штрихом суточной бульонной культурой исходного штамма. В перевернутом виде чашки термостатировали при температуре 37 °С на протяжении 96 часов.

По истечении сроков культивирования учитывали морфологический состав колоний.

Из последнего сектора каждую колонию пересевали в МПБ и термостатировали уже 24 часа. В культуральной взвеси определяли количество микробных тел по стандарту мутности Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Каждую -взвесь разводили последовательно до Ю"10 и по 0,1 мл суспензии первых четырех разведений вносили в 10 пробирок с питательным бульоном. После термо-статирования учитывали помутнение содержимого пробирок, принимая пробирки со стерильным бульоном как неконгаминированные.

Получаемые результаты служили исходными данными для расчетов

числа жизнеспособных бактериальных клеток, содержащихся в неразведен-ной взвеси, принимая последнее за число с наибольшей вероятностью, адекватное комбинации мутных и прозрачных пробирок, рассматривали их как наиболее вероятное число клеток (НВЧ).

Серотипирование культур осуществляли в основном по НаЬэ'у с помощью набора из 18 О-сывороток, изготовленных ПСИ им. Л.А. Тарасевича. Типовые сыворотки применяли в разведении 1:20 или 1:25 в реакции агглютинации на стекле. Результаты реакции учитывали после 2-минутного контакта сыворотки с культурой, выращенной на плотной питательной среде.

За положительную реакцию принимали интенсивность агглютинации в два и четыре креста.

Именно серотипы брали в расчет при определении вирулентных свойств синегнойных палочек.

Отобранные культуры синегнойной палочки тестировали на вирулентность по адгезивности, продукции экзотоксина А, активности протеазы и эла-стазы, учитывая связь активности экзопродуктов с взвешенными результатами реакции защиты животных и детерминант адгезивных антигенов и О-антигена.

Взвешенную реакцию защиты животных ставили на белых мышах живой массой 18-20 г путем подкожного или внутрибрюшинного введения им 100-300 млн. м.т. на голову тестируемых штаммов. После инокуляции взвеси за животными наблюдали на протяжении 52 часов. Причину гибели мышей подтверждали микробиологическим исследованием патматериала.

Адгезивную активность культур синегнойной палочки определяли в реакции агглютинации с эритроцитами различного происхождения по принятому в ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи методу. Эритроциты получали из венозной крови, смешанной 1:2 с раствором Олсвера. После отмывания на центрифуге готовили 0,5 % взвесь эритроцитов на фосфатном буфере РВС рН 7,4.

Культуру микроба выращивали на МПА, петлей переносили в 5 мл ТБВ 0,6 %-ного дрожжевого экстракта и термостатировали при 37 °С. Через 24 часа культуры трехкратно промывали РВС рН 7,4 на центрифуге и из осадка готовили взвесь 3*106 м.т., по 50 мкл которой закапывали в первую лунку планшета для иммунологических реакций, содержащую такой же объем РВС, и титровали до 12-ой лунки. Последняя составляла контроль, в котором содержалось 50 мкл РВС+50 мкл взвеси эритроцитов.

Положительной считали реакцию с образованием «зонтика» из агглютинированных эритроцитов, отрицательной реакцией - по образованию «пуговки» в центре лунки.

Вкупе с адгезивностью синегнойные изоляты тестировали на слизеоб-разование. Экстрацеллюлярная слизь также способствует фиксации бактерий на поверхности субстрата. Предварительным сравнением индикационных возможностей МПА и среды с гидролизатом бычьего сердца доказано преимущество последнего. После второго пассажа на сравниваемых средах культуры синегнойной палочки образовывали слизистые колонии больше, чем после первого и в обоих случаях образовывались бактериями на среде с гидролизатом интенсивнее примерно на треть.

При скрининге клонированных культур синегнойной палочки пользовались средой с гидролизатом бычьего сердца.

Продукцию экзотоксина А культурами изолированных от песцов синегнойной палочки тестировали по антигенным свойствам токсина (в реакции непрямой агглютинации, диффузионной преципитации) и специфической ферментативной активности экзотоксина А.

Для РИГА исследуемым материалом служили супернатант культур, выращенных на бульоне Мартена с добавлением 0,5 % глютамата натрия и 1 % глицерина при 22 °С на шугтель-аппарате. Супернатант получали путем центрифугирования в течение 15 минут при 3000 об/мин культуральной среды и

разбавляли изотоническим раствором хлорида натрия до 1:512.

В качестве носителя сенсинов использовали иммунные глобулины мо-новалснтной антитоксической сыворотки. Панель с реагентами термостати-ровали при 37 °С в течение 2-3 часов и учитывали результат гемагглютина-ции, как отмечено выше. Изолированные колонии микроба исследуемых штаммов тестировали также в реакции иммунодиффузии в чашках Петри (метод Eleck (1948) в модификации Ohman et al., (1980). С этой целью чашки заливали 1 % агаром Пурифайта с добавлением 0,05 М глютамата натрия и 1 % глицерина в объеме 10 мл. В сделанные в агаре лунки помещали моновалентную антитоксическую сыворотку. Разместив вокруг лунок с ангисывороткой материал 18 колоний исследуемого штамма, чашки с реагентами помещали в эксикатор и термостатировали при 32 °С. Наличие полос преципитации между реагентами учитывали через 18 часов. Ферментативную способность экзотоксина Л тестировали путем определения АДФ-рибозол-трансферазной активности экзопродукта по методу J R. Kandel, R.J. Collier, D. Chang (1974) no отношению к субстрату фактора элонгации - 2, выделенному из зерен пшеницы по методу D. Chang, R. Collier (1977). Метод основан на количественном определении радиоактивной метки, перенесенной под действием экзотоксина А от МС-НАД на фактор элонгации-2. Данная процедура выполняется быстро, с чувствительностью 100 нг/мл и высокой специфичностью. Предназначенная к учету на счетчике инкубационная смесь включала 200 мкл буфера (0,01 трис-HCL, pH 8,0; 0,4 мл дитиотренгола и 0,1 % БСА), 50 мл раствора фактора элонгации 2, содержащего 50 нмолей фактора элонгации, 50 мкл ни-котинамида 14С-адениндинуклеотида в концентрации 14,3 мкг/мл и 10 мкл испытуемого супернатанта. Инкубационную смесь для активации экзотоксина А смешивали с равным объемом 8 М-ного раствора мочевины и выдерживали 15 минут при комнатной температуре. Инактивацию смеси останавливали добавлением равного объема 20 % раствора трихлоруксусной кислоты. Радио-

активность сорбированного на фильтре преципитата измеряли на счетчике LS-250 Beckman (Англия).

Контрольные пробы содержали вместо экзотоксина 10 мкл трис-HCL. Активность каждой пробы определяли в трех повторностях. Необходимые при этом приборы, реагенты и методическая помощь были любезно предоставлены сотрудниками ожоговой лаборатории ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Тестирование продукции экзотоксина А завершали определением его биологической активности. Для этого готовили супернагант бульона Мартена, на котором 18 часов культивировали испытуемые штаммы возбудителя псевдомоноза. Культуральную жидкость центрифугировали в течение 10 минут при 10000 оборотов, над осадок пропускали через миллипоровый фильтр с диаметром пор 0,45 ммк. Стерильный супернатант разводили изотоническим раствором хлорида натрия с 1:2 до 1:512, по 1,0 мл каждого разведения вводили внутрибрюшинно четырем белым мышам. Через 5 дней наблюдения учитывали результат и рассчитывали LD 50 по методу И.И. Ашмарина и A.A. Воробьева (1962).

Протеолитические свойства синегнойной палочки изучали по ферментативной активности щелочной протеазы и иммунохимической активности эластазы. Предварительно готовили супернатант используемых культур после выращивания на среде Jensen, которую в соответствии с модификацией сотрудниками ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи готовили в два приема и добавляли аминопептид.

Среду Jensen (хлористый натрий, фосфорнокислый натрий, сульфат натрия, в алии, фенилаланин и глюкоза) растворяли в дистиллированной воде (смесь № 1), отдельно готовили солевую смесь 2 (хлористый кальций, сульфат железа и сульфат цинка) также на дистиллированной воде и добавляли к среде. К готовой среде Jensen дополнительно прибавляли аминопептид. После 18-часового шутеллирования при 32 °С засеянные среды центрифугировали

при 6000 оборотах в минуту в течение 20 минут и супернатант исследовали.

Активность щелочной протеазы определяли в реакции диффузии в агар с казенном по методу Б. Агаёзоп (1973). Казеин молока очищали по Гаммер-сгену. Протсолитическую активность оценивали по размеру зон расщепления казеина в агаре (2 % казеина, 2 % агара в 0,06 М фосфатном буфере рН 7,4) вокруг лунок, заполненных испытуемым раствором. В качестве положительного контроля и стандарта для количественного определения протеолитиче-ской активности использовали раствор трипсина в концентрации 4-320 мкг/мл.

Метод определения эластазной активности основан на реакции преципитации антигенных детерминант супернатанта с моновалентной антиэла-стазной сывороткой к высокоочищенному препарату эластазы синегнойной палочки.

Для постановки реакции использовали 1 % агар Пурифайта. Его заливали в чашки Петри по 10-15 мл, подсушивали и при помощи штампа в агаре делали луночки. В центральную лунку помещали антиэластазную сыворотку, в периферические - супернатант в разведениях 1:1 - 1:32 на изотоническом растворе хлорида натрия рН 7,4.

Результаты учитывали по наличию полос преципитации

Цифровые данные результатов исследования подвергали статистической обработке: при определении ЬО по методу И И. Ашмарина и А.А. Воробьева (1962), при определении достоверности средней арифметической и коэффициента корреляции последуемых факторов использовали методы, описанные П.Ф. Рокицким (1961). Достоверность клонирования рассчитывали по Дж. Мейнелл и Э. Мейнелл (1967).

3. Результаты исследований

3.1 .Результаты серологического типирования изолятов от павших песцов. Серологическому типированию подвергали культуры синегнойной палочки, выделенные из патматериала песцов в разные годы. По-

еле очистки хранившиеся на скошенном агаре под вазелиновым маслом штаммы клонировали. Уже клонированные штаммы синегнойной палочки тестировали по НаЬэ'у в реакции агглютинации, определяя серологические варианты термостабилыгого соматического антигена. При этом мы стремились учесть взаимодействие реагентов для каждого клона отдельно.

От каждого штамма сииегнойиых палочек получено по 2 клона культур, за исключением штаммов 521 и 532, от которых изолировано по 3 клона. Независимо от числа, все полученные от одного штамма клоны как правило, принадлежали одному серологическому варианту, кроме штамма 499. Его, видимо, можно отнести к штамму с маркировкой 02/05.

Половина из 51 тестированных клонов отнесено к 06 (17 клонов) и 03 (12 клонов), остальные клоны распределены примерно поровну между серо-варами 02, 02/05, 05, 09 и 011.

Большинство однотипных сероваров изолировано от павших песцов в прибалтийских зверохозяйствах.

Поскольку принадлежность к серологическому типу синегнойной культуры традиционно учитывается как природная маркировка штамма, при дальнейшем изложении результатов исследования факторов патогенности будет указывать серовар микроорганизма.

3.2.Результаты биотестирования культур синегнойной палочки. выделенных из патматериала. В начале исследования подбирали модель для биотестирования. С этой целью патогенность апробировали на песцах, морских свинках и белых мышах - по 4 животных каждого вида. Песцов и морских свинок заражали внутримышечно, мышей - внутрибрюшинно взвесью суточной агаровой культуры синегнойной палочки с определенным содержанием микробных тел в 1 мл. Тестируемые штаммы относились к се-роварам 03 (449, 494, 529), 06 (498) и 20/05 (510).

Результаты опытов показывали однотипный итог биотестирования. Во всех случаях биопробы животные всех видов гибли от культур синегнойной палочки. Правда, доза микроба и время гибели у подопытных животных разнились. Тем не менее, приведенные данные подтверждают эффективность биотестирования синегнойной палочки на самом доступном и дешевом виде животных - белых мышах.

Изолированные из трупного материала песцов культуры синегнойной палочки в дальнейшем тестировали на патогенность только на белых мышах. Взвесью данных бактерий с определенным серологическим вариантом и содержанием микробных тел внутрибрюшинно заразили по 4 гол. белых мышей живой массой 18-20 г в дозе 0,3 мл. За животными вели наблюдение на протяжении 5 суток.

Полученные данные показывают различную вирулентность исследованных в биопробе культур возбудителя псевдомоноза. Три исследованных штамма (495, 499 и 500) вызывали гибель подопытных животных только в повышенных дозах. Два штамма (476 и 785) вызывали гибель мышей через 48, а штамм 496 - через 120 часов. Лишь половина штаммов обладала 100 %-ной летальностью за 24 часа в минимальных испытанных дозах. При повышении дозы синегнойной палочки до максимальной 75 % подопытных мышей погибало в течение первых суток после заражения. Не проявляется также связь вирулентности возбудителей с серологическим профилем: из штаммов микроба серовара 02/05 только половина является высоковирулентной, серо-вара 03 примерно 60 %, серовара 06 - 30 % и совсем слабовирулентен штамм 500, относящийся к серовару 09.

Для уточнения летальной дозы возбудителей псевдомоноза песцов для белых мышей при тех же условиях заражения тестированию подвергли 5 клонированных штаммов.

Полученные данные уточняют летальную дозу возбудителя синегной-

ной инфекции песцов для белых мышей, которая практически для всех проверенных штаммов лежит в границах 300« 106 клеток. Со скоростью гибели зараженных мышей скорее связаны штаммовые различия. Тем более, что сопоставить летальность штамма с особенностями поверхностных структур О-антигена в данном случае не удается из-за отсутствия в опыте повторных се-ровариантов микроба.

3.3. Тестирование экзотоксина А. Определенный интерес представляет главный фактор патогенности синегнойной палочки, изолированной от павших песцов.

Прежде всего обсудим результаты тестирования специфической, ферментативной активности токсина. Полученные сведения о ферментативной активности экзотоксина А 29 клонированных штаммов синегнойной палочки неоднозначны. Во-первых, они свидетельствуют о существенных штаммовых различиях палочки, даже об индивидуальных свойствах клонов. Максимальная АДФ-рибозил-трансферазная активность в 2500 импульсов в минуту на чг белка отмечена у микробов второго клона 513 штамма синегнойной палочки, второго клона 514 штамма и второго клона 529 штамма. Отсутствие активности зарегистрировано у 10 штаммов. Между ними распределены по активности 16 штаммов.

Несовпадение активности клонов одних и тех же штаммов лишь подтверждает необходимость клонирования изолятов.

Во-вторых, проявление АДФ-рибозил-трансферазной активности у синегнойной палочки не коррелирует с серологическим профилем бактерий. Так, среди бактерий различных штаммов и клонов, объединенных серологической общностью (например, серовар 03), встречаются клетки-продуценты экзотоксина А с полной гаммой активности - от 0 до 2500 имп/мин/мг белка. То же наблюдается у сероваров 06, 09 и 02/05.

В данном контексте интересно рассмотреть тестирование токсической активности штаммов синегнойной палочки с учетом антигенных свойств экзотоксина А. Иммунохимическое тестирование экзотоксина сначала представим по пассивной гемагглютинации. Полученные нами данные также указывают на неодинаковые результаты тестирования токсичности синегнойной палочки в РПГА. У проверяемых бактерий она варьировала от 0 до 1:512, причем в первом случае у штаммов серовара 02/05 и реже у штаммов серова-ра 06, потому что синегнойные палочки серологического варианта 06 из 17 штаммов положительно реагировали 13, правда в разных разведениях. Также различный титр токсина отмечен у представителей и других сероваров микроба, что не позволяет утверждать о сопряженности этих двух показателей.

Наконец, тестирование токсинообразования у синегнойной палочки мы предприняли по методу иммунодиффузии, впервые примененном Эликом для определения дифтерийного токсина. Продукция токсина в данном случае учитывается по образованию полос преципитации между центральной лункой в агаре Пурифайта с антитоксической сывороткой и токсином-антигеном размещенных вокруг нее колоний испытуемого микроба.

Из проверенных в тесте Элика 38 культур клонов различных штаммов положительно среагировали 14, т.е. 36,8 %.

Максимальное число прореагировавших на специфическую сыворотку колоний соответствовало числу тестируемых, т.е. 18. Их, к сожалению, было только две культуры. Нулевые значения зафиксированы у 24 культур микроорганизма, что составляет 63,1 %.

Что касается продукции токсина синегнойной палочки в связи с серологическими свойствами О-антигена, максимально она выявлена у четырех штаммов из семи 011 серовара (57 %) и у четырех из десяти штаммов серовара 03 (40 %). Преимуществ других серологических вариантов не выявлено.

3.4. Результаты определения протеолитической активности. Протеолигическую активность ферментов синегнойной палочки можно представить по результатам определения активности щелочной протеазы и эласта-зы. Тестировали первый фермент по субстратлитической активности (казеин), второй - по образованию преципитации в агаровом геле супернатанта микроба с моновалентной антиэластазной сывороткой.

Результаты тестирования способности синегнойной палочки, изолированной от павших песцов, продуцировать щелочную протеазу только в одном случае оказались отрицательными - фермент не обнаружен у штамма 536. Все остальные клонированные микроорганизмы вырабатывали фермент, но с различной интенсивностью. Максимальная активность протеолитического фермента составляла 384 единицы интегрированного показателя активности (последнее положительное разведение, умноженное на диаметр зоны лизиса субстрата в мм), минимальная - 48 единиц.

Клоны возбудителя синегнойной инфекции песцов максимально сосредоточены в диапазоне средних величин литической способности микроба, повышенной активностью протеолитического фермента характеризуется лишь 16 % тестируемых культур.

Относительно связи ферментативной активности микроорганизмов с особенностями соматического антигена сделать определенные представления по приведенным результатам также нельзя. Дело в том, что среди синегной-ных палочек одного и того же серологического варианта по О-антигену встречаются продуценты фермента разной активности.

Результаты иммунохимического тестирования демонстрируют неравнозначную активность штаммов по продукции эластазы: разброс ее от 0 до 1:32. Причем эласталическая активность микроба варьирует в зависимости от клона. Например, клон 1 штамма 526 образует преципитат с антитоксической сывороткой в разведении 1:16, а клон 2 того же штамма - в разведении 1:4.

Отсутствие продукции эластазы зарегистрировано у 6 штаммов, максимальная активность у трех штаммов, остальные клонированные культуры распределяются между ними.

Особенно рельефно прослеживается активность эластазы синегнойной палочки в зависимости от принадлежности микроба к клонам.

Однако и в данном случае о связи продукции фермента и серовара однозначно судить невозможно. Так, например, среди трех продуцентов эластазы в максимальных титрах находится 2 штамма 06 серовара и они же представляют половину клонов с нулевой продукцией токсина.

Клоны синегнойной палочки с продукцией эластазы в средних диапазонах активности проявляют зависимость от серологического профиля как в случае продукции протеазы, т.е. автономно, хотя протеолитическая активность исследованных культур графически воспринимается однотипно.

3.5.Тестирование адгезивной способности. К структурным факторам патогенности синегнойной палочки можно отнести специальные выросты полюсной локализации (адгезины) или детерминанты полисахарида, представляющие внеклеточную слизь, которые обусловливают способность патогенных бактерий фиксироваться на поверхности занимаемой ниши в организме животного.

Для тестирования адгезивной активности бактерий обычно применяют реакцию гемагглютинации. Однако эритроциты каких животных предпочтительнее в данном случае, было неясно. Поэтому скрининг коллекции возбудителей псевдомоноза песцов на адгезивность мы предварили определением степени сродства к поверхностным структурам клеток синегнойной палочки мембранных детерминант эритроцитов различного происхождения.

Конечные разведения реагентов в результате положительной реакции на адгезию были сосредоточены преимущественно в графе с эритроцитами кро-

лика, в меньшей степени в графе с эритроцитами человека и совершенно не отражены в графе с эритроцитами барана. Но даже с кроличьими эритроцитами реагируют не все клоны коллекции синегнойной палочки, выделенной от песцов. Из 26 проверенных клонов положительно с ними прореагировало только 14, что составило 53,8 %. При этом максимальный агппотинационный титр 1:128 отмечен только в двух случаях, в остальных случаях положительных реакций он снижался дву-четырехкратно.

Эритроциты кролика агглютинировались синегнойной палочкой различной серологической принадлежности примерно с одинаковой частотой. Степень вьгражениости реакции очевидно не связана с сероваром бактерий. Однако, поскольку данная серия опытов позволила подобрать основной компонент тест-системы, адгезивность всех возбудителей псевдомоноза песцов мы проверили на агглютинабильность эритроцитов кролика. Взвесь отмытых эритроцитов кролика готовили с таким расчетом, чтобы каждый ее мл содержал ЫО8 красных клеток крови. Тестируемые культуры синегнойной палочки (исходная концентрация 3*106) двукратно разводили от 1:2 к 1:2048, принимая за положительный титр, умноженный на степень разведения культуры бактерий.

По полученным результатам можно сделать заключение о способности эритроцитов кролика агглютинироваться всеми испытанными микроорганизмами, но с различной интенсивностью. Наивысший агглютинационный титр 2048 присущ только второму клону штамма 529, больше он не воспроизводился. Остальные клоны агглютинировали эритроциты в более низких концентрациях.

Основная масса штаммов возбудителя псевдомоноза песцов проявляет адгезивные свойства средней активности от тиров 1:16 до 1:512. Примерно треть тестированных штаммов обладают сниженной адгезивностью.

С еще меньшим постоянством возбудители синегнойной инфекции песцов продуцируют экстрацеллюлярную слизь. Если взять во внимание, что ис-

следуемые клонированные штаммы синегнойной палочки перед тестированием слизеобразования дважды пассировали на среде с гидролизатом бычьего сердца, образование данного фактора можно рассматривать как штаммовой признак бактерий.

Экспериментальные данные иллюстрируют непостоянство синтеза внеклеточной слизи синегнойной палочкой: из 37 клонированных культур микроба ее образуют 20 (54 %), 17 (46 %) не образуют. Интересно отметить почти универсальный факт образования или необразования слизи одновременно обоими клонами штамма. Исключение составляет лишь штамм 524, первый клон которого синтезирует, а второй не синтезирует слизь. Отсутствие связи между сли-зеобразованисм и серологическим вариантом наглядно демонстрируется равным распределением клонов среди различных сероваров.

3.6.Статистическая связь между показателями вирулентности. Научный и практический интерес у исследователей патогенности синегнойной палочки вызывают количественные параметры факторов. Полученные данные свидетельствуют о широкой вариабельности в продукции факторов вирулентности даже клонированными микроорганизмами. Во всяком случае об. этом можно судить по неустойчивости среднеарифметических величин. Тем более, когда во внимание должны браться и индивидуальные особенности подопытных животных. Более стабильные средние показатели экзопро-дуктов микроорганизмов, взятых отдельно от животных. Тем не менее полученную информацию мы использовали при расчете статистической связи между показателями. Коэффициент корреляции всех показателей рассчитали по отношению к ферментативной активности экзотоксина А как главного фактора вирулентности возбудителя.

Коэффициент корреляции между показателем АДФ-рибозил-трансферазной активности экзотоксина А (показатель ферментативной актив-

ности токсина), РПГА (показатель антигенных свойств экзотоксина А) и LD50 (показатель летальности токсина) оказался достоверным и с положительным знаком. Положительная статистическая связь проявлена также между ферментативной активностью экзотоксина А и щелочной протеазы. Адгезивная, эластазная и ферментативная активность экзотоксина А у микроба проявляются как независимые. Однако последнее не исключает иммунохимического взаимодействия или единства отдельных факторов.

Наравне с идентифицированными полноценными возбудителями синег-нойной инфекции у песцов в опыт введен 751 неферментирующий штамм. Видимо, обусловленное этим своеобразие позволило иначе проявить адгезивные свойства. Полноценные штаммы после обработки антитоксической сывороткой утрачивали адгезивную способность, тогда как преинкубация с ангиполисаха-рндной сывороткой адгезии клеток не отменяла. Следовательно, адгезивность обусловлена структурами неполисахаркдной природы.

Аналогичные данные были получены также при использовании в качестве контроля неферментирующих штаммов 322, 326, 749, 755 и 756, относящихся к Aeromonas hvdrophila.

4. выводы

1. Вирулентность синегнойных палочек, как полидетерминантный признак, определяется токсичностью и инвазивностью, которые можно тестировать лабораторными методами.

2.Главный фактор вирулентности микроорганизма экзотоксин А (АДФ-рибозил-трансфераза) выявляется в 77 % ферментативным методом, в 87 % непрямой гемагглютинацией и в 37 % иммунодиффузионным тестом.

3.Факторы распространения: щелочная протеаза у 97,3 % клонов обнаруживается по казеинолитической способности, а эластаза у 76,3 % клонов индентифицируется в реакции преципитации.

4.Адгезивную активность поверхностных структур бактерий у 100 % клонов устанавливали в реакции прямой агглютинации с эритроцитами кролика, экстрацеллюлярное слизеобразование - у 47 % клонов по формированию соответствующих колоний после прединкубации с гидролиз атом бычьего сердца.

5.Путем инокуляции взвеси изолированной от песцов синегнойной палочки песцам, морским свинкам и белым мышам минимальная летальная доза микроорганизма установлена для белых мышей.

6.Биотестирование летальности положительно коррелирует с показателями уровня экзотоксина А, щелочной протеазы и адгезивной активности микроорганизма.

5. Рекомендации по использованию результатов исследований

1. Разработаны «Методические рекомендации по выделению синегнойной палочки из организма песцов и лисиц и их идентификации». Утверждены на совместном заседании Ученого совета НИИПЗК им. В.А. Афанасьева и секции пушного звероводства Россельхозакадемии 21.06.1994 г. Они предназначены для специалистов звероводческих ферм и диагностических лабораторий.

2. Выявлены, изучены и депонированы в музее бактериальных культур НИИПЗК им. В.А. Афанасьева 13 штаммов синегнойной палочки, дающие возможность получить иммунологически активный специфический препарат против синегнойной инфекции.

3. Материалы диссертации рекомендовано использовать в лекциях и на лабораторно-практических занятиях для слушателей ФПК и студентов факультетов ветеринарной медицины и биофаков вузов ветеринарного профиля.

6.список опубликованных работ по теме диссертации

1. Литвинов О.Б., Комарова Г.А., Семикрасова А.Н. Биологические свойства синегнойной палочки. Сообщение 1П // Сб. научных трудов НИИПЗК - Актуальные проблемы науки в области пушного звероводства и пантового оленеводства, M., 1990, т. 37, с. 142-145

2. Литвинов О.Б., Рютова В.П., Семикрасова А.Н. Методические рекомендации: Выделение штаммов синегнойной палочки из организмы песцов и лисиц и их идентификация // M., 1994, - 18 с.

3. Литвинов О.Б., Рютова В.П., Семикрасова А.Н. Нозоареал синегнойной инфекции // Тез докл. Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию НИИПЗК им. В.А. Афанасьева Проблемы пушного звероводства и кролиководства Моск. обл., Родники, 1997, с. 96-99

4. Литвинов О.Б., Рютова В.П., Семикрасова А.Н. Формы проявления синегнойной инфекции и ее течение у лисиц и песцов // Тез докл. Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию НИИПЗК им. В.А. Афанасьева. Проблемы пушного звероводства и кролиководства. Моск. обл.. Родники, 1997, с. 99-100

5.Литвинов О.Б., Семикрасова А.Н. и др. Штаммы бактерий Pseudomonas aeruginosa используемые для изготовления вакцин против псевдомоноза пушных зверей. - Патенты Роспатента №№ 99117149/13, 99117150/13, 99117151/13, 99117152/13, 99117153/13, 99117154/13, 99117155/13, 99117156/13, 99117157/13, 99117158/13, 99117159/13, 99117160/13, 99117161/13.

6. Emelyanenko P.A., Semikrasova A.N., Litvinov O.B. Biological testing Ps.aeniginosa pathogenicity, isolated from aretic foxes. II Internat. Vet. Vac. and Diagn. Conference-UK, Oxford, 23-28.07.2000

Оглавление диссертации Семикрасова, Алла Николаевна :: 2000 :: п. Родники, Московской обл.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Распространение и патогенетическая роль синегнойной палочки.

2.2. Биологические свойства синегнойной палочки

Pseudomonas aeruginosa).

2.3. Инвазивные свойства синегнойной палочки.

2.4. Экзотоксины синегнойной палочки.

2.5. Тестирование патогенности синегнойной палочки.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материал и методы исследования.

3.2. Результаты экспериментального исследования.

3.2.1. Результаты серологического типирования изолятов от павших песцов.

3.2.2. Результаты биотестирования культур синегнойной палочки

3.2.3. Тестирование экзотоксина А.

3.2.4. Результаты определения протеолитической активности синегнойной палочки, изолированной от песцов.

3.2.5. Тестирование адгезивной способности.

3.2.6. Статистическая связь между показателями вирулентности синегнойной палочки.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Семикрасова, Алла Николаевна, автореферат

Актуальность темы. В производстве пушнины песцеводству придается важное значение прежде всего из-за сравнительно низкой себестоимости и высокой окупаемости шкурковой продукции. Однако сдерживающим фактором в его развитии является патология, ассоциированная с синегнойной палочкой. Она, по данным О.Б. Литвинова (2000), контаминирует воду, корма, предметы ухода за животными и, проникая в организм песцов, обусловливает бактерионосительство, заболеваемость и гибель животных. Из-за поражения гениталий нарушается эмбриогенез, происходят аборты и рождается ослабленный молодняк. В результате снижается воспроизводительная функция животных и в зверохозяйствах формируется стационарное неблагополучие.

Относительно диагностической ценности поверхностных структур синегнойной палочки, таких как адгезивные антигены, внеклеточная слизь, степени продуцирования ими экзотоксина А и протеолитичееких ферментов научная информация неоднозначна. Зависимость вирулентности синегнойной палочки от степени выраженности синтеза, обусловливающего ее экзопродук-ты, определить еще предстоит. Тем более, что адаптированные к задачам ветеринарных лабораторий, медицинские методы лабораторного анализа не учитывают оценки корреляции многопланового тестирования с реакцией защиты организма. Еще не установлены ведущие факторы патогенности микроба, не оценена патогенетическая роль их для организма песцов. Между тем, такая информация необходима в познавательном и прикладном плане, в частности, при идентификации возбудителя псевдомоноза и при разработке специфических лечебшшрофилактических биопрепаратов.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование возможности тестирования и уровня взаимодействия факторов патогенности строго идентифицированных клонированных культур синегнойной палочки, изолированных из патологического материала поражённых псевдомонозом песцов. На полевом материале апробированы современные способы тестирования главного фактора вирулентности по ферментативной и иммунохимиче-ской активности, адгезинов - по прямой гемагглютинации и образованию экстрацеллюлярной слизи ^факторов распространения - по протеолитической способности щелочной протеазы и антигенной активности эластазы.

Для эпизоотологического анализа в зверохозяйствах (установление источника, пути распространения инфекции и рецепции возбудителя) предлагается определение экзотоксина А (в РПГА), адгезии (прямой гемагглютина-цией эритроцитов кроликов и слизеобразованием) и щелочной протеазы (по расщеплению казеина).

Тестирование токсичных экзопродуктов синегнойной палочки предлагается для отбора штаммов при изготовлении протективных препаратов, контроле их качества и защитной эффективности. Благодаря такому тестированию банк вакцинных штаммов синегнойной палочки НИИИПЗК им. В.А. Афанасьева пополнен нами 13 возбудителями псевдомоноза песцов, что подтверждено 2 патентами и 11 положительными решениями ВНИИГПЭ.

Апробация материалов диссертации происходила при ежегодном обсуждении планов, методик и отчетов по научно - исследовательской работе на методической комиссии № 4 и Ученом совете института (1989 - 1999), на секции пушного звероводства Российской академии сельскохозяйственных наук (1994), на Всероссийской научно - практической конференции, посвященной 65 - летию НИИПЗК им. В.А. Афанасьева (1997), на семинаре ветеринарных специалистов зверохозяйств на ВВЦ (1998), при обсуждении заявок в Роспатенте в 1999 году.

По материалам диссертации опубликовано 5 статей, получено 2 патента и 11 положительных решений на изобретения.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертационного исследования на тему "Тестирование вирулентности синегнойной палочки, изолированной от песцов"

5. ВЫВОДЫ

Вирулентность синегнойных палочек, как полидетерминантный признак, определяется токсичностью и инвазивностью, которые можно тестировать лабораторными методами.

4.Адгезивную активность поверхностных структур бактерий у 100 % клонов устанавливали в реакции прямой агглютинации с эритроцитами кролика, экстрацеллюлярное слюеобразование - у 47 % клонов по формированию соответствующих колоний после прединкубации с гидролизатом бычьего сердца.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2000 года, Семикрасова, Алла Николаевна

1. . Bergan Т. Epidemiological typing of Ps. Aeruginosa I I Brown M.R.W.(ed) Resistance of Pseudomonas aeruginosa.- London74 Willy Inter Sei., 1982,-P. 189-235.

2. Александрова И.А. Методы серологической диагностики инфекций, обусловленных Pseudomonas aeruginosa.

3. Антипенко В.П. и др. Энтеробактерии и Ps. aeruginosa в этиологии хронических заболеваний легких и плевры // Микробиология, 1990.- № 9.- С. 24-27.

4. Африканов С.Г. и др. Псевдомоноз птиц // Ветеринария,- 1985.- № 10.-С. 40-41.

5. Ашмарин И.И., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медицина, 1962,- 178 с.

6. Баснакьян И. А., Северцова М. К., Станиславский Е. С., Машилова Р. М., Определение активности токсинов in vivo и in vitro. Сообщение 1. Новый метод определения активности in vitro. ЖМЭИ, 1983, №9, с. 33-36.

7. Бредни С. Г. и др. Молекулярная биология. М.: Мир, 1977.- С. 7482.

8. Бродинова Н.С., Лучина Т.Я., Аджиева A.A. и др. Активность про-теазы штаммов Ps. aeruginosa, выделенных из различных источников // ЖМЭИ,- 1981,- № 10,- С. 54 57.

9. Буавэн А. и др. Физиология бактерий. Бухарест: Меридиане, 1963,-227с.

10. Венцел Р.П. Внутрибольничные инфекции.- М.: Медицина, 1990.655 с.

11. Выделение и идентификация штаммов синегнойной палочки из клинического материала: Методические рекомендации, утв. Минздравом СССР 17.01.1983,-М.:МЗСССР, 1983.

12. Гамалея Н.Ф., Шаррен A. Vactination et accoutunanse // G. R. Soc. Biol.- 1890,- 19,- 234

13. Гамалея Н.Ф., Шаррен A. Vactination et accoutunanse. // G. R. Soc. Biol.-1980. 1923.

14. Герхерд Ф. и др. Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1983.-Т.1.- С.112.

15. Данилов Е.П. Биологические свойства штаммов синегнойной палочки выделенных от норок // Научные труды НИИПЗК. 1973. - Т. 17. - С. 119-121.

16. Данилов Е.П. Псевдомоноз // Болезни пушных зверей. М.: Колос, 1984,-С. 118-124.

17. Данилов Е.П. Типизация возбудателя псевдомоноза пушных зверей // Научные труды НИИПЗК,- 1973,- Т. 17,- С. 119 121.

18. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенеза бактерий. М.: Наука, 1978.

19. Емельяненко П. А. Учение об инфекции и иммунитете // Ветеринарная микробиология. М.: Колос, 1982. - 280 с.

20. Кириллова Э.В., Добрянская A.JI. Характеристика штаммов Ps. aeruginosa, выделенных из спермы быков производителей // Инфекционные и инвазионные болезни с. - х. животных и птиц. - Одесса, 1984.- С.27 - 29.

21. Литвинов О.Б. Эпизоотологические особенности возбудителя синегнойной инфекции у песцов и лисиц: Диссертация на соиск. уч. степени доктора вег. наук. М., 2000. - С. 117 - 189.

22. Литвинов О.Б., Комарова Г.А. Новые данные о псевдомонозе пушных зверей // Новое в звероводстве. -1993. № 2. - С. 53-61.

23. Литвинов О.Б., Комарова Г.А., Кириллов А.К. и др., Псевдомоноз песцов // Кролиководство и звероводство. 1988. - № 4. - С.46.

24. Литвинов О.Б., Рютова В.П. Эпизоотические аспекты синегнойной инфекции // Кролиководство и звероводство. 1993. - № 5. - С.20-21.

25. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная биология (Теория и практика). М.: Мир, 1967.- С. 197 - 198.

26. Меньшиков Д.Д., Олейник В.А., Енилеев Р.Х. и др., Изменение состава возбудителей раневой инфекции в экстренной хирургии за период 1967 по 1987 годы //Микробиология. 1990,-№ 4,- С. 31 -36.

27. Мирдэозилова X., Журавлева Н. The blue bacelus in children under one year // Здравохранение Таджикистана. 1983. - № 5. - С. 44 - 46.

28. Михайлова H.A., Кузнецова Т.Н. Состояние углеводного обмена и токсинообразование при периодическом глубинном гомогенном культивировании синегнойной палочки // Бактериальные токсины: Тезисы 2 Всесоюзн. конференции. Юрмала., 1989. - С.78.

29. Мойсинко H.H. Динамика выживаемости клебсиелл и Ps. aeruginosa в имитатах морской воды // Методы инд. биоценоза патог. и потенц. патог. микроорганизмов в объектах окружающей среды. М., 1985.- С. 79 - 84.

30. Мороз А.Ф., Анциферова Н.Г. и др. Синегнойная инфекция. М.: Медицина, 1988.- 256 с.

31. Осокина Т.И. Оценка методов серо-, пиоцино- и фаготипирования синегнойной палочки и изучение возможности использования их для эпидемиологических целей: Дисс. на соиск. учен, степени канд. биол. наук. М.-1978.

32. Пенгаева Н. К., Селиванов А. В. Изучение чувствительности разных видов животных к возбудителю псевдомонозы. Биологические препараты против инф. болезней животных. М.- 1981,- с. 146-148.

33. Петровская В.Г. Проблема вирулентности бактерий. М.: Медицина, 1967. - 247 с.

34. Позур В.К., Кириченко Е.В., Вершигора Т.Г. Генотоксичность фильтрата культуры синегнойной палочки // Бактериальные токсины: 2 Всесоюзная конференция: Тезисы докладов. Юрмала, 1989. - С. 102.

35. Позур В.К., Хоробрых В.В. Влияние пеитидогликана на миграцию Т и В - клеток // Иммунология, 1991. - № 4. - С. 65 - 66.

36. Радчук Н.А., Азимов И.А. Биологические свойства экзотоксина А и эластазы, полученных из культур синегнойной палочки // Сборник научных трудов ЛВИ. Л., 1989. - Вып. 101. - С. 135 - 145.

37. Рокицкий П.Ф. Основы вариационной статистики для биологов,-Минск, 1961.-221 с.

38. Роуз Э. Химическая микробиология. М.: Мир, 1971. - 80 с.

39. Свирская Л.М., Строков В.А., Анциферова Н.Г. и др., Госпитальная инфекция, обусловленная синегнойной палочкой, в отделениях реанимации // Микробиология. 1986. - № 5. - С. 7 -12.

40. Седов Н. К., Селиванов А. Б. Изучение разных видов животных к возбудителю псевдомоноза. Биологические препараты против инф. болезней животных. М.-1981.- с. 146-148.

41. Семина Н. А. Премухина М.С. Основные характеристики вспышек внутрибольничных инфекций в СССР в 1986 1988 годах // Микробиология. - 1990. - № 10. - С. 60-64.

42. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. Определитель зоо-патогенных микроорганизмов: справочник. М.: Колос, 1975. - С. 163 - 167.

43. Случай на сепсис при прасета, причинен от Pseudomones aeruginose -Ветеринара. №.- 1981,- 79(6).- 30-32.

44. Смирнова Е. Н. Серотипирование штаммов Ps. aerugimosa.-ЖМЭИ.- 1976,-№9.- 126-129.

45. Сонин П.Ф., Ледовских Н.П. Характеристика культур синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa), выделенных от песцов // Сборник научн. трудов ЛВИ. 1989. - Вып. 101. - С. 140 - 145.

46. Сонин П.Ф., Ледовских Н.П., Ногинов В. К. и др., Особенности псевдомоноза у песцов и проведение мероприятий по оздоровлению и профилактике // Ученые труды ЛЗВИ. Л., 1990. - Вып. 107. - С. 85 - 90.

47. Стейнер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. М.: Мир, 1979,-Т.З.-С. 122-129.

48. Фробишер М. Основы микробиологии. М.: Мир, 1965.- С. 524529.

49. Хоулт Дж. Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир, 1980.-С. 112-121.

50. Цветкова Е.Т. Выделение патогенных бактериальных культур при ранней гибели щенков голубого песца // Труды НИИПЗК. 1980. - Т. 21. - С. 58-61.

51. Черномордик А.Б. Серологические типы синегнойной палочки:// ЖМЭИ. 1960. - № 5. - С. 100 - 101.

52. Черномордик А.Б. Синегнойная палочка, бактериология и серологическое исследование: Дисс. на соиск. уч. степени доктора биол. наук. Киев: АН УССР, 1959.

53. Шаталов В.Ф., Малевин В. И., Храпковская Л.П. Эпизоотологиче-ские особенности псевдомононосительства и его роль в воспроизводстве крупного рогатого скота // Меры борьбы с болезнями с. х. животных Сев.Кавказа. -1986.

54. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1972. - С. 64 - 65.

55. Akimoto Н., Mikami J., Saton Н. Acollutive outbrear and control of hemorrhagic pneumonia in mink // J. Japan. Veter. Assoc. 1987. - V. 40, N 10.-P. 735-788.

56. Ali L.A. Isolation of Pseudomonas aeruginosa from food.- J. Biol. Sci.-13, N2.-P. 35-43.

57. Atherton I.G. Types of Pseudomonas aeruginosa, isolated from horses // Equine veb. J.- 1982.- V.14, N 4.- P. 329 332.

58. Baltimore R.S. Clinical and apidemiological correlates of pseudomonas tiping // The J. Infect. Diseases. 1974.- V. 130, - P.53 - 59.

59. Bergan T. Epidemiological markers for Ps. aeruginosa 1. Pyocine typing and their interrelations I I Acta path. Microbiol. Scand.- 1973/- V. 8113.- P. 70 -80.

60. Berna R., Vasil M. Phospolipase C (heat ealile hemolysin) of Pseudomonas aeruginosa pulification and puliminary characterizatiion // J.Bacter, 1982.-V. 152.-P.239-245.

61. Björn M.J. et al., Incidence of exotoxin production by Pseudomonas species // Infect, and Immun. 1977. - V. 16. - P. 362 - 366.

62. Borowski R., Stock L., Schiller N. Development of an ELISA for studing Ps. Aeruginosa cell surface antigen // J. Clin. Microbiol.- 1984,- V. 19,N 6,-P. 736-741.

63. Botzenbuart K., Heizmann W. Pseudomonas aeruginosa in swimming pools//Ibl. Bakteriol.- 1987.-V. 13,N 183,-P. 5-6.

64. Boyd N.Z. a.u. Chronic colonization of rat airways with Pseudomonas aeruginosa // Infec. and Lnmun.- 1983,- 39 N 3.- P. 1409 1410.

65. Chiaradia V. et al., Valutasione di alcune caratterislisch biochimiche, Se-rologiche e di antibiotico- sensibilita di Pseudomonas aeroginosa per fini epidemi-ologici // Ann. Scand.- 1982,- 24.- №2,- 136-144.

66. Chung D.W., Collier R.J. Enzymatically active peptide from the adenosine diphosphate-ribosylating toxin of Pseudomonas aeruginosa // Infect. Immun. -1977.-V. 16, N3,-P. 832-841.

67. Cicmanec J.F., Holder A. Growth of Pseudomonas aeruginosa in normal and Barned skin Ixtract: nole of Extracellulas proteses // Infect, and Immun. -1979.- V.2, N 2,- P.477 483.

68. Clements J. A. Surface phenomena in relation to pulmonary baction sexth Bouditch lecture//Physiologist.- 1962.-5,-P. 11.

69. Collier R. J., Lory S. Diphteria toxin. Toxin Ps. aeruginosa // Metcha-nisms of action transport of macromolucules in cellular systems (ed S.C. Silverstein). Berlin: Danlem konferenzen, 1978. - P. 83 - 102.

70. Collier R.J. Mecklanos S. ADF riboyleting exotoxins // Multifunctional proteins (Ed. By Bisswenger H., Schminoke O.), NY, Wiley.- 1980,- P. 261 -291.

71. Collier R.J., Kandel J. Structure and activity of diphteria toxin. 1. Thiol -dependent dissociation of a fraction of toxin into enzymatically active and inaction fragments.- J. Biol. Chem.-1971.- V.246, N 5.- P. 1446 1503.

72. Cryz S.J., Friedman R.L., Igiewski B.H. Isolation and characterization of a Pseudomonas aeruginosa mutant producing a nontoxic immunologically crossre-active toxin A protein // Proc. Natl. Acad. Sei USA.- 1980.- V. 88, N 12.- P. 7199 -7203.

73. Dimitracopoulos G., Bartell P.F. Slime glikoprotein and the pathogenicity of varions strains of Pseudomonas aeruginosa in experimental infection // Infect. and Immun.- 1980.- V.30.- P. 402 408.

74. Döring G., Obernesser H., Botzenhart K. Extrazelluläse toxine von Pseudomonas aeruginosa. Enwirkung zweier gereningter proteasen auf die men-schichen immunoglobaline IgG, IgA and sekretorisches Igt. // Zbl. Bakteriol.-1981, AGT,- 249,1.-P. 89-98.

75. Dugnino N.N., Rosenberg F.A. Antibiotic resistant Ps. Aeruginosa in bottled drinking water // Can. J. Microbiol.- 1987.- V. 33, N 4.- P. 286 - 289.

76. Elsheikh L.E. et al. Assessment of elastase as a Pseudomonas aeruginosa viralence factor in experimenai lung infection in mink // Vet. Microbiol. 1987.-V. 13, N3.-P. 281-289.

77. El-Sisi M.A., Ismail A., Nasser A.A., El-Taher A., Shihata A.B., The role of Pseudomonas as a pathogen for Squabs //Egypt. J. Vet. Sei. 1985.- V. 22, N1,-P. 51-54.

78. Eluk S. The recognition of toxinogenic bacterice strain in vivo // Br. Med. J. 1948,- N 1. - P. 493 - 496.

79. Farmer J. et al., Hospital outbreaks coused by Ps. aeruginosa: importance of serogroup 011// J. clin. Microbiol.- 1982,- V. 16 N2.- P. 266 270.

80. Gallagher P.G. Watanakimakorn G. Pseudomonas bacterimia in a community teaching hospital (1980 1989) // Rev. Infect. Dis.- 1989.- Vol. 11, N 6,-P.846 - 853.

81. Gavis J. de, Heice H. Meningitis purulenta door Pseudomonas aeruginosa nalen aorta bifiircatieoperatie, vermoedelijk somenhangend met interathe-cade pijlestrijding // Oon der ned. Tijdschr. Genecsk.- 1983.- V. 127, N 9.- P. 377 -381.

82. Gilmore D.S., Bruce S.K. Pseudomonas aeruginosa colonisation in patients with spinal corol injuries // J. Clin. Microbiol. 1982.- V. 16, N 5.- P. 856 -860.

83. Greit Z., Merzbach D., Freundlich E. Pseudomonas Septicemia in child-brood // Isr. J. Med. Sei. 1983.- V. 19, N 11,- P. 977 - 979.

84. Habs J. Untersudungen über die O Antigene von Ps. Aeruginosa // Z. Hyg. Infekt. Rr.- 1957,- V. 144,- P. 218 - 228.

85. Heck L.W. et al. Specific cleavage of human type III and IV collagens by Pseudomonas aeruginosa elastase // Infect, and Immun.- 1986.- V. 51(1).- P. 115-118.

86. Homma J.C. Serological typing of Ps. Aeruginosa and several points to be considered // Jap. J. exp. Med/- 1974/- V. 44/- P. 1 12.

87. Homma J.G. et al. Changes in serotype of Ps. Aeruginosa // Jap. J. exp. Med.- 1972/- V. 42,- P. 171 172.

88. Homma J.V. Roles of exoenzymes and exotoxin in the pathogenecity of Pseudomonas aeruginosa of a new vaccine // Japan. J. Exp. Med.- 1980.- V.50, N 3.-P. 149-165.

89. Iglewski B.H. et al., Pseudomonas aeruginosa Exoenzyme-S Adenosine Diphosphate Ribosiltransferase distinet from toxin A // Proc Nat. Acad. Sei. USA.-1978,- V.75, N 7.- P.-3211 -3215.

90. Iglewski B.H., Kabet D. NAD dependent ingribition of protein sinthe-sis by Ps. Aeruginosa toxin // Proc. Natl. Acad. Sei USA.- 1975,- V12.- P. 2284 -2288.

91. Jacguot J. et al. In vitro evidence that human airway lysozyme is cleaved and inactivated by Pseudomonas aeruginosa elastase and not by human leukocyte elastase // Infect, and Immunol. 1985. - 47(2). - P 555 - 560.

92. Jagger K., Nickol M.M., Sachinger C.B. Resistance of exotoxin A to purified Pseudomonas proteolytic enzymes // Infect, and Immunol. 1980,- V.28, N 3.-P. 746. 752.

93. Janbon F et al. Les septicimies a Pseudomonas aeruginosa. Aspects cliniques et therepeutiques actenaess // Pathol. Diol.- 1982.- 30,N 6 dis.- P. 563 -567.

94. Jarvis F.G. Johnson M.J. A glycolinide produced by Pseudomonas aeruginosa // J. Am. Chem. Soc. 1949,- 71,- P. 4124.

95. Kandel J. Collier R. J., Chung D.W. Interaction of fragment A from diphteria toxin with nicotinamide adenine dinucleotide // J. Biol Chem.- 1974.-V.249, N 7.- P. 2088-2097.

96. Kangas J. Halsotillstandandet pa palsdjur sformerna a 1981 // Finsk Pal-stidskift -1981/- N 3,- P. 159 160.

97. Kauffmann F. The Differetiation of Eceherichia and Klepsiella Types ( Ed. Thomas).-1951.

98. Kawaharajo R. Changes in serotype of Ps. Aeruginosa // Jap. J. exp Vtl/-1973,-V. 43,- P. 225-226.

99. Kiss P., et al. Incidence of Ps. Aeruginosa serogroups in drinking water: use of serotiping in the control of water supplies // Acta micrjbiol. Hung.- 1983,- N 7,- 1984,- V.30,N 2,- P. 131 137.

100. Kooij D. Oranje J. P., Jijnen W.A.M. Grouser of Pseudomonas aeruginosa in Tap water in relation to utilization of subszrates at concentrations of fewmicrograms per liter // Appl. and Environ. Microbiol.- 1982.- V.44, N 5.- P. 1086 -1095.

101. Kusama R. Elisa Aor detection of Ps. Aeruginosa lipopolysaccharides // J. Clin. Microbiol.- 1983,- V. 17, N 2,- P. 317 322.

102. Lanyi B Serological properties of Ps. Aeruginosa // Acta Microbiol. Acad. Sei Hung.- 1970.- 17,- P. 35 38.

103. Leppla S.H. et al. The exotoxin of Ps. aeruginosa having an unusual mode of activation // Biophys. Res. Commun.- 1978,- V. 81, N 2.- P. 532 538.

104. Leppla S.H. Large seale purification and Characterization of the Exotoxin of Ps. Aeruginosa // Inf. Immun. - 1976,- V. 14, N 4. - P. 1077 - 1086.

105. Leprat R., Michel Brand G. Extracellular neuraminidaze production by a strain of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystra fibrosis // Ann. Micro-biol.- 1980,-V. 131,-P. 209-222.

106. Lin P.V. Biology of Pseudomonas aeruginosa // Hospital practice.-1976,-N 11.-p. 139-147.

107. Lin P.V. Exotoxins of Pseudomonas aeruginosa. I. Factors that influence the production of exotoxin A. J. Infect. Dis. - 1973. - 128 - P. 506 - 513.

108. Lin P.V. Extracellular toxins of Ps. Aeruginosa // J. of Infect. Dis.-1974,- 130 Sypplement.- P. 94 98.

109. Lin P.V. Hsieh H. Exotoxins of Pseudomonas aeruginosa. HI. Characteristics of anttoxin A // J. Infect. Dis. 1973. - 128/ - P. 520 -526.

110. Lin P.V. The role of varions fractions of Pseudomonas aeruginosa in its pathogenesis. Identification of letal toxins produced in vivo and in vitro // J. Infect. Dis.- 1966.-V. 116, N4,-P. 481-489.

111. Lin P.V., Abe Y., Bates J. L. The roles of varions fractions of Ps. aeruginosa in its pathogenesis // J. Infect. Dis. 1961.- 108 - P. 218 - 228.

112. Lin P. V., Yoshii S., Hsieh H. Exotoxins of Pseudomonas aeruginosa II. Concentration, purification and characterization of exotoxin A // J. Infect. Dis. -1973.- 128.-P. 574-579.

113. Lindemann R.A., Newman M.L., Kaufman A.K. Oral colonization and susceptibility testing of Ps. Aeruginosa oral isolated from cystic fibrosis patients // J. Dent. Res. 1986,- 64, N 1. -P. 54-57.

114. Lutz F. Purification of cytotoxic protein from Pseudomonas aeruginosa // Toxicon.- 1979,- V. 17,- P. 467 475.

115. Lutz F., Grieshaler S., Kaufer J. Cytotoxin from Pseudomonas aeruginosa in mice: distribution related to pathology toxicon.-1981.- V. 19.- P. 763 -771.

116. Martino P. et al. Water supply as a sourie of Pseudomonas aeruginosa in a hospital for hemotological nreignancies // Bool. Isk. Sieroter Milano.- 1985.-V. 64, N2.-P. 109-114.

117. Mc Leöd C. In.// Bacterial and mycitic infections of man Lippincott -1958-3 -ed. 83.

118. Mc Loc Acta Path. Microbiol. Scand/.- 1948,- 25 .- 414, 755.

119. Meitert E. et al. Food poisoning associated with Pseudomonas aeruginosa // Arch. Roum. Pathol. Exp. Et. Microbiol. 1984,- V.43, N 2.- P. 115 - 119.

120. Meitert M., Meitert E. Epidemiological and immunological implications of Pseudomonos aeruginosa epidemiological markers // Arch. Roum. Pathol. Exp. Etmicrobiol.- 1981.-40, N1,-P. 5-23.

121. Montie T.C., Anderson T.R. ELISA for detection of Pseudomonas aeruginosa H (Flagellar) antigen // Eur. J. Clin. Microbiol.- 1988,- V. 7, N 2/- P. 256-260.

122. Morihara K. et al. Effects of proteases on the structure and activity of Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A // Infect. Immunol.-1981,- V.34, N.2.- P. 435-440.

123. Obrig T.G. et al. Effect of Pseudomonas aeruginosa citotoxin on thymidine incorporation by murine splenocytes // Infect. And Immunol 1984,- V. 45, N 3.- P 756 - 760.

124. Ogaard A.R. et al. Correlation between adhesion of Ps. aeruginosa bacteria to cell sutfaces and the presence of some factors related to virulence // Acta pathol., microbiol. and immunol. Scand. 1985. - B 93, № 3. - P. 211-216.

125. Ohman D.E., Sadoff J.C., Iglewski B.H. Toxin A deficient mutans of Pseudomonas aeruginosa PA 103: isolation and characterization // Infect, and Immun. -1980.- V. 28. P. 899 - 908.

126. Parandiych W. et al. Pseudomonas pili // Antibiot. Chemother.- 1985. -V. 36,-P. 49-57.

127. Pavlovskis O.R., VoelkenT.A., Shackelford A.H. Pseudomonas aeruginosa exotoxin in mica histopathology and serum enzyme changes // J. Infect. Dis.- 1976.- 133.-P. 253-259.

128. Pavlovskis O.R., WretlindB. Assesment of protease (elastase) as a Pseudomonas aeruginosa virulence factor in experimental mouse burn infection // Infect, and Immun. 1979. - 24, N 1 - P. 181 - 187.

129. Pellett Sh., Bigley D.V., Grimes D.J. Distribution of Pseudomonas aeruginosa in a riverine ecosystem // Appl. and Ekoiron. Microbiol.- 1983.- V. 45, N1.-P. 328-332./

130. Pencheva P. Serotiping of Ps. aeruginosa strains isolated in Bulgaria using the Lanyl Bergan combined scheme // Acta microbiol. Hung. - 1986.- V. 33, N4. P. 345-349.

131. Piipoinen Malli, Hinlikka Eeva Liiza. Distribution of Pseudomonas aeruginosa acrey serotipes from mink and fox in Finland. A vaccinatio trial in mice // Scientific- 1986. - 10(3).- P. 206 -210.

132. Pollack M., Anderson S.E. Toxicity of Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A for Human Macrophyes // Inf. And Immun.- 1978.- V. 19, N 3,- P. 1092 -1096.

133. Pollack M., Toylor N.S., Callahan L.T. Exotoxin Production by clinical Isolates of Ps. aeruginosa// Infect. Immunol.- 1977.- 15. N 3.- P. 776 780.

134. Pollack M., Young L.S. Protective activity of antibodies to exotoxin A and Lipopolysaccharide et the onset of Ps. aeruginosa septicemia in man // J. Clin. Invest.- 1979,- 63, N 2,- P. 276 -287.

135. Ramphai R., Pier G.B. Role of Pseudomonas aeruginosa mucoid exopolysaceharide in adherece to tracheal colls // Infect and Immunol.- 1985.-V.47, N l.-P.l -4.

136. Ricci N. et al. Colomizzarione neonatale de Ps. aeruginose dovuta a disinfettanti contaminati in sala parto // Minerva pediat.- 1983.- V. 35, N 19.- P. 929-934.

137. Salmon P. et al. Whirlpool associated Pseudomonas aeruginose urinary tract infections И JAMA.- 1983,- V. 250, N 15,- 2025 - 2026.

138. Sandwik О. Serological comparateon between strains of Ps. aeruginosa from human and animal strains // Acta patn. Microbiol. Scand.- 1960,- 48.- P. 56 60.

139. Sandwik O. The serology of Ps. aeruginosa from bovine underin lections // Acta Vet. Scand.- 1960,- N 1 .- P. 221 228.

140. Snell K. et al. Цит. по НВБ Басмановой К.К. Факторы патогенно-стн синегнойной палочки // Синегнойная инфекция.- М: Медицина, 1988. С. 38.

141. Sokol P.A. et al. Production of exoenzyme S by clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa // Infect, and Immun.- 1981,- V.34,N 1.- P. 147- 153.

142. Stec E., Kudelski Z. Biologiczne wtasciwosci patectek z rodzajn Pseudomonas izolowanych z zywnosci // Med. Dosw. I mikrobiaL- 1986.- 38 N 3.-P.159 -163.

143. Tomas J., Oliver-Rodes B. Pseudomanas aeruginose an equas envasadas. Concentración optima del agents selectivo.- Alimentaria.- 1987.- 24,- №180.71-74.

144. Urbano P., Deir R., Tarantelli F. Epidemiological Studies of Pseudomonas aeruginosa infection in vleg ulurs.- Med. Microbiol and Immunit.- 1983.-172,-№1.-41-45.

145. Vasil M. L., Igleuski В. H. Comparative toxities of diphterial toxin and Pseudomonas aeroginosa exotoxin A: evidance for different cell, receptors.-1. Gen. Microbiol.- 1978,- 108.-2.-333-337.

146. Vasil M. L., Kabat D., Igleuski В. H. Structure activity relationships at an exotoxin of Pseudomonas aeruginosa.- Infect, and Immun.- 1977.- 19.- 353361.

147. Verder E., Evans J. A proposed antigenic schema for the identification of strains of PS. aeruginosa.-J. Infect.- Dis.- 1961.- 109,- 183-193.

148. Wasserman A. Experimentelle Untersuchungen über einige theoretische Punkte der immunitats- lehre.- Z. Hyg.- Infect.- 1896.- 22,- 263.

149. Watson D.A., Brandly С. Ann. Rev. microbiol., 1949, Ш, 195. Цит по Петровской В.Г. Проблема вирулентности бактерий.-М.: Медицина, 1967. С. 14.

150. Wieland М., Lederman М.М., Юте-King С. et ai. Left-Sicled Endo-careditis due to Pseudomonas aeroginosa. A seport of 10 cases and reniew of the literature.- Medicine (Baltimor).- 1986.- 65.- №3.- 180-189.

151. Zedan H.H., Khatibi A., Salama A.A. et al. Microbial contamination with bacteria of potential health hazard.- Egipt. J. Microbiol.- 1982 (1983).- 17,-№1-2,-151-178.

152. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО РЕАЛИЗАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ1. ИССЛЕДОВАНИЯ

153. Рекомендации по выделению и идентификации культурсинегнойной палочки

154. Общие сведения о бактериях рода Pseudomonas

155. Род Pseudomonas насчитывает около 200 видов, большинство из которых для пушных зверей не имеет никакого значения.

156. Характеристика и идентификация культур синегнойной палочки

157. Синегнойная палочка чувствительна к высушиванию, действию хлор-содержащих дезинфицирующих препаратов, легко инактивируется под воздействием высокой температуры (при кипячении, автоклавировании).

158. Встречаются штаммы синегнойной палочки атипичные беспигментные или малопигментные.

159. Для стимуляции синтеза пиоцианина с успехом применяется среда Кинг А; на среде Кинг А усиливается образование флуорисцеина.

160. Оптимальными для синтеза пиоцианина условиями являются температуры 30 37 °С, питательные среды, содержащие глицерин, аланин и ионы некоторых металлов (особенно и К4}.

161. При культивировании на питательных средах синегнойная палочка образует триметиламин, придающий культурам запах жасмина, земляничного мыла или карамели.

162. Дифференциально диагностические признаки синегнойной палочки представлены в таблице (см. Приложение).

163. Способы взятия, пересылки и посева исследуемого материала

164. Для бактериологического исследования предпочтительны трупы тех зверей, которые при жизни не подвергались антибиотикотерапии.

165. Труп павший после аборта самки и абортированные плоды доставляют в лабораторию в хорошо упакованной (полиэтиленовой, железной), исключающей пропитку упаковочного материала кровью, испражнениями и другими истечениями из трупа.

166. Банки закрывают стерильными крышками и с нарочным доставляют в лабораторию.

167. При проведении посева самку держат головой вниз, помощник одной рукой фиксирует щипцами голову, прижав ее к земле, а другой оттягивает в сторону хвост.

168. Методика бактериологического исследования

169. Плоские колонии неправильной формы;

170. Колонии, сходные с колониями кишечной палочки;

171. Складчатые («цветок маргаритки»);

172. Мукоидные, образующие большое количество слизи, которая со временем приобретает зеленую окраску;

173. Карликовые колонии, формируемые не менее, чем в течение 18 часов.

174. Рост Pseudomonas на МПА часто сопровождается феноменом радужного лизиса появление блестящего металлического налета и зон лизиса.

175. Обычно используют методы серо-, пиоцино и фаготипирования:

176. Пиоцинотипирование осуществляется по методу J. J. Jarmer, I. Е. Herman (1969). Метод основан на получении пиоцинов из исследуемых штаммов синегнойной палочки и проверки их в отношении набора 18 ALA индикаторных штаммов.

177. Схема пиоцинотипирования состоит из следующих этапов:1. Получение пиоцинолизатгов

178. Подготовка к работе индикаторных штаммов

179. Результаты исследования одного пиоцинолизата против 18 ALA штаммовследующий: 1 2 3 45 6 7 89 10 11 12 13 14 15 16 17 18+ + + -- + - - - +- + + + +

180. Найдем обозначение троек по вышеописанной схеме и получим пиоцинотип 167831.

181. Для сведения: один и тот же пиоцинотип может встречаться у штаммов синегнойной палочки различных серовариантов, поэтому использование в целях эпизоотологического анализа только метода пионинротипирования может привести к ошибке.

182. Фаготипирование штаммов синегнойной палочки

183. Специфичность литической реакции фага связана с наличием на поверхности клеточной стенки бактерий рецепторов для данного фага.

184. Процесс фаготипирования включает в себя следующие этапы:

185. Накопление фагов (получение фаголизатов), 2- определение титров фагов, 3- определение рабочих разведений фагов, 4- процесс фаготипирования.

186. Накопление фагов производят путем размножения их на гомологичных штаммах синегнойной палочки, имеющих обозначения аналогичные таковым у бактериофагов. В качестве питательной среды используют 1,6 % и 75 % МПА и МПБ.

187. Определение титров фагов (полученных фаголизатов ) осуществляют по методу ГРАЦИА (1936), основанном на подсчете количества негативных колоний, образующихся на плотной питательной среде.

188. Фаготип исследуемой культуры синегнойной палочки обозначают номером фагов, дающих реакции на 5, 4 и 3. Например: 7/21 Со 1 П.

189. Бальную оценку на 2 можно поместить в скобках 7/21 (44)/68.

190. Определение чувствительности синегнойной палочки к антибактериальным веществам.

191. Основные методы, используемые для определения биохимических свойств:

192. Определение продукции пиоцианина.

193. Тесты для определения аргининдегидролазы, лизиндекарбоксилазыи орнитиндекарбоксилазы. Полоски бумаги (ватман 3 М) размером 0,5 х 5,0 см пропитываются 0,03 М растворами аминокислот и подсушиваются

194. Аргинин HCL - 63 мг + 10 мл фосфатного буфера 0,0125 М (рН = 5,0)

195. Селективная среда для выделения культур Рб. аеп^шовапептон ферментативный 20,0 г сульфат калия - 7,0 гхлорид магния -1,5 гсульфат магния -1,5 г

196. N цетилперидиний хлорид (Киевский з-д РИАЛ) - 2,0 г агар-агар -10,0 гвода дистиллированная 1000,0 мл рН = 6,8 - 7,0 Среду довести до кипения, кипятить 2- 3 минуты и разлить по чашкам.