Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Эпизоотологические аспекты и иммунобиологические особенности возбудителя синегнойной инфекции у песцов и лисиц

На правах рукописи

ЛИТВИНОВ ОЛЕГ БОРИСОВИЧ р р 5 0д

" МАР 2300

УЖ 636.93 (619 616.9"^ (043^

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИНЕПЮЙНОЙ ИНФЕКЦИИ У ПЕСЦОВ И ЛИСИЦ

16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Москва - 2000 г.

Работа выполнена в отделе ветеринарной медицины Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева (НИИПЗК).

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник

доктор ветеринарных наук, профессор

доктор ветеринарных наук, профессор

П.А. Емельяненко

Н.Т. Татаринцев В.А. Бурлаков В.С. Слугин

Ведущее учреждение: •

Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Защита диссертации состоится 2000г. в часов

на заседании Диссертационного Совета Д.063.46.03 в Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ. Автореферат разослан 'Ж"^бе/У^¿V 2000г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.063.46.03, кандидат ветеринарных наук, доцент

/7 ъм 9

И.Г.Серегин

I. Введение

Важнейшим условием повышения рентабельности звероводческой отрасли является создание условий жизнеобеспечения и повышение воспроизводительной способности зверей. Переход к рыночным отношениям и возникшие экономические трудности в стране во многом сказались и на состоянии дел в звероводстве. Особую тревогу вызывает ухудшение качества кормов для зверей. Их неполноценность по составу и низкое санитарное качество приводят к резкому снижению естественной резистентности организма и активизации условно-патогенной микрофлоры, представителем которой является и синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa). В практике отечественного звероводства синегнойная инфекция (псевдомоноз) впервые была зарегистрирована в 1967 г. у норок. Болезнь протекала остро и сопровождалась большой смертностью. Однако в конце 70-х годов стали регистрировать еннегнойную инфекцию у крупного зверя — песцов и лисиц, протекающую хронически и тесно связанную с родовой патологией.

Различия в распространении и течении болезни, а также в формах проявления ее у норок и у крупного зверя не позволяют проводить на практике для борьбы с синегнойной инфекцией песцов и лисиц мероприятия, разработанные против псевдомоноза норок.

В доступной нам Зарубежной я отечественной литературе мы находим сведения по этому вопросу в основном в виде практических наблюдений и фрагментарных данных. Это и предопределило начало данной работы.

Актуальность проблемы. В период работы с возбудителем синегнойной инфекции в 1981-1998 гг., только диагностической лабораторией НИИПЗК им. В.А. Афанасьева он был зарегистрирован в 37 зверохозяйствах с общим количеством энзоотических вспышек более 60, что свидетельствует о широком распространении инфекции а частой стационарности ее. Возбуди-

тель синегнойной инфекции наносит значительный ущерб звероводству. Во время беременности самки абортируют или погибают за 2-3 дня до щенения. Широко распространено псевдомононосительство, в результате которого снижаются показатели воспроизводства за счет пропустования, прохолосто-вания самок, полного или частичного рассасывания эмбрионов в первой половине беременности. Попытки использовать при профилактике синегнойной инфекции у песцов вакцину против псевдомоноза норок оказались неудовлетворительными.

Не изучены были и эпизоотические аспекты инфекции, в частности, источники, пути распространения, течение и формы проявления ее. Названные вопросы эпизоотологии, значительный экономический ущерб от возбудителя синегнойной инфекции и отсутствие специфических средств борьбы определяют актуальность данной работы.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось определение нозоареала, условий развития синегнойной инфекции у песцов и лисиц и патогенетическое обоснование разработки препаратов специфической защиты указанных пушных зверей от данной болезни.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Исследовать особенности проявления синегнойной инфекции у лисиц и песцов в условиях различных зверохозяйств.

Изучить источники, пути распространения и проникновения в организм крупных ззерей возбудителя синегнойной инфекции.

Исследовать особенности персистенции синегнойной палочки в организме лисиц и песцов.

Изолировать культуры синегнойной палочки от больных и павших крупных зверей.

Провести идентификацию и изучить биологические свойства изолятсв синегнойной палочки.

Провести скрининг по факторам патогенности клинических и эпизоотических штаммов синегнойной палочки.

Исследовать кинетику инактивации факторов патогенности возбудителя синегнойной инфекции и возможность усиления их иммуногенного действия.

Сконструировать на основе внеклеточных факторов патогенности синегнойной палочки экспериментальные образцы вакцины и испытать их па зверях в неблагополучном по синегнойной инфекции хозяйстве.

Научная новизна. Сичсгнойная инфекция лисиц в песцов впервые нами определена как самостоятельная нозологическая единица. Несмотря на сходство нозоареала псевдсмоноза норок и крупного зверя, механизм передачи возбудителя болезни и системные поражения у них неодинаковы.

Протекгивная активность антигене» синегнойной палочки определенного серологического варианта у них проявляется по-разному. В отличие от норок среди лисиц и песцов широко распространено псевдрмононосигельство (28-32 %), что обусловливает стационарность инфекции и приводит к снижению результатов воспроизводства за счет пропустования, прохолостования самок и нарушения эмбриогенеза.

Впервые примененное в эпизоотологическом анализе внутривидовое типирование возбудителя по объективным маркерам - фаго - и пиоцинотипам - позволило установить обусловленность стационарного неблагополучия хозяйств выделением синегнойной палочки одного типа от носителей микроба и от больных животных

У изолированных от крупных пушных зверек синегнойных палочек впервые определена активность внеклеточных факторов патогенности - экзотоксина А, протеаз, внеклеточной слизи и адгезивных антигенов.

Путем подбора соответствующих продуцентов, условий их культивирования, инактивации экзотоксина и сорбции экстрацеллюлярных антигенов впервые удалось экспериментально обосновать возможность конструирования эффективных средств специфической защиты зверей от синегнойной инфекции независимо от серологического типа возбудителя.

Практическая значимость. 1. Разработана инструкция по предупреждению и ликвидации синегнойной инфекции (псевдомоноза) норок, лисиц и песцов. (Утв. Департаментом ветеринарии 29.09.98 г. № 19-4-09/778).

2. Изданы и внедрены в практику "Методические рекомендации по выделению штаммов синегнойной палочки га организма песцов и лисиц и их идентификация", которые позволяют в течение 3" дней поставить диагноз на синегнойную инфекцию, что особенно важно при беспигментных формах возбудителя. (Утв. РАСХН 21.06.1994 г.).

3. Издана (в соавторстве) и внедрена в практику "Технология песцевод-ства". (Утв. Зверопромом РФ 27.05.1992 г.).

4. Изданы и внедрены в практику "Правила взятия и пересылки патологического материала от пушных зверей и кроликов на инфекционные и инвазионные заболевания и проб кормов на доброкачественность". (Утв. РАСХН 20.10.1995 г.)

5. Подано тринадцать заявок н получены положительные решения на 13 штаммов синегнойной палочки с оптимальным набором прогеолитических ферментов и экзотоксина А, а также способ изготовления вакцины. Штаммы депонированы в музее бактериальных и вирусных препаратов НИИПЗК им. В.А.Афанасьева и могут быть использованы для конструирования высокоим-муногекной вакцины и других биологических препаратов против синегнойной инфекции лисиц и песцов №№ 99117149, 99117150, 99117151, 99117152, 99117153, 99117154. 99117155, 99117156, 99117157, 99117158, 99117159, 99117160,99117161.

6. Разработанная нами технология позволяет изготовить эффективную вакцину против синегнойной инфекции у песцов и лисиц.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на ежегодных заседаниях Ученого Совета НИИПЗК им. В.А.Афанасьева (1989-1998 гг.), на курсах повышения квалификации сельскохозяйственных кадров (1989-1998 гг.), на семинарах главных зрачей и главных зоотехников, проводимых Зверопромом РФ, Союзом звероводов России (1989-1997 гг.), ВВЦ (1998 г.), на научных конференциях в НИИПЗК им. ВААфанасьева (1997 г.), во ВНИИОЗ (1997 г.), на научной сессии Россельхозакадемии (1998 г.)

Экспериментальная серия вакцины против синегнойной инфекции у песцов и лисиц применена с положительным результатом на ферме ОАО "Крестовский пушно-меховой комплекс", Московская область (1997-1999 гг.).

Публикация результатов исследования. Основные положения диссертации отражены в 38 опубликованных научных работах, получены 13 положительных приоритетных справок на патенты.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: особенности инфекции у песцов и лисиц, нозоареала, персистенщш, биологических свойств возбудителя и обоснования научной концепции создания иммуногенноб вакцины против синегнойной инфекции .

Объем работы'. Диссертация изложена на 311 стр. машинописного текста. В работе имеется 72 таблицы, 4 рисунка, 13 приложений). Список использованной литературы включает 333 источника, в т.ч. 148 иностранных.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы

Экспериментальную работу проводили в период с 1981 по 1998 гг. на базе отдела ветеринарной медицины НИИ пушного звероводства и кролиководства

им. ВААфанасьева, лаборатории ожоговых инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.ФГамалеи РАМН, зверосовхозов "Родники" и "Тимоховский" Московской области и зверофермы НИИПЗК им. В.А.Афанасьева. Эпизоотические аспекты изучали в неблагополучных по синег-нойной инфекции звероводческих хозяйствах бывшего СССР.

Объектом исследования служили песцы и лисицы. Штаммы синегной-ной палочки вы ""ляли от зверей больных, павших, псевдомононосителей и неблагополучно ощенившихся, из кормов, с оборудования зверо кухонь, из объектов окружающей среды.

Выделение эпизоотических штаммов осуществляли путем бактериологических посевов из органов зверей (сердца, печени, почек, селезенки, головного мозга, полости матки, плодов), при исследовании на псевдомононоси-тельство - из влагалища, прямой кишки и препуция. Посевы производили на' мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), среду Эндо, среду, содержащую N-цетилпиридиний хлорид (N-цпх), которая является селективной средой, предназначенной для одноступенчатого выделения чистых культур синегнойной палочки. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течете 24-48 часов. Выделенные штаммы клонировали методом предельного разведения. По каждому клону вычисляли степень вероятности его чистоты, используя распределение Пуассона (Дж. Мейнел и др., 1967). Идентификацию выделенных культур проводили поэтапно. Принадлежность к роду Pseudomonas определяли по следующим тестам: 1) рост на среде с N-цпх, 2) тест на цитохромоксидазу, 3) определение аргинин-дегидролазы, лизин • и орнитиндекарбоксилазы, 4) окисление глюкозы в аэробных и анаэробных условиях, на среде Хью-Лейфсена или Гисса с глюкозой. Для определения видовой принадлежности Pseudomonas aeruginosa исследовали: характер аэробного роста (способность на поверхности МПБ образовывать серовато-серебристую пленку), рост на ацетамидном агаре (наличие гидролиза), тер-

мофильность (рост при 42 °С), образование пигмента пиоцианина, восстановление нитратов в нитриты. При изучении биохимических свойств использовали среды Гисса с углеводами, молоко, желатин, мочевину. Внутривидовое типирование проводили путем установления серо-, пиоцино - и фаготипа.

Серотипирование осуществляли по Habs'y с помощью набора из 18 не-адсорбированных О-сывороток. Использовали метод агглютинации на стекле. Сыворотки применяли в разведениях 1:20.

Для пиоцинотипирования использовали 18 стандартных штаммов ALA Ps. aeruginosa, полученные НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф.Гамалеи, от Tomas and Jones (College of Arts and Sciences University, Alabama). Индикаторные штаммы хранили при температуре 4 °С на МПА и в лиофилизированном состоянии. Получение пиоцинолизатов, подготовку индикаторных штаммов и процедуру пиоцинотипирования проводили по методике, описанной в книге "Синегнойная инфекция" (1988 г) под редакцией А.Ф.Мороз. Результаты оценивали по наличию или отсутствию зон задержки роста индикаторных штаммов в местах нанесения капель пиоцинолизатов. При перекрестном анализе пиоцинов пиоцииолизаты готовили из штаммов, выделенных от песцов и лисиц.

Фа1 шинирование осуществляли с помощью коллекции фагов Lindberg'a, состоящей из 19 фагов и штаммов-хозяев, полученной НИИ эпидемиологии и микробиологии ям. Н.Ф.Гамалеи, or Parkez (Central Health Laboratory, London). Использовали типовые фаги следующего обозначения: 7, 16,21,44,68,73, F-7, F-8, F-10,109,119x^4. 31.1214. М4. Мб, COL-ll, COL-21,188/]. Методически работу осуществляли по следующей схеме: получение фаголизатов, определение титров фагов, определение рабочего разведения фага и фаготипированне. Результаты учитывали по 5-бальной системе: 5 -сливной лизис, 4 - лизис в виде губки, 3 - наличие 10-15 бляшек, 2 - единичные бляшки, 0 - фаг отсутствует.

s

Определение чувствительности выделенных штаммов синегнойной па* лочхи к антибиотикам проводили методом реплик культур на плотную питательную среду, содержащую серии двукратных разведений антибиотиков, а также методом дисков.

При изучении факторов патогенности выясняли продукцию штаммами синегнойной палочки экзотоксина А, протеолитических ферментов (щелочной протеазы и эластазы), внеклеточной слизи и наличие адгезивной активности.

Продукцию экзотоксина А выявляли: 1) в реакции пассивной гемагглю-тинации с использованием эритроцитов, сенсибилизированных иммуноглобулином, выделенным из моновалентной антитоксической сыворотки (в отдельных случаях использовали реакцию преципитации). В качестве исследуемого материала использовали супернатанты культур, бесклеточные суспензии, выращенные на бульоне Мартена с добавлением 0,5 % глютамата натрия и 1 % глицерина; 2) путем определения АДФ-рибозил-трансферазной активности, используя в качестве субстрата фактор элонгации - 2 из зерен пшеницы; 3) путем определения токсичности отдельно взятых колоний в реакции иммунодиффузии в агаре Пурифайтг, обогащенного 0,5 % глютамата натрия и 1 % глицерина, с моновалентвой антитоксической сывороткой.

Протеолипгч ескую активность изучали по активное™ щелочной протеазы в реакции диффузии в аггр, содержащий казеин, по методу S.Arvidson (1973). Результаты оценивали по цифровому показателю (ЕД), полученному умножением предельно активного разведения супернатанта на соответствующий ему диаметр зоны просветления (гидролиза казеина), или в logj.

Эластазную активность изучали в реакции преципитации суперкатанта с монсвалеотяой анткзлзстазной сывороткой, полученной к высокоочищен-ному препарату эластазы (в 1о&).

При изучении протеолитической и эластазной активности штаммов культуры выращивали на среде Енсена, модифицированной путем добавления солей и аминопептида.

Слизеобразующую активность бактериальных штаммов изучали на среде с гидролгоатом бычьего сердца; адгезивную активность - в реакции гемагглюта-нашш с эритроцитами кролика. Выбор штаммов-продуцентов синегнойной палочки проводили с учетом оптимальных показателей по факторам патогенности, серо вариантов штаммов, вирулентности в иммуногеиных свойств, выявляемых при испытании антигенов.

Вирулентность штаммов определяли путем титрования на белых мышах ж.м. 18-20 г путем внутрибрюшинного заражения их кратными дозами живой культурой бактерий в изотоническом растворе хлористого натрия, приготовленными с таким расчетом, чтобы нужные дозы клеток содержались в одном объеме жидкости (0,3 мл). Дозы культур, предназначающиеся для заражения мышей, составляли 0,2*10', 0,4*10®, 0,8*10® мк/клеток. Каждую дозу культур синегнойной палочки вводили группе животных по 10 мышей За меру вирулентности штамма синегнойной палочки принимали среднюю смертельную дозу микробов ЫЗя- При оценке' протекгавной активности вакцины, а также характеристике штаммов по вирулентности и иммуногенности использовали статистические методы обсчета результатов опытов по Керберу в описании ИЛАшмарина и ААБоробьева (1962).

Для инактивации штаммов синегнойной палочка использовали димерэ-тиленимин (ДЭИ), бинарный димерэтиленимин (БДЭИ) и итакояовую кислоту. Кинетику инактивации изучали по степени инактивации микробных клеток в различные сроки после добавления в бактериальную суспензию инакти-ванта и при значениях рН среды 4,0; 7,0; 7,2; 7,4 и 8,5. Эффективность ДЭИ изучали на примере 18 супернатангов бесклеточных суспензий по тестам: вирулентность и жизнеспособность микробных клеток, биологические и аетн-

генные свойства экзотоксина А, протеииазная и эласголитическая активность, инактивация внеклеточной слизи и адгезивной способности.

Супернатанты готовили из штаммов с оптимальными значениями факторов патогенности при выращивании их на средах, обеспечивающих наибольшую продукцию факторов патогенности. Для адсорбции антигена применяли гидроокись - алюминиевый и липосомный адью ванты. Полноту сорбции определяли в реакции преципитации с антитоксической, антипроте-азной и актиэластазной сыворотками против соответствующих антигенов вакцины.

Иммуногенные свойства вакцины испытывали в тесте защиты белых мышей против гомологичных и гетерсшогичных штаммов. Стерильность вакцин проверяли на тиогликолевой среде, безвредность на белых мышах; экспериментальный образец вакцины - на песцах, пирогенность на кроликах. Иммунологическую эффективность экспериментальных образцов вакцины проверяли на песцах ОАО "Крестовский пушно-меховой комплекс". О результатах судили эпизоотологическими критериями по показателям воспроизводства зверей в подопытной и контрольной группах.

Для выяснения условий хранения штаммов синегнойной палочки исследовали вирулентность при хранении в условиях 4 °С, в высушенном состоянии (вакуумная сушка) и в столбике полужидкого 0,4 % агара (на бульоне Мартена с добавлением в него 0,5 % 0,05 М глютамата натрия и 1 % глицерина) под вазелиновым маслом. Морфологические свойства хранившихся штаммов проверяли в мазках, окрашенных по Граму, биохимические - на среде с глюкозой в аэробных и анаэробных условиях, вирулентность исследовали на белых мышах.

3. Результаты исследований 3.1. Эпизоотология еские аспекты сииегнойной инфекции у песцов и лисиц

В период работы зарегистрировано 37 зверохозяйств, неблагополучных по синегнойной инфекции с общим количеством вспышек 62, что свидетельствует о стационарности болезни в некоторых хозяйствах. Наибольшее распространение возбудителя инфехции отмечено среди песцов, т.к. из 37 зверохозяйств только в 6 она зарегистрирована у лисиц. Щенки зверей болеют редко. Прослеживается четкое увеличение роста неблагополучных хозяйств по годам (рис.1).

19вв ■ 2

1987 • в

Рис. 1. Рост численности неблагополучных по синегнойной инфекции зверохозяйств по годам (1981-1990).

У взрослых зверей болезнь проявляется в период щенения. Форма проявления - септицемия, локальная инфекция и бессимптомная. В первом случае гибнут щенки и самки на последних сроках беременности, перед смертью заметно переболевают, при пальпации отмечается увеличение матки я ее флюктуация. При бактериологическом исследовании всегда выделяли чистую культуру Рэ. аешдшоБа. При локальном течении проявляются признаки эндометрита с грязно-кровавыми или гноевидными выделениями из влагалища с последующим выбросом разложившихся неопределенной формы тканевых

комков или мертвых плодов. Самки в таких случаях недлительно переболева-ют. Истечения из влагалища продолжаются 2-3 недели. Иногда самка щенится в срок, но щенки, покрытые гноевидной массой, гибнут в первые дни жизни. Часто у самок бывают аборты, пропустование, прохолостование и рассасывание плодов во второй половине беременности.

Путь проникновения возбудителя - per os и половой, что было установлено при внугриматочном, внутривлагалищном и пероральном инфицировании самок суточной агаровой культурой синегнойной палочки в дозе 0,2-1 -8 *109 м.т. При патологоанатомическом вскрытии павших самок отмечали отечность и гиперемию слизистой оболочки матки, иногда покрытой фибринозной пленкой. В полости густая гноевидная масса и мертвые плоды. Иногда происходила перфорация стенки матки и выход щенков в брюшную полость. У павших щенков в большинстве случаев регистрировали катаральда-геморрагическую пневмонию, иногда экссудативный плеврит. При экспериментальном внутримышечном заражении песцов (4*10® м.т.) у них обнаруживали сильное кровенаполнение печени, легочной ткани, гнойно-воспалительный процесс в области введения культуры и аутолиз мышц и мездры шкурки.

Источником возбудителя инфекции служат больные звери и звери-псевдомононосители, как самки, так и самцы, а факторами передачи - конта-шпшрованные синегнойной палочкой корма, вода и т.д.

Антисанитарное состояние з зеро кухни создает услозия для длительного сохранения жизнеспособности синегнойной палочки и для ее размножения в объектах окружающей среды (на оборудовании, в остатках корма, в сточных колодцах, в кухонных приемниках и т.п.). В таблице 1 представлены данные по обсеменекности кормов и объектов окружающей среды синегнойной палочкой, которые свидетельствуют, «гго в 17,8 % случаев кормосмеся

были обсеменены синегнойяой палочкой, а, как следствие, отмечали частое обсеменение и самого оборудования кухни и кормушек зверей.

Таблица 1

Степень обсеменнсности кормов и окружающей среды сннегнойпой палочкой

л в/п Объекты исследования 3/с "Родники" З/сТииотовский" Всего

Вето иссл. проб Ин-фиц. проб */.ин-фи-аир. проб Всего иссл. проб Ин-фиц. проб %ин-фи-цир. проб Всего иссл. проб Ин-фиц. проб %ин-фи-цир проб

1. Мясные и рыбные субпродукты S1 2 2,5 81 2 2,5

2. Молочные продук-ты(молоко, сметана, творог) 52 4 7,7 52 4 7,7

3. Кормосмеси 97 19 19,6 83 13 15,7 180 32 17,8

4. Оборудование эве-рокухни 19 3 15,8 19- 3 15,8

5. Вода я поилках зверей 96 0 0 9 1 11,1 10S 1 0,9

6. Кормушки 152 15 9,9 26 5 19,2 178 20 11,2

7. Паи, септик зверо-кухнн 9 * 2 22,2 9 2 22,2

Всего объектов 345 34 9,9 277 30 10,6 622 64 10,2

В стационарпо неблагополучных по синегнойной инфекции зверосовхозах "Племзавод Родники" и "Тимоховский" проверяли зверей на псевдомо-ноносительство (табл. 2). Данные таблицы 2 свидетельствуют, что в различных замкнутых популяциях песцов число псевдомононосителей различно даже в пределах одного совхоза. Это подтверждает факт распространения инфекции не только через корма, но и через самих зверей и обслуживающий персонал. Были исследованы на псевдомононосительство 102 лисицы зверосовхоза "Тимоховский".

Таблица 2

Носительство синегнойной палочки среди песцов

№ л/п Показатели, в %% Зверосовхоз "Родники" Зверосовхоз Ткиоховасий" Итого по 2 хоз.

Бригада 3 Бригшха4 Всего

1. Исследовано самок, гол.(%) 63 40 60 100 163

2. Выявлено носителей, гол.(%) 6(9,5) 7(17,5) 25(41,7) 32(32) 38(23,3)

3. В том числе:

- вагинальных носителей 2(3,2) 1(2,5) 8(13,3) 9(9) 11(6,7)

- ректальных носителей 3(4,8) 5(12,5) 12(20) 17(17) 20(12,3)

- смешанных носителей* 1(1,6) 1(2,5) 5(8,3) 6(6) 7(4,3)

4. Исследовано самцов, гол. 28 20 25 45 73

5. Выявлено носителей. гол.(%)** 4(14,3) 2(10,0) 3(12,0) 5(11,0) 9(12,3)

Примечание: * - смешанное носительство - сннегнойняя палочка выделяется одновременно из влагалища н прямой кишки; *• . носительство установлено по выделению синегнойной салочки кз препускальвого мешка.

Выявлено, что 9,8 % клинически здоровых лиекц идут в гон, имея zo влагалище возбудителя синегнойной инфекции. Наиболее часто выявляли у зверей ректальное носительство. Псевдомононосктельство отрицательно сказывается на результатах щенения (табл. 3, 4), снижая плодовитость н выход щенков.

При изучении микробного фона во влагалище и прямой кишке у 100 самок песцов и 102 самок лисиц выявлена широкая контаминация их синегнойной палочкой в ассоциации с бактериями рода Proteus.

Установлено, что в 22 % случаев неблагополучное щенение происходит на фоне присутствия синегнойной палочки в родоьых путях. Результата им-

мунизации песцов специально приготовленной для зверосовхоза "Тимоховский" вакциной против синегнойной инфекции в производственлом опыте показало увеличение выхода щенков за счет повышения плодовитости самок (по 0,4 гол.).

Таблица 3

Результаты щенеиия самок песцов в зависимости от факта

_псевдомоноиосительства_

п/п Показатели Носители голов (%), п=9 Свободные голов (%), п=16

1 Благополучно ощенилось, голов ЮЛ 9 (100) 16(100)

2 Родилось щенков всего 87 168

3 В том числе мертвых 6(6,9) " 6(3,6)

4 Плодовитость самок 9,7 10,5

5 За регистрировано щенков, всего 77 148

б Зарегистрировано щенков на самку, гол. 8,6 9,3

Таблица 4

Результаты щенения самок лисицы в зависимости __,от факта псевдомоноиосительства_

№ п/п Показатели Самрп псевдомо-ионосители (%), п=18 Самки "свободные" гол. (%), п=52

1. Благополучно ощенились, гол.(%) 13 (66,7) 46 (88,5)

2. Родилось агнков, всего 65 242

3. в т.ч. - мертвых 5 (7,7) 6 (2,5)

4. Плодовитость самок 5,0 5,3

5. Зарегистрировано щенков, всего 54 228 .

б. На благополучно ощенившуюся самку, голов 4,2 5,0

Рассматривая результата воспроизводства зверей в зависимости от предварительно проведенной вахцинашш против возбудителя синепюшюй палочки, прослеживается эффективность иммунной обработки зверей.

Таким образом, анализ полученных данных позволяет заключить, что носительство псевдомонад в организме самок зверей отрицательно сказывается на результатах воспроизводства.

3.2. Выделение эпизоотических штаммов синегнойной палочки от песцов и лисиц и их идентификация

Всего выделено 380 бактериальных культур, полному исследованию подвергнуто 36, из которых путем клонирования получено 66 клонов; 88,8 % бактериальных культур выделено от самок песцов, 2,8 % - от самок лисиц, 5,6 и 2,8 % - от щенков песцов и лисиц соответственно. При морфологической оценке колоний наиболее часто встречаются R и S формы, реже складчатые и мукоидные.

3.2.1. Родовая идентификация. При определении родовой принадлежности бактерий по классификации B.Bergey и определителя зоопатоген-ных микроорганизмов (Сидоров М.А. и др.,1995) установили, что 71,2 % культур на среде с N-цетилпиридинием хлорида через 24 часа дают характерный рост. В 100 % случаев получены положительные результаты по цитохро-моксидазному и аргинингидролазному тестам, ив 100 % случаев отрицательные по лизин- и орнитиндекарболазному. Все клоны обладали сахаролитиче-ской активностью по отношению к глюкозе в аэробных условиях. Полученные характеристики определяют род Pseudomonas. По свойствам соответствует РНК - секции, первой ДНК - группе.

3.2.2. Видовая идентификация. При определении видовой принадлежности 100 % клонов росли на ацетомидном агаре с гидролизом его, на поверхности обычного мясопептонного бульона (МГГБ) образовывали характерную серовато-серебристую пленку, а на дне - осадок. Характерным является образование в МПБ у 89,4 % штаммов через 18 часов и у 100 % через 24 часа

водорастворимого фенозииового пигмента пиоцианина. Все куяьтурк имели, характерный запах жасмина (синтез триметиламина).

Все клонированные штаммы росли при +42 °С и не росли при +4 ... +5 °С, восстанавливали нитраты в нитриты. В мазках, окрашенных по Граму, бактериальная культура имела вид прямых или изогнутых грам-отрицатгльных палочек размером 1-3 мк в длину, 0,5-1,0 мк в ширину, расположенных одиночно, парами, заборчиком, иногда цепочками. Некоторые бактериальные культуры имели металлический блеск. При исследовании под электронным микроскопом обнаружены 1 или 2 полярно расположенных жгутика, а на поверхности ~ пили (фимбрии). Все эти данные характерны для вида Pseudomonas aeruginosa i: соответствуют дифференциальным признакам видов РНК-секции 1-го рода (Palleroni, 1984).

При биохимическом исследовании синегнойная палочка проявляла активную кислотообразующую способность при ассимиляции моносахаридов гексозы (глюкозы и галактозы), ее протеолитические ферменты рачжижают желатин. Не отмечено образование индола и сероводорода.

3.2.3. Внутривидовая идентификация. Внутривидовое тестирование предполагало серологическое, пиоцино- и фаготипирование.

3.2.3.1. Серологическое типирование. Серологическому тштрованию подвергнуто 183 бактериальные культуры, в т.ч. выделенных от павших самок песцов и лисиц (73 б.к.), от неблагополучно ощенившихся песцов и лисиц (24 б.к.), от песцов - псевдомононосителей (32 6.x.), от лисиц-псевдомононосителей (34 б.к.), самцов - псевдомононосителей (4 б.к.) и из различных кормов (16 б.к.).

Данные таблицы 5 показывают, что от павших зверей выделено 11 бактериальных культур с типируемыми О-антигенами и 1 - с нетипируемым, а наиболее часто регистрировали серовары 03, 06 и 011 (соответственно 17,8; 23,3; 13,7 %). Отмечено, что в начальной стадии беременности патологию

чаще вызывал серо вар 03, на более поздних сроках - серовар 06. С годами количество серовариангов синегнойной палочки, выделяемых от погибших зверей увеличивается (рис. 2).

Таблица 5

Результаты серотипирооания штаммов синегнсйной палочки, выделенных от самок песцов, лисиц и из кормов

|№№ п/п Заре-гистр. ссровар. Выделены бактриалъные культуры от (в%)

Погибших самок, гол / % п=73 Неблагопо-лучн. ощенившихся, гол/ % п=24 Самок-псев-домононос., п=66 Из кормов п=16

1 01 6/8,2 4/16,7 - 7,6 0

2 02 5/6,8 0 1,5 0

3 02/05 6/8,2 0 0 0

4 03 13/17,8 3/12,5 0 31,3

5 04 3/4,1 0 0 0

6 05 4/5,5 4/16,7 0 0

7 06 17/23,3 2/8,3 1,5 6,3

8 08 1/1,4 0 0 0

9 09 6/8,2 2/8,3 0 25,0

10 010 0 0 1,5 0

11 011 10/13,7 6/25,0 22,7 12,5

12 013 0 1/4,2 0 7,1

13 014 1/1,4 • 1/4,2 •0 0

14 016 0 1/4,2 59,0 0

15 Не тапир. 1/1,4 0 6.0 18,8

Всего 5.к. типкрозалось 11 9 6 5

■онер! серосаров

Рис. 2. Регистрация серо вариантов синегнойной палочки, выделенных от погибших песцов и лисиц в 1981-1990 гг.

Это связано с увеличением числа неблагополучных хозяйств и, по всей вероятности, с различными дополнительными источниками возбудителя инфекции. В некоторых неблагополучных по синегнойной инфекции хозяйствах могут циркулировать в один сезон одновременно 2-4 серовара (зверосовхоз "Плавский", "Племзавод Родники" и др.). Не отмечено стабильности серова-риантов в определенных регионах страны.

От неблагополучно ощенившихся зверей из влагалища песцов наиболее часто выделяли синегнойную палочку серо вариантов 01, 03, 05, 06, из влагалища лисиц - 011 (у носителей была однотипная патология - рассасывание эмбрионов и пропустование).

У зверей псевдомононосптелей наиболее часто выделяются серогарн-анты 01, 011, 016 (у песцов) и 016 (у лисиц). Корма наиболее часто контами-

нированы игпшмамн сероваров 03 н 09. Нетипируемых оказалось 18,8 % штаммов.

3.2.3.2. Пиоыинотшпгрованис. Пиоцинотипированию было подвергнуто 59 клонов полученных от 32 штаммов синегнойной палочки. Анализ пиоци-нотипирования показал, что почти у всех штаммов клоны имели сходные пиоцинотипы, за исключением двух штаммов с различными пиоцинотипами клонов (529, - 373512 и 5292 - 885586; 531, - 281651 и 5312 - 611244). Не обнаружено штаммов совершенно одинаковых пиоцинотипов, но несколько штаммов были близки по пиоцинсггипу (518 и 476; JIO&, 494 и 485; 521 и 516). Такое различие объясняется тем, <гго каждый штамм имел свою собственную экологическую нишу (штаммы выделены в разные годы, в различных зверо-хозяйствах, от зверей с различными условиями кормления и содержания и т.д.), которая оказала воздействие на внутрипопуляционную изменчивость пиоцинотипа. При наличии достаточно высокой чувствительности многих индикаторных штаммов к пиоцинолизатам исследуемых штаммов некоторые из них оказались слабо или совсем не чувствительными к пиоцинолизатам штаммов определенных серологических групп. Ингибирующей активностью по отношению к штаммам ALA не обладали пиоцинолизаты штаммов 06 се-ровара (4 шт.) и пиоцинолизат одного клона-штамма 09 серовгра.

Таким образом, 5 штаммов из 32 или 9 клонов из 59 оказались непио-цмнотипируемыми.

Степень лнзирования штаммов ALA пиоцинолизатами остальных исследуемых штаммов различных серо вариантов также различна. Так, пиоцинолизаты 06 серо вара лизировали 32 % штаммов ALA , 03 серо вара 19 %; пиоцинолизаты штаммов остальных сероваров лизировали в пределах 10-11 % индикаторных штаммов. Среди исследуемых штаммов выделены 7 (21,8 о/о) с высоким спектром лизирующей способности (50-78 %). В опытах по перекрестной активности пиоцинов 21,8 % штаммов обладали высоким спек-

тром лизирующей активности. Не отмечено какой-либо зависимости литиче-ской активности пиоцинолизатов от серо варианта штамма родителя.

3.2.3.3. Фзготипирование. Фагсггипированию подвергнуто 12 клонов, из них типировались только 10 (83,3 %). Полностью аналогичных фаготипов не обнаружено. Совершенно разных фаготипов оказались клоны штаммов, выделенные одновременно от одного зверя в "Племзавод Родники" в 1988 году (5291 и 5292). Это свидетельствует о возможности циркуляции в организме одного животного синегнойной палочки разных фаготипов, а следовательно детерминирующие в себе различных антигенные свойства. В последствии оказалось, что клон 5292 обладает высокой активностью экзотоксина А], а 529] высокой протеолигаческой активностью.

Культуры синегнойных палочек исследуемых штаммов оказались относительно устойчивыми к лизису фагами из коллекции 1лпдЬег& что было заметно по характеру литических реакций. Однако проявление самих реакций можно назвать сильным, так из всех 55 литических реакций сливной лизис составлял 41,8 %, губчатый лизис - 27,3 %, наличие 10-15 бляшек - 21,8 %, единичные бляшки - 9,09 %.

3.3. Чувствительность синегнойной палочки к антибиотикам

Определяли устойчивость штаммов синегнойной палочки к следующим антибиотикам: гентамищшу, рифампицину, вибрамицину, ципрофлоксацину, азлоциллину, клафорану, кефзолу, нитроксалину, диоксидину, ампициллину, таревиту, тиментину, аугментину. Испытано 11 ппаммов синегнойной палочки, выделенных от зверей, павших в результате синегнойной септицемии. В большинстве случаев чувствительность всех штаммов к одному испытываемому антибиотику находится на одинаковом уровне, за исключением диокси-дина и ампициллина, минимальная ингибирующая концентрация (МИК) которых колебалась в пределах двух последовательных разведений (312,0 -

625,0 и 6,2 - 15,6 мкг/мл соответственно). Наибольшую чувствительность отметили к ципрофлоксацину и рифампицину, МИК которых составила соответственно 0,97 и 1,94 мкг/мл.

При диагностических исследованиях методом дисков большинство штаммов были чувствительными к полимиксину М, стрептомицину, неоми-цину, карбенициллину. Больше всех диаметр задержки роста (20-22 мм) был у полимиксина М и карбенициллина. Нечувствительными культуры оказались к ампициллину, бензилпенициллину, доксициклину, лсвомицетину, ок-сациллину, рифампицину, ристомицину, олеандомицину. Полученные данные свидетельствуют о необходимости подтитровки каждого антибиотика при использовании его в практических условиях.

3.4. Патогенность штаммов синегнойной палочки, выделенных от песцов и лисиц

3.4.1. Патогенность для песцов. В результате внутримышечного заражения (штамм 529i) LDjo для песцов составляет 3,981*10®. Ошечено, что патогенность некоторых штаммов с годами падает. Так, например, штамм 513 не вызывал гибели песца в дозе 8*10® м.т. (2 LD»), но при введении его в дозе 16*10® (4 LDjo) песец пал через 48 часов. При проверке этого же штамма через год (4 LDjo), патогенность не проявлялась. Аналогичную картину отмечали и с некоторыми другими штаммами, такими как 524, 521,499 и 570. Эти данные свидетельствуют, что длительное хранение штаммов в столбике агара под вазелиновым маслом приводит к снижению вирулентности.

3.4.2. Вирулентность для белых мышей и морских свинок. Исследовано 17 штаммов, выделенных от павших зверей. При внутрибрюшин-ном заражении в дозе 2*10* м.т. 100 %-ную летальность для мышей показали 13 штаммов, при дозе 4*10* м.т. - 15 штаммов (88,2 %), осталь-

ные 3 штамма - 25-75 %. Для морских свинок LD/50 составляла 1 »4* 109 м.т. при внутримышечном заражении.

Протигровано на белых мышах 13 штаммов синегнойной палочки при внутрибрюшинном заражении. Их LD/50 составляет для штамма 476j - 2,5*10'; 449j - 2,884*10*; 4992 - 4,677*10s; 500j - 3,177*10»; 5132 - 4,0*10*; 5142 -3,573*10*; 521, - 2,044*10*; 524 - 2,8*10»; 527, - 3,573*10*; 529, - 3,177*10»; 529: - 2,044*10»; ЛО, - 2,5*10*; Л О, - 4,0*10*.

Таким образом, LD» каждого штамма выражалась значениями 2-4,6*10» и для дальнейших исследований иммуногенности каждого штамма'шш биопрепарата доза микроорганизмов составляла 1*109 микробных клеток, что соответствует 2-4 LDjo. Эта доза обеспечивала 100%-ную гибель контрольных животных.

3.4.3. Патогенностъ штаммов, выделенных от зверей-псевдомононосителей. Проверено 10 штаммов от песцов и 14 от лисиц. Отмечено снижение патогенности по сравнению со штаммами, выделенными от павших зверей. При внутрибрюшинном заражений мышей в дозе 1*109 м.т. летальность в пределах 89,2 %; при подкожном - 37,8 %.

3.4.4. Патогенностъ штаммов, выделенных от неблагополучно щенившихся самок песцов и лисиц. Проверено 9 штаммов сразу же после свершившегося факта неблагополучного щенения. Их патогенностъ при подкожном заражении на 20 % выше, чем у штаммов, выделенных от зверей-псевдомононосителей и составляла 56,3 - 60,0 % в сравнении с 37,8 %. При внутрибрюшинном заражении бактериальными культурами, выделенными от песцов-псевдомононосителей, вирулентность их увеличивается более чем в 2 раза.

3.5. Определение продукции внеклеточных факторов вирулентности

3.5.1. Определение продукции экзотоксина А. Из двух испытанных сред - обогащенный бульон Мартена и синтетическая среда Аджиева A.A.

(1982) отобрана для культивирования штаммов синегнойной палочки первая, поскольку титр экзотоксина в РИГА на ней был 5-8 log:, на синтетической • 1-4 log2 соответственно.

Продукцию экзотоксина А проверяли в реакции пассивной гецагглю-тинации (РПГА). Супернатанты разводили до 9 logj. Протестирован 61 клонированный штамм. В результате 11 (18,0 %) не показали наличия экзотоксина А, у 2* не получен результат из-за радужного лизиса, 43 штамма распределились в следующих интервалах разведений: от 1 до 5 log2 —27 клонов (44,3 %), от 6 до. 7 log: - 17 клонов (27,9 %), or 8 до 9 log2 - 4 клона (6,6 %).

С высокими титрами экзотоксина А 7 и 9 1о£г оказалось 13 клонов. С помощью РПГА установлено, что наибольшее количество токсигенных штаммов относится к сероварам 09 и 011.

Методом Элика протестировано 58 клонированных штаммов. Полоса преципитации в реакции диффузии зарегистрирована только у 13 (22,4 %).

При определении АДФ-рибозил-трансферазной активности экзотоксина А исследовано 55 клонированных штаммов. Наиболее высокую активность (1800 - 2500 имп/мин/мг) показали 9 клонов (16,4 %), среднюю (1000 - 1500) -7 (12,7 %), активность до 1000 имп/мин/мг - 25 (45,4 %), отрицательный результат дали 14 клонов (25,5 %). Более высокой токсигенностью обладали клоны сероваров 09 и 011.

Итак, в результате тестирования токсигенности штаммов тремя методами отобрано 6 штаммов с наиболее высокой токсигенной активностью -ЛО,, 524,, 500г, 5292, 5132, 5142.

3.5.2. Лротеолитическая активность. Активность щелочной про-теазы проверяли у 47 клонированных штаммов. Из них только 2 не проявили протеолитнческую активность, остальные по показателю зоны просветления в

реакции гидролиза казеина распределились следующим образом по интервалам:

Таким образом, с оптимальной продукцией щелочной протеазы отобраны 4 штамма (529ь 4992, 521, 5270(320 и более ЕД (6 1о&). Наиболее часто высокой протеолитаческой активностью обладали штаммы сероваров 02/05 и

Эластазная активность определена у 52 клонкрованных-штаммов. Не показали наличие эластазы з РП 12 шт. (26,9 %). Остальные распределились по активности эластазы в пределах следующих разведений:

Наиболее часто высокой активностью обладали клоны сероваров 02/05 п 03. Для дальнейшей работы отобраны 3 клонированных штамма с наиболее высокой эластолитической активностью (476г, ЛОз, 449г).

3.5.3. Продукция внеклеточной слизи. Наличие слизи определяли у 59 клонированных штаммов на протяжении 2* пассажей. На среде с гидроли-затом бычьего сердца выявлено во 2-ом пассаже 30 слизеобразующих клонов (50,8 %), на МПА - 22 (37,2 %). Наиболее часто слизеобразующне хлоны относятся к сероварам 011 (75 %), 03 (61,5 %). Отобраны 2 клонированных штамма для дальнейшей работы.

3.5.4. Адгезивная активность. Предварительно определена степень адгезивной активности по отношению эритроцитов барана. О-группы человека и кролика.

. 16 шт. (34,0 %), 30-87 ЕД(41ое) 20 шт. (42,5 %,), 88-159 ЕД (5 1о&) 9 шт. (19,1 %), 160-384 ЕД (6 log:)

06.

цел суперн. - 2 шт.,

1 log» - 6 пгг.,

2 log: -15 шт.,

3 log2 - 7 шт.,

4 log2 - 4 шт.,

5 log2 - 3 шт.

Наибольшей чувствительностью в реакции гемагглклинацни обладали эритроциты кролика. Проверена адгезивная активность 29 клонированных штаммов синегнойной палочки. Отобран 1 клонированный штамм (5292), дающий высокую степень адгезии -111о{>2. .

Итак, на основании проведенных исследований было отобрано 13 клонированных штаммов с наивысшими показателями активности факторов па-тогенности. Эти штаммы предназначаются для конструирования различных биологических препаратов по ликвидации синегнойной инфекции. Данные штаммы депонированы в музее бактериальных и вирусных микроорганизмов НИИПЗК им. В.А.Афанасьева и на них получены решения о выдаче патентов.

3.6. Разработка научной концепции создания иммуногенной вахщпш против синегнойной инфекции песцов и лисиц, основанной на факторах патогенности

Задачи разработки: 1 - инактивация вирулентных свойств штаммов-продуцентов, 2 - стимуляция иммунного ответа макроорганизма за счет депонирующих свойств адьюванта и 3 - проверка протекгивной активности препарата в эксперименте и в условиях неблагополучного хозяйства.

3.6.1. Инактивация вирулентных свойств. Использованы три инактиванта: димерэтиленимнн (ДЭИ), бинарный димерэтиленимин (БДЭИ) и итаконовая кислота.

Определены методом титрования минимальные концентрации инактиванта, задерживающие рост микроорганизма (МЗК). В качестве инакгивирующей концентрации была принята субтормозящая, превышающая в 4 раза МЗК: для ДЭИ - 0,5 %, для БДЭИ - 0,1 %, итаконовой кислоты - 16 мг/мл. Изучена кинетика инактивации на протяжении 18 часов. Начальные и конечные результата инактивации даны в таблице 6.

Таблица 6

Кинетика инактивации синегнойной культуры

Объет исследования ДЭИ БДЭИ Итаконовая кислота

Время инактивации <час)

0 18 0 18 0 4

Культура+ инактивант 1*10' роста нет 1x10' роста нет 1*109 роста нет

Культура (контроль) 1*10' сплошной рост 1*10' сплошной рост 1*Ю9 1 сплошной рост

Инактиванты испытаны при различных значениях рН среды. Лучшие результаты инактивации получены при рН среды 7,2. В дальнейшей работе использовали инакшвант ДЭИ. Для изучения его инакгивирующей способности было приготовлено 18 антигенов-супернатангов. Данные таблиц 7, 8,9 подтверждают результативность ДЭИ. Микробные клетки оказываются все убитыми, т.к. на среде ТБА не обнаружено колоний, а факторы пзтогенности инакгивиру-ются. Все мыши после заражения остаются живыми.

Таблица 7

Влияние ннактнвацин на вирулентность микробных клеток, биологические п антигенные свойства экзотоксина А

№№ штамма Вирулентность микробных клеток (и)/») Титр (в 1о&) экзотоксина вРПГА

до инакт. после инакт. до инакт после инакт

5293 2,044*10* все мыши жкзи 8,3 ±0,815 2,4 ±0,666

513: 4,0*108 «с 5,33 ± 0,409 1,33 + 0,109

5143 3,573*10* «( 7.1 ±0,666 1,2 + 0,86

5002 3,177*10* и 9,67 + 0,11 2,1 +0,01

524, 2,8*10* и 7,1 ±10,666 0,53 + 0.29

Л02 2,5*10* «4 8,3 ±0,815 1,0 + 0,0

РА-7 контроль 3,10x10* и 8,47 ± 0,327 2,0 ± 0,0

Таблица 8

Влияние инакцивации на вирулентность микробных клеток и протеиназную активность

№№ штамма Вирулентность микробных клеток (из/50) Протеолнтическая активность (в 1о&)

до инактивации после инактивации до инактивации после инактивации

529, 3,177*108 все мыши живы 6,0 0

521, 2,044* 108 и 6,0 0

4992 4,67740" и 6,0 0

527, 3,573*10® и 6,0 0

268 контроль 1,5*108 м 6,0 0

Таблица 9

Влияние инакцивации на вирулентность микробных клеток и эластолитическую активность

№№ штамма Вирулентность микробных клеток (Ш/») Эластолктическая активность титр (в 10Й2) в РП

до инактивации после инактивации до инактивации после инактивации

ЛО, 4,0* 10* все мыши живы ■ 5,0 0

4762 2,5*10* и 5,0 0

4992 4,677*10* и 5,0 0

286 (контроль) 1,5*10» и 5,0 0

Аналогично проверяли эффективность ДЭИ в отношении шт.5922 и 592), выращенных на средах с оптимальной продукцией ими внеклеточной слизи и адгезивной активностью. ДЭИ полно-

стью инактивнрует клетки, уничтожает их жизнеспособность и вирулентность.

Итак, все вышеприведенные данные опытов показали эффективность испытанного инактиванта ДЭИ, применяемого в конечной концентрации 0,5% в течение 18 часов.

3.6.2. Иммуногенные свойства штаммов синегнойной палочки, продуцирующих различные факторы патогенности (на основе бесклеточных суспензий). Приготовлено 13 супернатантов - 4 Ьз штаммов токсичных и 9 из протеолитических. Проверены на иммуногенность в тесте защиты мышей против гомологичных и гетерологичных штаммов. Мышей иммунизировали подкожно однократно по 0,5 мл, заражали через 15 дней

внутрибрюшинно 4 ЫЭ5о культуры.

В результате по токсигенным штаммам защита мышей против гомологичных штаммов составила 60,0 - 80,0 %, против гетерологичных - 20,0 - 40,0 %. По протеолитическим тутаммам соответственно 60,0 - 90,0 % и 20,0 - 50,0 %. Все контрольные неиммунизнрованные мыши погибали через 24 - 48 час.

После анализа полученных данных было отобрано три штамма с наилучшими иммунологическими свойствами: штамм 52% (продуцент экзотоксина, внеклеточной слизи и с высокой адгезивной активностью), штамм 4762 (продуцент эластазы) и штамм 5211 (продуцент щелочной протеазы).

Из этих штаммов приготовлены антигены и изучена динамика иммунологической активности против гомолопгнгых и гетерологичных штаммов. Заражение проводили через 7-30 дней после вакцинации. Результаты представлены в таблице 10.

Из таблицы 10 видно, что моновакцины-супернатанты создают иммунитет, способный защитить 70,0 - 80,0 % мышей на 7 день после иммунизации от 4 1ЛЭ/5о живых культур гомологичных штаммов и 20,0 - 40,0 % от

культур гетерологичных штаммов синепнойной палочки. К 30-ому дню иммунитет снижается, но достаточно высок, если учесть, что вакцины приготовлены без адъювантов. В контрольных группах мыши в 100 % случаях гибли через 24 - 48 часов.

Таблица 10

Продолжительность иммунитета, создаваемая моновакцинами против гомологических и гетерологичных штаммов

Моно- Заражение мышей после иммунизации в.днях

вакцины 7 15 22 30

из - % заражения мышей против штаммов

штаммсв 529, 476, 521, 529, 476, 521, 529, 476, 521, 529, 476, 521,

5292 серов. 03 10/3 70 10/6 40 10/6 40 10/2 80 10/6 40 10/5 50 10/2 80 10/6 40 10/6 40 10/5 50 10/6 40 ЮЛ 30

476j серов. • 02/О5 10/6 40 10/2 80 10/6 40 10/5 50 10/2 80 10/6 40 10/6 40 10/4 60 10/6 40 10/7 30 10/5 50 10/7 30

521, серов. Об 10/6 40 10/8 20 10/2 80 10/5 50 10/7 30 10/2 80 10/6 40 10/7 30 10/2 80 10/8 20 10/7 30 10/4 60

Контр. 10/ 10/ 10/ 10/ 10/ 10/ 10/ 10/ 10/ 10/ 10/ 10/

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3.6.3. Изготовление лабораторного образца поливалентной вакцины и контроль стадий ее производства. Были использованы штаммы 5292,521 j и 4762. Штамм 5292 (продуцент экзотоксина А) выращивали на обогащенном бульоне Мартена, вырабатывал экзотоксин А с титром 8 log2 в РПГА. Штаммы 5211 и 476г культивировали на модифицированной среде Iensen. При контроле супернатанга из штамма 52 lj (продуцента щелочной протеазы) вырабатывал ее в титре 6 log: в РП, при контроле суиерна-танта из штамма 4762 (продуцент зластазы) в РП получена четкая полоса при разведении его 4 log2. Все полученные супернатанты подвергнуты инактивации путем добавления ДЭИ в конечной концентрации 0,5 %. Через 18 часов

добавляли тиосульфат натрия (конечная концентрация 1,5 %) для нейтрализации инактиванта. Эффективность инактивации проверяли путем высева на чашки с ТБА, МПБ, МПА и центримидный агар. Рост на средах отсутствовал. Далее каждый супернатанг проверяли на безвредность, для чего его вводили 5 морским свинкам подкожно 3,0 мл и 10 белым мышам по 1,0 мл внутри-брюшинно. За время наблюдения не отмечали гибели животных, вялости, похудения. Затем супернатанты соединяли в одну емкость в равных количествах. Бактериологические исследования показали ее стерильность.

Протективное действие поливакцины проверяли на мыш!х в зависимости от вводимой дозы н сроков исследования. В каждый срок заражали по 10 мышей вакцинированных и 10 .контрольных смесью в равных объемах штаммов 521], 476} и 529г в дозе 4 ЫЭ5о на голову. В результате оказалось, что наилучший иммунологический эффект получен от дозы вакцины 0,5 мл. Через 5 недель вакцина даже без адт-ованта создавала иммунитет у 80 % мышей. Контрольные мыши все пали на 2-3 день.

3.6.4. Эффективность депонирования вакцины. Были испытаны гидроокись алюминия и липосомный адъювант.

3.6.4.1. Эффективность сорбции гидроокисью алюминия. В вакцины из штаммов 529г, 521] и 476; добавлена гидроокись алюминия из расчета 2 мг сухого остатка окиси алюминия к 1,0 мл. вакцины. Через 18 часоз вакцина проверенз на стерильность. Рост на питательных средах отсутствовал. Сорбированной и несорбироваяной вакцинами иммунизировано по 40 мышей в дозе 0,5 мл подкожно. Заражены мыши ка 15-ын день после иммунизации различными дозами.

В результате добавления адью ванта усиливается протективкый эффект в отношении живой культуры синегнойной палочки. Особенно это становится очевидным при увеличении заражающей дозы. Протсктнвный эффект вакци-

ны без адъюванта начинает снижаться уже при использовании заражающей дозы 81Ия. Так, при заражении 16 Ш» вакцина с адъювантом предохраняет мышей на 50% больше, чем не сорбированная. Все это свидетельствует о том, что вакцина с адъювантом создает более напряженный иммунитет.» Контрольные мыши все пали на 2-3-ий день.

При изучении длительности протективного эффекта инактивированной ГОА поливалентной вакцины испытали ее в сроки от 2-х до 3-х месяцев. Оказалось, что препарат обеспечивает значительную защиту мышей на пртяже-нии срока наблюдения. При заражении мышей 4 И)» сохранность их через 90 дней составляла 90%.

Таблица 11

Протективные свойства поливалентной вакцины против 17 эталоннных _ штаммов синегнойной палочки известных сероваров_

серовара Защита мышей после заражения их через 15 и 30 дней после иммунизации, жив/меггтв. % _

15 30

02/05 30/0 100 30/0 100

01 30/2 93,4 30/2 93,4

03 30/0 100 30/0 100

04 30/6 80 30/2 93,4

06 30/0 100 30/0 100

07 30/2 93,4 30/1 96.7

09 30/3 90 30/2 93,4

010 30/4 86.7 30/3 90

011 30/6 80 30/5 83,3

012 30/7 76,7 30/6 80

013 30/8 73,3 30/8 73,3

014 30/7 73.3 30/7 76,7

015 30/0 100 30/2 93,4

016 30/3 90 30/2 93,4

017 30/0 100 30/2 93,4

018 30/0 100 30/0 100

Контроль 64/64 0 64/64 0

Таким образом, данная вакцина должна обеспечить надежную иммунологическую защиту песцов от синегнойной инфекции от срока покрытия до щенения (60 дней).

Проверены протективные свойства поливалентной вакцины против культур синегнойной палочки, на сегодняшний день выделенных от всех видов животных и людей, 17 эталонных серо вариантов.

Заражение мышей проводили внутрибрюшинно в дозе 4 LD» на 15 и 30-ый дни после вакцинации. Результаты представлены в таблице 11.

Данные таблицы 11 показывают, что вакцина обладает? достаточным анпшротеазным, антитоксическим и антиэластазным свойствами. Особенно отчетливо прослеживается эффект против гомологичных штаммов, т.е. по сероварам 02/05,03 и Об, когда после заражения мышей и через 15 и 30 дней гибели животных не отмечали.

Не регистрировали гибели мышей и через 15 дней после заражения их штаммами 015,017 и 018 сероваров. И хотя эти серовары пока не встречались в звероводстве (за весь период работы мы не выделяли штаммы синегнойной палочки указанных сероваров), несомненно, в теоретическом плане - это положительный результат.

Итак, следует отметить, что 70-80%-ная сохранность животных против всех гетерологичных штаммов синегнойной палочки открывает перспективу создания выскоиммуногенного специфического препарата.

3.6.4.2. Эффективность сорбции на липосомах. Вакцина, изготовленная с использованием липосомного адью ванта, проверена на иммуногенность на мышах по уровню'антитоксических антител в сравнении с сорбированной на гидроокиси алюминия и несорбированной.

Результаты опыта показывают, что лкпосомная форма вакцины обеспечивает значительное увеличение титра антитоксических антител. Показатель

ее выше, чем у несортированной н сорбированной на гидроокиси алюминия вакцин, на 2,0 - 4,0 log: соответственно.

3.7. Условия хранения штаммов.

Штаммы синегнойной палочки сохраняют свои морфологические, культуральные, биохимические, патогенные и вирулентные свойства при хранении в вакуумно-высушенном состоянии в течение трех лет с момента сушки (срок испытания), в столбике полужидкого 0,4%-ного агара, приготовленного на бульоне Мартена с добавлением в него 0,05 М глутамата натрия и 1 % глицерина под вазелиновым маслом в течение 3 месяцев; в пробирках со скошенным мясо-пептонным агаром - не более 14 дней.

С целью поддержания штаммов, хранящихся на агаризованных средах, необходимо проводить один раз в 3 месяца пассаж на мышах и один раз в год на песцах.

3.8. Испытание инактивированной ГОА поливалентной вакцины против

синегнойной инфекции песцов и лисиц в производственных условиях

Согласно разработанной нами технологии изготовлены опытные образцы инактивированной поливалентной гидроокисьалюминиевой вакцины для испытания на песцах. Предварительно вакцина была апробирована на полноту инактивации, стерильность, пирогенность (на 3s кроликах) и безвредность на песцах ветеринарной фермы НИИГОК им. В .А. Афанасьева. Вакцину вводили внутримышечно 9 песцам в область бедра в дозах: трем песцам по 1,0 мл, трем - по 2,0 мл и трем - по 3,0 мл. Наблюдение велось в течение 7 дней.

В 1996-1999 гг. на песцовой ферме ОАО "Крестовского пушно-мехового комплекса", неблагополучной по синегнойной инфекции, было иммунизировано внутримышечно в дозе 1,0 мл 1500 самок песца, в качестве контроля (невакщширо ванные) служили 750 самок - аналогов по возрасту и окрасу. В результате проведенной вакцинации препарат предотвратил расса-

сывание плодов у опытной группы, в то время как у самок контрольной группы был зарегистрирован приплод всего 4-5 щенков, что чаще всего было обусловлено рассасыванием плодов в первой половине беременности.

Таким образом, в результате вакцинации повысилась плодовитость самок на 0,9 щенка на основную самху и на 1,1 щенка - на благополучно ощенившуюся, по сравнению с неиммунизиро ванными самками.

Практические предложения

1. Разработана Инструкция о мероприятиях по предупреждению и ликвидации синегнойной инфекции (псевдомоноза) норок, лисиц и песцов. (Утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 29.09.98 г.).

2. Разработаны "Методические рекомендации по выделению штаммов синегнойной палочки из организма песцов и лисиц и их идентификации". Утверждены на совместном заседании Учёного совета НИИПЗК им. В.А. Афанасьева и секции пушного звероводства Россельхозакадемин 21 июня 1994 г. (протокол № 2). Они предназначены для специалистов звероводческих ферм, диагностических лабораторий, слушателей ФПК и студентов высших учебных заведений сельскохозяйственного профиля.

3. Выделены, изучены и депонированы в музее НИИПЗК им. В.А. Афанасьева 13 штаммов синегнойной палочки, дающие возможность получить нммунологическн активный специфический препарат против синегнойной инфекции.

4.На лиофилизнрованные вакцинные штаммы Pseudomonas aeruginosa получены положительные решения ВНИИГПЭ (патенты) №№ 99117149 -99117161.

5. Разработана научная концепция получения вакцины против синегнойной инфекция у песцов н лисиц ва основе использования экзопродукгов синегнойной палочки. Технология получения вакцины позволяет быстро из-

готовить серию вакцины для применения в неблагополучном хозяйстве по

согласованию с Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ.

ВЫ$ОДЫ

1. Синегнойная инфекция широко распространена среди песцов и лисиц звероводческих хозяйств, характеризуется тенденцией к увеличению ареала и сезонностью, которая тесно связана с биологическим циклом зверей - воспроизводством.

Эпнзоотологическим мониторингом за зверохозяйствами на территории бывшего СССР в 1981-98 гг. было выявлено 62 вспышки в 37 неблагополучных пунктах, что свидетельствует о стационарности болезни в ряде хозяйств.

2. Синегнойная инфекция у крупных зверей протекает в трех основных формах - септической, локальной и бессимптомной.

Клинически болезнь проявляется у самок песцов и лисиц в период беременности, сопровождается гнойными эндометритами, нарушением процессов оплодотворения и эмбриогенеза, абортами, гибелью приплода и самок в результате синегнойного сепсиса.

3. В стационарно неблагополучных по синегнойной инфекции зверохозяйст-вах регистрируется псевдомононоснтельство: среди песцов - 32 %, у лисиц - 28,4 %. При этом кишечное (ректальное) носипгельство отмечено у 16,7 - 17,0 %, вагинальное - у 9,0 - 9,8 % и смешанное -у 1,9-6,0 % животных.

4. В среднем 22 % случаев родовой патологии у песцов н лисиц ассоциируются с синегнойной инфекцией. Больные звери-псевдомононосители являются основным источником этой болезни в зверохозяйствах. Факторами передачи служат контаминировашшс синегнойной палочкой корма, оборудование зверо кухни, поилки и кормушки зверей.

5. Экономический ущерб от синегнойной инфекции слагается из пропусто-вания самок, рассасывания эмбрионов в первой половине беременности, абортов, рождения нежизнеспособного молодняка и выбраковки неблагополучно щенившихся самок. У самок песцов-псевдомононосителей наблюдается снижение плодовитости на 0,8 щенка и выхода щенков на ощенившуюся самку на 0,7; у самок лнсиц-псевдомононосителей - соответственно на 0,3 и 0,8 щенка.

6. Таксономические признаки возбудителя синегнойной инфекции песцов и лисиц характерны для Pseudomonas aeruginosa, объективными маркерами экологического постоянства которого являются пиацинино- и фаготипы.

7. Пиацинотипированием клонированных штаммов синегнойной палочки продемонстрирована сходность маркировки пигмента, 15 % из которых сказались не пиацинотипируемыми.

Зависимость литической активности пиацинолизатов от серологического варианта родительского штамма не отмечено.

8. Патогенетическая роль Pseudomonas aeruginosa у песцов и лнскц коррелирует преимущественно с серологическими вариантами микроба 01,03,05,06,011 и 016.

Контаминация кормов псездомонадами связана с этими же серовграми.

9. Патогенность изолированных из клинического н патологического матер игла культур синегнойной палочки обусловлена биосинтезом эюопродуктов (экзотоксина А, протеазы, зластазы, внеклеточной слизи) и адгезивной активностью, что не коррелирует с серологическим профилем микроба.

10. Определены оптимальные условия повышения активности внеклеточных факторов вирулентности возбудителя синегнойной инфекции зверей

(токсина, протеаз, слизи н адгезинов), основанные на подборе соответствующих культуральных сред и добавок.

11. Инактивация жизнеспособности микробных клеток и факторов их патогенности достигается с помощью димерэталенимина (ДЭИ) при концентрации препарата 0,5 %, рН 7,2, экспозиции 18 часов и нейтрализацией тиосульфатом натрия в конечной концентрации 1,5 %.

12. При сорбции на гидроокиси алюминия и особенно на липосомах превентивная акгавность препарата у внеклеточных факторов патогенное™ синегнойной палочки повышается.

13. Экспериментально обоснована научная концепция защиты пушных зверей от синегнойной инфекции биопрепаратом из внеклеточных факторов патогенное™ возбудителя, который создает защиту у 73-100 % белых мышей от гомологичных и гетерологичных штаммов микроба и улучшает "результаты воспроизводства песцов за счет увеличения плодовитости на 0,9 щенка и выхода молодняка на благополучно ощенившуюся самку на 1,1 гол.

Список основных работ, опубликованных по материалом диссертации

1. Литвинов О.Б., Комарова Г.А., Кириллов А.К., Майоров А.И. Псев-домоноз песцов // М., ж. Кролиководство и звероводство, 1988, № 4, с.46.

2. Литвинов О.Б. Биологические свойства синегнойной палочки. Сообщение I // Сб. научных трудов НИИПЗК - Актуальные проблемы науки в области пушного звероводства и пантового оленеводства., М., 1990, т. 37, с. 132-136.

3. Литвинов О.Б., Комарова Г.А. Биологические свойства синегнойной палочки. Сообщение П // Сб. научных трудов НИИПЗК - Актуальные проблемы науки в области пушного звероводства и пантового оленеводства., М., 1990, т. 37, с. 137-141.

4. Литвинов О.Б., Комарова ГА., Семнкрасова А.Н. Биологические свойства синегнойной палочки. Сообщение Ш // Сб. научных трудов НИИПЗК - Актуальные проблемы науки в области пушного звероводства и пантового оленеводства., М., 1990, т. 37, с. 142-145.

5. Толстенко Л .В., Снытко В.С., Коддаева ЕМ., Литвинов О.Б., Рютова В.П. Технология песцеводства // М, 1992, с. 59-67.

6. Литвинов О.Б., Комарова ГА Новые данные о псевдомонозе пушных зверей // Инф. журнал Новости звероводства, М., 1993, № 2, с. 53-61.

7. Литвинов О.Б., Рютова В.П., Семнкрасова А.Н. Методические рекомендации: Выделение штаммов синегнойной палочки из организмы песцов и лисиц и их идентификация // М., 1994,18 с.

8. Литвинов О.Б., Рютова В.П. Патогенные свойства штаммов синегнойной палочки // М., ж. Кролиководство и звероводство, 1995, № 6, с. 23.

9. Литвинов О.Б., Квартникова Е.Г., Геллер В.И., Жукова Н.М., Цветко-ва Е.Т. // Правила взятия и пересылки патологического материала от пушных

зверей и кроликов на инфекционные и инвазионные заболевания н проб кормов на доброкачественность // М, 1996,12 с.

10. Литвинов О.Б. Протеолитическая активность штаммов синегнойной палочки // М., ж. Кролиководство и звероводство, 1997, № 5, с. 26.

11. Литвинов О.Б. Синегнойная палочка, выделенная от песцов и лисиц // М., ж. Кролиководство и звероводство, 1997, № 3, с. 27-28.

12. Литвинов О.Б. Чувствительность синегнойной палочки (Р. aeruginosa), выделенная от песцов и лисиц, к антибиотикам // М., Информационный журнал Новости звероводства, 1997, № 2-3, с. 40-42.

13. Литвинов О.Б. Изучение токсигенности штаммов синегнойной палочки, выделенных от песцов и лисиц // М., Информационный журнал Новости звероводства, 1997, № 2-3, с. 42-47.

14. Литвинов О.Б. Протеолитическая активность штаммов синегнойной палочки, выделенных от песцов и лисиц // М, Информационный журнал Новости звероводства, 1997, № 2-3, с. 47-52.

15. Литвинов О.Б. Экстрацеллюлярная (внеклеточная) слизь н адгезивная активность штаммов P. aeruginosa, выделенных от песцов и лисиц // М., Информационный журнал Новости звероводства, 1997, № 2-3, с. 52-57.

16. Литвинов О.Б. Пиоцинирсвание штаммов синегнойной палочки, выделенных от песцов и лисиц // М., Информационный журнал Новости звероводства, 1997, № 2-3, с. 57-61.

17. Литвинов О.Б. Адгезивная активность штаммов синегнойной палочки // Тез докл. Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию НИИПЗК им. В А. Афанасьева. Проблемы пушного звероводства и кролиководства., Моск. обл., Родники, 1997, с. 88-90.

18. Литвинов О.Б. Экстрацеллюлярная слизь синегнойной палочки // Тез докл. Всероссийской научно-практической конференции, посвященной

65-леппс НИИПЗК им. В .А. Афанасьева. Проблемы пушного звероводства и кролиководства., Моск. обл., Родники, 1997, с. 90-92.

19. Литвинов О.Б. Протеолитическая активность штаммов синегнойной палочки. Сообщение I. Щелочная протеаза. // Тез докл. Всероссийской науч-но-пракгической конференции, посвященной 65-летию НИИПЗК им. В.А.Афанасьева. Проблемы пушного звероводства и кролиководства., Моск. обл., Родники, 1997, с. 92-93.

20. Литвинов О.Б. Протеолитическая активность штаммов синегнойной палочки. Сообщение П. Активность эластазы. // Тез докл. ВсерсЛссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию НИИПЗК им. В.А.Афанасьева. Проблемы пушного звероводства и кролиководства., Моск. обл., Родники, 1997, с. 93-96.

21. Литвинов О.Б., Рютова В.П., Семикрасова А.Н. Нозоареал синегнойной инфекции // Тез докл. Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию НИИПЗК им. В.ААфанасьева. Проблемы пушного звероводства и кролиководства., Моск. обл., Родники, 1997, с. 96-99,

22. Литвинов О.Б., Рютова В.П., Семикрасова А.Н. Формы проявления синегнойной инфекции и ее течение у лисиц и песцов // Тез докл. Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию НИИПЗК им. В.А.Афанасьева. Проблемы пушного звероводства и кролиководства., Моск. обл., Родники, 1997, с. 99-100.

23. Литвинов О.Б., Конопаткин А_А., Минасуев Ю.Н. Определение па-тогенности синегнойной палочки, выделенной от песцов и лисиц // Тез докл. на 2-ой Международной научно-практической конференции. Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции. М„ 1997, часть 2, с. I77-I7S.

24. Литвинов О.Б. Экстрацеллюлярная слизь и адгезивная активность штаммов Ps. acniginosay/M., ж. Ветеринария, 1998, № 8, с. 21-23.

25. Литвинов О.Б. Пиоцинотипирование штаммов Ps. aeruginosa. // М., ж. Ветеринария, 1998, № 12, с.23.

26. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 4992) используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Балакирев H.A.,

в

Литвинов О.Б., Семикрасова А.Н. Решение о выдаче патента № 99117149/13, 1999.

27. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 5132, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Тинаева Е.А., Литвинов О.Б , Семикрасова А.Н. Решение о выдаче патента № 99117150/13, 1999.

28. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 5002, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Тинаева ЕА., Литвинов О.Б., Семикрасова А.Н. Решение о выдаче патента № 99117151/13, 1999.

29. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 499j, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Литвинов О.Б., Семикрасова А.Н. Решение о выдаче патента № 99117152/13,1999.

30. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 4762, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Литвинов О.Б., Семикрасова А.Н. Решение о выдаче патента № 99117153/13,1999.

31. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa ЛО1, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Литвинов О.Б., Семикрасова А.Н. Решение о выдаче патента № 99117154/13,1999.

32. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 5292, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Литвинов О.Б., Семикрасова АЛ., Ригель И.А. Решение о выдаче патента № 99117155/13, 1999.

33. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 529j, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Литвинов О.Б., Семикрасова А.Н., Ригель Л.А. Решение о выдаче патента № 99117156/13, 1999.

34. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa ЛОз, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Литвинов О.Б., Семикрасова А.Н., Ригель Л.А. Решение о выдаче патента № 99117157/13, 1999.

35. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 514j, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Тинаева Е.А., Литвинов О.Б., Семикрасова А,Н. Решение о выдаче патента № 99117158/13, 1999.

36. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 5211, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Балакирев H.A., Литвинов О.Б., Семикрасова А.Н. Решение о выдаче патента № 99117159/13, 1999.

37. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 527|, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Балакирев H.A., Литвинов О.Б., Семикрасова А.Н. Решение о выдаче патента № 99117160/13, 1999.

38. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 524u используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей. Балакирев H.A., Литвинов О.Б., Семикрасова А.Н. Решение о выдаче патента № 99117161/13, 1999.