Тест-системы на основе иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу болезни Ауески

Яснева, Елена Анатольевна

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Тест-системы на основе иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу болезни Ауески

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Яснева, Елена Анатольевна Владимир 2008 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Тест-системы на основе иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу болезни Ауески

Пи правах рукописи

ЯСНЕВА Елена Анатольевна

ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ БОЛЕЗНИ АУЕСКП

16.00.03 «Ветеринарная микробиология, нирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой пенсии кандидата исгерипарпых наук

У*

Т0

Владимир-2008

003455489

Работа выполнена в федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир.

Научный руководитель -доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник ДИЕВ Вячеслав Иванович Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

СТРИЖАКОВ Александр Анатольевич ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН (ГНУ ВНИИВВиМ) - кандидат ветеринарных наук КУКУШКИН Сергей Анатольевич ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Ведущая организация ГПУ «Всероссийский научно-исследовательский

технологический институт биологической промышленности» (Г11У «ВНИТИШI»)

Защита состоится « декабря 2008 г. в 10 часов на заседании сове 1а по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 мри ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, 1. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Автореферат разослан ноября 2008 г. Ученый секретарь совета по защите док торских и кандидатских диссертаций кандидат биологических наук, /

старший научный сотрудник Г.М. Семенова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Болезнь Ауески (БА) вызывается вирусом псевдобешенства, который относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae. Основным фактором, определяющим эпизоотологические особенности вируса болезни Ауески, является его способность оставаться в латентной форме. Реактивация вируса происходит под воздействием различных факторов (стрессы, гормональные сдвиги, травмы и пр.) и, вероятно, связана с подавлением Т-клеточного иммунитета [В.А. Сергеев и др., 2007].

Болезнь Ауески - остро протекающее в виде эпизоотии и спорадических случаев контагиозное вирусное заболевание сельскохозяйственных (в основном свиней) и диких животных, пушных зверей и грызунов, наносящее значительный экономический ущерб странам с развитым свиноводством, в том числе и России.

Экономический ущерб при возникновении болезни Ауески обусловлен большим отходом поросят, малой эффективностью при откорме и непригодностью в качестве племенных животных. Заболевание свиноматок приводит к резкому нарушению воспроизводства стада из-за абортов и рождения нежизнеспособных поросят [В.Н. Сюрин и др., 1998; П.В. Малярец и др., 1993; В.А. Сергеев и др., 2007].

Анализ эпизоотической ситуации показывает, что болезнь Ауески широко распространена в мире. За период с 2000 по 2007 гг. заболевание зарегистрировано в 72 странах мира. Наибольшее количество стран, где зафиксированы вспышки БА было в Европе - 38 (Белоруссия, Франция, Болгария, Испания, Италия, Польша, Португалия, Россия, Украина, Бельгия, Нидерланды и др.), в Азии - 20 (Япония, Филлипины, Китай, Корея и др.), в Америке - 13 (Куба, Мексика, Аргентина, Боливия, Бразилия и пр.).

Российская Федерация стационарно неблагополучна по болезни Ауески. За период с 1998 по 2007 гг. было зарегистрировано 87 случаев заболевания.

выявления и забоя больных и подозрительных в заболевании свиней [G. Wittman, 1991; G. Wittman, 1989]. Такие программы искоренения невозможны в странах и областях с высоким процентом инфицированных животных, так как это приведет к огромным экономическим потерям. Очевидно, что единственно возможным способом решения проблемы искоренения болезни Ауески в таких странах является выявление и выбраковка инфицированных животных без прекращения вакцинации. Такие мероприятия проводятся с использованием маркированных вакцин и дискриминирующих тестов, позволяющих дифференцировать вакцинальный и инфекционный иммунитет.

Среди маркированных вакцин наиболее широкое распространение получили gE-негативные вакцины [В. Lugovic et al., 1986; R.J.M. Moorman et a!., 1990]. Соответственно, дискриминирующие тесты, направленные на выявление антител к гликопротеину gE и дифференцирующие вакцинированных и инфицированных животных, также нашли наиболее широкое применение и их разработке и совершенствованию уделяется особое внимание [T.G.Kimman et al., 1996; М. Banks et al., 1996; J. Grom et al., 1995; M. Kit et al., 1991; Q. J. Tonelli, 1991].

Серологическая диагностика болезни Ауески является наиболее распространенной, как в аспекте ретроспективного отслеживания возможных вспышек заболеваний, так и оценке эффективности специфической профилактики.

Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к вирусу БА в сыворотках крови свиней, а также присутствие вируса и его антигенов в биологических материалах, основано на иммуноферментном анализе (ИФА) [В.Т. Сакович и др., 1989; М. Banks, 1989; М. Banks et а!., 1995; J. Grom et al., 1995; M.W. Mellencamp et al., 1989; P. Quist et al., 1989]. Достоинствами ИФА являются высокая чувствительность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов.

На основе ИФА разработаны и описаны различные тест-системы для диагностики БА (T.G.Kimman et al., 1996; М. Banks et al., 1995; M. Eloit et al., 1989; M.W. Mellencamp et al., 1989; M. Kit et al., 1991; Q.J. Tonelli, 1991]. При этом все известные наборы, позволяющие дифференцировать вакцинальный и

инфекционный иммунитет основаны на использовании гликопротеинов или моноклональных антител, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований. Таким образом, усовершенствование тест-системы для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К», которая обладала бы достаточной чувствительностью и специфичностью и при этом имела бы меньшую себестоимость является актуальной. Кроме этого, представляется целесообразным разработать отечественную тест-систему на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющую определять точный титр тестируемой сыворотки по единственному фиксированному разведению на основе уравнения связи с S/P - показателем, что помогло бы существенно повысить производительность анализа за счет увеличения количества исследуемых проб сывороток.

Цел и и задачи исследований. Целью настоящих исследований было усовершенствование тест-системы на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К», а также - разработка отечественной тест-системы на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющей проводить оценку титра тестируемой сыворотки по единственному фиксированному разведению на основе уравнения связи с S/P - показателем. В рамках поставленной цели были определены следующие задачи:

- отработать метод получения высокоочищенных и концентрированных антигенов вируса БА штаммов «ВК» и «К»;

- получить специфические сыворотки крови свиней, содержащие антитела к штамму «ВК» и «К»;

- получить сыворотки крови свиней, одновременно содержащих антитела к штамму «ВК» и «К»;

- определить оптимальную концентрацию и условия взаимодействия компонентов реакции;

- сопоставить результаты исследования сывороток крови свиней с помощью разработанной тест- системы на основе непрямого варианта ИФА с результатами

коммерческого набора фирмы IDEXX (США) и оценить чувствительность и специфичность разработанного тсста;

- для тест-системы с использованием штамма «ВК» определить допустимые величины показателей оптической плотности для отрицательного и положительного контролей; установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции; определить величину разведения сыворотки, S/P-показатель которой будет использован для вычисления ее титра; построить уравнение связи между S/P - показателем фиксируемого разведения и величиной титра сыворотки;

- с помощью разработанных тест-систем провести исследования сывороток крови свиней на наличие антител к вакцинному и полевому штаммам вируса болезни Ауески.

Научная повита исследований. Усовершенствована тест-системы для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К», а также разработана отечественная тест-система на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющая определять титр тестируемой сыворотки по одному рабочему разведению на основе уравнения связи с S/P - показателем. При этом отработан метод получения антигенов вируса болезни Ауески штаммов «ВК», «К» и получены специфические гипериммунные сыворотки крови свиней, определены оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции, а также установлены величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции, определена величина разведения сыворотки, S/P-показатель которой будет использован для вычисления ее титра, построено уравнение связи между S/P — показателем фиксируемого разведения и величиной титра сыворотки для расчета титра антител при тестировании проб в одном разведении.

Сопоставлены результаты исследования сывороток крови свиней с помощью усовершенствованной тест- системы на основе твердофазного непрямого варианта

ИФА с результатами коммерческого набора фирмы IDEXX (США) и проведена оценка чувствительности и специфичности предлагаемого теста.

Практическая значимость исследований. Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методики:

- «Методика концентрирования и очистки штамма «ВК» вируса болезни Ауески», 2008 г.;

- «Методика получения иммуноглобулинов сывороток крови кроликов на маркированный штамм «ВК» и эпизоотический штамм «К» вируса болезни Ауески», 2008 г.;

- «Методика определения уравнения линейной регрессии для вычисления титра антител к вирусу болезни Ауески в сыворотках крови свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа способом одного разведения», 2008 г.

Результаты научных исследований использованы при составлении СТО 00495527 - 0006 - 2005 «Вирусвакцина против болезни Ауески свиней и овец сухая культуральная из маркированного штамма «ВК»», утвержденного заместителем руководителя Россельхознадзора 07.08.2007 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

- усовершенствованная тест-система для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К»;

- отечественная тест-система на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющая проводить оценку титра тестируемой сыворотки по единственному фиксированному разведению на основе уравнения связи с S/P - показателем

- результаты использования тест-систем на основе твердофазного непрямого варианта ИФА при исследовании сывороток крови свиней на наличие антител к вакцинному и полевому штаммам вируса болезни Ауески.

Публикация научных исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы, в т.ч. 2 работы в издании по перечню ВАК.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации доложены и опубликованы в материалах международной научно-практической

конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященной 50-летию ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», (Владимир, 2008 г.) и докладывались на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с научным сотрудником Г.А. Блотовой, к.в.н. А.В. Константиновым, к.б.н. Т.И. Корпусовой, а также сотрудниками лабораторий болезней свиней и диагностики болезней КРС и свиней, за что автор выражает им искреннюю благодарность.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах, иллюстрирована 19 таблицами и 21 рисунками. Список использованной литературы включает 234 источника, из них 159 на иностранных языках 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

Вирусы. В работе использовали следующие штаммы вируса болезни Ауески:

- эпизоотический контрольный штамм «К», выделенный от черно-бурых лисиц в зверосовхозе г. Кировокана в 1970 году;

- вакцинный штамм «ВК», делеционный мутант по гликопротеину полученный в ФГУ «ВНИИЗЖ» в 1997 году из слабовирулентного штамма «ВагАа», выделенного от свиней, пассированием и адаптацией к суспензионной культуре клеток ВНК-21.

Животные. В работе использовали кроликов массой 2 - 3 кг (6 гол.), подсвинков массой 20-50 кг (3 гол.) и свиней массой 60 - 80 кг (6 гол.).

Сыворотки. Материалом для исследования служили 280 проб сывороток крови свиней с различным уровнем антител к вирусу болезни Ауески.

Культуры клеток. Основные вирусологические исследования выполнены на перевиваемой линии клеток ВНК-21.

Питательные среды. Для культивирования перевиваемых культур клеток использовали полусинтетическую питательную среду ПСП по стандартной прописи (рН - 7,4, производства ФГУ «ВНИИЗЖ»), для отмывания монослоя клеток применяли раствор Хенкса (рН - 7,2, производства ФГУ «ВНИИЗЖ»).

Коммерческие наборы: Использовали коммерческие диагностические наборы Pseudorabies Virus gE Antibody Test Kit и Pseudorabies Virus gB Antibody Test Kit фирмы IDEXX, USA.

Культивирование вируса болезни Ауески. Культивирование вируса болезни Ауески проводили стационарным способом на 2-3-суточной перевиваемой культуре клеток ВНК-21, выращенной в клинских матрасах с хорошо сформировавшимся монослоем. Заражение проводили с предварительной адсорбцией вируса на клетках. С этой целью вирус инокулировали в матрасы из расчета 0,01 ТЦД5о на клетку после удаления ростовой среды и трехкратного промывания монослоя раствором Хенкса и инкубировали в термостате при 37±0,5°С в течение 1 часа с последующим внесением поддерживающей питательной среды ПСП. Контролями служили матрасы с неинфицированной культурой клеток. Репродуктивную активность вируса оценивали по времени появления цитопатического действия (ЦПД), интенсивности его развития и инфекционной активности вируса. Сбор вирусного материала проводили при проявлении ЦПД на 70-90% монослоя с последующим промораживанием вирусного материала при температуре минус 40°С.

Определение инфекционной активности вируса. Определение инфекционной активности вируса болезни Ауески проводили с помощью титрования на перевиваемой культуре клеток ВНК-21. Титр вируса расчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД50/см3.

Получение антигенов вируса болезни Ауески. Антиген вируса болезни Ауески штамма «ВК» получали согласно «Методике концентрирования и очистки маркированного штамма «ВК» вируса болезни Ауески» (ФГУ «ВНИИЗЖ, 2008) методом дифференциального центрифугирования, осаждения ПЭГом с молекулярной массой 6000, очистки высокоскоростным центрифугированием через 20% сахарозу с использованием неионного детергента твин-20.

Антиген вируса болезни Ауески штамм «К» получали аналогичным способом.

Получение гипериммунных сывороток крови свиней. Специфические гипериммунные сыворотки крови свиней получали методом интрацеребрального заражения и внутримышечного введения животным лиофилизированного

культурального вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К» с активностью 8,33 lg ТЦД5о/см3 и 10,0 lg ТЦД50/см3 соответственно. На первом этапе животных заражали интрацеребрально в объеме 0,2 см5 двукратно с интервалом 7 дней, далее проводили двукратную внутримышечную инъекцию вируса в объеме 5,0 см3 в область внутренней поверхности бедра.

Получение гипериммунных сывороток крови кроликов. Специфические сыворотки крови кроликов на штаммы «ВК» и «К» вируса болезни Ауески получали методом трехкратной иммунизации кроликов. Для гипериммунизации животных применяли инактивированные (0,2%-ным димером этиленимина) концентрированные и очищенные антигены вируса болезни Ауески, которые эмульгировали с адыовантом Фрейнда в соотношении 1:1. На первом этапе иммунизации эмульсию вводили в мякиши подушечек задних конечностей кролика в объеме 0,5 см3, через 7 дней - в подколенные лимфоузлы в объеме 1,0 см3 и спустя неделю - подкожно в объеме 1,0 см3. На 10 день после последней инъекции кроликов обескровливали и отбирали пробы крови.

На данном этапе получали также нормальные сыворотки крови кроликов, не содержащие антител к вирусу болезни Ауески, которые использовали в качестве отрицательного контроля при постановке ИФА.

Получение иммуноглобулинов сывороток крови кроликов. Специфические иммуноглобулины сывороток крови кроликов получали согласно разработанной нами «Методике получения иммуноглобулинов сывороток крови кроликов на маркированный и эпизоотический штаммы вируса болезни Ауески» (ФГУ «ВНИИЗЖ», 2008) способом трехкратного осаждения белков сыворотки крови насыщенным раствором сульфата аммония.

Иммуноферментпый анализ. В работе применяли твердофазный непрямой вариант иммуноферментного анализа, оптимальные условия постановки которого определяли экспериментально. Результаты реакции учитывали на спектрофотометре - ридере при длине волны 492 нм.

Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки результатов исследований использовали общепринятые методы, рекомендованные Гланцем С. (1999) и другими авторами, а также компьютерные программы Microsof Office Exel и Statistica: Basic Statistic and Tabes.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Культивирование вируса болезпн Аусск-н

Для культивирования штамма «ВК» и «К» вируса болезни Ауески использовали перевиваемую культуру клеток ВНК-21.

Титр вируса болезни Ауески штамма «ВК» варьировал, в зависимости от времени его репродукции в пределах 6,6 - 8,33 ^ ТЦД50/см3. Электронно-микроскопический анализ показал, что наибольшее количество полностью сформировавшихся вирионов присутствовало в вирусном материале после 70 часов культивирования, концентрация вирусных частиц при этом составляла 108,5частиц/см3.

Максимальное накопление инфекционной активности вируса болезни Ауески штамма "К" происходило через 14 и 19 ч (10,0 ^ ТЦД50 /см3) после заражения клеточной культуры ВНК-21. При более продолжительном экспонировании (24, 28 ч) происходило снижение титра вируса до 8,66 и 7,5 1ёТЦД50/см3

2.2.2. Получение антигенов вируса болезни Ауески штаммов «ВК», «К» и специфических иммуноглобулинов сывороток крови кроликов

В качестве исходного материала для получения антигенов вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К» использовали вируссодержащую суспензию, которую отделяли от клеточного детрита низкоскоростным центрифугированием при 1000 об/мин в течение 15-20 мин. Осаждение вирусного белка проводили с помощью полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 в концентрации 10% от общего объема вируссодержащей суспензии с добавлением натрия хлористого до 0,5 М. После полного растворения внесенных компонентов вируссодержащую суспензию выдерживали при 4-6 С в течение 18 ч.

Формирование осадка осуществляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 80 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировапи в 0,02 М натрий-фосфатном буферном растворе с 0,15 М ЫаС1 (рН 7,5) и 0,1% твином-20 (ЗФРТ) в объеме 1/100 от первоночального объема суспензии и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость -первый элюат — осторожно сливали, осадок ресупендировали в ЗФРТ 1/100 от исходного объема и повторно центрифугировали в том же режиме. В аналогичном

режиме обработки получали второй и третий элюаты, которые объединяли и очищали центрифугированием через 20% сахарозу, приготовленную на ЗФРТ, в течение 2 ч при 20000 об/мин. Полученный осадок - продукт очистки — суспензировали в минимальном количестве ЗФР.

Электронно-микроскопическими исследованиями установлена в 1-м элюате высокая концентрация балластных белков и относительно невысокая - вирусных частиц (108 частиц/мл). Во 2-м элюате концентрация вирионов составляла 109 частиц/мл при степени очистки суспензии от балластных белков в пределах 90-95%. В данном элюате вирусные частицы, в основном, были представлены суперкапсидными оболочками и незначительным количеством капсидов в суперкапсидной оболочке (рис. 1). Активность полученных антигенов в ИФА составляла 1:1000000.

Рис.1. Электронная фотография негативно контрастнрованных вирионов маркированного штамма вируса болезни Ауески (увеличение х 75000; препарат концентрирован в 200 раз)

При проведении электрофореза была установлена чистота вирусных антигенов (рис. 2).

116

66.2 45 35 "' 25 — 18.4

та 14,4

Sé*

Рис. 2. Электрофореграмма белков вируса болезни Ауески

Примечание: 1- штамм «ВК» ВБА, 2 - штамм «К» ВБА; 3- маркер

Подтверждением специфичности полученных антигенов вируса болезни Ауески являлось их взаимодействие в нИФА с гетерологичными вирусспецифическими сыворотками к инфекционному ринотрахеиту КРС и оспы овец на уровне фона.

Для получения иммуноглобулинов гипериммунные сыворотки крови кроликов центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин с целью очистки сывороток крови от липопротеинов и балластных белков. Полученную надосадочную жидкость разводили в 0,15М ЫаС1 в соотношении 1:1. Далее вносили по каплям при постоянном перемешивании 10% раствор ПЭИ до наступления флокуляции белков и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин. Затем проводили трехкратное осаждение глобулинов сывороток крови насыщенным раствором сульфата аммония (40%-, 35%- и 33%-ное насыщение).

Активность полученных иммуноглобулинов крови определяли в непрямом варианте иммуноферментного анализа по общепринятой методике. Специфическая активность иммуноглобулинов сывороток крови кроликов для штамма «ВК» составила 1:128000, для штамма «К» - 1:64000-1:128000.

Полученные высокоактивные иммуноглобулины использовали для определения активности вируссодержащих суспензий и культуральных антигенов штаммов «ВК» и «К» вируса болезни Ауески.

2.2.3. Получение специфических гипериммунных сывороток крови свиней Получение гипериммунных сывороток крови свиней на маркированный и эпизоотический штаммы вируса болезни Ауески. Для получения специфических сывороток свиней применяли маркированный и эпизоотический штаммы вируса болезни Ауески с активностью 8,33 ^ ТЦД50/см3 и 10,0 ^ ТЦЦ50/см3 соответственно. Для гипериммунизации использовали свиней в количестве 6 голов массой 80 кг, полученных из частного сектора и не имеющих антител к вирусу болезни Ауески (серологический статус подтвержден в коммерческом наборе ГОЕХХ). Свиньи содержались в разных боксах по 3 головы. На первом этапе животных заражали интрацеребралыю в объеме 0,2 см3 двукратно с интервалом 7 дней, далее проводили двукратную внутримышечную инъекцию вируса в объеме 5,0 см3 в область внутренней поверхности бедра. От животных отбирали пробы

крови и исследовали в непрямом варианте иммуноферментного анализа. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Таблица 1

Результаты исследований специфической активности сывороток крови свиней в непрямом варианте ПФА

Штамм, используемый для иммунизации Титр антител

№ дни после инъекции суспензии вируса

п/п до заражения интрацеребральной внутримышечной

9 21 28

1 <1:10 1 20 1:25600 1:51200

2 «ВК» <1:10 1 10 1:12800 1:51200

3 <1:10 1 10 1:12800 1:40960

4 <1:10 1 20 1:640 1:3200

5 «К» <1:10 1 10 1:1280 1:10240

6 <1:10 1 10 1:1280 1:6400

Приведенные в табл. 1 данные свидетельствуют, что титр специфических антител через 9 дней после интрацеребрального заражения составил 1:10-1:20 для маркированного и эпизоотического штамма, через 21 день после внутримышечного введения - 1:12800-1:25600 и 1:640 - 1:1280, через 28 дней - 1:40960 - 1:51200 и 1:3200-1:10240 соответственно.

Серологический статус сывороток был подтвержден при тестировании их с использованием коммерческого набора фирмы ШЕХХ.

Получение гипериммунных сывороток крови свиней, одновременно содержащих антитела к маркированному и эпизоотическому штамму.

С этой целью свиней в количестве 4 голов массой 60 кг вакцинировали согласно наставлению по применению маркированной вакцины против болезни Ауески, изготовленной в ФГУ «ВНИИЗЖ». Через 21 день после иммунизации у животных отбирали пробы крови и подвергали интрацеребральному заражению методом, описанным выше. Через 14 дней после заражения отбирали пробы крови и исследовали в нИФА. Результаты исследований представлены в табл. 2.

Из данных представленных в табл. 2 видно, что титр антител с гомологичным антигеном через 21 день после вакцинации был значительно выше, чем с гетерологичным и находился в диапазоне от 1:640 до 1:2560, а с гетерологичным антигеном - от 1:40 до 1:160. Через 14 дней после заражения в крови вакцинированных животных титр антител был - 1:1280 - 1:12800 и 1:5120 -

1:25600, соответственно. Таким образом, при заражении вакцинированных животных происходило значительное увеличение активности сывороток.

Таблица 2

Результаты исследования активности сывороток крови свиней в непрямом варианте ИФА

№№ жнв-х Характеристика сывороток против штамма

«ВК» «К»

1 через 21 день после вакцинации (шт. «ВК») 1:1280 1:80

2 1:2560 1:160

3 1:2560 1:160

4 1:640 1:40

1 через 35 дней после вакцинации (шт. «ВК») и 14 дней после заражения (шт. «К») 1:6400 1:25600

2 1:12800 1:6400

3 1:10240 1:5120

4 1:1280 1:10240

2.2.4. Усовершенствование тест-системы для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Аусски штаммов «ВК» н «К» 2.2.4.1. Оптимизация условий постановки твердофазного непрямого варианта нммуноферментного анализа Оптимизация условий иммобилизации антигенов. Исследовали влияние температуры и времени экспозиции на сорбцию антигенов в лунках планшета. С этой целью в 3-х повторностях испытывали режимы иммобилизации в течение 3, 6, 9, 16 часов при температуре 4°С и 1; 1,5; 2; 2,5 часов - при 37°С. Процесс адсорбции антигена оценивали по интенсивности реакции с контрольными вирусспецифическими и негативными сыворотками в серийных разведениях. Определяли средние величины P/N, где: Р и N - показатели оптической плотности положительной и отрицательной контрольной сывороток.

В результате проведенных исследований установлено, что целесообразнее использовать режим иммобилизации антигена в течение 2,5 часов при температуре 37°С или 16 часов при температуре 4°С.

Определение оптимального времени экспозиции исследуемых сывороток. Процесс образования стабильных иммунных комплексов в тест-системе ИФА является сложным процессом и требует определенного времени, для установления

которого в 5-ти повториостях оценивали интенсивность реакции по Р/Ы-показателям в зависимости от времени инкубирования (от 10 до 90 мин) специфических и отрицательных сывороток в серийных разведениях при температуре 37°С. Установлено, что Р/Ы-показатели в диапазоне от 10 до 60 мин возрастали, а далее стабилизировались. Наблюдаемый эффект был зафиксирован для сывороток, обладающих различным уровнем специфической активности. На этом основании 60-минутную экспозицию сывороток приняли достаточной для достижения максимальной и стабильной реакции.

Определение оптимальных условий блокирования. С целью снижения неспецифической реакции - сорбции конъюгата на иммунный и неспецифический комплекс антиген-антитело в 5-ти повториостях были проведены исследования по уменьшению фоновых «помех» при использовании сухого обезжиренного молока, дрожжевого экстракта, бычьего сывороточного альбумина (БСА) и нормальной сыворотки лошади в концентрациях 1,5, 10 % в буферном растворе для разведения сывороток крови свиней и конъюгата. Установлено, что использование нормальной сыворотки лошади в буферном растворе для разведения конъюгата уменьшало фоновые «помехи», на что указывали максимальные значения Р/Ы-показателей, которые соответствовали для концентрации 1% - 6,1; 5% - 5,0; 10% - 5,2 при иммобилизации планшетов штаммом «ВК», и 5,5; 4,7; 5,0 при иммобилизации планшетов штаммом «К», соответственно.

На основании этих данных в последующих исследованиях блокирование при использовании антигенов штаммов «ВК» и «К» осуществляли 1% раствором нормальной сыворотки лошади в буферном растворе для разведения конъюгата.

2.2.5. Практическое применение усовершенствованной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления антител к вирусу болезни Ауески

В целях испытания возможностей предлагаемой тест-системы исследовали пробы сывороток крови свиней, направляемые для анализа в ФГУ «ВНИИЗЖ» из свиноводческих хозяйств России в период с 2001 по 2006 гг.

Определение уровня колостральных антител у поросят, полученных от свиноматок, иммунизированных вирусвакциной против болезни Ауески. Определение колостральных антител в крови поросят, полученных от свиноматок,

иммунизированных вирусвакциной против болезни Ауески из штамма «ВК», проводили с использованием нИФА по методике описанной выше, а также набора фирмы ШЕХХ. С этой целью было отобрано 8 свиноматок и 18 поросят в возрасте от 8 до 36 дней, полученных от этих свиноматок. Исследования сывороток крови проведены через 45 дней после вакцинации свиноматок, принадлежащих СПК «Элеком» Республики Мордовия.

Результаты исследований сывороток крови поросят, показали что, в основном, уровень колостральных антител в крови поросят против вируса БА штамма «ВК» зависел от уровня антител в крови свиноматок. Так, например, если в группах животных 1 - 4 титр антител в крови свиноматок был 1:100 - 1:200, то в крови поросят он соответствовал 1:100 - 1:800, а в группах 5-7, если титр антител в крови свиноматок был 1:800 - 1:3200, то в крови поросят уровень колостральных антител был 1:800 - 1:1600, соответственно. Активность сывороток крови от вышеперечисленных групп с антигеном штамма «К» вируса БА находилась на уровне фоновой реакции. Сыворотки крови свиноматки и поросят 8 группы были активны с антигенами штаммов «ВК» и «К», при этом титр антител составлял 1:400-1:6400 и 1:200 - 1:1600, соответственно, чго возможно связано с контактом животных с полевым вирусом.

Полученные данные были подтверждены при исследовании сывороток крови свиней с использованием коммерческого набора ШЕХХ.

Вышеизложенное свидетельствует о чувствительности и специфичности метода нИФА при выявлении поствакцинальных антител - в крови свиноматок, и колостральных - в крови поросят.

Выявление и определение концентрации антител к вирусу болезни Ауески. С этой целью были тестированы сыворотки крови хряков-производителей, основных и ремонтных свиноматок, а также свиней откормочной группы. Всего было исследовано 256 сывороток крови свиней.

Исследуемые сыворотки были параллельно тестированы с использованием коммерческого набора фирмы ШЕХХ, США. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты исследований сывороток крови свиней с помощью предлагаемого _варианта ПФА и коммерческого набора фирмы ШЕХХ_

нИФА (ФГУ «ВНИИЗЖ») ИФА - ГОЕХХ

сыворотки с наличием антител только к вакцинному штамму сыворотки с наличием антител к полевому штамму всего

сыворотки с наличием антител только к вакцинному штамму 191 3 194

сыворотки с наличием антител к полевому штамму 36 26 62

всего 227 29 256

Согласно полученным данным была установлена чувствительность, специфичность и совпадаемость результатов нИФА относительно набора фирмы ГОЕХХ, рассчитанные по методу, представленному в учебнике по диагностике вирусных болезней животных, 3. Лярски:

191

1. Чувствительность =-х100% = 84,1 %,

227

2. Специфичность = — х100% = 89,6%

3. Совпадаемость результатов = ^ *+ х100% = 84,7 %

256

Таким образом, чувствительность разработанной тест-система на основе непрямого варианта ИФА относительно тест-ситемы ГОЕХХ составила 84,1%, специфичность - 89,6%, совпадаемость результатов - 84,7%.

2.2.6. Разработка отечественной тест-системы на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющей проводить оценку титра тестируемой сыворотки по единственному фиксированному разведению на основе уравнения связи с в/Р — показателем.

Выбор величины разведения сыворотки, позволяющей прогнозировать оценку титра антител. Изучали возможность использования принципа расчета титра антител на основе 8/Р-показателя, установленного для единственного разведения испытуемой сыворотки. С этой целью исследовали сыворотки с разным уровнем антител к вирусу болезни Ауески, определяли значения показателей

оптической плотности соответственно испытанным разведениям, исследовали их эмпирическое распределение, устанавливали значения титра данных сывороток и определяли корреляцию между значениями ^Т и ^Э/Р.

Для разведений сывороток 1:80, 1:160, 1:320 и 1:640 исследовали зависимость (для всех исследуемых сывороток) между Б/Р-показателями этих разведений (5/Р80, Б/Р^о, 5/Р32о, 5/Р640) и установленными величинами Т для данных сывороток.

Для всех испытанных разведений связь между Э/Р-показателями и эмпирическими значениями Т была довольно высокой, коэффициенты корреляции составили значения 0,94; 0,95; 0,95; 0,96 соответственно разведениям сывороток 1:80, 1:160, 1:320 и 1:640.

В дальнейшем для практического применения рекомендовали регрессионную модель, установленную для разведения 1:160. По мере увеличения испытанных разведений степень корреляции увеличивалась, однако использование высокого разведения сывороток, в качестве единственного, считали нецелесообразным, т.к. сыворотки с низкой активностью могли оказаться ниже показателя отрицательного контроля. С другой стороны при использовании наиболее низкого разведения (1:80) значения оптических показателей высокоактивных сывороток могли находиться в зоне верхнего «плата».

-----------5- 1«Т ♦ «V

1ёТ= 2,9967 х [1е(УР)] + 4,0044 . г = 0,95 ♦

♦* ♦

♦ ^^^^^

^^ 2,5

-0,6 -0.5 -0,4 -О.З -0,2 -0,1 О 0,1 0,2

1г(Б/Р>

Рис. 3. Распределение значений ^Т соответственно показателям ^(8/Р) и величине разведения сывороток 1:160. Уравнение связи вида ^Т = 2,99 * [1§(5/Р)] + 4,00, коэффициент корреляции г = 0,95

Таким образом, для контрольных и испытуемых сывороток в качестве рабочего приняли разведение 1:160 как наиболее надежное для прогнозирования значения титра антител (рис. 3).

Определение допустимых величин показателей оптической плотности для отрицательного и положительного контролей. При постановке реакции ИФА по одному разведению было необходимо определить для контрольных положительных и отрицательных сывороток допустимую величину оптической плотности, ниже или выше которой результаты расчета величины титра антител в исследуемой сыворотке будут считаться некорректными. На различных планшетах в 30 повторностях анализировали вариации значения оптической плотности положительной и отрицательной контрольных сывороток в разведении 1:160. Полученные значения оптической плотности позволили вычислить соответствующие средние величины и их статистические характеристики в виде дисперсий (а) и 95,5%-ых доверительных интервалов (2хс) (табл. 4).

Было установлено, что для получения достоверных значений титра антител в сыворотках крови при тестировании их в одном разведении, оптическая плотность контрольных сывороток с 95% уровнем достоверности должна находится в интервале 0,072-Ю,172 для отрицательной и в интервале 0,323-И,065 - для положительной контрольных сывороток.

Таблица 4

Результаты измерения значений оптической плотности _положительного и отрицательного контролей_

Характеристика сывороток Значения оптической плотности Допустимые величины показателей оптической плотности

отрицательная 0,100; 0,200; 0,140; 0,133; 0,119; 0,115 0,113; 0,118; 0,118; 0,177; 0,116; 0,114 0,122; 0,127; 0,118; 0,120; 0,110; 0,130 0,122; 0,100; 0,115; 0,128; 0,118; 0,112 0,119; 0,117; 0,128; 0,112; 0,142; 0,117 0,122±0,050 (0,072-Ю, 172)

положительная 0,453; 0,713; 0,457; 0,454; 0,724; 0,689 0,523; 0,461; 0,496; 1,065; 0,512; 0,453 0,744; 0,851; 0,725; 0,987; 0,805; 1,076 1,100; 0,678; 0,559; 1,205; 0,489; 0,488 0,980; 0,611; 0,568; 0,690; 0,453; 0,468 0,693±0,370 (0,323-4,065)

Определение значений величин оптической плотности для разграничения неспецифической, сомнительной и специфической реакций. Целью исследований было обоснование пороговых величин оптических показателей для интерпретации результатов анализа. Для этого определяли максимальное значение оптического показателя, соответствующего реакции неспецифического типа и минимальное значение - для специфической реакции. Соблюдая ранее разработанные условия проведения анализа (величина разведения контрольных и исследуемых сывороток, а также соответствующие допустимые значения оптической плотности) в трех повторностях тестировали пробы сывороток, не имеющих антител к данному заболеванию, и образцы сывороток, имеющих специфические антитела к болезни Ауески. Определяли средние значения оптических показателей для отрицательных и положительных сывороток, а также их дисперсию, позволяющую прогнозировать ожидаемые значения нижней и верхней границ доверительного интервала, соответственно (табл. 5).

Таблица 5

Величины значений оптической плотностп нсспецнфпческн и

Характеристика сывороток Средние значения оптическом плотности

отрицательные 0,100; 0,106; 0,111; 0,111; 0,111; 0,113; 0,115; 0,117 0,117; 0,117; 0,118; 0,121; 0,122; 0,122; 0,123; 0,124 0,125; 0,127; 0,127; 0,127; 0,128; 0,130; 0,130; 0,131 0,131; 0,131; 0,132; 0,133; 0,133; 0,134; 0,134;0,137; 0,142

верхняя граница доверительного интервала (р<0,045) 0,175

положительные 0,303; 0,436; 0,448; 0,448; 0,498; 0,563; 0,568; 0,578 0,587; 0.611; 0,647; 0,655; 0,678; 0,690; 0,725; 0,770 0,774; 0,774; 0,783; 0,785; 0,801; 0,805; 0,823; 0,851 0,864; 0,870; 0,939; 0,980; 1,076; 1,107; 1,163; 1,164

нижняя граница доверительного интервала (р<0,045) 0,142

Установили, что верхняя граница доверительного интервала для отрицательных сывороток составила значение 0,175 (р<0,045), а нижняя граница доверительного интервала для положительных сывороток - 0,142.

Поскольку установленная удвоенная величина отрицательного контроля составила 0,244 (табл. 4), то обе вышеприведенные критериальные оценки для отрицательных и положительных образцов оказались ниже данного значения.

Таким образом, были сделаны следующие заключения, принятые в качестве условий разграничения отрицательной, сомнительной и положительной реакций:

- если оптический показатель исследуемого образца меньше значения отрицательного контроля, то реакцию следует считать отрицательной;

- если тестируемый образец имеет показатель оптической плотности равный отрицательному контролю, но не превосходит его удвоенного значения, то реакцию следует считать сомнительной;

- если оптический показатель образца превосходит удвоенное значение отрицательного контроля, реакцию следует считать положительной.

Определение ожидаемого диапазона вариации показателей титров. Известно, что экспериментально полученные оценки результатов анализа являются вариабельными. Такого рода вариации обусловлены совокупностью объективных причин, присущих данному методу. Очевидно, что интерпретация результатов будет корректной, если величина вариации определена. С этой целью исследовали статистические характеристики величин титров в повторных экспериментах. Для испытания использовали сыворотки крови свиней, обладающих различной активностью по отношению к антигену вируса болезни Ауески. Оценку величины титра проводили на основании Б/Р-показателей, полученных при разведении 1:160 по соответствующей формуле (рис. 3). Полученные результаты представлены в табл. 6.

Таблица 6

Определение диапазона вариации показателей титров

№ повторности Титр сывороток, ^

1 2 3 4 5

1 3,317 3,993 3,387 4,337 3,115

2 3,378 4,102 3,286 4,137 2,918

3 3,238 3,918 3,170 3,987 2,979

4 3,397 4,130 3,213 4,103 2,850

5 3,628 3,839 3,430 4,195 3,130

а 0,146 0,121 0,111 0,128 0,122

Было определено, что практически во всех случаях диапазон вариаций единичных измерений титров находится в границах одного двоичного шага. Установленные величины средних квадратичных отклонений были достаточно близкими по значениям и логарифмической размерности находились в интервале

0,11-0,14. На этом основании сделали заключение, что при использовании предлагаемой методики ожидаемое среднее квадратичное отклонение (±а) логарифмических величин титров будет находиться в установленных границах.

Сравнение оценок титров сывороток, установленных методом одного разведения и последовательных двукратных разведений. Сыворотки крови свиней, обладающие различной специфической активностью, исследовали в непрямом варианте ИФА методом одного разведения и последовательных двукратных разведений. Таким образом, получали параллельно установленные показатели ^Т, между которыми исследовали наличие связи и устанавливали коэффициент корреляции, который составил 0,98, что характеризовало устойчивую взаимосвязь между исследуемыми показателями.

3. ВЫВОДЫ

1. Разработана отечественная тест-система на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющая проводить оценку титра тестируемой сыворотки (^Т) по единственному фиксированному разведению на основе уравнения связи с Э/Р - показателем, которое имеет вид ^Т=2,99[1§(8/Р)]+4,00, а также установлены соответствующие пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции.

2. Усовершенствована тест-системы для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К». Показана чувствительность, специфичность и совпадаемость результатов предлагаемой тест-системы по сравнению с набором фирмы ШЕХХ (США), которые составили 84,1%, 89,6% и 84,7% соответственно.

3. Отработан метод получения высокоочищенных и концентрированных антигенов вируса БА маркированного штамма «ВК» и эпизоотического - «К» путем центрифугирования, осаждения ПЭГом с молекулярной массой 6000, трехкратного элюирования, очистки высокоскоростным центрифугированием через 20% сахарозу с использованием неионного детергента твин-20. Активность антигенов в непрямом варианте ИФА составила 1:1000000.

4. Оптимизирован метод получения гипериммунных сывороток крови свиней

на штаммы «ВК» и «К» вируса болезни Ауески путем интрацеребралыюго и

внутримышечного введения суспензии вируса. Активность сывороток в непрямом варианте ИФА через 28 дней после гипериммунизации составила 1:40960 - 1:51200 и 1:3200- 1:10240, соответственно.

5. Установлено, что при постановке непрямого варианта ИФА оптимальной является концентрация антигена, обеспечивающая значение оптической плотности положительных сывороток не менее 1,0 o.e., при значении оптической плотности отрицательных сывороток до 0,2 o.e. Целесообразнее использовать режим иммобилизации антигенов в течение 2,5 ч при температуре 37°С или 16 часов - при 4°С. Для достижения максимальной реакции 60-минутная экспозиция сывороток является оптимальной.

6. Результаты исследований более 300 образцов сывороток, полученных из различных хозяйств, проведенных с использованием разработанных тест систем, позволяют считать, что предлагаемые варианты ИФА пригодны для выявления и оценки титра антител к вакцинному и полевому штаммам вируса болезни Ауески.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методики:

1. «Методика концентрирования и очистки штамма «ВК» вируса болезни Ауески», 2008 г.;

2. «Методика получения иммуноглобулинов сывороток крови кроликов на маркированный штамм «ВК» и эпизоотический штамм «К» вируса болезни Ауески», 2008 г.;

3. «Методика определения уравнения линейной регрессии для вычисления титра антител к вирусу болезни Ауески в сыворотках крови свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа способом одного разведения», 2008 г.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Яснева, Е.А. Изучение иммуногенной активности вакцины против болезни Ауески свиней и овец из маркированного штамма «ВК» на козах / Е.А. Яснева, Д.К. Басова, В.И. Диев // Ученые записки УО ВГАВМ. - Витебск, 2005. - Т. 41.-Вып. 2, ч. 1. -С. 57-58.

2. Яснева, Е.А. Титр вируса болезни Ауески штамма «К» и его зависимость от времени репродукции в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 / Е.А. Яснева, Д.К. Басова, A.B. Константинов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2006. - Т. 4.-С. 145-148.

3. Яснева, Е.А. Динамика накопления полноценного вируса болезни Ауески маркированного штамма «ВК» в перевиваемой линии клеток ВНК-21/ Е.А. Яснева //Вет. патология.-2006. - №4. -С. 107- 108.

4. Яснева, Е.А. Оптимизация условий постановки непрямого варианта иммуноферментного анализа для определения антител в сыворотках крови свиней на вирус болезни Ауески штамм «ВК» и «К» / Е.А. Яснева, A.B. Константинов / Вет. патология. - 2007. - № 4. - С. 51 - 55.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Тираж 90 экз., ноябрь 2008 г.

Оглавление диссертации Яснева, Елена Анатольевна :: 2008 :: Владимир

СI р.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Историческая справка о распространении болезни Ауески

1.2. Эпизоотическая ситуация по болезни Ауески в мире и Российской Федерации

1.3. Характеристика вируса болезни Ауески

1.3.1. Морфология

1.3.2. Устойчивость возбудителя к факторам внешней среды

1.4. Клинические признаки болезни Ауески

1.5. Культивирование вируса болезни Ауески

1.6. Очистка и концентрирование вируса болезни Ауески

1.7. Иммунитет при болезни Ауески

1.7.1. Неспецифические факторы защиты

1.7.2. Гуморальный иммунитет

1.7.3. Клеточный иммунтег

1.7.4. Белки иммунного ответа

1.8. Методы диагностики болезни Ауески

1.8.1. Выделение возбудителя

1.8.2. Серологические методы диагностики

1.8.2.1. Иммуноферментный метод диагностики

1.8.2.2. Дискриминирующие диагностические тесты

1.9. Вакцины против болезни Ауески

1.10. Искоренение болезни Ауески

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Яснева, Елена Анатольевна, автореферат

Актуальность темы. Болезнь Аусски (БА) вызывается вирусом псевдобешепства, который относится к семейству Herpesviridae. подсемейству Alphaherpesvirinae. Основным фактором, определяющим эпнзооголо) пчсскпс особенности вируса болезни Аусски, является его способность оставаться в латентной форме. Реактивация вируса происходит под воздействием различных факторов (стрессы, гормональные сдвиги, травмы и пр.) и, вероятно, связана с подавлением Т-клеточпого иммунитета [58].

БА - остро протекающее в виде эпизоотий и спорадических случаев контагиозное вирусное заболевание сельскохозяйственных (в основном свиней) и диких животных, пушных зверей и грызунов, наносящее значительный экономический ущерб странам с развитым свиноводством, в том числе и России.

Экономический ущерб при возникновении БА обусловлен большим отходом поросят, малой эффективностью при откорме и непригодностью в качестве племенных животных. Заболевание свиноматок приводит к резкому нарушению воспроизводства стада из-за абортов и рождения нежизнеспособных порося т |2„ cS. 14, 24, 30, 38, 39, 56, 57, 68].

Ведущие исследователи проблемы борьбы с БА па симпозиуме в Брюсселе в 1988 г. пришли к выводу, что БА - одна из наиболее опасных для свиноводства вирусных инфекций [227].

Сложившаяся эпизоотическая ситуация в 70-80-х гг. побудила власти европейских стран распространить на болезнь Ауески требования обязательного сообщения о появлении заболевания, как это принято при особо опасных инфекциях [183].

Международный опыт показывает, что искоренение заболевания возможно при применении стратегии борьбы, включающей выявление инфицированных животных (в том числе латентно инфицированных) и их выбраковку, а также реализацию комплекса санитарно-эпидемиологических и других мер. В ряде стран (Великобритания, Дания) было проведено искоренение заболевания посредством выявления и забоя больных и подозрительных в заболевании свиней [230, 2321. Такие программы искоренения невозможны в странах и областях с высоким процентом инфицированных животных, так как это приведет к огромным экономическим потерям. Очевидно, что единственно возможным способом решения проблемы искоренения БА в таких странах является выявление и выбраковка инфицированных животных без прекращения вакцинации. Такие мероприятия проводятся с использованием маркированных вакцин и дискриминирующих тестов, позволяющих дифференцировать вакцинальный и инфекционный иммунитет.

Среди маркированных вакцин наиболее широкое распространение получили gE-негативные вакцины [108, 151J. Соответственно, дискриминирующие тесты, направленные на выявление антител к гликопротеину gE и дифференцирующие вакцинированных и инфицированных животных, также пашли наиболее широкое применение среди дискриминирующих тестов, и их разрабо1кс и совершенствованию уделяется особое внимание [80, 84, 113, 1 14. 134. 145. 157. 217].

Серологическая диагностика БА является наиболее распространенной, как в аспекте ретроспективного отслеживания возможных вспышек заболевания, так и оценке эффективности специфической профилактики.

Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к вирусу БА в сыворотках крови свиней, а также присутствие вируса и его антшепов в биологических материалах, основано па иммуноферментном анализе (ИФА) |17. 55, 60. 72, 84, 94, 1 14, 134, 145, 193, 207, 2081. Достоинствами ИФА являются: высокая чувствительность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие обьемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех с i алий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов.

Па основе ИФА разработаны и описаны различные тест-системы для диагностики БА [80, 84, 94, 113, 114, 135, 145, 157, 193,207, 208, 217|. При эюм все известные наборы, позволяющие дифференцировать вакцинальный и инфекционный иммунитет основаны на использовании гликопротеипов или моноклопальных антител, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований. Таким образом, усовершенствование ieci-системы для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни

Ауески штаммов «ВК» и «К», которая обладала бы достаточной чувствительностью и специфичностью и при этом имела бы меньшую себестоимость является актуальной. Кроме этого, представляется целесообразным разработать отечественную тест-систему на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющую определять 'точный титр тестируемом сыворотки по единственному фиксированному разведению на основе уравнения связи с S/P — показателем, что помогло бы существенно повысить производительность анализа за счет увеличения количества исследуемых проб сывороток.

Цели и задачи исследования. Целыо настоящих исследований было усовершенствование тест-системы на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Луески штаммов «ВК» и «К», а также - разработка отечественной тест-системы па основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющей проводить оценку титра тестируемой сыворотки по единственному фиксированному разведению па основе уравнения связи с S/P - показа!слем. В рамках поставленных целей были определены следующие задачи:

- отработать метод получения высокоочищеппых и концентрированных антигенов вируса БА штаммов «ВК» и «К»;

- получить специфические сыворотки крови свиней, содержащие антитела к штамму «ВК» и «К»;

- получить сыворотки крови свиней, одновременно содержащих антитела к штамму «ВК» и «К»;

- определить оптимальную концентрацию и условия взаимодействия компонентов реакции;

- сопоставить результаты исследования сывороток крови свиней с помощью разработанной тест- системы на основе непрямого варианта ИФА с результатами коммерческого набора фирмы IDEXX (США) и оценить чувствительность и специфичность разработанного тсста;

- для тесг-системы с использованием штамма «ВК» определить допустимые величины показателей оптической плотности для отрицательного и положительного конгролей; установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифичсскую (отрицательную) реакции; определить величину разведения сыворотки, S/P-показатель которой будет использован для вычисления ее титра; построй п» уравнение связи между S/P — показателем фиксируемого разведения и величиной титра сыворотки;

- с помощью разработанных тест-систем провести исследования сывороюк крови свиней па наличие антител к вакцинному и полевому штаммам вируса болезни Аусски.

Научная новизна исследований. Усовершенствована тест-системы для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К», а также разработана отечественная тест-сис1ема на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющая определять титр тестируемой сыворотки по одному рабочему разведению на основе уравнения связи с S/P — показателем. При этом отработн меюд получения антигенов вируса болезни Ауески штаммов «ВК», «К» и получены специфические гипериммунные сыворотки крови свиней, определены оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции, а также установлены величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положптсльп\ю) п песпецифическую (отрицательную) реакции, определена величина разведения сыворотки, S/P-показатель которой будет использован для вычисления се титра, построено уравнение связи между S/P - показателем фиксируемого разведения и величиной титра сыворотки для расчета титра антител при тестировании проб в одном разведении.

Сопоставлены результаты исследования сывороток крови свиней с помощью усовершенствованной тест- системы на основе твердофазного непрямого варпаша ИФА с результатами коммерческого набора фирмы IDEXX (США) и проведена оценка чувствительности и специфичности предлагаемого тест.

- «Методика концентрирования и очистки штамма «ВК» вируса болезни Ауески», 2008 г.;

- «Методика получения иммуноглобулинов сывороток крови кроликов па маркированный штамм «ВК» и эпизоотический штамм «К» вируса болезни Ауески», 2008 г.;

Результаты научных исследований использованы при составлении СТО 00495527 — 0006 - 2005 «Вирусвакцина против болезни Аусски свиней и овец сухая культуральная из маркированного штамма «ВК»», утвержденного заместителем руководителя Россельхозпадзора 07.08.2007 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

- усовершенствованная тест-система для выявления антител па основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К»;

- отечественная тест-система па основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющая проводить оценку титра тестируемой сыворотки по единственному фиксированному разведению на основе уравнения связи с S/P - показателем

- результаты использования тест-систем на основе твердофазного непрямого варианта ИФА при исследовании сывороток крови свиней па наличие антител к вакцинному и полевому штаммам вируса болезни Ауески.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации доложены и опубликованы в материалах международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященной 50-лстию ФГУ «Федерального центра охраны здоровья животных», (Владимир, 2008 г.) и докладывались па заседании ученого совета ФГУ «Федерального центра охраны здоровья животных».

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена авюром самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с научным сотрудником Г.А. Блотовой, к.в.н. А.В. Константиновым, к.б.н. Т.И. Корпусовой, а также сотрудниками лабораторий болезней свиней и диагностики болезней КРС и свиней, за что автор выражает им искреннюю благодарность.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертационного исследования на тему "Тест-системы на основе иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу болезни Ауески"

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана отечественная тест-система па основе структурно-целостного вируса болезни Луески штамма «ВК», позволяющая проводить оценку титра тестируемой сыворотки (lgT) по единственному фиксированному разведению па основе уравнения связи с S/P - показателем, которое имеет вид lgT=2,99[lg(S/P)]+4,00, а также установлены соответствующие пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции.

2. Усовершенствована тест-системы для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К». Показана чувствительность, специфичность и совпадаемость результатов предлагаемой тест-системы по сравнению с набором фирмы IDEXX (США), которые составили 84.1%. 89,6% и 84,7%) соответственно.

3. Отработан метод получения высокоочищенных и концентрированных антигенов вируса БА маркированного штамма «ВК» и эпизоотического - «К» путем центрифугирования, осаждения ПЭГом с молекулярной массой 6000. трехкратного элюировапия, очистки высокоскоростным центрифугированием через 20%) сахарозу с использованием неионного детергента твип-20. Активность апттпепов в непрямом варианте ИФА составила 1:1000000.

4. Оптимизирован метод получения гипериммунных сывороток крови свиисй на штаммы «ВК» и «К» вируса болезни Ауески путем интрацерсбральпого и внутримышечного введения суспензии вируса. Активность сывороток в непрямом варианте ИФА через 28 дней после гипериммупизации составила 1:40960 - 1:51200 и 1:3200- 1:10240, соответственно.

5. Установлено, что при постановке непрямого варианта ИФА оптимальной является концентрация антигена, обеспечивающая значение оптической плотности положительных сывороток не менее 1,0 о.е., при значении оптической плотности отрицательных сывороток до 0,2 о.е. Целесообразнее использовать режим иммобилизации антигенов в течение 2,5 ч при температуре 37°С или 16 часов - при 4°С. Для достижения максимальной реакции 60-мипутпая экспозиция сывороток является оптимальной.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. «Методика концентрирования и очистки штамма «ВК» вируса болезни Ауески», 2008 г.;

2. «Методика получения иммуноглобулинов сывороток крови кроликов па маркированный штамм «ВК» и эпизоотический штамм «К» вируса болезни Ауески», 2008 г.;

3. «Методика определения уравнения линейной регрессии для вычисления титра антител к вирусу болезни Ауески в сыворотках крови свиней в непрямом варианте иммунофермсптного анализа способом одного разведения», 2008 \.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2008 года, Яснева, Елена Анатольевна

1. Андреев, П.Н. Инфекционные болезни свиней. 4-е изд. / П.П. Андреев, К.II. Андреев. - М.: Сельхозгиз, 1954. - С. 282-314.

2. Антитела: Методы. Т.2: пер. с англ. / под ред. Д.Кэтти.-М.: Мир, 1991. 382 с.

3. Ашмарин, И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов / И.П. Ашмарин, И.П. Васильев, В.А. Амбросов.-Jl.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1974. 76 с.

4. Баборенко, Е.П. Иммунобиологические свойства штаммов вируса болезни Ауески: автореф. дис. канд. биол. паук / Баборенко Елена Павловпа.-Владимир. 1996.-25 с.

5. Бслоконь, B.C. Сравнительная оценка чувствительности к вирусу болезни Ауески разных систем культивирования / B.C. Белоконь, В.А. Мищенко, Л.Е. Корниенко // Биотехпол. вет. преп.: матер.науч.-практ. копф. Харьков, 1993. -С. 14.

6. Бшоконь, B.C. Виробнич! випробувапия емульешно!' шактивовано!' концептратвакцини против хвороби AyecKi / B.C. Бшоконь // Вет. мед.: \пжвщ. тем. науч.-Харк1в, 1996.-Вып. 72.-С. 12-18.

7. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина.-М.: ВНИТИБП,1998,- 928 с.

8. Вольф, В.Г. Статистическая обработка опытных данных / В.Г. Вольф. М.: Колос, 1966.-255 с.

9. Выращивание вируса болезни Ауески в суспензии клеток и тканей / В.А. Сергеев, А.А. Коломыцев, В.И. Жестеров и др. // Актуал. вопр. вет. вирусол.: тез. докл. 4-й Всесоюз. вет. вирусол. конф. Владимир, 1976. - 4.1. - С. 106 108.

10. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц: пер. с апгл.-М.: Практика, 1999.-459 с.

11. Госманов, Р.Г. Прижизненная диагностика больных и переболевших болезнью Ауески свиней / Р.Г. Госманов, Р.Х. Юсупов // Иифекц. болезни с.-х. ж-ных: сб. науч. тр. — Новосибирск, 1983. С. 99.

12. Гринин, А.С. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных / А.С. Гринин, И.Н. Титов. М.: «Колос», 1971. - 238 с.

13. Гуссва, М.Н. Разработка технологии изготовления ипактивированной вакцины против болезни Ауески из штамма, делеционпого по гликопротеину Е: авторсф.дис. .капд.биол.наук / Гусева Марина Николаевна. Владимир. 1999. - 23 с.

14. Заволока, А.А. Особенности диагностики и клипико-гематологического проявления респираторной формы болезни Ауески у свиней / А.А. Заволока, JI. Миланко // Ветеринария.- Киев, 1983. Вып. 62. - С. 31-33.

15. Иммунофсрмептиый анализ / под ред. Т.Т. Нго, Г.Ленхоффа. М.: Мир. 1988. -444 с.

16. Иммуноферментный метод при диагностике болезни Ауески / В.А. Мищенко. Л.Н. Корниенко, М.Г. Костюченко и др. / Болезнь Ауески свиней: сб. науч. работ. -Владимир, 2001.-С. 41-42.

17. Иммунобиологические свойства производственного штамма вируса болезни Ауески / В.А. Мищенко, Л.Н. Корниенко, Л.Е. Корниенко и др. // Вирусные и микробные болезни с. х. ж - пых: сб. науч. тр. - Владимир, 1995. - С. 205 - 208.

18. Использование иммунофермептиого анализа для определения антител к вирусу болезни Ауески / А.Е. Антоненко, В.Т. Сакович, В.А. Кобовец. Р.Н. Евсейченко // Вет. наука произ ву. - Минск, 1987. - Вып. 25.- С. 28 - 3 1.

19. Камалов, Г.Х. Чувствительность лабораторных животных и культуры ткани к вирусу болезни Ауески / Г.Х. Камалов, В.Н. Сюрин // Ветеринария. 1964. - № 6. -С. 23 - 24.

20. Копдыбаева, Ж.Б. Оценка эффективности различных методов концентрирования вируса болезни Ауески / Ж.Б. Кондыбаева, JI.B. Маликова, Б.I I. Хайруллин // Актуал. пробл. вирусол.: тез. докл. науч. конф,- п. Гвардейский, 1994. -Ч. 1.-С.62.

21. Конопаткин, А.А. Болезнь Ауески / А.А. Кононаткин // Эпизоотология и инфекц. болезни с.-х. ж ных. - М., 1984. - С. 189-197.

22. Константинов А.В. Вакцина против болезни Ауески / А.В. Константинов // Жив во России. - 2004. - № 2. - С. 32.

23. Концентрирование вируса болезни Ауески с помощью ПЭГ / B.C. Белокопь, JI.E. Корниенко, М.В. Волкова и др. // Вопр. вет. вирусол., микробиол. и эпизоотол.: матер, науч. конф. ВНИИВВиМ. Покров, 1992. - Ч. 1. - С. 195 - 196.

24. Кулеско, И.И. Иммунофлюоресцентный метод обнаружения вирусного антигена при чуме свиней и болезни Ауески / И.И. Кулеско, А.И. Собко. Н.М. Соболев // Актуал. вопр. вет. вирусол.: матер. 2й Всесоюз. вст. вирусол. конф. -М.,1965.-Ч. 1.-С. 45 -46.

25. Лярски, 3. Диагностика вирусных болезней животных / 3. Лярски. М.: «Колос», 1980. - С.212 - 214.

26. Лаптев, IO.B. Вирус болезни Ауески: выращивание и иммуногенные свойства У Ю.В. Лаптев, В.А. Сергеев // Достижения пауки и техники АПК. 1991.- №10. -С. 19.

27. Малярсц, П.В. Болезнь Ауески. (Обзор литературы) / П.В. Малярец, В.В. Гусева, Т.А. Ануфриева,- Владимир: ВНИИЗЖ, 1993. 26 с.

28. Мониторинг'по болезни Аусски: отчет о науч. — произв. деят — ти лаб. болезни свиней по теме «Вег. благополучие 3 02» за 2006 год. - Владимир: ФГУ «ВНИИЗЖ», 2006. - С. 29 - 32.

29. Набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении: инструкция. ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2007.

30. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоское!и -76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении: инструкция. ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2007.

31. Набор для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении: инструкция. ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2007.

32. Некоторые аспекты эпизоотического проявления классической, африканской чумы свиней п болезни Ауески: информационно аналитический обзор / А.А. Шевцов, С.А. Дудников, А.К. Караулов |и др.| - Владимир: ФГУ «ВНИИЗЖ». 2008. -38 с.

33. Никитин, М.Г. Болезнь Ауески / М.Г. Никитин, П.М. Базылев. М.: Колос. 1967.-263 с.

34. Никитин, М.Г. Болезнь Ауески / М.Г. Никитин // Эпизоотология. 2-е изд. -М„ 1979.-С. 170-180.

35. Ночевный, В.Т. Управляемое культивирование вируса болезни Аусски в суспензии эксплантатов куриных эмбрионов / В.Т. Ночевный, Д.Ф. Осидзс, А.Г. Ирский // Культивирование клеток ж ных и человека: матер. 1 Всесоюз. совещ,-Пущино, 1983. - С. 25.

36. Ночевный, В.Т. Методы культивирования вируса болезни Ауески в суспензии клеток1/ В.Т. Ночевный // Ветеринария,-1970.-№ 10.-С.44-47

37. Оганесян, Л.С. Разработка непрямого варианта иммунофермсптного анализа для определения титра антител к вирусу болезни Ауески в сыворотках крови свиней / А.С. Оганесян // Вет. патология. 2004. - № 6. - С. 103 - 106.

38. Очистка вируса болезни Ауески изопикническим центрифугированием / И.О. Карпова, В.А. Перевозчиков, JI.H. Корниенко и др. // Вопр. вирусол. 1995. -Т. 40, №3. - С. 130 - 132.

39. Оценка вирусвакцины для профилактики болезни Ауескп свиней / А.А. Коломыцев, В.А. Бабаян, И.Ф. Вишняков и др. // Ветеринария.- 1991.-№1.-С.31-33.

40. Оценка иммупогенной активности инактивированпой вакцины против болезни Ауески на кроликах / В.А. Мищенко, А.И. Дудников, А.Ф. Бондарепко и др.j // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: матер, науч. копф. ВНИИВВиМ,-Покров, 1992.-Ч. 1.-С. 194.

41. Петропавлова, JET. Изучение оптимальных условий технологии промышленного изготовления живых вирусных вакцин против болезни Ауески штаммов В ГНК И и БУК-628: автореф. дис.капд.вст.паук / Петропалова Л.Т.Казань, 1981. 20 с.

42. Петропавлова, JI.T. Влияние технологических условий произволе!на на качество вирусвакцины из штамма ГНКИ против болезни Ауески / JI.T. Петропавлова, Г.Х. Камалов // Уч. зап. КГВИ. Казань, 1976. - Т. 122-. - С. 63.

43. Платонов, А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы / А.Е. Платонов.-М.: Изд-во РАМП, 2000.-52 с.

44. Получение высокоочищенных и концентрированных ДНК-содержащих вирусов / Г.И. Ермакова, Э.М. Прохорова, С.И. Цыганкова, Т.М. Арсентьева // Дезинфекция животноводческих помещений и ветеринарная санитария па транспорте. М., 1983. - С. 110-115.

45. Получение высокоочищепного и концентрированного вируса болезни Ауескп / Б.М. Ярчук, JEM. Корниенко, Л.И. Корниенко и др. // Вет. медицина. Киев, 1995,- Вып. 70. - С. 16 - 19.

46. Прейс, И.Е. Культивирование вируса болезни Ауески в однослойных культурах тканей / И.Е. Прейс // Матер. 13-й науч. конф. Лепилгр. вет. ин-та. Л. 1964.-С. 35 - 37.

47. Разработка производственного метода репродукции вируса болезни Ауески / Д.Т. Осидзе, С.А. Фисеико, И.А. Хорьков и др. // Ветеринария.-1975.-№10.-С.39-42.

48. Ройзман, Б. Герпесвирусы и их репликация / Б. Ройзмаи, У. Баттерсон // Вирусология / под ред. Б. Филдса и Д. Найпа. М.: Мир, 1989.- Т. 3, гл. 29. - С. 186 - 245.

49. Сакович, В.Т. Сравнительная оценка иммуноферментного анализа па твердой фазе и реакции нейтрализации для диагностики болезни Ауески / В.'Г. Сакович. А.Е. Антопепко // Вет. наука-произ ву. - Минск, 1989. - Вып. 27. - С. 53 - 58.

50. Сергеев, В.А. Вирусные вакцины / В.А. Сергеев. Киев: Урожай, 1993.- 367 с.

51. Сергеев, В.А. Выращивание вируса болезни Ауески в различных культурах клеток и его иммупогсипыс свойства / В.А. Сергеев, Ю.В. Лаптев, В.И. Жестерев //Тр. ВИЭВ.-М., 1987.- Т.64.-С.24-28\

52. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А. Сергеев, Е.А. Нсиоклопов, Т.И. Алипер.-М.: «Библиотека», 2007. С. 294 - 312.

53. Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. М.:Мир; 1985. - С. 81-82, 237-239.

54. Соломкии, П.С. Болезнь Ауески у сельскохозяйственных животных / 11.С. Соломкин. -М.: Сельхозгиз, 1949. 127 с.

55. Сосов, Р.Ф. Болезнь Ауески / Р.Ф. Сосов, В.А. Ведерников // Болезни свиней. -3-е изд.-М., 1980.-С. 62-69.

56. Сосов, Р.Ф. Методические указания по применению статистических методов в эпизоотологии / Р.Ф. Сосов, А. А. Глушков.-М.: MB А, 1974. 67 с.

57. Спиер, Р.Е. Биотехнология клеток животных / Р.Е. Спиер, Г.Д. Адаме, Д.Б. Гриффите,- Т.2.-М.: Агропромиздат, 1989.-520 с.

58. Способы очистки и концентрирования антигена вируса болезни Ауески /B.C. Белоконь, J1.E. Корниенко, В.О. Мищенко, Л.Н. Корниенко // Вет. медицина. — 1993.-Вып. 68.- С.81-85.

59. Сравнительное изучение репродукции вируса болезни Ауески в суспензии клеток и тканей эмбрионов птиц / Д.Т. Осидзе, С.А. Фиссико, И.А. Хорьков и др. // Вопр. вирусол.-1975.-№5.-С.581-586.

60. Сурин, Б.И. Культивирование вируса болезни Ауески в культурах ткани / Б.И. Сурин // Тр.ВИЭВ.-М., 1962.-Т.29.-С.221-230.

61. Сюрин, В.Н. Диагностика вирусных болезней животных: справочник / В.II. Сюрин, Р.В. Белоусова , Н.В. Фомина. — М.: Агропромиздат, 1991.- 528 с.

62. Татаров, Г. Авирулентный gl-пегативный мутант вируса Ауески / Г. Татаров // Вет. Сбирка. 1990. - № 3. -С. 19 - 23.

63. Тахаутдипов, Ф.Б. О репродукции вируса болезни Ауески в культурах ткани / Ф.Б. Тахаутдипов // Актуал. вопр. вет. вирусол.: матер. 3й Всесоюз. вет. вирусол. конф. -М., 1967. Ч. 1. - С. 64.

64. Теория и практика иммупоферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова.-М.: Высшая школа, 1991.-288с.

65. Тимакипа, К.Т. Выращивание вируса болезни Ауески в суспензии тканевых эксплантатов куриных эмбрионов / К.Т. Тимакина, В.Т. Ночевпый // Актуал. вопр. вет. вирусол.: тез.докл. 4-й Всесоюз. вет. вирусол. конф. Владимир, 1976. - Ч. 1. -С. 108 - 109.

66. Уласов В. Болезнь Ауески свиней / В. Уласов, А. Ольшанская // Болезнь Ауески свиней: сб. науч. работ. Владимир, 2001. - С. 53 - 56.

67. Чувствительность к вирусам новых перевиваемых клеток / А.А. Поздняков, B.C. Авилов, М.Т. Гололобова и др. // Актуал. вопр. вет. вирусол.: тез.докл. 4-й Всесоюз. вет. вирусол. конф. Владимир, 1976.-Ч. 1. - С. 103 - 104.

68. A complement -dependent neutralizing monoclonal antibody against glycoprotein II of pseudorabies virus / T. Nakamura, T. Ihara, T. Nagata et al.// Vet. Microbiol.- 1990.-Vol. 24-P. 193 198.

69. A novel conccpt for the control of Aujcszky' s disease: experiences in two vaccinated pig herds / J.T. Van Oirschot, J.M. Wijsmullcr, C.A.I I. dc Waal. P.M. van Lith // Vet. Rec. 1990. - Vol. 126.-P. 159 - 163.

70. A vaccinc strain of pseudorabies virus with deletions in the thymidine kinase and glycoprotein X genes / C.C. Marchioli, R.J. Yancey, R.C. Wardley |ct al. // Am.J.Vct.Res. 1987. - Vol.48. - P. 1577 - 1583.

71. Afshas, A. Immunoperoxidase plaque staining for detection of pseudorabies virus / A. Afshas, G.C. Dulac // Can.J.Vet.Res. 1986. - Vol. 50, № 1. - p. 118 - 119.

72. Annelli. J.F. Status of Aujeszky's disease (Pseudorabies) in the Americans / J.F. Anneli // Aujezsky's Disease: OlE Symp. Bangkok, Thailand, 1994. - P. 71 - 75. »

73. Banks, M. Aujeszky's disease ELISA: cross-reaction with other herpesvirus antisera / M. Banks // Vet. Microbiol.-1989.-Vol. 20. P. 1 - 8

74. Banks, M. Aujeszky's disease ELISA using glycoprotein gE (gl) expressed in baculovirus / M. Banks, B. Tehranchi, S. Weightman // Proc.3rd Congress Europ.Soc.Vet.Virol. Interlaken, Switzerland, 1995. - P. 137 - 141.

75. Bartha, A. Experiments to reduce the virulence of Aujeszky's virus / A. Bartha // Magy. Allatorv. Lapja. 1961. - Vol. 16. - P. 42-45.

76. Batza, H.J. Eradication of Aujeszky's disease in Germany / I I.J. Batza // Proc. 16 Ui Int. Pig Vet. Soc. Congr. Melbourne, Australia, 2000. - P. 611.

77. Ben-Porat, T. Molecular biology of pseudorabies virus / T. Ben-Porat. A.S. Kaplan // Herpesviruses. 1984. - Vol. 3. - P. 105.

78. Blewett, E.L. Cleavage of bovine herpesvirus glycoprotein В is not essential for its function / E.L. Blewett, V. Misra // J.Virol. 1991.-Vol. 72. - P. 2083 - 2090.

79. Blocking immunoenzymatic assay (ELISA) for specific Aujeszky disease virus gE glycoprotein antibodies detection in porcine sera samples: Instruction.-INGENASA, Spain, 2006

80. Blocking immunoenzymatic assay (ELISA) for specific Aujeszky disease virus gB glycoprotein antibodies detection in porcine sera samples: Instruction.-INGENASA, Spain. 2006

81. Bouwkamp, F.T. Use of colostrum to detect antibodies against glycoprotein I of Aujeszky's disease virus / F.T. Bouwkamp, J.A. Stegeman, T.G. Kimman // Vet. Rcc. 1993. Vol. 133, № 24. - P. 591 - 593.

82. Briaire, J.R. An ELISA for detection of antibody against Aujeszky's disease virus in pig sera / J.R. Briaire, R.H. Meloen, S.J Barteling // Zbl. Vct.-mcd. R.B. 1979. - Bd. 26. - S. 76-81.

83. Broers, P. Field study for reduction of spread of Aujcszky's disease virus in Finishing pigs with different vacctination regimes / P.Broers, N.Visscr, W.Eggcr // Acta. Vet. Hungarica. 1994. - Vol. 42. - P. 397 - 403.

84. Brown, T.M. Diagnosis of latent pseudorabics virus infection using in situ hybridization / T.M. Brown, F.A Osorio, D.L Rock // Vet. Microbiol. 1990. - Vol. 24. -P. 273 - 280.

85. Bush, C.E. Immunologic comparison of the proteins of pseudorabies virus and bovine herpesvirus! / C.E.Bush, R.F.Pritchelt // Am.J.Vet.Res. 1986.-Vol. 47. - № 8. -P. 1708- 1712.

86. Carualho, R. Teste imuno-enzimatico (ELISA) indireto para a dcteccao dc anticorpos contra о virus da doenca de Aujeszky (VDA) cm soros de suinos / R. Carualho. M. Resende. J.Franco // Arq. Bras. Med. Ved. e Zootccn. 1994. - Vol. 46. -№2.-P. 101 - 110.

87. Characterization of protective viral glycoproteins for pseudorabies virus infection / A. Matsuda, N. Okada, S. Katayama Let al.J // J.Vet.Med.Sci.-1991 -Vol. 53, № 4. P. 737" -741.

88. Cheung, A.K. The BamHIJ fragment (0.706 to 0.737 map units) of pseudorabies virus is transcriptionally active 'during replication / A.K. Cheung // J. Virol. 1990. -Vol. 64, №3,- P. 977 - 983.

89. Cheung, A.K. Humoral immune response to immediate-early protein of pseudorabies virus in swine with induced or naturally acquired infection / A.K. Cheung // Am. J. Vet. Res. 1990. - Vol. 51, № 5. - P. 222 - 226.

90. Chinsakchai, S. Immunobiology of pseudorabies virus infection / S. Chinsakchai, T.W. Molitor // Vet. Immun. Immunopathol.-1994.- Vol. 43. P. 107 - 116.

91. Cloning and expression of an antigenic domain of glycoprotein gE of pseudorabies virus in Escherichia coli and its use as antigen in diagnostic assays / L.I I. Ro, S.S. Lai. W.L. Hwang et al. // Am.J.Vet.Res. 1995. - Vol. 56. - P. 555 - 561.

92. Сое, N.E. Mapping and characterization of neutralizing epitopes of glycoproteins gill and gp50 of the Indiana-Funkhauser strain of pseudorabies virus / N.E.Сое, W.L. Mengeling // Arch. Virol. 1990. - Vol. 110, № 1/2. - P. 137 - 142.

93. Cook, D.R. Efficacy of a killed gpX deleted pseudorabies virus vaccine / D.R. Cook, H.T. Hill, D.R. Kinkcr // Can. J. Vet. Res. 1990. - Vol. 54, № 4. - P. 438 - 445.

94. Comparison of immunoekzyma test and gel immunodiffusion test in the detection of pseudorabies virus antibodies / B. Eugovic, S. Cajavcc, S. Cvctnic, J. Madic // Abstracts.-1986.- Bibliogr. P. 831 - 832.

95. Construction and characterization of deletion mutants of pseudorabies virus: a new generation of "live"' vaccines / W.G.V. Quint, A.E.J. Gielkens, J.T. Van Oirshot |et al.| // J.Gen. Virol. 1987. - V.78. - P.523-534.

96. Crowther, J.R. ELISA. Theory and practice / J.R. Crowthcr // Methods in Molccular Biology. -Totowa, New Jersey, 1995,- P. 64, 161-176.

97. Deletions in vaccine strains of pseudorabies virus and their effect on synthesis of glycoprotein gp63 / E.A. Petrovskis, J.G. Timmins, T.M. Giermann, L.E Post // J. Virol. -1986.-Vol. 60. -P.1116- 1169.

98. Demonstration of three major species of pseudorabies virus glycoproteins and identification of a disulfide-linked glycoprotein complex / N. Lukacs, IT-.T. Thiel, T.C. Mettenleiter, H-J. Rziha // J. Virol.-1995. Vol. 69. - P. 970 - 979.

99. Detection of pseudorabies virus DNA sequences by the polymerase chain reaction / S. Belak, A. Ballagi-Pordany, J. Flensburg, A. Virtanen // Arch. Virol. 1989.,-Vol. 108. -P. 279 -286.

100. Development of an ELISA to differentiate between animals either vaccinated with or infected by Aujeszky' s disease virus / M. Eloit, D. Frageaud, P.Vannier, B.Toma // Vet.Rec. 1988. - Vol. 124. - P. 91 - 94.

101. Development of an ELISA based on baculovirus synthesized glycoprotein В of pseudorabies virus / M. Gut, L. Jacobs, H. Kcrstens at al. // Proc. 16th Int. Pig Vet. Soc. Congr. Melbourne, Australia, 2000. - P. 555.

102. Dietzen, R.G. Nonspecific binding of immunoglobulins to coat proteins of certain plant viruses in immunoblots and indirect ELISA / R.G. Dictzen, R.I.B. Francki // J. Virol. Methods.-1987.-Vol. 15.-P. 159-164.

103. Dorsett, P. Latex agglutination test for PRV antibody detection / P. Dorsett // Proc. Livestock Conservation Institute Ann.Mcctg. -1986,-Vol. 39. -P. 143 146.

104. Ducatelle, R. Immunoperoxidase study of Aujeszky's disease in pigs / R. Ducatelle, W. Coussement, J. Hoorens // Res. Vet.Sci. 1982. - Vol. 32. - P. 294 - 302.

105. Effect of the concentration of maternal antibodies on the neural invasion of Aujeszky's disease virus in neonatal pigs / S.K. Krilas, H.J. Nauwynck, II.B.Pensaert . r S.C. Kyriakis//Vet. Microbiol. 1997. - Vol. 55, №1/4. - P. 29 - 36.

106. ELISA microtiter plates / R.F. Vogt, D.L. Phillips, L.O. Henderson ct al. // J. Immunol. Methods. 1987. - Vol. 101. - P. 43 - 50.

107. Eloit, M. Identification of antigenic sites on pseudorabies virus glycoprotein gp50 implicated in virus penetration of the host cell / M. Eloit, H. Bouzghaia, B.Toma // J. Gen. Virol. 1990,-Vol. 71, №9.-P. 2179 - 2183.

108. Engel, M. Eradication of Aujeszlcy's disease virus from a Swedish pig herd using gl/TK-vaccine / M. Engel, M. Wierup // Vet.Rec. 1997. - Vol. 140. - P. 493 - 495.

109. Engel, V. Vaccination and eradication programme against Aujeszky' s disease in Sweden, based on agl ELISA test / M. Engel, M. Wierup // Vet. Rec. 1989. Vol. 125. -P. 236 - 237.

110. Engvall, E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) "Quantitative assay of immunoglobulin G / E. Engvall, P. Perlmann // Immunochemistry.- 1971.- Vol. 8,-P. 871 874.

111. Evalution of two ELISA kits for the detection of Aujeszlcy's disease antibodies in pigs / M. Arias, M. Moyano, J.M. Escribano, J.M. Sanchez-Vizcaino // Vet. Rec. 1992,-Vol. 131.-P. 391 -393.

112. Fujita, T. Aujeszky' s disease control program in Japan / T. Fujita // Aujeszlcy's Disease: OlE Symp. Bangkok, Thailand, 1994. - P. 85-96.

113. Genetic basis of the ncurovirulcnce of pseudorabies virus / B. Lomniczi. S. Watanabe, T. Ben-Porat. A.S. Kaplan // J. Virol. 1984. - Vol. 52. - P. 198 - 205.

114. Genetic engineering of the pseudorabies virus genome to construct live vaccines / L.E. Post, D.R. Thomsen, Е.Л. Petrovskis et al. // J. Rcprod. Fcrt. 1990. - Vol. 41. -P. 97- 104.

115. Glycoprotein gill of pseudorabies is multifunctional / C. Schreurs. T.C. Mettcnleiter, F. Zukermann Let al. // J.Virol.-1988,-Vol. 62, № 7. P. 2251 - 2257.

116. Genetically engineered pseudorabies virus vaccine with detection in thymidine kinase and glycoprotein genes / S. Kit, M. Kit, M.J. Bartko, C. Dees // Vaccines-87 Modern Approaches to new Vaccines. N. Y.: gold Spring Harbor Lab. 1987.1. P. 345 349.

117. Grom, J. Monoclonal blocking ELISA detecting Aujeszky' s disease virus to the dlycoproteins gl and gll / J. Grom, N. Linde. S. Ljung // Proc.l2th IPVS Congr.- Den Haag, 1992.-P.82.

118. Grom, J. Aujeszky' s disease virus antibodies detected by gE,gB,gC ELISA / J. Grom. N. Linde, B. Klingeborn // Proc. 3rd Congr. Europ. Soc.Vet.Virol. lntcrlalcen. Switzerland, 1995. - P. 142 - 146.

119. Gustafson, P.D. Pseudorabies / P.D. Gustafson // Diseases of Swine: 3rd ed. by H.W. Dunne. Ames, Iowa, 1970. - P. 337-355.

120. Gustafson, P. D. Pseudorabies / P.D. Gustafson // Disease of Swine. Scs.2. Viral. disease.-Ch.18. Ames, Iowa, 1975.-P. 391 -410.

121. Gustafson, D.P. Pseudorabies / P.D. Gustafson // Manual of Small Animal 1 Infections Diseases. N. Y. etc., 1988. - P. 25 - 30.

122. Haffcr, K. Indirect hemagglutination test for pseudorabies antibody detection in swine / К. I Iaffer, D.P. Gustafson, C.L. Kanitz // J.Clin.Microb. 1980. - Vol. 11. - P. 217-219.

123. Herpes simplex virus 1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family / R.I. Montgomery, M.S. Warner, B. Lum, P.G. Spear // Cell. -1996.-Vol. 87.-P. 427 -436.

124. Hirose, O. Current situation of Aujeszky's disease vaccination program / O. Hirosc // 44 th Japan Workshop on Pig Diseases held at Kitazato Institute. Japan, 1993.

125. Hopp, W. Constancy of Aujeszky's field virus antibody titres in sows repeatedly vaccinated with a gl-ncgative vaccine / W. Hopp, R. Jungblut // Acta Vet. Hungarica. -1994.-Vol. 42.-P. 409 -413.143. http://www.oic.int/wahid-prod/public.php?page-=home

126. Hwa-Tsung, S. Eradication of Aujeszky's disease in Taipei, China / S. IIwa-Tsung, Y. Ping-Cheng // Aujeszky's Disease: OIE Symp. Bangkok, Thailand, 1994.-P. 97 - 103.

127. Identification of pseudorabies virus-exposed swine with a gl glycoprotein enzyme-linked immunosorbent assay / M.W. Mellencamp, N.E. Pfeifer, B.T. Suiter et al.| // J. Clin.Microbiol. 1989. - Vol. 27. - P. 2208 - 2213.

128. Identification of the pseudorabies virus glycoprotein gp5() as a major target of neutralizihg antibodies / M Eloit, D.Frageaud, R. L'Haridon, B. Toma // Arch.Virol. 1988. - Vol. 99. - P. 45 - 56.

129. IDEXX instruction for an enzyme immunoassay for the detection of antibody in chicken serum. IDEXX Laboratories, Inc. USA, 1996.

130. Immunoprophylaxis of Aujeszky's disease in pids. 4. Evaluation of efficacy of an inactivated and an attenuated vaccine in pigs / J. Madic, L. Markus-Cizclj, S. Cajavec et al. // Vet. Arch. 1992. -Vol. 62, № 1. -P. 15-23.

131. Inactivation of thye thymidine kinase gene of a deletion mutant of pseudorabies virus generates a safe but still highly immunogenic vaccine strain / R.J.M. Moorman. T. De Rover, J. Briaire etal.//J. Gen. Virol. 1990. - Vol. 71.-P. 1591 - 1595.

132. Katz, J.B. Recombination in vivo of pseudorabies vaccinc strains to produce new virus strains / J.B. Katz, L.M. Henderson, G.A. Ericlcson // Vaccine. 1990. - Vol. 8, № 3.-P. 286 -288.

133. Katz, J.B.Analysis of glycoprotein 1 negative and abberant pseudorabies viral diagnostic isolates / J.B. Katz, J.C. Pederson // J.Vet.Res.-1992.-Vol. 53,- P.2259-2266.

134. Kemeny, D.M. Microtitre plates and other solid phase supports / D.M. Kcmeny. S.J. Chailacombe // ELISA and Other Solid Phase Immunoassays. Chichester ets, 1988,- P. 31-39.

135. Kemeny, D.M. An introduction to ELISA / D.M. Kemcny, S. Chantler // ELISA and Other Solid Phase Immunoassays. Chichester ets, 1988.- P. 3-5.

136. Kimman, T.G. Immunological protection against pseudorabies vims / T.G. Kimman // Aujezsky's Disease: OIE Symp. Bangkok, Tailand, 1994. - P. 11 - 22.

137. Kit, M. Sensitive glycoprotein gill blocking ELISA to distinguish between pseudorabies (Aujeszky's disease) infectcd and vaccinated pigs / M. Kit, S. Kit // Vet. Microbiol. - 1991,-Vol. 28.-P. 141 - 155.

138. Kit, S. Safety and efficacy of genetically engineered Aujeszky's disease vaccines / S. Kit // Vaccination and Control of Aujeszky' s Disease / J.T. Van Oirshot ed. -Dordrech, 1989. P. 45 - 55.

139. Klein, R.J. The pathogenesis of acute, latent and recurrent Herpes Simplex Virus infection / R.J. Klein // Arch. Virol. 1982. - Vol. 72. - P. 143 - 168.

140. Kooij, D. Economic aspects of the control of Aujeszky' s disease in the European Community / D. Kooij // Acta Vet. Hungarica. 1994. - Vol. 42. - P. 405 - 408.

141. Latency characteristics of pseudorabies vaccine viruses / H.J. Rziha, V. Ohlinger, D.J. Lutticken. N. Visser // Vaccination and Control of Aujcszky's Disease. Dordrecht ctc., 1989.-P. 79 85.

142. Lomniczi, B.Multiple defects in the genome of pseudorabies virus can affect virulence without dctectably affecting replication in cell culture / B. Lomniczi, A.S. > Kaplan, T. Ben-Porat // Virology. 1987. - Vol. 161. - P. 181 - 189.

143. Marker vaccines, virus protein-specific antibody assays and the control of Aujeszky' s disease / J.T. Van Oirschot, A.L. Gielkens, R.J. Moormann, A.J. Bcrns // Vet. Microbiol. 1990. - Vol. 23. - P. 85 - 101.

144. Mayer, J.IT. A comparison of serum neutralization and agar-gel immunodiffusion for the delection of pseudorabies antibody / J.H. Mayer, T.W. Molitor, I.A. Scheppcr // Proc.Nat.Acad.Sci USA. 1979. - Vol. 33. - P. 45.

145. McClarcn, M.L. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Practical aspects of standardization and quality control / M.L. McClaren, J.E. Lillywhitc, C.S. Andrew//Med. Lab. Sci.- 1981.- Vol. 38,- P. 245-251.

146. McCullough, S.J. Vaccination and control of Aujeszky's disease in Northern Ireland / S.J. McCullough // Vaccination, and Control Aujeszky's Disease. Dordrecht etc. 1989.-P. 231 - 238.

147. Measurement of isotype-specific antibody responses to Aujeszky's disease virus in sera and mucosal secretions of pigs / T.G.Kimman, R.A. Brouwers, F.J. Daus |at al.| // Vet. Immunol. Immunopathol. 1992,- Vol. 31. - P. 95 - 113.

148. Mengeling, W.L. Virus reactivation in pigs latently infected with a thymidine kinase negatine strain of pseudorabies virus / W.L. Mengeling // Arch. Virol. 1991. - Vol. 120. -P. 57 - 70.

149. Mettenleitcr, T.C. Immunobiology of pseudorabies (Aujeszky' s disease) / T.C. Mettenleiter // Vet. Immunol. Immunopathol. 1996. - Vol. 54. - P. 221 - 229.

150. Mettenleiter, T.C. Molecular biology of pseudorabies. (Aujeszky's disease) virus У T.C. Mettenleiter // Сотр. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 1991. - Vol. 14. -P. 151-163.

151. Mettenleiter, T.C. Pseudorabies virus avirulent strains fail to express a major glycoprotein / T.C. Mettenleiter, N. Lukacs, H.J. Rziha // J. Virol. — Vol. 56. -P. 307 311.

152. Mettenleiter, T.C. Pseudorabies (Aujeszky's disease virus): Slate of the art. August 1993 / T.C. Mettenleiter// Acta Vet. Hungarica. 1994. - Vol. 42. - P. 153 - 177.

153. Molitor, T. Pseudorabies vaccines: past, present and future / T. Molitor, D. Thawlcy // Compend. Contin. Educ. Pract. Vet. 1987. - Vol. 9. - P. 409 -.416.

154. Moynagh, J. Aujeszky's disease and the European Community / J. Moynagh // Vel. Microbiol. 1997. - Vol. 55. - P. 159 - 166.

155. Nauwynck, H.J. Programmes for the eradication of Aujeszky' s disease virus (pseudorabies virus) in the member states of the European Union / H.J. Nauwynck. M.B. Pensaert // Aujeszky's Disease: OIE Symp. Bangkok, Thailand, 1994. - P. 55 - 65.

156. Nauwynck, H.J. Effect of specific antibodies on the cell-associated spread of pseudorabies virus in monolayers of different cell types / H.J. Nauwynck, M.B. Pensaert // Arch. Virol.- 1995,- Vol. 140,- P. 1137 1146.

157. Nieuwenhuis, H.U.R. The eradication of Aujeszky's disease in the Netherlandes / H.U.R. Nieuwenhuis // Acta Vet. Scand. 1988. - Vol. 22. - P. 161 - 163.

158. Origin of unenveloped capsids in the cytoplasm of cells infected with herpes simplex virus 1 / G. Campadelli-Fiume, F. Farabegoli, S. Di Gaeta. B. Roizman // J. Virol.- 1991.- Vol. 65.- P. 1589 1595.

159. Osorio, F.A. Diagnosis of Aujeszky's disease / F.A. Osorio // Aujeszky's disease: OlE Symp. Bangkok, Tailand, 1994. - P. 33 - 43.

160. Pereira, L. Function of glycoprotein В homologues of the family herpesviridae / E. Pereira // Infect. Agents. Dis. 1994. - Vol. 3. - P. 9 - 28/

161. Pietzarka, G. Untersuchungen zur Epide miologie der Aujeszkyschen Krankheit der Schweine in Hessen.-Inaug: Inaug.-Diss.-Giessen, 1991 5S.

162. Polymerase chain reaction amplification of pseudorabies virus DNA from acutely and latently infectcd cells / R.K. Maes, C.E. Beisel, S.J. Spatz, B.J. Thacker // Vet. Microbiol. 1990. - Vol. 24. - P. 281 - 295.

163. Processing of pseudorabies virus glycoprotein gll / U. Wolfer, V. Krufl. D. Sawitzky et al.J // J. Virol. 1990. - Vol. 64. - № 6. - P. 3122 - 3125.

164. Protection from pseudorabies virus challenge in mice by a combination of purified gll, gill and gIV antigens / T.A. Matsuda, S. Katayama, N. Okada et al. // J.Vet.Med.Sci. 1992. - Vol. 54, № 3. - P. 447 - 452.

165. Pseudorabies Virus gB Antibody Test Kit: Instruction. IDEXX Laboratories, Inc. USA, 2005

166. Pseudorabies Virus gE Antibody Test Kit: Instruction. IDEXX Laboratories, Inc. USA, 2005

167. Pseudorabies virus glycoprotein gl: in vitro and in vivo analysis of immunorelevant epitopes / W. Fuchs, H.J. Rziha, N. Lukacs et all // J.Gen.Virol.-1990- V.71.- №5,-P.l 141-1151.

168. Pseudorabies virus glycoprotein gill is a major target antigen for murine and swine virus specific cytotoxic T lymphocytes / F.A. Zuckermann, L. Zsak, T.C. Mettcnlciter. T. Ben-Porat//J. Virol. 1990. - Vol. 64, № 2. - P. 802 - 812.

169. Quist P. Detection by enzyme-linked immunosorbent assay of Aujeszky's Disease virus in tissues of infected pigs / P. Quist, A. Meyling, R. Hoff-Jorgensen // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P. 383 - 384.

170. Quist, P. Monoclonal blocking ELISA detecting serum antibodies to the glycoprotein gll of Aujeszky's disease virus / P. Quist, K.J. Sorenscs, A. Meyling // J. Virol. Methods. 1989. - Vol. 24. - P. 169 - 180.

171. Rapid diagnosis of Aujeszky's disease in pigs by improved in situ hybridization using biotinylated probes on paraffinembcdded tissue sections / K. Belak, K. Funa. R. Kelly, S. Belak // J. Vet. Med. R.B. 1989.-Vol. 36, № 1. - P. 10 - 20.

172. Rapid detection of pseudorabies virus genomic sequences in biological samples from infected pigs using polymerase chain reaction DNA amplification / A. Jestin, T. Foulon, B. Pertuiset et al. // Vet. Microbiol. 1990. - Vol. 23. - P. 317 - 328.

173. Rauh, I. Pseudorabies virus glycoproteins gll and gp50 are essential for virus penentration /1. Rauh, T.C. Mettenleiter// J. Virol.- 1991,- Vol. 65. P. 5348 - 5356.

174. Report of the pseudorabies differential diagnostic test subcommittee / C. Kanitz, L. Ludeman, R. Maes et al. // Proc. 96th Ann. Meet. U. S. Animal Health Assoc. 1992. -P. 440-441.

175. Replication and virulcnce of pseudorabies virus mutants lacking glycoprotein gX / D.R. Thomson, C.C. Marchioli, R.J. Yancey, L.E. Post // J. Virol. 1987. - Vol. 61. -P. 229 - 232.

176. Recombinant gE-based differencial ELISA for PRV infected and gE-deleted PRV vaccinated pigs / G.Z. Tong, J.Q. Ni, S.J. Zhang et al. //Proc. 16th Int. Pig Vet. Soc. Congr. Melbourne, Australia, 2000. - P. 558.

177. Role of glycoproteins of pseudorabies virus in eliciting neutralizing antibodies / T. Ben-Porat, J.M. DeMarchi, B. Lomniczi, A.S. Kaplan // Virology. 1986. - Vol. 154. -P. 325 - 334.

178. Round table on controle of Aujeszky's disease and vaccine development based on molecular biology / M. Pensaert, A.L.J. Giclkens, В Lomniczi et al. // Vet. Microbiol. -1992.-Vol. 33.-P. 53 67.

179. Sabo, A. Rapid diagnosis of Aujeszky's disease by the fluorescent technique / A. Sabo, J. Rajcani // Acta Virol. 1970. - Vol. 14. - P. 475 - 484.

180. Sawitzky, D. Entry of pseudorabies virus into CHO cells is blocked at the level of penentration / D. Sawitzky, II. Ilampl, K.-O. Habermehl // Arch. Virol. 1990. - Vol. 115. №3/4.-P. 309 - 316.

181. Schoenbaum, M.A. Pseudorabies virus latency and reactivation in vaccinated swine / M.A. Schoenbaum, G.V. Beran, D.P. Murhy // Am. J.Vet. Res. 1990. - Vol. 51.-P. 334-338.

182. Shigcki. I. Characterization of pseudorabies virus neutralization antigen glycoprotein gill produced in insect cells by a baculovirus expression vector / I. Shigcki. Y.Shunji // Virus Res. 1991. - Vol. 21, № 2. - P. 123 - 139.

183. Second-generation pseudorabies virus vaccine with deletions in thymidine kinase and glycoprotein genes / S. Kit, M. Shepard, II. Ichimura, M. Kit // Am. J. Vet. Res. -1987.-Vol.48.-P.780 793.

184. Snyder, M.L. Applications of an enzyme labeled antibody test in porcine pseudorabies / M.L. Snyder, W.C. Stewart // Proc. Annu. Meetg. Am. Assoc. Veter. Lab. Diagnostic. 1977. - P. 17-32.

185. Sorensen, K.J. Aujeszky' s disease blocking ELISA for the delection of serum antibodies / K.J. Sorensen, J.C. Lei //J. Virol. Methods. 1986.-Vol. 13. - P. 171- 181.

186. Srtuctural organization of the termini of the L and S components of the genome of pseudorabies virus / J.M. De Marchi, Z. Lu, G. Ball et al. // J. Virol. 1990. - Vol. 64. № 10. - P. 4968 -4977.

187. Suhaci, I. Cultivation of the virus of Aujeszky's disease in the chick embryos / I. Suhaci, R. Vrasche, V. Tomescu // Studii Cere. Infamicrobiol. 1956. - Vol. 7. - P. 111117.

188. Taft, A.C. The eradication of Aujeszky's disease in the united states / A.C. Та ft // Proc.l6th Int. Pig Vet Soc. Congr. Melbourne, Australia, 2000. - P. 559.

189. Thayer, S.G. Comparison of two commercial enzyme-linked immunosorbent assays and conventional methods for avian serology / S.G. Thayer, P. Villegas, O.J. Fletcher 11 Avian Dis. 1987. - Vol. 31,- P. 120 - 124.

190. The adsorption of pseudorabies virus glycoprotein gill to the host cell / A. Matsuda Tsuchida, N. Okada, S. Katayama et al.J // J. Vet. Med. Sci. 1991. - Vol. 33, № 5. -P. 957 - 958.

191. The gene encoding the gill envelope protein of pseudorabies virus vaccine strain Bartha contains a mutation affecting protein localization / A.K. Robbins, J.P. Ryan. M.E. Whealy, L.W. Enquist // J.Virol. 1988. - V.63. - P. 250-258.

192. The DNA sequence of equine hcrpesvirus-1 / E.A. Telford, M.C. Watson. K. McBride, A.J. Davison// Proc. Nat. Acad. Sci,USA.-1992. Vol. 89. - P. 304 - 316.

193. The DNA sequence of equine hcrpesvirus-4 / E.A. Telford, M.C. Watson, J. Perry ct al. // J. Gen. Virol. 1998. - Vol. 79. - P. 1197 - 1203.

194. Tonelli, Q.J. Development and validation of Herdchcck pseudorabies virus gX and gl antibody test kits for use with gene-deleted pseudorabies vaccines / Q.J. Tonelli // Proc. 1st Int.Symp.Erad. Pseudorabies Virus. St.Paul, 1991. - P. 301.

195. Traub, E. Cultivation of pseudorabies virus / E. Traub // J. Exp. Med. 1993. -Vol. 58.-P. 663 - 681.

196. Ultrastructural analysis of the replication cyclc of pseudorabies virus in ecll culture: a reassessment / II. Granzow, F. Weiland, A. Juns at al.J // J. Virol. 1997. - Vol. 71. -P. 2072-2082.

197. Use of muscle exudates for the detection of anti-gE antibodies to Aujeszky' s disease virus / M.F. Le Potier, A. Fournier, C. Floudayer et al. // Vet. Rec.- 1988. -V.143. P. 385-387.

198. Vannier, P. Eradicaion and control programmes against Aujeszky' s disease (pseudorabies) in France / P. Vannier, F. Vedeau, C. Allemeersch // Vet. Microbiol. -1997.-Vol. 55.-P. 167 173.

199. Van Oirschot, J.T. The antibody response to glycoprotein gl and the control of Aujeszky' s disease virus / J.T. Van Oirschot // Vaccination and Control of Aujeszky's Disease / J. T. Van oirschot. Dordrecht, 1989.-P. 129 - 138.

200. Van Oirschot, J.T. Properties of gl-ncgative and companion diagnostic tests for the eradication of Aujeszky's disease / J.T. Van Oirschot // Proc.Ninety-Sixth Ann.Meet. U. S. Animal Health Assoc. 1992. - P. 405 - 416.

201. Van Oirschot, J.T. Comparison of two ELISAs for detecting antibodies to glycoprotein I of Aujeszky' s disease virus / J.T. Van Oirschot, H.L Oci // Vct.Rcc.r1989.-Vol. 125.-P. 63 -64.

202. Variability of pseudorabies virus glycoprotein I expression / T.C. Mettcnlcitcr. C. Schereurs, I I.J. Thiel, H.J. Rziha//Virology. 1987.-Vol. 158.-P. 141-146.

203. Visser, N. Experiences with a gI-/TK- modified live pseudorabies virus vaccine: strain Begonia / N. Visser, D. Luttichen // Vaccination-and Control of Aujeszky's Disease. Dordrecht, 1989. - P. 37-34.

204. Wang, F.I. Single dilution indirect solid-phase radioimmunoassay for the detection of anti-pseudorabies immunoglobulin G in swine sera / F.I. Wang, E.C. Hahn // Am. J. Vet. Res. 1986. - V.47. - P. 1495-1500.

205. Wardley. R.C. The use of the gX deleted vaccinc pry gX-1 in the control of Aujeszky's disease / R.C. Wardley, L.E. Post // Vaccination and Control of Aujeszky's Disease. Dordrecht, 1989. - P. 13 - 25.

206. Wheeler, J.G. Investigation of sites of PRV latency using polymerase chain reaction / J.G. Wheeler, F.A. Osorio //Am.J. Vet. Res. 1991. - Vol. 52. - P. 1799 - 1803.

207. Wittman, G. Spread and control of Aujeszky' s Disease / G. Wittman // ComP. Immun.Mierobiol. Infect. Dis. 1991. - Vol. 14. - P. 165 - 173.

208. Wittman, G. Occurrence and reactivation of latent Aujeszky' s disease virus following challenge in previously vaccinated pigs / G. Wittman, V. Oilinger, II.J. Rziha // Arch. Virol. 1983. - Vol. 75. - P. 29 - 41.

209. Wittman, G.Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs / G. Wittman, H.J. Rziha // Herpesvirus Diseases in Cattle, Horses and Pigs / ed. by G. Wittman. Kluver, Boston, 1989.-P. 230- 325.

210. Zuckermann, F.A. Role of pseudorabies virus glycoproteins in immune response / F.A. Zuckermann, T.C. Mettenleiter, T. Ben-Porat // Vaccination and Control of Aujeszky's Disease. Dordrecht, 1989. - P. 110 - 117.