Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Технология изготовления сухой ослиной гемолитической сыворотки для серологических реакций

КАЗАХСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

Казахский научно-исследовательский ветерннарный институт

«V " I

П Г Б ОД

- Я На правах рукописи

~ " УДК 619:612-017:615-373

САЙДУЛДИН ЕРКИН ТЛЕУБЕРДЫУЛЫ

ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СУХОЙ ОСЛИНОЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

16.00.03. — ветеринарная микробиология, иммунология, эпизоотология и инфекционные болезни животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

АЛМАТЫ, 1996

Работа, выполнена на кафедре эпизоотологии Аллиипинского зооветеринарного института и в отделе бруцеллеза Казахского научно-исследователыжого ветеринарного института.

Научный руководитель

член-корреспондент КазАСХН доктор ветеринарных наук, профессор, Н. П. Иванов

Ведущая организация ■

Казахский научно-исследовательский институт микробиологии, эпидемиологии и инфекционных болезней

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ж. Ж. Жумашев

доктор медицинских наук, профессор К. Б. Садыков

Защита состоится « ¿V » О^ 1996 г. в /О час. на заседании специализированного совета Д 55.03.01 при Казахском научно-исследовательском ветеринарном институте по адресу: ■ 480016, Алматы, проспект Райимбека, 223.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « ^ ■» 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор ветеринарных наук 'ыл^ ^ - Б. Ф. Керимжанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Л/стучуялясл^ mej'tt. В серологической диагностике инфекционных „ инвазионных болезней кроме антигена, специфического по отношено к каждому возбудителю, применяются также универсальные препа-аты, такие как гемолизин и комплемент. Потребность в них ветерннар-ых и медицинских лабораторий определяется количеством проб псдле-ащего исследованию материала. При этом важно отметить, что произ-здство гемолитической сыворотки в Республике Казахстан не осущест-гается. Между тем число инфекционных, а также инвазионных болез-:й, диагностику которых проводят с помощью реакций, где использу-гся гемолизин (РСК и ее варианты), быстро растет. Кроме того в прак-{ку предложены и новь!е серологические тесты: реакция связьгоания энппотшшрующего комплекса, ее длительный вариант, реакция агрс-фовання иммунных комплекссов, реакция связывания комплемента -эшади, при постановке которых в качестве компонента также применятся гемолитическая сыворотка.

Существующая в настоящее время технология изготовления гемопи-1ЧССКОЙ сыворотки основана на исследованиях J. Bordet (1895, 1898), роведенных еще в прошлом веке. При этом препарат получают га кро-1 кролика, иммунизированного эритроцитами барана, н выпускают в идком виде, консервированном глицерином. Данная технология не в элной мере отражает научный опыт, накопленный в этой отрасли ганнй. Поэтому необходимость производства гемолитической сьгоорот-1 в Республике Казахстан очевидна, а изыскание приемлемых н более гшевых методов изготовления этого препарата актуально.'

Цель и задач» исследований. Целью исследований является размотка и внедрение в практику доступного и дешевого способа изго-)вления сухой гемолитической сыворотки посредством использования шов в качестве продуцентов, удобных для эксплуатации.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать схему иммунизации ослов - продуцентов гемолитической сыворотки;

2. Установить оптимальный режим эксплуатации ослов-продуцентов;

3. Разработать технологию изготовления сухой ослиной гемолитической сыворотки;

4. Обосновать основные параметры для определения контрольных показателей качества сухой гемолитической сыворотки;

5. Испытать сухую ослиную гемолитическую сыворотку в серологических реакциях.

Научная повита. Впервые разработаны метод получения гемолитической сыворотки из крови ослов путем пшериммунизации их эритро-щг/арными антигенами овцы ( КузлЬ? № 174 от 24.06.1994 г. на объест интеллектуальной собственности), технология изготовления и методы контроля качества сухой ослиной гемолитической сыворотки, составлена нормативно-техническая документация на этот препарат.

Пракш-.¡ческах иешюсть. Промышленное изготовление сухой ослиной гемолэтичгскоП сыворотки согласно разработанной нами нормативно-технической документации позволит удовлстаор»ггь потребность г ней ветеринарных диагностических лабораторий Республики Казахстан и снизит затраты на ее производство.

Внедра ие. Освоена промышленная технология изготовления сухо? ослиной гемолитической сыворотки для серологических реакций в условиях Алматинского биокомбината и выпущено 6 опытных серий препарата, которые удовлетворили потребность ветеринарных диагностических лабс^раторнй Республики Казахстан за 1994 - 1995 годы. Этот диаг-ностнкум рекомендован таюте для применения в медицинской практик! и при общих иммунологических исследованиях.- Способ получения > методы применения ослиной гемолитической сыворотки внедрены I

небный процесс на кафедре микробиологии и вирусологии Алматин-:кого ЗВИ.

Oauwiut положат,% ашоегипif. па innnsniy:

1. Схема иммунизации ослов для получения гемолитической сыво-зотки против эрщроцитов барана;

2. Регким эксплуатации ослов - продуцентов гемолитической сы-зороткн;

3. Технология изготовления сухой ослиной гемолитической сьгао-зотки для серологических реакций;

4. Методы контроля качества сухой оелнггой гемошттской сыворотки для серологических реакций;

5. Результаты испытания сухой ослиной гемолитической сыворотки з серологических решениях при диапгосппсе бруцеллеза крупного рогатого скота.

Агрэб&ииярайать Основные полоштия диссертации доложены на 1 Ме:кдународной научно-практической конференции по аграрным проблемам (Алматы, 1993), Республиканской научно-практической конференции, посвященной 150 -лгтнго А б ал Кушнбасва (Алматы, 1995), М.жлуплрэяксг! научно-практической конференции "Молодежь н ее вклад в пауку з период реформ" (Акмола, 1995), ученом сслгте КазНИВИ (1993-1996), научно-техническом совете Алматинского ЗВЙ (1996), заседании сотрудников отдела бруцеллеза КазНИВИ (! 996) и на мезхлабораторном заседании сотрудников КазНИВИ (1996).

Пхйшзшшк По материалам диссертации опубликовано б печатных работ, получено 1 свидетельство (кузтк) на объест интеллектуальной собственности, 3 нормативных документа.

Объел1 и структура, даесертсоат. Диссертация изложена иа 169 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Материалы диссертации ¡ш-

люстрированы 23 таблицами и 6 рисунками. Список литературы содер жит 126 источников, из которых 40 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе по изготовлению гемолитической сыворотки были использованы 36 ослов и 5 валухов, гемолизин доя РСК производства Курско биофабрики, сухой комплемент морской свинки для РСК производств Алматинского биокомбината, антиген единый бруцеллезный для РА РСК производства Херсонской биофабрики, конглютинирующая сывс ротка для РСКК производства Алматинского биокомбината.

За период исследований изготовлено 6 опытных серий сухой оста ной гемолитической сыворотки, во время чего отрабатывали метод контроля качества этого препарата. Испытания сухой ослиной гемол; тической сыворотки проводили на 57 пробах бруцеллезной сыворотки 1186 пробах сыворотки крови животных из неблагополучного по брз целлезу хозяйства.

В работе были использованы следующие методы:

Исследования сыворотки крови крупного рогатого скота на бруце: лез в РСК и РДСК проводили согласно "Наставлению по диагноетт бруцеллеза животных", утвержденному Главным управлением ветерин: рин Минсельхоза СССР от 30 декабря 1982 г. Постановку РСКК ос; ществляли согласно "Наставлению № 044-3 от 16 ноября 1990 г. по по. тановке VI учету реакции связывания конглютинирующего комплекс при исследовании сыворотки кровн крупного рогатого скота для выл: ления антител к возбудителю бруцеллеза".

Для приготовления стромы эритроцитов, последние лидировали | холоду'В подкисленной дистиллированной воде . Затем строму тгцател: ио отмывали путем центрифугирования холодным 0,001 М ацетатны буфером, после чего кипятили 1 ч и дисперпфовали в магнитной меша;

ке до состояния гомогенности. Содержание белка в гомогенате определяли по модифицированному методу Лоури, после чего готовили суспензию с содержанием белка 20,0 мг/см3.

Для получения точных и воспроизводимых результатов серологических тестов эритроцитарную взвесь стандартизировали путем фото-метрирования на ФЭК-М с использованием кривых контроля Л.С. Резниковой (1967) и Е. Касымова (1990).

В сухом препарате гемолитической сыворотки определяли остаточную влажность согласно ГОСТ 24061-89, содержание борной кислоты -по методике, изложенной в Государственной фармакопеи (X издание, 1969), содержание сернокислого магния - согласно ГОСТ 16446-78.

Титрование гемолизина и комплемента провод!аги согласно "Наставлению по диагностике бруцеллеза животных" оз" 30 декабря 1982 г.

Статистическая обработка результатов серологических исследований осуществляли по методу Т. Сандудпипа (1981).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Гипериммуниэация и эксплуатация ослов-продуцснтоз

В качестве продуцентов гемолитичесхой сыворотки отбира/ги ослов з возрасте от 1 до 4 лет с массой тела не менее (00 кг. Для выяснения оптимальной дозы антигена были сформированы по принципу аналогов 3 группы по 3 животных в казкдой. С трехдневными промежутками всем ослам ваодаши 50 % взвесь отмытых в физиологическом растворе эритроцитов барана. Первые два раза такие инъекции осуществляли внутривенно, последний - подкожно. Ра5ница между группами состояла в дозировке вводимого антигена - в первой группе ока составила 25,0 см3, во второй - 50,0 см3 я в третьей 100,0 см3. Перед первой инъекцией, а в последующем через каждые 3 дня, у животных брали кровь для опреде-

яешш титра гемолизина.

Установлено более позднее появление гемолизина медленное нарастание его титров в сыворотке хрови животных первой группы, пс сравнению с аналогичными результатами в двух других группах, то антитела к эритроцитам барана обнаруживались раньше, но их дина мика резко отличалась между собой. Так, во второй группе титры сыво роток быстро нарастали, достигнув к 9 - 12-му дням с начала опыта наи большего показателя 1:250 (+26,6 %; - 21,1 %) (рисунок 1). В третье! группе, после раннего появления антиэритроцитарных антител, дальней шего повышения гемолитической активности сывороток крови не отме чали, наоборот, происходило снижение этого показателя. Исхода из из ложенного, оптимальной разовой дозой введения 50 % взвеси эригро Ц1ГГ0В барана был признан ее объем 50,0 см3.

Г т т

в/в в/в п/к В - доза эритроцитар-

ного антигена

иммунизация

Рисунок 1

Динамика выработки гемолизина у ослов-продуцеито: при разной дозе эритроцнтарного антигена.

Для определения сроков начала второго цикла введения антигена 9 ослам 2 раза внутривенно, а третий раз подкожно, вводили по 50,0 см' 50 % взвеси эритроцитов барана, после чего животные были разделены на 3 равные группы. В первой группе по прошествии 30 дней, во второй - 45 дней, а в третьей - 60 дней осуществляли второй цикл иммунизации, включающий 3 подкожные инъекции, с трехдневным интервалом, 50,0 см3 50 % взвеси эритроцитов.

После завершения первого цикла иммунизации средний титр гемолизина составлял 1:200 (+8,7 %; - 8,0 %). В начале второго цикла этот показатель составил в первой группе 1:100, во второй -1:70 (+ 26,6 %; -21,1 %), а в третьей - анттритроцитарные антитела обнаружены не • были.

1:1600

первый (подготовительный) цкял !г.п;у1П(зацш1

Рисунок 2

второй ,

(з&клгочвтельпый) цикл иммултацкв 1ТГ - введение эрнтроидтяриого атпгена Титры гемолизина у ослов-продуцентов в зависимости от продолжительности перерыва между циклами иммунизации.

После второго цикла иммунизации уровень гемолизина достиг в первой группе - 1:320 (+ 26,6 %; - 21,1 %), во второй - 1:490 (+ 26,6 %; - 21,1 %), а в третьей - 1:1600 (рисунок 2). Таким образом, наивысший результат получен при реиммунизацни продуцентов гемолитической сыворотки после 60-дневного перерыва.

После завершения второго цикла иммунизации у 5 ослов, начиная с второго по восьмой день, ежедневно брали кровь и определяли титр гемолизина для выяснения оптимального срока кровопускания. Наивысшие титры в пределах 1:1500 - 1:2000 были установлены на 4 - 5-ый день после завершения гипериммунизации. Эти сроки были признаны наиболее подходящими для кровопускания у продуцентов.

Таким образом, отработанная нами схема гипериммунизации состоит из двух циклов: первого, включающего две внутривенные и одну подкожную инъекции 50,0 см150 % взвеси эритроцитов барана, и второго -с трехкратным подкожным введением антигена, с перерывом между циклами в 60 дней. Интервал между инъекциями составляет 3 дня, кровопускание осуществляется через 4 дня после завершающего введения антигена, из расчета 1600,0 см3 на 100 кг массы продуцента.

Используя представленную схему, 6 ослов, от которых получена гемолитическая сыворотка с титром 1:1000 (у четырех) и 1:500 (у двух), подвергли гипериммунизации.

В дальнейшем, для повторного использования с целью получения ги-периммунн й гемолитической сыворотки, после двухмесячного перерыва, было сформировано две группы по 3 осла в каждой. Животных первой группы иммунизировали 50 % взвесью эритроцитов подкожно в дозе по 50,0 см3 трехкратно с интервалом в 3 дня. Вторая группа в качестве аншгена, получала строму эритроцитов барана с содержанием белка 20 мг/см3. Антиген вводили с той же кратностью, что и продуцентам первой группы, но в дозе 3,0 см3. По прошествии 4-х дней со времени завершающей цикл иммунизации инъекции осуществляли кровопускание. В

первой группе ппры гемолизина составили у двух ослов - 1:500, у одного - 1:1000, со средним значением - 1:666. Во второй группе у двух ослов установлен титр гемолизина 1:1500, у одного 1:2000, со средним пока-" зателем 1:1666. После двухмесячного отдыха два животных первой и одно второй групп были подвергнуты иммунизации стромой эритроцитов по вышеописанной схеме, в результате чего, от всех трех продуцентов получена гемолитическая сыворотка с титром 1:1500.

Уже во втором цикле при первоначальной гипериммунизации животные трудно переносили иньекции цельных эритроцитов. Поэтому, было целесообразным уже на этом этапе использовать в качестве антигена строму эритроцитов барана. Опыт, проведенный по этой схеме на б животных, дал следующий результат. У трех ослов титры антиэритро-цитарных антител были равны 1:1500, в трех других случаях - 1:1000, со средним значением 1:1250. После двухмесячного перерыва животных иммунизировали путем трехкратного введения 3,0 см3 эритроцитарной стромы с интервалами в 3 дня. При этом средний титр по группе тахже составил 1:1250, при несколько иных индивидуальных показателях: в двух случаях -1:500, в двух - 1:1000, в одном -1:2000.

Учитывая приведенные результаты, при изготовлении опытных серий гемолитической сыворотки принят следующий режим эксгщуатации продуцентов: животным вводится два раза внутривенно и один раз подкожно по 50,0 см3 50 % взвеси отмытых эритроцитов барана. Этот этап является грундиммунизацией, после которой не проводится кровопускание. Через 60 дней после завершающей первый цикл инъекции антигена, трехкратно, с интервалами в 3 дня, подкожно вводится по 3,0 см3 стромы эритроцитов с содержанием белка 20,0 мг/см1. Спустя 4 дня после последней инъекции производится кровопускание. Дальнейшая эксплуатация ослов-продуцентов может быть осуществлена после двухмесячного перерыва, путем иммунизации их промой эргпроцитоз по схеме второго цикла.

И

ч

Таким образом, использование для гипернммунизации ослов вместо цельных эритроцитов их стромы позволило длительно эксплуатировать животных без осложнений, получая гемолитическую сыворотку с высоким титром.

3.2. Технология изготовления сухой ослиной гемолитической сыворотки

Разработка технологических процессов изготовления сухой ослиной гемолитической сыворотки проводили по следующим направлениям: составление серии готового препарата, стабилизация нативной сыворотки путем добавления различных ингредиентов и прогревания, расфасовка и сублимационная сушка, контроль качества готового сухого препарата, маркировка, упаковка и хранение. Из всех перечисленных процедур особо тщательно отрабатывали методы стабилизации нативной гемолитической сывортки. Остальные процессы осуществляли по нормам, принятым в биологической промышленности. За основу брали правила и приемы, применяемые на Алматинском биокомбннате при изготовлении сухого комплемента морской свинки и сухой конппотини-рующей сыворотки крупного рогатого скота. Наши исследования имели цель определить приемлемость используемых приемов для изготовления сухой ослиной гемолитической сыворотки и при необходимости внести соответствующие коррективы.

Режим прогревания нативной ослиной гемолитической сыворотки определяли в опыте с 7 пробами. Испытание проводили в условиях водяной бани с ультратермостатом путем нагревания опытных образцов в течение 30 минут при температуре от 54°С до 70°С с интервалами в 2°С. В качестве оптимальной была выбрана температура 58°С, при которой полностью утрачивалась комплементарная активность гемолитических сывороток без отрицательного влияния на титр гемолизина. Опыт показал, что такое прогревание лучше осуществлять после внесения в натив-

ную сыворопсу 5 % сернокислого магния и 2 % борной кислоты. Режим лиофильного высушивания, принятый для изготовления других препаратов из сыворотки крови животных, оказался вполне приемлемым для ослиной гемолитической сыворотки.

Для выяснения влияния технологических процессов на специфическую активность препарата, на разных этапах его изготовления из каждой из шести изготовленных нами опытных серий было взято по 5 проб: нативной сыворотки после составления серии, после добавления сернокислого магния и борной кислоты, после прогревания при 58°С, после завершения замораживания при минус 42°С в процессе лиофилизации, после запаивания ампул с готовым сухим препаратом. В хаждон пробе определяли титр гемолизина и испытывали его активность в РСК на бруцеллез. Во всех шести сериях сухой гемолитической сыворотки тнтр, установленный на первом этапе составления серии нативной сыворотки, сохранился без изменения на всех последующих стадиях технологического процесса.

Специфическую активность препарата в РСК определяли при исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота с наличием бруцеллезных антител в титрах от 1:5 до 1:160. Все пробы ослиной гемолитической сыворотки на разных стадиях изготовления показали результаты, аналогичные соответствующим показателям при постановке реакции с использованием коммерческого кроличьего гемолизина.

Одна из опытных серий сухой ослиной гемолитической сыворотки имела титр 1:500. Наставление по применению гемолитической сыворотки кролика, консервированной глицерином, запрещает использование препарата с такой активностью. Нами изучалось влияние повышенных концентраций консервантов, создающихся при низких разведениях ослиного гемолизина, в случае относительно меньшей его активности, на результаты РСК. Опыты показали, что увеличение содержания борной кислоты и сульфата магния в тест-системе, если препарат имеет низ-

кис пары (1:10, 1:50), не оказывай- отрицательного влияния на ход реакции.

3.3. Контроль качества и режим хранения сухой ослиной гемолитической сыворотки

Исходя из общепринятых требований, предъявляемых к аналогичным препаратам, и собственных исследований, были определены следующие нормативные показатели для контроля качества готовой сухой ослиной гемолитической сыворотки:

- растворимость - менее 3 минут;

- влажность - менее 3 %;

- наличие сульфата магния - 4,5 - 5,5 %;

- наличие борной кислоты - 1,8 • 2,2 %;

- титр гемолизина - не ниже 1:500.

Испытаниям были подвергнуты 6 опытных серий. По внешнему виду препарат представлял собой сухую, пористую однородную массу светло-желтого цвета. При добавлении дистиллированной воды и легкого встряхивания содержимое ампул полностью растворялось в течение 2,2 - 3 минут с образованием прозрачной, слегка опалесцирующей жидкости желтовато-розового цвета (таблица 1). Остаточная влажность разных серий препарата составила от 2 % до 2,8 %.

Содержание сульфата магния определяли после растворения сухой гемолитической сыворотки в дистиллированной воде в соотношении 1:25 путем титрования 0,1 N раствором трнлона Б в присутствии аммиачного раствора хромового индикатора. Количество сернокислого магния в разных сериях препарата находилось в пределах 4,7 - 4,9 %.

Определение содержания борной кислоты в готовой сухой ослиной гемолитической сыворотке проводили титрованием 0,1 N раствором едкого натрия. Этот показатель колебался в разных сериях от 1,8 % до 2,0 %.

и

Таблица I

Контрольные показатели сухой гемолитической сыворотки 6 опытных серий

Показатели Норма Номера серии

1 2 3 4 5 б

Растворимость, мин менее 3 2Д 3 2,6 2,4 2,4 2,3

Наличие вакуума в ампулдх + + + + + + +

Влажность, % ыенее 3 2,3 2 2,4 2,5 2,6 22

Сульфат цагкня, % 4,5-5,5 4,8 4,9 4,8 4,7 4,9 4,3

Борная кнслота, % 1,8-2,2 1.9 1.9 1,8 1.9 1,9 2,0

Титр в( шнгг 1:508 1:1500 1:1500 1:1000 1:1000 1:1030 1:500

Образцы шести опытных серий сухой гемолитической сыворотки хранили в трех температурных режимах: в холодильнике при +4°С, пр ! комнатной температуре (16 - 22°С) и в термостате при 37 - 38°С. Ежемесячно, а в препарату хранившемся в условиях термостата, два раза в месяц, проверяли титр гемолизина. При хранении в условиях термостата начальные титры гемолизина оставались без изменений до 5 - 6-го месяцев, после чего активность препарата медленно снижалась к 10 - 11-му месяцам. Хранение при комнатной температуре и в условиях бытового холодильника до 20 месяцев (срок наблюдения) ке повлияло на титр гемолизина.

Сухую гемолитическую сыворотку серии МЬ 2, хранившуюся в термостате, на разных этапах хранения испытывали в РСК в сравнении с бнофабричным кроличим гемолизином. Исследуемый препарат имел титры: первоначально - 1:1500, через 5 месяцев хранения - 1:1500, через 10 месяцев - 1:1000, через 15 месяцев - 1:500, через 20 месяцев - 1:500. В опытах использовали сыворотки крови крупного рогатого скота, негативные н имеющие бруцеллезные антитела в титрах от 1:5 до 1:160. Все пробы сухой гемолитической сыворотки дали одинаковые результаты в сравнении с биофабричным гемолизином.

3.4. Испытание сухой ослиной гемолитической сыворотки в серологических реакциях

Изготовленная сухая ослиная гемолитическая сыворотка была испытана при серологической диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота в реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента (РДСК) и реакции связывания конппотини-рующего комплекса (РСКК).

Материалом для исследования служили 1186 проб сыворотки крови животных трех дойных гуртов, родильного отделения, сухостойных коров и нетелей, принадтсежащих табак-совхозу "Ащисайский" Шелек-ского района Алматннской области, неблагополучного по бруцеллезу" крупного рогатого скота.

Каждый из перечисленных трех серологических тестов ставили параллельно с сухой ослиной гемолитической сывороткой и с кроличим гемолизином производства Курской биофабрикн. В РСК положительные результаты с двумя шцуми гемолизина установлены в 54 случаях. В РДСК с обоими диагностихумами позитивно реагировало 62 пробы, только с применением одного - по одной пробе, всего - 64 пробы. В РСКК как с кроличим, так н с ослиным гемолизином бруцеллез диагностирован в 88, только с ослиным - в одном, только с кроличим - в одном,

всего - в 90 случаях.

Ослиная гемолитическая сыворотка была испытана в комиссионном опыте в Республиканской ветеринарной лаборатории. После получения положительного результата препарат широка использовался п течение ! 994-J 995 годов в ветеринарных лабораториях Республики Казахстан при постановке PC К и РДСК для диагностики различных инфекционных болезней животных, главным образом, бруцеллеза.

Лаборатория особо-опасных инфекций Республиканской СЭС испытала сухую ослиную гемолитическую сыворотку в РСК для проведения 900 анализов от людей и 250 от грызунов с различными баю^иаль-нымн антигенами. Полученные результаты позволили рекомендовать препарат для применения в медицинской лабораторной практике и ет;о периментальной иммунологи».

4. ВЫВОДЫ

1. Оптимальная доза антигена для иммунизации ослов в возрасте от

I до 4 лет массой тела не менее 1С0 кг, с целью получения гемолитической сыворотки, равна 50,0 см3 50 % взвеси цельных зритрофггов барана irai 3,0 см3 их стромы с содержанием белка 20 иг/см3.

2. Гнпернммуннзацшо ослов - продуцентов гемолитической сыворотки целесообразно проводт. по схеме:

- Первый ЦИКЛ, СОСТОЯЩИЙ ИЗ ДЗуХ ВНутрЕШСШГЫХ И ОДНОГО подковного введения 50 % взвеси эритроцитов барана в дозе 50,0 см3 с промежутком г.£«:<зу инъекциями 3 дня и последующим перерывом в течение 60 дней;

- второй цикл, включающий три подкожных введения по 3,0 см5 стромы эритроцитов барана с содержанием 20 мт/сы3 белка, с последующим кровопусканием из расчета 1600 см3 на 100 кг массы тела спустя 4 дня после последней инъекции;

- дальнейшая эксплуатация ослов-продуцентов возможна после предоставления им отдыха в течение 2 месяцев. При этом дальнейшая иммунизация и кровопускание должны проводиться по схеме второго цикла.

- 3. Стабилизация нативной ослиной гемолитической сыворотки достигается путем добавления 5 % сернокислого магния и 2 % борной кислоты с последующим прогреванием при 58°С в течение 30 минут.

4. Лнофильное высушивание ослиной гемолитической сыворотки можно осуществлять с помощью оборудования и режима, принятых в биологической промышлености для сушки комплемента морской свинки и хонглютшшрующей сыворотки крупного рогатого скота.

5. Контроль качества сухой ослиной гемолитической сыворотки необходимо проводить путем определения растворимости, остаточной влажности, наличия вакуума в ампулах, содержания сернокислого магния и борной кислоты, установления титра гемолизина.

6. Сухая ослиная гемол1ггическая сыворотка сохраняет свою активность при комнатной температуре в течение 20 месяцев (срок наблюдения).

7. Сухую ослиную гемолитическую сыворотку можно использовать в РСК и се различных вариантах, основанных как на феномене гемолиза, так н контяютинации.

5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

1. Изготовление гемолизина осуществлять путем иммунизации ослов взвесью цельных эритроцитов барана или их стромы, согласно разработанной нами нормативно-технической документации.

2. При постановке РСК и других лимитированных реакций, базирующихся как на явлении лизлеа, так н коигтотинацни, использовать сухую ослиную гемолитическую сыворотку в соответствии с представленным нами наставлением по ее применению.

Список опубликопаню>гх работ по теме диссертации

1. Сайдулдин Е. Подбор ослов-продуцентов для получения гемошь тнческой сыворотки. // Материалы 1 Международной научно-практической конференции по аграрным проблемам. - Алматы, 1993. - С. 284285.

2. Сайдулдин Е. Т. Технология изготовления сухой ослиной гемолитической сьгаороткн, II Резервы биотехнологии, ветеринарной медицины и зоотехнии в повышении эффективности животноводства. Сб. научных трудов. - Алматы, 1995. - С. 47-49.

3. Сайдулдин Е. Т. Получение гемолитической сыворотки путем гн-периммунизации ослов. II Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в Казахстане. - Алматы, 1995. - С. 29-32.

4. Сайдулдин Е. Т. Серологияльп? реакцияларда есектщ гемолизишн пайдалану. II Жаршы. - 1996, № 2, - 43-48 б.

5. Сайдулдин Е. Т. Ослиная гемолитическая сыворотка для РСК и её вариантов. II Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана. - 1996, №3.-С. 51-54.

6. Сайдулдин Е. Т. Сухая ослиная гемолитическая сыворотка для РСК. II Вестник науки Акмолинского сельскохозяйственного института.- 1996,№4-С. 115-116.

7. Сайдулдин Е. Т. Метод получения гемолитической сыворотки для РСК. Куглж № 174 приор:гтет 24.06.94. на интеллектуальную собствен мость.

8. Сыворотка гемолитическая ослиная сухая дня серологических реакций. Технические условия. Разработчик Е.Т.Сайдулдин. Утверждено ГУВ МСХ Республики Казахстан 4 апреля 1996 г.- 15 с.

9. Инструкция по изготовлению и контролю сыворотки гемол!Гги-ческон ослиной сухой для серологических реакций. Разработок Е.Т.Сайдулдин. Утверждено ГУВ МСХ Республики Казахстан 4 апре-

ля 1996 г.- 16 с.

10. Наставление по применению сыворотки гемолитической ослиной сухой для серологических реакций № 06-3-2/30. Разработчик Е.Сайдулдин. Утверэдепо ГУВ МСХ Республики Казахстан 4 апреля . 1996 г. - 1с.

Ii

САЙДУЛДИН EPKIH Т1ЛЕУБЕРД1¥ЛЫ

СЕРОЛОГИЯЛЫК РЕАКЦИЯЛАРДА КОЛДАНЫЛАТЫН ЕСЕКТЩ KYPFAK ГЕМОЛИТИКАЛЫК КАН САРЫСУЫН ДАЯРЛАУ ТЕХНОЛОГИЯСЫ

16.00.03 - Ветеринариялык микробиология, иммунология, нщеттану жэне жануарлардыц жукпалы аурулары.

Биология гылымыиьщ кандидаты дзрежесш а луга арналган.

ТУЙ1Н1

Зерттеудац ма^саты - eceirri иммундеу аркылы гемол!ггт:ал!>п; цлп сарыеуын даярлау технолсгиясын ;касау.

Есгктерд! шпериммундеущ 2 цикл бойынша журпзу керектт аньп;-талган, Gipiiimi циклда 3 кун аралатып 2 рет кек тамырта, 1 рет тер i аетына K.oíl эритроциттернпц 50 % тунбасын 20 см3-ден JKißepin, 60 кун узшстен соц eKiiiuii циклда 3 кун аралатып TCpi астына 3 рет rçypa-мында 20 мг/см3 белок бар 3 см1 эритроцит стромасын згабередь 4 кун отаенде есехтщ 100 кг массасына есептегснде 1600 см3 rçan алып, 2 ай дем алдырган соц екшин цихлдаш ретпен иммундеп, жануарды один ары лайдалапупг болады.

Алынган кац сарысуын 5% магний сулъфатын жэпе 2% бор ^ылын к.осып, 58°С-та 30 минут ^ыздырып, лиофнльдис 0Д!спгн кегго-реД!.

Дайып препаратгы тексеру yuiiii еру цасистш, :^алдьп^ ьиз-алдышн ампуладагы вахуумды, гсмолизиннщтитрш аньотгайды.

Есектщ к;урга^ гемолитнхалы^ кян сарысуы бруцеллеза КБР, KYEP »вне К КБР DzucTepi.Mcii балау кезпще бпофабрикалъп; к4оян геколн-эишмен б1рдей нэпгже бердо. Даярлапган препаратгы комплемента байланыстыру реакциясыныц гемолпзге жэне конглютинацияга непэ-дглген spiypni варнаютарында пайдалануга болады.

SAIDOULDIN ERKIN TLEUBERDIULY

TECHNOLOGY OF PREPARING DRY DONKEY HEMOLYTIC SERUM FOR SEROLOGICAL TESTS

16.00.03 - Veterinary microbiology, immunology,

epizoolology and infection diseases of animals.

The defence for the candidate's degree of biology science.

SUMMARY

The purpose of the research is development of technology of producing dry hemolytic serum from donkey's blood.

As established, the hyperimmunisation of donkeys should include two cycles. The first cycle consists of two intravenously and one subcutaneously injections of 50 % suspension of sheep's red blood cells IRBC] in a dose of 50 cm3 with a interval between injections 3 days. The second cycle begin after 60 days. This cycle includes three subcutaneously injections on 3 cm3 of RBCs stroma with contents of 20 mg/cm3 protein, and with subsequent bloodcollection at the rate of 1600 cm3 on 100 kg weight of a body after 4 days. The further using of the animals is possible after granting them rest for two months. Thus, subsequent immunisation and bloodcollection should be conducted under the schedule of the second cycle.

The stabilization of native donkey's hemolytic serum is reached by addition of 5 % magnesii sulfas and 2 % acidum boricum with subsequent heating at 58 °C for 30 minutes. Then sublimation of the serum is made.

The quality control of the ready preparation should be executed by determination of solubility, residual humidity, availability of vacuum in am-pulas, contents of magnesii sulfas and acidum boricum, determination of hemolysin'« titer.

The diy hemolytic serum was tested in complement fixation test {CFfl, complement Iongsam fixation test and conglutination complex fixation test for diagnostics of bruccliosis. Identical results were received v/ith commercial rabbit's hemolysin. The preparation can be used in CFT and its various variants, based as on a hemolysis as a conglutination phenomena.