Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические особенности бактерий рода Morganelle и ускоренная индикация их в объектах ветеринарного надзора

На правах декоре it

п о ОЦ

2 7 т foe-

БРИТОЗА СОЗЬЯ ВАСИЛЬЕВНА

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БАКТЕРИЙ РОЛА MORGANEI.LA И УСКОРЕННАЯ ИНДИКАЦИЯ ИХ В ОШКТАХ ЕЕТЕРЯНАРНОГО НАДЗОРА

16.00.03. Зетеркк&ркая микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и тлукология

АВТОРЕ 5 ЕР А'Т диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных, наук

Москва, 1097

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук

Л.С.КАВРУК

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук

В.Г.ИВАНОВ (ВНИИВСГЭ), кандидат ветеринарных наук О.А.ТУГАРИНОВ (ВГНКИ

ветпрепаратов)

Ведупхш организация - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко

Защита состоится 1897 г. в /О час.

на заседании диссертационного совета Д. 020.50.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (128022, Москва, Звенигородское шоссе, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Автореферат разослан "10" г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Л.П.Пименова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Массовые яелудочно-кишечные заболевания новорожденных телят и поросят-сссунов иыепт повсеместное распространение и накосят значительный зкономический ущерб хозяйствам, особенно крупным гшвотноводческиы фермам ввиду высокой эаболевае-цостн и падежа молодняка, а такте больших затрат на лечение больных животных. В преобладающей большинстве случаев эти заболевания •шепт инфекционную природу и обусловлены разнообразными агентами. Работами многих исследователей (3.Л.Светоч,1972; Р.А.Хабибуллин, 1972; О. А.Полякова. 1976; Л.С.Каврук.Шб; Е.С.Воронин,1989; Л.Т. Парайко.1992; С.Н.Золотухин,1992,1694; D.S.Waldhalm н сотр.,1969; O.Krcgstad.1974; D.R.Osens н сотр.,1974; H.J.Robson, 1974; M.Tsu-bokura и сотр.,1976; S.I.Chrlstonsen, 16SQ; I. J.ü5CCo,1982; C.H. Collins. 1935 и др.) отазчена существенная роль грамотрицателышх условно-патогенных зктерсбакторий в этиологии инфекционной диареи молодняка, которая протекает в виде энзоотических вспышек 5» чаш всего в Форме созванной кнфзгада.

Проведецкш нами исследования по нэучеик» видового состава условно-патогеияой иккрофлоры репродукторных пододанкй сейноёод-' чзских и молочных ферм нотазази, что во шгагяг свкноводчзскнх и ыолочшй фэрдех при иеосовых 2шдуяочно-юйезчшйс 8азо®ввякя* поросят-сосунов 5! ноЕсргэдешшх телят sapssay а кввасшши вошЗудителя-ыи диарзн, ОТНОСЙЕЩШ5СЯ к родам Escherichia, Proteus, Cltrofcacter я др. встречаются бактерии рода Mbrgsaalla (вид 1!. ыоргаз-д}, обладавшие патогенное тъю для лабораторных зевотных. Роль ыикро-оргашзяов а этиологии г-»:«7дочго- кргэт'йж аабагэвшшй ыолодняка се&скохсшсйсгввшшх яивотанх долгое время оставалась ш кзугэпноЭ КЭ.Ч И UOCTO ИХ В С0Е5ЭЙ СТр^Яура ЕОЗбудXTQ&úfí УКШЯ1Ш забОДвВа-

кий Обтазадся открыли ms® вопрос, нухао ли яришшать so вни-

- г -

мание морганеллы при санитарно-бактериологической оценке помещений животноводческих ферм.

Существующий бактериологический метод обнаружения морганелл требует продолжительного времени (до б суток), ввиду чего актуальной задачей является изыскание более быстрого и доступного широкой практике метода индикации данных бактерий во внешней среде и патологическом-материале. Этим требованиям могут отвечать более совершенные серологические методы индикации микроорганизмов, для разработки которых важно знать, какие серологические группы и се-ровары бактерий наиболее часто циркулируют на животноводческих фермах разных регионов страны и какие диагностические сыворотки необходимо иметь для их серологической идентификации.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы сводилась к определению места морганелл в общей структуре возбудителей диа-рейных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных, изучению их биологических свойств и усовершенствована метода индикации этих бактерий в объектах внешней среды и патнатериале.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- изучить распространенность бактерий вида М.тогкапН в реп-родукторных помещениях молочных к свиноводческих ферм:

- изучить продолжительность выживания морганелл в разных объектах внешней среды и возможность изменчивости их культураль-но-биохимических, антигенных и патогенных свойств при обитании в этих объектах;

- определить устойчивость морганелл к различным дезинфицирующим средствам и температурным режимам;

- получить активные агглютинирующие О-сыворотки к разным стамыам морганелл, выделенным из помещений животноводческих ферм

- а -

и патологического материала;

- изучить антигенные свойства полевых штаммов морганелл с помощью экспериментально полученных морганеллезкых агглютинирующих О-сывороток и установить доминирующие серогруппы этих бактерий, имеющие эпнзоотологическое значение;

- провести серологически маркировку полевых атаымов морганелл с помощь» международной коллекции эталонных штатов названных бактерий;

- изыскать ускоренный метод индикации бактерий вида Ы.тогеапИ во внесшей среде, кормах и патологическом материале:

Научная новизна. Изучена распространенность бактерий вида Моггапе11а глгеапИ в гагаотназогчес(асх хозяйствах различных регионов страны. Определены сроки выживания морганелл в разных объектах внешей среды: сточных водах, почве, навоза. а также на деревянных. керамических н датаялических поверхностях. Изучена устойчивость этих бактерий к некоторым дезинфицирующим средстваы м действия высоких температур.

Установлены доиинкрущиэ сорогрушш морганелл, ццркудкру^й на животноводческих ферказ и ншдаэ эпизоотодогичсскэв значение. Выявлены две новые серогруппы каатсс бактерий. озаг-шгзгзея по антигенному строение от нзгестных серсгрупп мездународаой ксшзк-ют. Бактерии серогруппы "13я использованы в кздосгвэ прсиэсоло-твекяого втаьш мм кзгогомшш кабороз ¿юргзяедоэзных аггали-ннрузкзих серогруппозых сызорогогс, укзгеягяй зазг™он авторским свидетельство1.!.

Определены оппаеалыш узлсзкя кул&тивщтешпш зсаотеогого стафилококка пт.иш споссбсгвукщш манстэдьвом/ нзкоша-

нка белка А в- тетках этого ш?аша. Разрйогаа £тфое$нкый способ "останозкя реакция коаггйэткЕацгш для ускоренней иэтдгткацкн корга-

нелл ео внешней среде, кормах и патологическом материале.

Практическая ценность. Установленные более короткие сроки выживания морганелл во внешней среде по сравнению с другими видами энтероОактерий, их значительно меньшая чем у эшерихий устойчивость к девнифектантам, позволяют рекомендовать при обнаружении их на животноводческих фермах проведение ветеринарно-санитарных мероприятий как при колибактериоае.

Разработанные диагностические средства (набор агглютинирующих серогрупповых сывороток 8 типов), используемые при индикации М.тоггапи с помощью реакции коагглютинации, дают возможность проводить ускоренное обнаружение их во внешней среде, кормах и патологическом материале с высокой результативность». При отсутствии коммерческого стафилококкового реагента, содержащего белок А. предложен оптимальный режим культивирования золотистого стафилококка штамм Сшап-1, обеспечивающий высокий уровень накопления белка А, что позволяет готовить стафилококковый реагент в лабораторных условиях.

Реализация результатов исследований. Результаты работы вошли в "Методические указания по ускоренной индикации морганелл, сальмонелл и энтеропатогеняьк эоерихий. с адгезивными антигенами К88 и К99 в объектах внешней среды, кормах и патологическом материале при помощи реакции коагглютинации"; "Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными знтеробактериями"; " Инструкцию по изготовлению и контролю набора сывороток нативных мор-ганеллезных агглютинирующих серогрупповых"; "Технические условия на набор сывороток нативных морганеллезных агглютинирующих серогрупповых" и "Наставление по применению набора сывороток нативных морганеллезных агглютинирующих серогрупповых".

- б -

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно-практической республиканской (Украина) конференции "Повышение эффективности ветеринарного обеспечения промышленного свиноводства" (г.Киев,1987); Всесоюзной конференции "Эпизоотология, эпидемиология , средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, обзщх для человека и кивотных" (г.Львов.1988); Всероссийской научно-производственной конференции "Гигиена, ветсанитарш и экология животноводства" (г.Чебоксары, 1694) и межлабораторном совещании научных сотрудников ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и зкологш (1996).

Опытно-промышленная партия наборов моргаиедлеаных агглютини-руюаих серогрупповых сывороток в 1990 г. успешно прояла приемочные испытания и производственную апробацию в двух республшсансюпс и пяти областных ветлабор&тсриях. Набор« сывороток демонстрировались в 1990 г. на ВДНХ СССР, за разработку и Екэдрение которых автор награжден серебряной иедадыз выставки.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 0 научных статей.

Объем и структура работы. Диссертация состой? из введения, обзора литературы, собственных кссдедоваякй, обсущонкя полученных результатов, выводов, предзояений производству, сяиста литературы и приложений.

Работа нздояепа на 112. страницах ыатенопнопого текста, иллюстрирована 12 таблицами и 2 рисунками. Список зэтерадуры втачав* 125 нсточшзсов о?ечествоиннх и гарубзшшх авторов.

ССЗСТ12Ш5.:2 ЙССЩОВАНКЯ

Натерпвдь;, изчот и иесто кроаэдонля Езследоааикй. Эксперикеитальш.'з исследования проводились а иэркод 1981-1996 гг. J л Зоратории санитарнса микробиологии Есэроссийгксго научко-кс-

следовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ), на базе животноводческих ферм Московской, Пензе некой, Липецкой, Тульской, Ивановской, Винницкой областей и Краснодарского края. В опытах использовали полевые штаммы M.morganii 10 серогрупп, международную коллекцию морганелл 46 серогрупп, полученную из Будапештского медицинского университета, 10 музейных штаммов P.morganil и штамм болотистого стафилококка Cowan-1, полученные из ГИСК им.Тарасевича, и разные штаммы энтеробактерий из коллекции лаборатории санитарной микробиологии. В исследованиях были использованы 80 кроликов, 256 белых мышей, родовую и видовую идентификацию проводили у 890 культур микроорганизмов.

Материалом для изучения видового состава условно-патогенной микрофлоры помещений являлись сборные пробы соскобов с полов и фекалии клинически здоровых и больных диареей поросят-сосунов и новорожденных телят, а также внутренние органы и ткани трупов молодняка, погибшего от желудочно-кшпечннх заболеваний. Для выделения энтеробактерий использовали общепринятые микробиологические методы, родовую и видовую идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили согласно международной классификации бактерий семейства Enterobacterial аэ (1963) и руководству по систематике бактерий Бэргн (1984), используя 19 тестов.

Бактериологическое исследование трупов новорожденных телят и поросят-сосунов проводили согласно действующим методическим указаниям по бактериологической диагностике колибактериоза (эиерихи-оэа) животных (1974,1981) и сальмонеллезов животных (1971,1990).

Патогенные свойства морганелл определяли в биопробе на белых мышах весом 13-15 г, заражая их внутрибрюаинно в дозах 500 мля-1 млрд м.к. Каждой дозой и штаммом заражали 3-4-х мышей.

Гемолитические свойства изучали на кровяном {ДНА, содержащем

52 эритроцитов барана.

Для определения антигенной структуры морганелл применяли экспериментально полученные агглютинирующие О-сыворотки, в качестве антигенов использовали 3-4 трд взвеси суточных клонированных культур морганелл. имеющих типичную Б-форму.

Гипериммукизашаэ кроликов проводили по двум схемам, отличающимся друг от друга кратностью введения антигена, интервалами между каждой инъекцией и дозами антигена. По первой схеме кроликам вводили антиген пятикратно с интервалом 4-5 дней в нарастающих дозах: 1-1,5;2;3;4;6 млрд м.к.. а по второй схеме - шестикратно с интервалом 6-7 дней. Последняя доза повторялась. Преимущества той иди иной схемы оценивали на примере штамма N 257, который использовался в обеих схемах.

Серологическую маркирозку полевых штаммов морганелл проводили с помощью экспериментально полученных морганеллезных агглютинирующих О-сывороток и антигенов моргакелд 46 серологических групп международной коллекции с пеиощыэ развернутой реакции агглютинации,

Опыты по определении сроков выживания морганелл проводин на искусственно контаминироваяных деревянных, керамических и металлических тест-объектах, а также в пробах почвы, навоза и сточных вод при температуре 4, 18-22 и 30 °С. Пробы для исследования отбирали через каждые 6-7 дней,у выделенных с тесг-объекгов культур определяли культуральные,биохимические,анкЕгенкуэ к патогенные свойства.

Изучение устойчивости М.пюггап11 к действию дгзинФзгстантов проводили на батистовых тест-объектах в соответствии с "Методическими указаниями о порядка испытания новых дезоредств для ветеринарной практики", угверздеянши ГУВ ИСХ СССР 25.12.85. В качестве дезинфектантов использовала раствори едкого начра, фсрмальдагида, ."•лу'арового альдегида, дезанола и нейтрального гкпохдсркта кадь-

ция марки "Б". Устойчивость морганелл к действию высоких температур изучали путем определения жизнеспособности суспензия М.погеа-пН, подвергнутой прогреванию в водяной бане при температурах 5660 °С. Чувствительность ыоргакеаа к антибиотикам проводили в соответствии с "Методическими указаниями по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекцонных болезней с/х животных",утв.ГУБ МОХ 30.10.71 г. методом диффузии в агар о применением кшыерчесЕшх дисков.

В качестве ускоренного ыегода индикации М.тог^апИ в объектах внешней среды, кормах и патологическом материале использовали реакцию коагглютинаши (РКОА). Для приготовления коагглютинирующих ыорганедяезных диагностикумов применяли коммерческий препарат"Ста-филококковый реагент.содержащий белок А, сухой", выпускаемый био-предпркятием Санкт-Петербургского НЮ13М кц.Пастера, или приготовленную наш в лабораторных условиях убитую взвесь золотистого стафилококка штамма Сомап-1. Культуру золотистого стафилококка получали после культивирования его в поптонно-дрожжевой среде, на пеп-тонно-дроажевом агаре, бульоне Хоттннгера, агаре Хоттингера в течение 8 - 24 ч при температуре 37 °С; в жидких средах культуру выращивали при шуттелировании.Динамику роста золотистого стафилококка изучали путем нефелоыетрирования растущей культуры на ФЭК-56ПЫ с интервалом 1-2 ч. Полученную бакмаасу ияактивировали 0,5Х раствором формальдегида в течение 3 ч, затем прогревали ее в водяной баке при 60 °С один час. Уровень белка А определяли в РНГА с помощью экперимзнтально полученного и лвбеано предоставленного нам сотрудником ВГНКЙ ветпрепаратов В.И.Кисом зритроцитарного диаг-ностикума, содержащего иммуноглобулины класса 3. РНГА ставили в ' шкроварианте с использованием микротитратора Такачи.

Для сенсибилизации стафилококкового реагента использовали эк-

спериментаяьно полученные агглютинирующие морганеллезные О-сыво-ротки 8 серологических групп (01.016.026.029.033,045.049."13"). а также аналогичные типы сывороток опытно-промышленной партии, изготовленные на Грузинском биокомбинате, имеющие титры в РА 1:8001:1600. Оптимальное количество сыворотки, необходимое для сенсибилизации стафилококкового реагента специфичесгааш антителами, устанавливали по показателю предела чувствительности РКОА й опытах с различными концентрациями клеток ыоргадзлл гомологичной серогруппы в мл суспензии. Взвесь стафилококка сенсибилизировали сывороткой в разведениях от 1:5 до 1:100 в объемах 0,2-1 мл. В качестве диагностика использовали 2Х-пую взвесь стафилококка

Специфичность диагностикумов определяли в РКОА с антигенами гетерологичных серогрупп морганедл и девятью видаш других микроорганизмов. Предел чувствительности РКОА устанавливали в опытах со взвесями гомологичных культур иорганелл.

Для производственной апробации РКОА использовали материал из животноводческих хозяйств Московской к Ивановской областей, который исследовали параллельно с бактериологическим методом.

При статистической обработке полученных результатов использовали рекомендации И.П.АЕмарина и А.А.Воробьева (1852). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Изучение распространенности морганедл на мелочных и свиноводческих фермах

»

За период работы нами были проведены бшекриагогачееккз исследования 469 проб сосксбов и фа1«Ш!й от больных диареей теля? и поросят-сосунов из 17 молочных (14 неблагополучных по гшлуаочно-кнЕечным заболевания« и 3 благополучных) и 27 свиноводческих хозяйств (22 неблагополучных я б благополучных), а тшпга катзлоги--зс $ катеркал от 27 трупов новорожденных тэт? п поросят, ноги-

бших от диареи, из 13 хозяйств. Проведенные исследования показали, что бактерии ввда М.morganИ были обнаружены у животных на Б из числа 14 полочных ферм, где отмечались массовые желудочно-кишечные заболевания телят и на 11-ти свиноводческих неблагополучных фермах Частота обнаружения этих бактерий в пробах колебалась от 8 до 25X, а в двух хозяйствах (на одной молочной и одной свиноводческой ферме) соответственно в 71 и 75%. При бактериологическом исследовании внутренних органов и тканей погибших животных морганеллы были выделены от 9 из 27 трупов (в 332 случаев).

Морфологические, кулътуральные и ферментативные свойства всех свекевыделениых культур морганелл соответствовали эталонным пггашам. В процессе хранения культур у б-ти штаммов была утрачена способность расщеплять мочевину,у 4-х штаммов - декарбоксилировать орнитин. Отличительной культуральной особенностью многих штаммов являлась склонность к диссоциации культур (образование R-формы) черев 12-16 мес их хранения в полужидком ЫПА.

Из общего количества 44 выделенных штаммов М. morgan11 39 (882) обладали патогенноегью для белых мызей, 88 штаммов (862) обладали гемолитическими свойствам.

Изучение антигенных свойств полевых штаммов Morgamlla morganl!

Для изучения антигенных свойств штаммов морганелл. выделенных иэ животноводческих помещений и патологического материала, нам предстояло получить агглютинирующие О-сыворотки с целью определения серогруппозой принадлежности культур, циркулирующих в животноводческих хозяйствах и вызывающих инфекционную диарею у телят и поросят.

Для получения морганеллезных агглютинирующих О-сывороток ис-польвовали 18 полевых и 2 эталонных штамма морганелл. Гиперимму-

- и -

низацию кроликов проводили по двум схемам, которые отличались друг от друга кратностью введения антигена, интервалами между каждой инъекцией и дозами антигена. Обе схемы позволяли получать сыворотки с достаточно высокой активностью: 1:800 - 1:1600 и только в 5-тн случаях титр сыворотки составлял 1:400. Всего нами было получено 20 типов агглютинируюпщх ыорганедлезных О-сывороток.

для определения наличия серологической идентичности выделанных штаммов морганелл их исследовали в перекрестной РА с гомологичной и гетеродогичными экспериментально подученными О сыворотками. Для постановки РА в качестве антигенов использовали культуры 44 полевых и 10 музейных штаммов морганелл, получсн!шх из ГИСК им.Тарасевича. Результаты серотипировачкя полевых птай-гов шрга-нелл позволили сгруппировать большинство их (40 итакмов) в 10 серологических групп на основе идентичности О-антигена. При изучении антигенных свойств у 10 музейных ¡ятаыыов, выделенных от ладей, ни один из них не агглютинировал с порченными наш О-сыворотками.

Следуюзди этапом изучения антигенной структура полевых итам-мов морганелл явилась их наркнрозга по О-акгчгсну на основе определения типа каждой экспериментально колучеянсЯ О-сыворотки с антигенами эталонных иташоз морганеад 46 серогрутт международной коллекции. Результаты этих исследований позволили установка се-рогруппу каждой экспериментально подученной сыеоро?ки и соответственно выделенных наии полевых итаммоз морганелл. 3 частота, из общего числа 44 полевых штаммов названные бактерий к серогруплэ 026 относилось 7 втаъаезв.к серогруппам 01 и 015 - по 5 атгммев. к 029 и 033 - по А ятамма, к 016 и 019 - по 3 Етшиа, 025 - 2 втам-ма. 6 атаммоз не принадлежали ни к одной из известных серогрупп, что дало нам основание сгнести ses к новым серогрупяам,условно обо-эначетшм номереми "4" и "13". 4 штампа m огкоскяиоь к кавесткш

и выявленным нами серогруппам, что свидетельствует о наличии в природе большего Ч!!сла серогрупп этих бактерий.

В 1989 году па Грузинском биокомбинате была изготовлена опытно-промышленная партия наборов натквных ыорганеллеаных агглютинирующих серогрупповьгх сывороток, для получения которых использовали депонированные в ВГННИ ветпрепаратов штаммы морганелл 8 серологических групп (01,016,026,С29,083,045,049, "13"). Результаты комиссионной и широкой производственной проверки полученных наборов сывороток показали, что все они отвечали требованиям ТУ по внешнему виду, стерильности, активности и специфичности.

Изучение сроков выживания МогкапеПа тогеал11 во внешней среде При изучения сроков вшашания Ы.тогдапИ на разных объектах внешней среды при различных условиях было проведено 3 серии опытов в 3-5-кратной повторное™, используя 3 полевых штамма морганелл.

В результате опытов установлено, что самый короткий срок выживания морганелл (7-10 сут) отмечался в сточных водах при всех использованных температурных режимах: 4, 18-22 и 30 °С. Наиболее продолжительную выживаемость тоги бактерии в увлажненном навозе -75 сут и увлажненной почве - 60 сут при температуре 4 °С. В навозе и почве без увлажнения выживаемость морганелл составляла 30-38 сут как при 4 °0, так и при 18-22 °С, а при температуре 30 °С - 24 сут. На поверхностях керамических, деревянных и металлических пластин с защитным покрытием ыорганеллы сохраняли жизнеспособность 28-35 сут при 4 °С, при комнатной температуре (18-22 °С) - 20-23 сут, а при температуре 30 °С - 10-18 сут.

Изучение свойств у культур морганелл всех трех штаммов, выделенных о разных тест-объектов и в разные сроки опытов, показало. что их морфологические, культурально-биохимические, патоген-

кые я антигенные свойства не изменялись в течение 2,б-месячного периода наблюдений.

Таким образоа, на основании результатов исследований по изучению срогаэв выживания М.шг&ап11 на поверхностях тест-объектов и некоторых субстратах, модно заключить, что ыоргаиедлы сравнительно недолго сохраняют свою аианедеятзльнссть в объектах внесшей среды, наличие влаги и низкие температуры способствуют более длительному сохранен:» их жизнеспособности. Повыгзние температуры и Еьгсувиванке сокращают сроки выживания ыоргакелл.

Изучение устойчивости корганелл к высоким температурам и химическим средствам Для изучения устойчивости ыоргакелл к действию высока температур нами было поставлено 8 опытов с использованием 4-х полевых птаиыов ыоргаколя и 2-х пташов звэрихкй. Эти исследования показали, что шрганедлы имеют значительно меньшую устойчивость к высоким температурам по сравнению с эвернхшши. Так, температура 69 и 60 °С вызывала моментальную гкбель аорганелл, тогда как эвери-хии выживали при этих температурах соответственно в течение 10 и 1 минуты. При Солее низких температурах (50,Б7,Бб °С) срок яиэне-способнссти корганелл был очень коротким (10 сек, 1 и 2 мин) и значительно ывньшш чем у эвгерихий.

Изучение устойчивости У.пог^апН к действию некоторых дезин-фгщируюяих средств проводили в 10 опытах с использованием 4-х полевых штаммов иорганелл и 3-х пттшов зяюркхий. Зги исследования показали, что разные птааггы моргалелл имеют одинаковую устойчивость к дезинфектантаы. Нами была определена бактерицидная активность едгого натра, гипохлорита кальция нейтрального, формальдегида. глутарового альдегида и дезанола в отношении морганелл и сравнительная оценка этой активности для эшерихий. Так,едкий натр

при экспозиции 30 мин убивал морганеллы при разведении препарата 1:14^,3, тогда как эшерихии погибали при разведении 1:1033,1; ги-похлорит кальция убивал морганеллы в разведениях 1:2024,0 при экспозиции 10 мин. а эшерихии при этой же экспозиции погибали в разведении препарата 1:1466,3. К формальдегиду, глутаровому альдегиду и деваиолу бактерии М.тоггапИ имели такую же устойчивость как и Е.соП при экспозициях препаратов 10 и 30 мин. но при определении срока проявления бактерицидного действия дезанола било установлено, что разведение его 1:137,2 убивает морганеллы в течение минуты, тогда как эверихии выживали в течение 4-х минут.

При определении анткбиотикочувствительностн 82 полевых культур морганелл к 0 антибиотикам: бенаилпенкциллину. тетрациклину, неомицину, мономицину, левоиицетику,псшшикеину,канамицину. эритромицину, олеандошщдау установлено, что большинство их (70-7971) обладали чувствительностью к левомицэтину. неомицину, иономицину и канашшшу: слабую чувствительность проявляли к тетрациклину, олеандомицину и эритромицину, были устойчивы к бенаилпенициллину и полимжсину. 7 культур, выделенных из внутренних органов, обладали устойчивостью ко всем использованным антибиотикам.

Разработка ускоренного метода индикации морганелл в разных объектах внешней среды, кормах и патологическом материале при помощи реакции коагглютинации При разработке ускоренного метода индикации морганелл в объектах вковкей среды при помощи реакции коагглютинации использовали экспериментально полученные сыворотки и аналогичные типы опытно-промышленной партии морганвдлевньк серогруппоаьк агглютинирующих сывороток, а также кошюрческий и полученный в лабораторных условиях стафилококковый реагент,содержащий белок А.

Для определения оптимального режима культивирования штампа

золотистого стафилококка Cowan-1 мы провели сравнительное изучение динамики его роста на плотных и в жид; эс пептонно-дрожхевьи средах и средах Хоттингера (бульоне и агаре). Нами было установлено, что максимальная концентрация клеток стафилококка в жидких средах достигает через 7-8 ч культивирования; на плотных средах - в течение 17-18 ч при температуре 37 °С. Определение биологической активности белка А в разных культурах золотистого стафилококка показало, что она не зависела от среды культивирования, максимальный уровень отмечен у б-ти часовой культуры, выращенной в жидких средах и 17-ти часовой, выращенной на плотных средах. Титр белка А золотистого стафилококка штамма Cowan-1 в РИГА с зритроцитарным диагностккумом составлял 1:512-1:1024. Аналогичной активностью обладал и коммерческий "Стафилококовый реагент, содержащий белок А, сухой".

Для -риготовления коагглютинирующих морганеллезиых диагности-кумов оптимальной дозой специфической агглютинирующей сыворотки активностью 1:800-1:1600 является 0,2 ил в разведении 1:50 при сенсибилизации 1 мл 102-ной взвеси регвдратированного коммерческого препарата "Стафилококковый реагент" или 1 мл 102-ной взвеси убитого золотистого стафилококка штамма Cowan-1. Сенсибилизация стафилококкового реагента наступала через 2-3 мин после смешивания компонентов и выдерживания смеси при комнатной температуре. Это обстоятельство послужило основанием для разработки нового способа постановки РКОА. основанного на одновременном смешивании всех компонентов, участвующих в реакции (стафилококковый реагент, специфическая сыворотка и испытуемая взвесь бактерий). При использовании этого способа отмечалось совпадение результатов исследования с общепринятым методом постановки реакции, чустви-тельность его также была аналогичной. Предложенный нами способ, защищенный авторским свидетельством, исключает необходимость'

предварительного изготовления коагглютинирующих диагностикумов и удобеи для производственных лабораторий.

Специфичность приготовленных коагглютинирующих диагностикуыов проверяли в РКОА с убитыми нагреванием культурами гетероло-гичных серогрупп морганелл. E.coll 7 серогрупп, бактериями видов Citrobacter freundli, Citrobacter dlversus, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella dublln, Salmonella typhlmurlum, Providencia rettgorl, Pseudononas aeruginosa, а также в опытах со смешанными культурами разных выдов микроорганизмов. Все морганел-лезные коагглютинирующие диагностикумы к 8 серогруппам морганелл (01,016.026,029.033,045,049,"13") в РКОА обладали специфичностью, выявляя только бактерии гомологичных серогрупп морганелл в опытах с чистыми и смешанными культурами.

Предел чувствительности реакции при использовании приготовленных диагностикумов составлял: с чистыми культурами 2-8 млн м.к./мл, со смешанными культурами 8-32 млн и.к./мл. Активность диагностикумов оставалась неизмененной в течение 3-х месяцев хранения при температуре 4 °С, спустя 4-6 месяцев она снижалась в 24 рааа и. через 10-13 месяцев после получения препаратов предел чувствительности составлял 125-250 млн м.к./мл.

При лабораторном и производственном апробировании РКОА нами было исследовано 27 проб фекалий от больных диареей поросят-сосунов и 20 проб фекалий от новорожденных телят, а также патматериал от 2-х телят, погибших от диареи. Исследование проводили параллельно бактериологическим методов и в РКОА. В результате исследования морганеллы бы л обнаружены в 4-х пробах фекалий поросят как в РКОА, так и бактериологическим методом.

При исследования в РКОА смешанных культур ба^геерий, выделен-кьк из 8 проб комбикорма и овса, искусственно контаминированных

взвесями морганелл серогрупп 016,026."13". а также взвесями сальмонелл и эшерихий приходилось выявлять только искомые бактерии соответствующие серогрупп.

Таким образом, на основании полученных данных ыозшо закга-чить, что серологический метод индикации ll.tnorganli о помощью реакции коаггляткнацки является специфичным, ускоренным и чувствительны«, пе требует применения лабораторного оборудования, является простым по технике выполнения, позволяет выявлять искоше бактерии в свешанных культурах при наличии ползучего роста протея. РКОА снижает в 30 раз расход диагностических сывороток по сравнению с обсдаприяятым серологическим методом типизации культур.

ВЫВОДЫ

1. Результаты исследований по изучению распространенности ¡{organella morganll в молочных н свиноводческих хозяйствах разных регионов и областей, неблагополучных по массовым келудочно-кишечным заболеваниям новорожденных телят и поросят-сосунов, свидетельствуют о частой циркуляции во многих из них патогенных пташов морганелл. Так, из числа 27 обследованных свиноводческих хозяйств М. morganll были обнаружены в 12, а иа 17 молочных - в 6 хозяйствах. Частота обнаружения названных бактерий в пробах фекалий больных диареей телят н поросят-сосунов была в пределах 8-352,а в двух хозяйствах 71-75%; из патологического материала погибашх от ®елу-дочно-кижечных заболеваний животных бактерии вида M.morganli выделяли в 9-ти случаях из числа 27 исследованных.

2. Изучены морфологические, культуралыше, ферментативные, гемолитические, патогенные и антигенные свойства 44 полевых штаммов М.morgan! 1, выделенных из разных материалов. Все штаммы соответствовали признакам эталонных иташов морганелл, гемолитическими свойствами обладало 38 (86*), а патогенными для белых мышей -

39 (88Х) штаммов.

L. При изучении серогрупповой принадлежности штаммов M.morga-nll, циркулирующих в обследованных хозяйствах, установлено, что из 44 штаммов морганелл 34 относились к серогруппам 01. 016, 026, 026. СС9 . 033, Oí5. 049. 6 штаммов отличались по О-антигену от известных серогрупп и были отнесены к двум новым серогруппам, условно обозначенным "4" и "13". 4 штамма ке агглютинировали с набором экспериментально полученных сывороток. Доминирующими серо-групгтмк M.morganíl. имеющие зпизоотологическое значение, являлись oí. огб. озз, "13".

4. Подобрана схема гипериммуниаации кроликов О-антигенами морганелл, позволяющая получать активные (в титрах 1:800-1:3200) и специфичные морганеллезкые агглютинирующие О-сыворотки,предназначенные для серологической идентификации и ускоренной индикации эпизоотических штаммов морганелл в реакции коагглютинации (РКОА). Данная схема включает 5-ти краткую иммунизацию кроликов прогретой при 100 «С в течение 2,5 ч суспензией отмытых клеток морганелл в нарастающих дозах 1:1.5; 2; 3; 4 млрд м.к. с интервалом 4-5 сут.

5. Установлены сроки выживания морганелл в разных субстратах и на тест-объектах при различных температурных режимах. Наиболее продолжительный срок выживания эти бактерии имели во влажном навозе (75 сут) и увлажненной почве (60 сут) при 4 °С. В сухом навозе и сухой почве срок выживания морганелл при температуре 4°, 18-22° и 30 °С был в пределах 24-38 сут. Наименьшую выживаемость имели бактерии в сточных водах (7-10 сут) при всех температурных режимах. На поверх?' ~стях деревянных, металлических и керамических пластин при 4 ° и 18-22 °С и относительной влажности 65-75* мор-ганеллы сохраняли жизнеспособность 23-35 сут, а при температуре ао °о - ia сут. Морфологически» и физиологические свойства,а так-

ке патогзннооть бактерий не изменялись в течение всего периода изучения их жизнеспособности.

6. При определении бактерицидной активности дезинфектантов в отношении М.тоггапН и сравнительной оценки этой активности для Е. со11 установлено, что морганеллы менее устойчивы, чем эшерикга к едкому натру, гипохлориту кальция и дезанолу и имеют одгааковую устойчивость к глутаровоыу альдегиду и формальдегиду. Устойчивость ыоргщнзлл к действию высоких температур (56-60 °С) также была значительно меньшей чем у эиерихий. Из числа 82-х изученных культур ыорганелл большинство их (70-79Х) обладало чувствительностью к ле-вомицетину, неомицину, монсыгаину и канамицину, слабую чувствительность проявляли к тетрациклину, олеандомицину и эритр шщину и были устойчивы к бензилпенициллину и полимиксину.

7. Для ускоренной индикации энтеробзктерий вида М.тоггап11 в объектах внешней среды, кормах и патолопгческом материале предложена реакция коагглютииации (РКОА), имеющая большие преимущества перед бактериологическим методом обнаружения этих бактерий в результативности, времени и экономичности исследования материала, будучи доступной для любых диагностических производственных вет-лабораторий.

8. Определен оптимальный режим культивирования штамма золотистого стафилококка Со»ап-1, способствующий максимальному образованию у бактерий белка А. Установлено, что наибольший уровень белка А отмечается у 6-часовой культуры, выращенной в жидкой пеп-тонно-дрожжевой среде и бульоне Хоттингера. Культивирование стафилококка на плотных питательных средах - пептокно-дрожжевом агоре и агаре Хоттингера в течение 17-18 ч при 37 °С позволяло получать бактериальную массу, в которой белок А обнаруживали в титрах 1:612-1:1024. Аналогичный уровень белка А по покавателяы РИГА

содержался в коммерческом препарате "Стафилококковый реагент, содержав Оелок А, сухой", выпускаемом предприятием по производству бакпрепаратов С.-Петербургжского НИИЭМ им.Пастора.

9. Разработай более простой способ постановки РКОА для обнаружения ¡¿сргакелл в с-и$г2нннх иулътурах микробов: »«¿деленных ив различных материалов, который не требует изготовления коагглюти-нкруюних диагностикумов н по чувствительности не уступает известному способу постановки данной реакции.

ПРЕДЛОЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Материалы диссертации вошли в следующие документы:

1. Методические указания по ускоренной индикации морганелл, сальмонелл и энтеропатогенных эоерихий с адгезивными антигенами К88 и К99 в объектах внешней среды, кормах и патологическом материале при помощи реакции коагглютинации. Утверждены ГУВ Госагроп-рома СССР 18.01.89.

2. Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробакприями. Утверждены ГУВ Минсельхозпрода СССР 12.11.91.

3. Инструкция по изготовлению и контролю набора сывороток нативных морганеллезных агглютинирующих серогрупповых. Утверждена директором ВНЖВСГЭ 14.11.91.

4. ТУ 10.07.259-91. Набор сывороток нативных морганеллезных агглютинирующих серогруппоЕык. Утверждены ГУВ Минсельхозпрода СССР 12.11.91; зарегистрированы в Госкоыстандартов Совмина СССР за Н 2477 ОТ 26.12.91.

5. Наставление по применению набора сывороток нативных морганеллезных агглютинирующих серогрупповых. Утверждено ГУВ Нкн-сельхозпрода СССР 12.12.91.

- 21 -

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Каврук Л.С.,Бритова С.В..Гиряева И.О. Характеристика лак-тозоотрицательных килечных бактерий, выделенных из помещения реп-родукгорных отделений животноводческих комплексов.//Дезинфекция животноводческих помещений и ветеринарная санитария на транспорте. Сб.Н. ТРУДОВ ВНИИВС,1983, Т.77. с.96-102.

2. Бритова C.B. Выживаемость Morganella morganll на разных объектах внесшей среды.//Дезинфекция и санитария продуктов животного происхождения. Сб.н.ТРУДОВ ВНИИВС,1985, Т.81,с.83-85.

3. Каврук Л.С..Бритова C.B. Определение серогрупповой принадлежности атаммов Morganella morganll.//Ветеринария.1987. N 3, с.76-78.

4. Бритова C.B. Применение РКОА для ускоренной индикации морганелл в помещениях животноводческих ферм.//Повышение эффективности ветеринарного обеспечения промышленного свиноводства. Материалы научно-практической республиканской конференция.-Киев, 1987, С.34-35.

5. Кононенко A.B..Бритова C.B..Шурдуба H.A.,Кис В.И. Влияние условий культивирования и состава питательной среды на биологическую активность белка золотистого стафилококка Соиап-1. //Проблемы ветеринарной дезинфекции объектов животноводства. Сб.н.трудов ВНИИВС,1987,Т.86, С.20-24.

6. Бритова C.B..Каврук Л.С. Смешанная кишечная инфекция молодняка сельскохозяйственных глвотиых, протекающая с участием Morganella morganll.//Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней,общих для человека и животных. Материалы Всесоюзн.конф. .Львов, 1S88, 0.343-344.

?. Каврук Л.С..Кононенко А,Б..Братова C.B. Ускоренная инди/

кация патогенных энтеробактерий.//Ветеринария,1992, H б, с. 31-33.

Кононенко A.B..Бритова C.B. Условия получения коагглюти-нирующих сальмонедлезных и морганеллезных диагкостикумов на основе золотистого стафилококка штамм Cowan-1.//Сб.н. трудов ВНИШСГЭ, 1995, Т.97.С.109-115.

0. Каврук Л.С.,Кононенко А.Б.,Бритова C.B. Видовой состав к свойства патогенных энтеробактерий, циркулирующих на кивотновод-ческих фермах при массовых диарейных заболеваниях поросят и телят. //Гигиена, ветсанитария и экология животноводства. Материалы Всероссийской научно-производственной конференции.-Чебоксары, 1994, с.171-172.

10. A.c. К 1480177 СССР. Способ выявления антигена в биологическом материале (авторы изобр. Кагрук Л.С..Кононенко A.B..Бритова C.B.).1889.

11. A.c. К 1654360 СССР. Штамм бактерий ^organella storganll, используемый для изготовления днагностнхуыа и специфической агглютинирующей О*сыворотки (авторы изобр. Каврук Л.С..Бритова C.B.). 1989.

ВНИИВСГЭ. 1996 г.. Москва, Звенигородское mace, 6. бак. Тираж 80 s кз.