Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Сравнительное изучение геномов микоплазм, инфицирующих крупный рогатый скот

РГБ ОА

2 9 МАЙ В95

На правах рукописи

МАРКИНА Ольга Станиславовна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОМОВ МИКОПЛАЗМ, ИНФИЦИРУЮЩИХ КРУПНЫЙ РОГАТЬИ СКОТ

16.00.03. - "Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология"

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени . кандидата ветеринарных наук

Казань - 1395

Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного инс.итута и в лаборатории молекулярной генетики Казанского института биологии КНЦ РАН.

Научные руководители - доктор ветеринарных наук, заслуженный деятель науки РТ, заведующий лабораторией эпизоотологии ВНИВИ Гаффаров Х.З.

- кандидат биологических наук, заведусадй лабораторией молекулярной генетики КИБ КНЦ РАН

Чернов В. М.

Официальные оппоненты - доктор ветеринарных наук, профессор,

заслуженный деятель науки РТ и РФ, Хазипов Н. 3.

- доктор ветеринарных наук, заведующий лабораторией биохимии ВНИВИ Алимов A.M.

Ведущее учреждение: Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева

Эавдта состоится ¿¿■¿-¿¿/-¿-В. 199S г. в час. на

заседании диссертационного совета Д-120.22.01 при Казанской государственной академии Ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана (420074, г.Казань, академия ветеринарной медицины).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана.

Автореферат разослан

1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доцент

Чеботарев В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теин. Интерес к багологии микоплазн сегодня объясняется, с одной стороны, унукальностьг структурной организации этих микроорганиэчов, а с другой, - практической необходимостью так как микоплазмы имеет большое негативное значение для медицины, сельскохозяйственного производства и биотехнологии.

Болезни микоплазменной этиологии сельскохозяйственных животных широко распространены во всем мире и наносят значительный а ■■ териальный ущерб скотоводческим фермам и птицефабрикам. В 70-е rwv ды отечественные исследователи уделяли большое внимание изучен«? этиологической роли микоплазм при респираторных заболеваниях телят, маститах и других поражениях гешггальной снстс и крупного рогатого скота (Гаффаров Х.З., Митрофанов П. М., 1362, Коваленко Я. Г. и др., 1971; Курбанов И. А., 1972; Митрофанов П.М., 1977 и др.:. Оказалось, что возникновение микоплазмозов связано с нарушением природного равновесия во B3i тодействии симбиотической системы "микоплазма-организм хозяина" с факторам- окружающей среды, которое неизбежно происходит в процессе интенсификации животноводства.

Сложность и трудоемкость бактериологических исследований, отсутствие серологических методов диагностики микоплазмозов сельскохозяйственных животных, а также то обстоятельство, что в антигенная структуре, помимо компонентов, обладающих строгой специфичностью, содержатся и общие антигены, присущие другим видам лазм, ориентирует на поиск современных диагностических методов • надежных средств, обладают« высокой чувствительностью и специфичностью.

Достижения молекулярной биологии и генной инженерии! создали предпосылки для разработки новых биотехнологий, которые могут оып-успевно применимы для получения более эффективных яиагноствкуиоь.

8 этом плаке пенуноферментный анализ СИФА) првдставл.те? оооо;, уникальную комбинацию высокой чувствительности при индикации анти-геков и выявлении актатея. Популярности зте? м^тоя пользуете*. > при диагностике микоплазмозов животных и пгаа,. Яричеи, г»с чугствп-тельности и специфичности ИМ, как правило, превосходит такие серо -иикунологичеекгг вето»» как PCX, РИГА, РДП и В®Ф (LaEbert К. „

Cabasse E., 1987; Schaeren W., Nícolet J., 1983 и др.). Однако ИФА такке не гарантирует точного типирования различных видов, сероти-пов микоплазм, ахолеплаэм и уреоплазм, выделяемых от животных с различиьши формами клинического проявления заболевания.

Несовершенство диагностических методов затрудняет своевременное выявление микоплазменной инфекции, изучение механизмов взаимодействия микоплазм с клетками и организмом хозяина и разработку специфичных методов подавления инфекции.

В настоящее время решение проблемы диагностики микоплазменных инфекций связывают . применением метода ДНК-ДНК-гибридизации с использованием специфичных ДНК-зондов.

В изучении взаимодействия микоплазм с клетками и организмом хозяина сделаны лишь первые шаги, - показана роль микоплазм в возникновении того или иного заболевания и описаны симптомы болезни. Молекулярные механизмы взаимодействия микоплазм с клетками животных до сих пор не выяснены. Имеющиеся данные позволяют предположить возможность обмена между взаимодействующими организмами не только низкомолекулярными веществами, но и биополимерами, включая нуклеиновые кислоты.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является сравнительное изучение структурной организации геномов микоплазм, наиболее часто инфицирующих крупный рогатый скот и создание специфичных ДНК-эондов для обнаружения и идентификации этих микоплазм. В связи с поставленной цельс в задаче настоящего исследования входило:

1) определение степени гомологии разных видов микоплазм;

2) оп,еделение уровня гомологии между ДНК микоплазм и некоторых бактерий;

3) конструирование специфичных ДНК-зондов для обнаружения и идентификации микоплазм, наиболее часто инфицирующих крупный рогатый скот.

Научная новизна работы. Впе. зые установлено, что гомология между Mycoplasma bovis и большинства других микоплазм " ахолеплазм по ДНК касается отдельных фрагментов генома, соответствующих генам рРНК.

Впервые показано, что гомология межчу М. bovis и М. gallisepti-cum составляет более 50'/..

В геномах следующих п .р микоплазм: М. bovis и М. gallisepticum.

M. mycoides capri н M. fermentans, М. raycoides capri и H. fco-.:? ,inis обнаружены гомологичные повторявшиеся последовательности.

Сконструированы видоспецнфичные рекомбинантнне плазмиды рМЫ, pKbr9, pMmclS, содержание фрагменты геномов М bovis, М. bovirhinis, М. mycoides capri, которые позволяют обнаружить 1С?иикоплазменшя: частиц в любом биологическом материала и могут быть нспольэоезкн г качестве видоспецифичных ДНК-зоадов для обнаружения перочисяеинь.-' микоплаэм.

В геноке мнкоплазм обнаружены последовательности нуклеотидой, гомологичные сайтам посадки эукариотической топопзомерззн I,

Научно-практическая значимость работы. Отмечена знащ:те~,;г:? гомология между патогенными видами микоплаэм. Наличие гомологичны; повторявшихся нукяеотидных последовательностей в еномах миког.' лаэм, возможно свидетельствует о наличие каких-л::бо «^лков. или ферментов метаболизма, свойственных всем патогенкам кнхопяаэмш*, или ко эти участки ДНК связаны с генами обеспечиващюж метаболические потенции "минимальноЯ" '.летки.

Сконструированные рекомбинантные пл?змйды, содержание фрагменты геномов Н.bovis, М. bovirhinis н М. mycoides capri, явяявтся специфичными диагностическими зондами, которые могут бить использованы при диагнос.хке микоплазыента инфекций скота и идентификации этих видов микопяази.

До настоящего времени последовательности, гомологична™ сайтам узнавания топоизомераэы I, были идентифицированы только в геномах вирусов и эукариот. Наличие подобных участков в геноме ш;опяг?1 может быть аргументов за схогесть механизмов регуляции, »волпцкок-но сохранившихся от прокариотических к эукарпотеческии оргаднэка1.:.

Апробация работы. Основные положения работы доложены обсуждены на Международных конференциях ВсемирноЗ организации мйкоп-лазцологов (2-7 августа 1992г., Айкс, США; 18-27 нвля Í934r., Бордо, Франция), Яколе-сехйнаре по проблем. 5нстрой дкагксстаки ксплаэкепкых инфекция С?~14 августа 1S31 г., Иерусалим, йэраяль), Отчетной конференции Казанского научного центра Российской Ахзде-мии• Наук С22-29 января, 1333 г., Казань), заседания Ученого Совет-

вниви.

Публикации. По катерналак диссертация опубликовано в научных

работ.

Внедрение. Результаты работа оформлена в виде Еэтоаччесю»*

рекомендаций "Обнаружение и идентификация микоплазменных инфекций крупного рогатого скота методом ДНК-ДНК гибридизации" и используются для диагностики микоплазменных инфекций сельскохозяйственных животных.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Гомология М. bovis и исследованных видов микоплаэы и ахолеп-лаэм по ДНК касается отдельных фрагментов генома, соответствующих генам рРНК.

2. Гомология между М. bovis и М. galiisepUcura по ДНК составляет более 50%.

3. В геномах не; торых исследованных микоплаэм обнаружены гомологичные повторяющиеся последовательности нуклеотйдов размером 7, 9, 10. S тыс. н.п., соответственно.

4. В геноме М. bovis обнаружены последовательности нуклеотйдов, гомологичные сайтам посадки эукариотической топоизомеразы I.

5. Сконструированные диагностические ДНК-зонды позволяет обнаружить микоплаэменнур инфекцис в любом биологическом материале, вызванную М.bovis, М. bovirhinis, М.mycoides capri.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 92 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включая методы и обсуждения результатов исследования, выводов и заключения, иллюстрирована 7 таблицами и 9 рисунками. Список использованной литературы включает 172 наименования, в том числе 152 иностранные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Патериалы и методы исследований*

В работе использованы микоплаэмы; Mycoplasma arginini, М. bo-vigenitalirn, M.bovirhinis, M.bovis, H.mycoides capri, И.gallisep-ticum, M. f6imentans, Acholeplasma laidlawii PG8 и PG9, A.modicum, A. axanthum, а также штаммы HB101 DH5 Escherichia coli. Штаммы микоплаэм были получены из коллекции НШ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН и музея лаборатории молекулягчой генетики Института биологии КНЦ РАН. Микоплаэмы выращивали на среде Эдварда, приготовленной в лаборатории питательных сред ВНИВИ. Культуры выращивали в течение 5-20 суток пр'- температуре 37°С.

Исследуемый биологический материал (кровь, молоко, носовая

слизь) получали от клинически больных животных. нодоз:лггс..*дшс к заболеванию и клинически здоровых, принадлежащих совхозу "Калининский" и откормсовхозу "Высокогорский" Высокогорского района республики Татарстан.,

Выделение ДНК. Клетки шисопяазы суспендировали з 5'; растЕо-ре ТХУ-ЭДТА-На, рН 8.0 и вскрывали 0.5« раствором БГЗ. ДНК »к«?-— гировали смесью фенол-хлороформ (1:1) и осаждали 2.5 ооьекаи» 9Гг этанола. Обрабатывали РНКазсй и протеиназоя К, Гидролиз ры, триктазами проводили по стандартные методикам (Наина "с 1. и ¡.\-198Л.

Злектройоретнческоэ разделение фрагяеятоа 7по?огп.т" г-

0.8% агарозных гелях в горизонтальных блоках. Для опо?,пг.л&ь";;я меров фрагментов ДНК строили калибровочные кривые, :.спояьэул ь кп-чэстве реперов ЕсойУ-фрагкекты Л2П! X яэ»вйтноа ллинн.

Взятие проб биологического ммериадо проредит?» « «иАи> дусмотренных правил в стерильные пробирки. Образцы центрифугировали.(18 тыс. об/мин, 10 шт.), из осадков -вкделялй ДШ1 согласи;: стандартной методики, добавляя лизоцим в :ониентрации 4 пгл'х.

Перенос фрагментов ДНК с агароэного геля на нитроцёллвлозккз фильтры осуществляли по методу Сауэерна без модификация. Для переноса высокомолекулярной ДНК - пробы, обработанные денатурирущим я нейтрализушим буферами наносили на фильтр » растворе 10-ти кратного ББС используя микроворонки "М1п1Го1сГ.

ведение радиоактивной метки в ДНК проводили методом ки> -трансляции по й. ¡?1дЫ с соавт. (1977). Удельная раг'оактиьност, меченной (а32Р)дНТФ составляла 108 имп/мин/мкг.

ДНК-ДНК гибридизацию с радиоактивными зондами проводили ПР1. температуре 42°С в растворе 35% формамида. После гибридизации фильтры отшвали при температуре 5ЕРс в растворе 2-х краткого йзг, (2 раза по 1 ч.), 2-х кратного £ЗС с 0. IX ЗОБ (2 раза по' 30 кик.) и 2-3 ч. в 3 мМ растворе триса, рД 9.0. Радиоавтографы полу.чалг при экспонировании фильтров с рентгеновской пленкой в течение 1-й уток при температуре - 20°С.

После гибридизации с ДНК-зондами меченныю; биоУТФ оильтры оо-рабатывали согласно прописи для работы с диагностическим комплотом "Мигитест" (Кардиоцентр РАМН, г.Москва),

Встраивание фрагиентов ДНЕ в плазмидный вектор рВК328, трансформации бактериальных штаммов рекомбинантными плазш-;дз;лт к сеяек-

цив и выделение пмзмид проводили по стандартным методикам (Маниа-тис Т. и др., 1984).

Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили по А.Максам и У.Гилберту С1986) твердофазным методом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЕ

Рестриктазные спектры микоплазм. Электрофоретические спектры рестриктазных фрагментов ДНК микоплазм, образующихся при обработке ДНК разными рестриктазами, оказывается дискретными, что зависит от частоты встречаемо :ги соответствующих сайтов рестрикции и малого размера генома микоплазм. При гидролизе ДНК рестриктазами образуется небольшое количество фрагментов С20-50), что дает возможность их четкого электрофоретического разделения в 0.8/4 агароэных гелях. Анализ злектрофоретиЧеских спектров рестриктазных фрагментов ДНК микоплазм может быть использован для идентификации видов и даже штаммов, а также эти спектры являются материальной основой гибри-

1 2 3 4 5 6

Рис. 1. Гомология участков геномов разных видов микоплазм

с ДНК Mycoplasma bovis. Радиоавтограф - результат блот-гибридизации меченной ^Р ДНК М. bovis с KcoRV-фрагментами ДНК: 1-М. bovirhinls; 2 - A. modicum; 3 - A. axanthum; 4 - A. laidlawi * PG8; 5 - A. iaidlawii PG9; 6 - М. bovis.

1изационного подхода при исследовании молекулярной организации ге-юма микоплэзм с помощью меченых зондов.

Гомология микоппазм по ДНК. Известно, что гомология между :редставителями класса микоплазм колеблется от 2 до 60/,. M. galli-septicum - наиболее тахителичная микоплазма, филогенетически отда-тенная от всех других представителей класса Moliicutes. Гены рРНК являются единственными гомологичными участками ДНК M. даHisepticum л большинства, микоплазм (Борхсениус С.H., Чернова O.A., Î989). Б экспериментах по ДНК-гибридизации нами установлен, что гомология '4. bovis и почти всех исследованных микоплазм по ДНК касается от-цельных участков генома, соответствующих генам рРНК С рис.1), в то ьремя как топология между другими видами микоплазм определяется не только рибосомными генами, но и по генам тРНК н другим учасгяаи геномов.

Гомология между M. gallisepticum и М. bovis составляет более 50'/.. Кроме того, в ходе работы нами было установлено, наличие общих, в том числе повторяющихся нуклеотидных последовательностей в геномах этих микоплазм.

При анализе данных С табл.1) по определению степени гомологии

Таблица 1.

Результаты перекрестной дот-гибридизации по определению степени гомологии микоплазм

ДНК зонды M. bovis M. bovi-' rinis M. mycoi -des capri A. laid-lawu A A. laid-lawii В M. fer- men- tans M. gal-lisep-ticuni

М. bovis + + +

M. bovir-turus + +

M. myco i-des capri + +

ALA + +

ALB + +

Примечание: знаком "«■" отмечены гзгксплаэж, при перекрестной

гибридизации которых степень гомологии прэзкшает 10%.

ДНК микоплазм, полученных в экспериментах по дот-гноридизгцкн обращает на себя внимание гомология между м. Гегтеп1апБ и другими идиоплазмами. Следует также отметить наличие обаих участков иежду патогенными видаки. Возможно, эти фрагменты ДНК связаны с кодированием ключевых белков, имеющих значение для патогенности микоплазм или генами, обеспечивающими метаболические потенции "минимальной" клетки.

Наличие гомологии между микоплаэмами и бактериями. Многие авторы рассматривали проблему гибридиэуемости ДНК микоплазм с ДНК других микроорганизмов. Так как существуют инфекционные заболевания, имеющие симптоматику, сходную с клиническим проявлением мико-плазмозов, нами при разработке диагностических ДНК-зондов на кико-плазкэнные инфекции крупного-рогатого скота проведено определение гомологии микоплазм и некоторых бактерий. Результаты перекрестной дот-гибридизации представлены ь таблице 2. ДНК-ДНК-гомология юшо-плаи с клетками БЬаШоссш; не превышает 5% и касается, по-видп-ыоыу, лишь отдельных непротяжэнных участков в их геномах.

Таблица 2.

Результаты перекрестной гибридизации микоплазм и бактерий

ДНК на фильтре

М.bovis! М.bövlrhinis

ДНК-зонды

, Mycobacterial ; avium

Brucella abortus

A. laldlawii A M. bovis M. bovirhinis

StwfllOCOCCUS

Bacillus subtills

Esherichia coll

Brucella abortus

Mycobacterium avium

+

+

+

♦

+

+

4

- и -

Харктеристика сконструированных ДНК-зондов. Рекомбинантныв

1 лазмиды были получены и отобраны из туех серий клонотек, обозначенных Mb СМ. bovis), Mbr СМ. bovirhinis), Mac СМ. mycoides caprl), <аждая из которых состояла из десятков клонов, несущих случайные ïcoRV-фрагменты ДНК соответствующих микоплази), клонированных в векторе рВк323. Рекомбинантные плазмиды, содергащие вставки геномов м:коплазм первоначально выявлялись по злектрофоретической под-аиккости в агароэном геле, а затем по гибридизации с геномной ДНК гой гад микоплаэмы. В результате проведенных экспериментов были отобраны три рекомбинантние плазмиды, содержание вставки генома Ч. bovis: pMbl, рКЬЗ, рМЬ26, При определенна специфичности этих было выявлено, что плазмиды рМЬЗ и p№i2ô содержат участ-:гл, гомояогичйыа ДКХ M gai i isepticua, s то креыя как рМЫ имеет глотательную перекрестную реакции только с ДНК М. bovis. Далгз бн-(10 установлено, что плазыида рМЬ26, позволяющая обнаружить 3 иг ВДК М. bovis в исследуемых образцах, уступает по чувствительности ллазммдам рМЫ и рМЬЗ, выявляющих в тех же условиях 0.5 нг ДНК мн-коплазиы, что соответствует 104 инфекционных частиц С рис. 2). Как сказалось, этот эффект обьясняется тем, что в отличие от рМЬ26, плазмиды рМЫ и р№3 содержат фрагменты ДНК М. bovis, представленные в геноме ликсплазмы несколькими копиями.

Рис. 2. Оценка чувствительн<ста плазмид рМЬ28 Ca), рМЫ (б),

Р^З Сз).

Каждая из трек полос (а-э) содержит ДНК М. bovis в колпчестзахг 10 нг С1), 5 Hl С2), 0.5 яг СЗ) на точку.

- i2 -

Рекомбинантная плазмила pMbrQ, содержащая фрагмент генома H. boYlrhinis, является видоспецифичной для этой микоплазмы, но в отличие от плазкиды рМЫ, она гибридизуется только со своим фрагментом ДНК на фильтре, который соответствует по размеру фрагменту ыикоплазменной ДНК в плазмиде Сб. 7 тыс. н.п.). Это свидетельствует о том, что данный клонированный фрагмент генома; M. bovirhinis не только видоспецифичен, но и уникален. По чувствительности, плазми-да рМЬгЭ не уступает рМЫ.

При определении степени гомологии ДНК разных видов микоплаэм интересные результаты были получены в отношении M. mycoides capri. Эта микоплазма была взята в работу по создание диагностических зондов как возбудитель заболеваний мелкого рогатого скота для сраьненительного изучения. В качестве видоспецифичного ДНК-эонда нами была выбрана плазмида рМтс16, содержащая фрагмент генома M.mycoides capri, размером 1.3 тыс. н.п. Чувствительность полученного зонда также составляет 0.5 нг.

В сконструированной нами клолотеке Mme были также идентифицированы клоны, имеющие положительную перекрестную реакцию с гомологичными фрагментами в геномах M. bovirhinis (клон 12) и M. fermen-tans Склон 23). Кроме того, сказались, что клонированный EcoRV-фрагмент M. mycoides capri в геноме M. ferment-ans был представлен несколькими копиями. Эти данные согласуются с наличием высокой гомологии между видами M.fermentans и M.mycoides capri, выявленной в ваших экспериментах.

Как было отмечено выше, плаз милы рМЫ, рМЬгЭ. pMmcia были получены при клонировании случайных EcoRV-фрагментов ДНК кикоплазы в векторе pBR328. Таким образом, зонды представляют из себя реком-бинантные плазкиды, содержащие ДНК вектора размером 4.9 тыс. н.п. и ДНК фрагментов генома соответствующих микоплазм: М. bovis С1.7 тыс. н.п.), M.bovirhlnls Сб.7 тыс. н.п.) и M.mycoides capri С1.3 тыс. н.п.).

Обиорусаки© михоплаэиениых инфекций Н. bovis и M. bovirhinis в биологическом материала с поношш ДНК-зондоа. Сконструированные ДНК-зонды рКЬ1 и рМЬг9 были испытаны нами в лабораторко-производ-ственных условиях при исследовании биологических образцов с целью обнаружения и идентификации М. bovis и M. bovirhiris. В качестве проб были взяты: кояоко от коров с клиническим проявлением масти-

а, носовая слизь от телят 1-1.5 месячного возраста с признаками) оражекия органов дыхательной системы (бронхопневмония, ринит), а акже кровь от клинически здоровых бычков-откормочников.

В результате ДНК-ДНК гибридизации с диагностическими зондами МЫ и рНЬгЭ было обнаружено, что в 72*/. проб С18 из 25) присутству-т микоплазмы. Данные по обнаружение микоплазменных инфекций сье-ены в таблицу 3.

Таблица 3.

Обнаружение микоплазменных инфекций М bovis и М bovirhirus в биологическом материале

сйёйанная

Зиологический материал М. bovis М. bovirhinis микоплазменная

инфекция

кровь 50/. 70'/. 20%

носовая слизь 50% 75% 25%

молоко ' 54.5% 63.6% 30%

Наличие микоплазм в образцах, гзятых от клинически здоровых <вотнъгх, моано объяснить способностью микоплазм длительное время »холиться с макроорганизмом в симбиотических отношениях.

На основании лабораторно-производственных испытаний сконстру-эованных плзмидных зондов, нами разработаны методические рекомен-щии по обнаружению и идентификации микоплазменных инфекций круп-зго рогатого скота методом ДНК-ДНК-гибридизации.

В геноме И. boyis обнаружены последовательности нуклеогидов, экологичные сайтам посадки эухариотической топоизонеразы I. При

{бридиэации плазмиды рМЬЗ с EcoRV-фрагментами ДНК разных видов {коплаэм было обнаружено, что клонированный фрагмент М. bovis зоявляет слабую гомологию с оперонами рРНК. протестированных микста- ч. В ходе дальнейших экспериментов было установлено, что плаз-1да рИзЗ не содержит участки рРНК генов. Определение первичной ,'клеотидной последовательности показало, что клонированный фраг-. гнт содержит тетрадекамерный мотив ТСТТТдААААСТЬа. Анализ банка

данных нуклеотидных последовательностей, представленный в программе "DNASIS", показал, что обнаруженный нами тетрадекамерный мотив является сайтом посадки эукариотической топоизомераэы I. До сих пор последовательности, гомологичные сайтам узнавания топоизомераэы I, были идентифицированы только в геномах вирусов и эукариот. Наличие подобных структур в геноме микоплазм может быть аргументом за схожесть механизмов регуляции, эволвционно сохранившихся от прокариотических к эукариотнческим организмам.

вывода

1. Гомология Н. bovis и большинства других микоплазм и ахолеп-плазм по ДНК касается отдельных фрагментов генома, соответствуюиих генам рРНК.

2. Гомология между И. bovis и M. gallisepticum по ДНК составляет более 50%. .

3. В геномах следующих пар микоплазм: M.bo^is и М.gallisepticum, M. mycoides caprl и M. fer .Dent ans, M. mycoides caprl и M.bovir-hinis обнаружены гомологичные повторяющиеся последовательности размером 7, 9, 10. S тыс. н. п.

4. В геноме М. bovis обнаружены нуклеотидные последовательности, гомологичные сайтам узнавания эукариотической топоизомеразы I.

5. Схонструировглы видоспецифичные ДНК-зонды СрМЫ, рМЬгЭ, pMmclß) для обнаружения М.bovis, M. bovirhinis, M.mycoides capri, инфицирующих сельскохозяйственных животных.

Практические предложения.

1. Сконструированные плазмиди рМЫ С размером 6.6 тыс. н.п. ), рМЬгЭ (11.6 тыс. н.п.) и pWnclö (размером 6.2 тыс. н.п.) состоят кз плазкидного вектора pBR328 (размером 4.9 тыс. н.п. ) и специфичных фрагментов ДНК соответствующих микоплазм и позволяют обнаружить 0.5 иг юпсоплазкенной ДНК р любом биологическом материале. Пяазкидо рМЫ, рМЬгЭ, phtocie могут быть использованы в качестве специфичный ДНКгзондой для обнаружения микоплазменнцх инфекций сельскохозяйственных гавотных.

- 15 -

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Чернов В.М. , Маркина 0.С., Гаффаров Х.Э.Чернова O.A. аецифичный ДНК-зонд для обнаружения инфекций Mycoplasma bovis // атериалы научной конференции ВНШВВиМ, октябрь 1992. г. Покров.

. 275.

2. Chernova O.A. , Markina O.S. , Chernov V.M. Repeated DMA equences shared by Mycoplasmas // IOM Letters, 1992. Vol. 2.

. 256.

3. Chernov V.M. , Chernova O.A.. GogoleY Y.V., Markina O.S. epeated tetradecamer nucleotide sequences as elementary struc-ures of genetic regulation in Mollicutes IOM Letters. 1994. ol. 3. P. 402.

4. Гаффаров X 3. , Маркина O.C., Чернов В. M. Диагностичес-ая эффективность твердофазного ИФА и ДНК-зонда при микоплазыен-ых инфекциях животных // Вопросы инфекционной патологии живот-ых. Межвузовский сборник научных трудов. Казань. 1994. С. 5-10.

5. Маркина 0. С. , Чернов В. М., Чернова 0. А., Гаффаров X. Э. бнаружение микоплазма бовис с помощью ДНК-зонда // Вопросы нфекционной патологии животных. Межвузовский сборник научных рудов. Казань. 1994. С. 11-13.

6. Чернов В. М., Гаффаров X. 3., Маркина 0. С., Чернова 0. А. оздание видоспецифичного ДНК-зонда для обнаружения и идентифи-ации Mycoplasma bovis у крупного рогатого скота // Сельскохо-яйственная биология. 1995. N 2. С. 47-52.

аказ te 99. Подписано в печать J7.05.95. «topuai 6Ü х 84^/16 у>зга ьисчан. Печать офсетная. 2'п.л. Тира» 100 экз. чьсток офсетьой печати КГАБМ. Казань-420074