Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Сравнительная оценка иммуногенных свойств эпизоотических штаммов F. Necrophorum

П У

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.КОВАЛЕНКО (ВИЭВ)

российская АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННА НАУК

На ПРйпах лукогглси

МУСЛЕВ ДМИРМСЛЛМ РАНАЗДНОШЧ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ ЭПИЗООТИЧЕСКИХ ШТАММОВ г.^скоркокил

16.00.03- ветеринарная микробиология, вирусопогия,впиесэтслогип, мико/югия и инмунслогия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации мл сс^ск«*-^» ученой степени кандидата сетерииарну^ н^ук

Москва- 1993

Работа выполнен« со Всероссийском научно-исследовательском институте вкспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коеалемк

Научные руководители! доктор ветеринарных наук,профессор, лауреат пгчмлл Совета Министров СССР Каравае» П. Д.

ст.научный сотрудник,кандидат ветеринар ных наук,лауреат прении Совета Министров СССР Сенс/чова И. И.

ВФицшпыти omoHiHTui доктор ветеринарных наук,профессор Голиков A.B. 1ВИЗВ), доктор биологических наук Ярцев М.Я. (БНИИТиЬП)

Ведущее учреждение« Московская ветеринарная агча^едоя ин.К.И.Скрябина

Защиъа диссертации состоится --1993 г.

а "тТГд часов на васедании Специализированного ccesta К 020.2$.01 по'««щите диссертаций на соискание ученой степени кандидат* наук при Всероссийском научно-иссле-доеательском институте »ксперимемтальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко

Адрес! 109472, Москва Х-472, Куаьиимки, ВИЭВ

С диссертацией мохно ознакомиться • библиотеке ВИЭВ Автореферат Разослан -ЮТ3 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат ветеринарных наук •.Г.Теренко»

ОБЩАЯ "ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.Животноводство является одной из веду-М'Л отраслей сельского хозяйства нашей страны.В перспективах планах развития народного хозяйства предусмотрено неук-онное развитие и всемерное повышение этой важной отрасли, величение животноводческой продукции в целях более полного доолетеорения потребностей промышленности 8 сырье, а насе- ■ иния в продукта« питания.

Для выполнения этой иажнсй народнохозяйственной задачи редусматривается создание прочной кормовой базы, разработка внедрение' системы профилактических мероприятий по снижению щерба от заболеваемости и падежа животных при различных бо~ езнях. Одним из заболеваний, приносящим значительный эко-омический ущерб животноводству, яилпатся мекробактериоз.

По вопросам иммунитета и иммунизации животных против не-робактериоза имеете« ряд работ как отечественны!*, так и за-уйехныя авторов.Одни авторы утоврхдают, чго антигеном, поученным из культуры некро«>0!*>'С<1, можно•вызнать иммунитет у уистоительны;! животных (Анд. Ревнивы;:, 1632; R. Katiс, 1974, 976 J N. Katri rika,1979,1986} B.L.Clark et.ai., 1985JВ.А.Жирсв, • И.Солонаха с сотр. ,19SS). Другие же (Ф.И. Каган, Я.Р.Кова-i онко, 1944J i'i. И. ПисАренко, 1976) придерживаются прот^вополож-ой точки зрения. В связи с чем до настоящего времени не редлохены специфические средства профилактики и лечения не-робактериоза животных.

Поэтому борьба с этмп заболеванием до сих пор проводится утем специального комплекса ветеринарно—санитарных, пр'оФи-, актических и лечебных мероприятий. Для осуществлении по-ледних предложено большое количество различных срадста и

методов.Однако, существующие методы и средства борьбы с некробактериозом являются* трудоемкими, малоэффективными и несовершенными для крупных хозяйств, ведущих интенсивное хивотноводство на современной основе.

Следовательно, выделение, изучение более антигенных штам нов Р.песгорЬогит и разработка технологии изготовления средств специфической профилактики являются весьма

актуальными научно-исследовательскими задачами для современной науки.

Цель работы. Учитывая вышеизложенное*, мы поставили перед собой следующие задачи:

1.Выделить ат больно:« животных из хозяйств различных при-родно-геограФических гон нашей страны штаммы возбудителя

' иекробактериоза. • '

2.Изучить культугалыга-морФологические и биохимические свойства выделенных штаммов.

3. Изучить их патогенмость для лабораторных животных.

4.Подобрать оптимальный метод концентрирования экзотоксина Р.песгор1югит.

5. Подобрать оптимальный вариант инактивации токсинов и бактериальных клеток Р.песгорЪогит.

6. Изучить в сравнительном аспекте иммуногенные свойства инактивированного бактерина и анатоксинов против некробакте-риоза.

7. Предложить для изготовления средсть специфической профилактики один или несколько штаммов'Г.песгсрИогит.

Научная новизна. Сравнительно изучены биологические свойства штаммов, выделенных от разных животных из различных природно-геограФических зон наией страны.

Предложен дли иоготовления средств специфической профи-

иактикп один из наиболее иммуногенных штаммов. 1 ___________

-Подобран оптмнальный матод концентрирования экзотоксина г.песгор(логит.

Разработан оптимальный вариант инактивации эксотоксина, ¡ндотоксина и бактериальных клеток.

Подобран наиболее подходящий адъювант для приготовления |акцины и анатоксинов против некробактериоэа «изотнык.

Изучены в сравнительном аспекте иимуногенныв свойства гакцины и анатоксинов против некробактериоаа животных.

Предложена вакцина для профилактики некробактериоаа рога-ого скота, на которую получена положительное решение 1НИИГПЗ N 4928897/13 <026326) от 29 января 1992 г на выдачу 1атента. .

Практическая ценность. Полученные данные вошли о ! Инструкцию по мерам борьбы и профилактики некробактериоаа ивотных",утвержденную ГУВ МСХ РФ, ТУ " Вакцина против не-робактериоэа Рогатого скрта", "Временнук> инструкции по иэ-отовлвнию и контролю вакцины против нвкробактвриова рога-сзго скота.Нормативно-техническая документация одобрена чоным Советом БИЭВ (протокол N15 от 21 октября 1992 г.).

Апробация работы« Материалы диссертационной работы допоены на«

1.Конференции молодых ученых БИЭВ г.Москва 1990 г.

2.Заседании Ученого Совета ВИЭВ, (1992 г.)

3 Ив*лабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ 1992 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано "3 статьи и имеется положительное решение ВНИИГПЭ N 4928387/13(026326) и» выдач/ патента "Вакцина протип некробактериоза рогатого скота " .

Объем работы. Диссертация изложена на 145 страница;; машинописного текста и состоит иа введения, обзора литературы, собственны» исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 7•рисунками.Список использованной литературы включает 224 источника, из них 67 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы ■

Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии, диагностики И профилактики болезней овец ВИЭВ и в неблагополучных по некробактериоэу хозяйствах Московской, Магаданской, Рязанской, Тульской областей,Дагестана и Ямало-ненецкого автономного округа в течение 198В-1971 гг. •.

Для выделения возбудителя некробактериоза нами был исследован патологический материал:

1.пораженные копыта от северных оленай из хозяйств Мага- ' данской области и Ямало-ненецкого автономного-округа.

2. пораженные копыта от вынужденно убитого крупного рогатого скота хозяйств Московской,Рязанской и Тульской областей.

З.от ягнят, больных стоматитом, с поражением языка, губ, век и пачени, а также от овец с признаками различной степени хромоты хозяйств Дагестана.

Материал от больных и«вынужденна убитых хнвотнмх» доставляли а лабораторию а термосе со льдом,гда делали еоскоби на границе здоровой * пораженной ткани.Соскобы суспендировали в иясо-пептонном бульоне (МПБ) в соотноиении 1:5 или 1:10. Приготовленную суспензию высевали на жидкие (среда Кптт-Та-роцци ) и плотные (кровяной агар Цейсслера, кровяной сахарный агар) питательные среди. Посевы выдерживали в терностате при температуре +37сС. Оптимальные сроки культивирования иа среда Кмтт-Тароцци определяли по наличию роста микроорганизма, газообразования, выпадания бактерий э осадок. Наличие роста на плотных средах проверяли после 3 сут. инкубирования в анаэростатв.

Биологические свойства возбудителя некробактериоэа изучали общепринятыми методами (А.А.Либамеико, Л.Л.Самоловов,

1987 и др. ).

Под&ор оптимального метода концентрирования экзотоксина проводили путей сравнительного изучения удельной, активности и выхода концентрированного экзотоксина, полученного осаждением сернокислым аммонием, хлористин натрием и полиэтилен-гликолем ( В. Л. Благовещенский, 1959; Л.С-Гри /(, И.Н.Титов, 1971; Т.И.Тихоненко,1973). Для этого в полученной концэнтри-роаанием экзотоксина определяли содержание белка по моури и проверяли токсичность его для кроликов. Эндотоксин получали' путем дезинтегрирования бактерий на ультразвуковых установках И5Е и УЗДН-2Т. Активность эндотоксина также определяли на этой виде животных по дермЗнекротичаской пробе и белых ыыиах.

Детоксикаци» экзотоксина и эндотоксина проводили Формалк-

• О :

ном при температуре 42 С, а инактивацию бактерий - при■комнаткой температуре»

Степень обезвреживания экзотоксина и эндотоксина опрвдв-

*

ляли на кроликах и белый мышах при их внутривенном и внутри-брющинном методе введения,соот! тственно, ■ а также в реакции гемолиза,проводившейся с использованием эритроцитов барана.

Полноту инактивации бактерий определяли путем высева их на среду Китт-Тароцци.

Стерильность антигенов определяли на МПД, МПВ, Китт-'Та-роцци и на среде Сабуро, безвредность - на кроликах и белых

мышах введением антигенов подкожно.Антигены сорбировали на

I

геле гидроокиси алюминия, масляном адъюванте, а также в аэросиле. Сравнительную оценку адъювантов проводили путем иммунизации кроликов и определением в сыворотке крови титров антител. Стабильность эмульсии определяли путем центрифугирования при 1500 об/мин. в течение 2 мин. и после 2—надельной выдержки в термостате при Z'P С. Эмульсии признавали стабильными, если не происходило расслоение на водную и масляную Фазы.

Уровень антител крови животных во всех опытах определяли по общепринятой методике в реакции агглютинации.

Активность препаратов проверяли на естественно восприимчивых животных при контактном способе содержания больных, контрольных и вакцинированных животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Выделение Р.песгорЬогига из патологического материала. Первая культура возбудителя некробактериоэа была выделена в ноябре 19В8 I . из пораженных тканей копыт северного опеня, принадлежавшего совхозу "Ярсилинский" Ямало-ненецкого автономного округа.

Выделанный микроорганизм образовывал на кровяном сахарном агаре бесцветные, гладкие колонии с ровными краями, окруженные зоной гемолиза. Он был грамотрицательным и имел Форму палочек и нитей. У некоторых бактериальных клеток отмечено наличие зернистости и колбовидного утолщении

Непрямым методом реакции иммуноФлуоресценции была подтверждена идентичность выдыленнаго микроорганизма возбудителю некробактериааа.

Суспензией патологического материала, из которого выделили F.necrophorum, заразили кролика и белых мышей.

У кролика на месте введения суспензии уже через 24 часа развился воспалительный отек, постепенно захвативший близлежащие здоровые ткани. У корня уха черед 3 дня появлялась Флюктуирующая припухлость, кожа истончалась и образовывался -вищ, а затем язва. D дальнейшем наступал парез уха и савви-ылсп никроз мышц головы. Кролик пал на 11 сутки после занаженил.

На среду Китт-Тароцци сделали высевы из некротизирован-чых тканей ух а,онутренних органов и головногр мозга.

На вторые сутки выросла смешанная культура в посе-iax,сделанных из легких, печени и уха.Посевы из головного шага оставались стерильными. При высеве крови из сердца бы->а выделена .чистая культура, которую условно обозначили Q-1.

Вторая культура <0-2), ¿ила выделена из пораженных тканей опыта северного оленя из хозяйства Магаданской области в екабрв 19ВВ г.

Для выделения третьей культуры F.necrophorum (Т-10) в нвдре 1990 г был использован патологический материал от ынужденмо убитой коровы, принадлежавшей колхозу "Нова»

в

жизнь" имени Н.С.Семенова ' Щекинского района Тульской □¿ласти.

Четвертая культура (ЯГ-1) была выделена в марте 1990 г иа некротизированной печени убитого в атональном состоянии ягненка, принадлежавшего совхозу "Акушинский" Акушинского района Республики Дагестан.

Выделенные нами•культуры идентифицированы согласно определителю микроорганизмов О.Н.Вегдеу (1986) как р.песгорИо-гит. I

•. Попытки выделения возбудителя из' остального патологического- материала не увенчались ¿•спехом.

В качестве эталонных использовали 2 штамма Р.песго*огигп СКАЗ и ЯР) выделенных от животных из Казахстана и .Ярославской области, соответственно, сотрудниками лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней овец.Свойства, выделенных культур сравнивали с вталонными штаммами V.песго-рИогиш.

Морфология и тинкториальные свойства я.посгорЬогит.

Возбудитель некробактериоэа имел самую разнообразную форму, а именно нити, шаровидные водутип, длинные и короткие палочки и кокки.

В препаратах из свежих культур,выделенных из очагов некроза, возбудитель имел Форму палочек и длинных зернисто-окрашенных четкообразных переплетающихся нитей длиной 1Р0-300 мкм5 нити не выходили из одного поля зрения микроскопа.' Некоторые нити Формировали шаровидные и колбовидные вздутия, находившиеся в середине или конце нити.Эти образования в 5-6 раз превосходили толщину основной.нити.'

В мазках иа старых культур Р. песгорИогит ' имел форму ка-ротких папочек длиной 0,7-4 мки и шириной 0,3-0,5 мкм. Па-

почки переходили ■ коккообразные. Формы.Палочки и короткие нити на всем своем пр.отяжении имели одинаковую толщину.

В препаратах, приготовленных изпатологического"материала, взятого на границе живой и пораженной ткани, обнаруживали палочки и нити различной величины. Некоторые нити обладали яернистостью. В препаратах палочки располагались, глав" ним образом, попарно, но не редки были цепочки из 3-4 члеников ' •

В наакая некротиаированных органов встречались кокковид-ные формы бактерии некроза. Кокковидные формы отмечались также при частых пересевах в культурах и при добавлении в среду Китт-Тароцци стрептомицина и кананицина.

' Р.песго^огит спор и капсул не образовывал,был неподвижен, вырастал а анаэробных условия):. Окрашивался по Грану ' отрицательно. При окраске была ааметна тонкая структура клетки - ее зернистость.Нити, как и палочки,окрашивались неравномерно, по всей длине довольно часто встречались бесцветные участки.

Культуральныв свойства Р.пасгорЬогига. изучении куль-

тур альным свойстн Р.песгорЬогиш использовали плотную питательную среду ( кровяной сахарный агар> и среду Китт-Тароц-ци.

На плотно^ питательной среде с кровью лошади поверхностный рост Р.песгар(югит появлялся черев 2-3 суток, первоначально ввиде росинок, а в дальнейшем колонии увеличиьались до 1-3 мм и принимали ярко очерчеик формы, были видны зоны гемолиза.Для изучения биологических свойств отдельные колонии снимали стерильными пастеровскими пипетками и переносили в жидкие питательные сроды.

На среде Китт-Тароцци культуры давали рост черве 24-36 час. Вначале происходило помутнение а нижних слоях пройирки, а затем вс»лго столбика, среды. У штаммов 0-1, 0-2, Т-10, ЯГ-1-отмечалось газообразование. У всех культур через 2 суток роста наступала самоагглютинация - кусочки печени покрывались слизистым серым налетом. Через 7-10 суток наступал'о полное просветление среды.

Штамм 0-1 на среде Китт-Тароцци имел^морфологию длинных нитей,а штаммы 0-2, Т-10 и ЯГ-1 -нитей и палочек.

Биохимические и пготеолитическив свойства Р.песгорЬогшп

Для определения протеолитических свойств культур изучали способность их образовывать индол, сероводород, разжижать желатину и свертывать молоко.

При изучении биохимических свойств культуры засевали на среду Китт-Тароцци с 0,5Х соответствующего углевода или многоатомного спирта "пестрого ряда" (арабинозы, лактозы, глюкозы, галактозы, дульцита, инулина, глицерина, маннита, . ксилозы, мальтозы, сахарозы, сорбита) с индикатором Андреде. Посевы выращивали при температуре 37^С в течение 10 суток.

Результаты изучения биохимических и протеолитических свойств культур представлены в таблицах 1 и 2.

Как видно из таблицы 1, все изученные штаммы образовывали индол и выделяли при культивировании на среде Китт-Тароцци газ. Особенно сильное выделение газа отмечалось у свежих культур,при отсутствии его у старых.Образование сероводорода было установлено в 935£ случаев. Штаммы Т-10 и ЯР в слабой степени продуцировали сероводород, а штамм КАЗ-не продуцировал его вообще« Ни одна из изученных культур не свертывала молокА и не раззихала желатину.

и

Таблица 1

Результаты изучения протеолитических свойств культур р. песгорИогшп '

Культура Образо- Образо- Сверты- Разжижение 20У. желатины

........ .ваиие вание вание разведение культуры

индола сероео- молока цельная 1:2 114 1>в П16

0-1

0-2

Т-10

ЯГ-1

КАЗ

ЯР

Примечание! Оценка результатов! "+"-положительный, "+"-слабоположительный, "-"- отрицательный

При изучении биохимически* свойств культур(таблица 2), установили, что не все штаммы фвривнтируют арабинозу, лактозу, глюкозу, галактозу, дульцит, инулин, глицерин, маннит, ксилозу, мальтозу, сахарозу, сорбит. Это свидетельствует о том, что на все штаммы р.песгорЬогит имеют Ферменты, расщепляющие углеводы и многоатомные спирты. В наших! .;''гах по этношению к сахарам болев активным был штамм 0-1.

Патогенные свойства Р.песгорИогиа.Патогенные свойст-аа штаммов возбудителя некробактариоза изучали на кроликах чассой 2,3-3 кг и белых мышах - 18-20 гр. Для заражения использовали суточную культуру в дозе 0,5 и 1 мл, содержащую в 1 мл 1. млн.бактерий. Каждый штаммом заражали по 6 мышей и 6 сроликов, по 3 животных на 1 разведение.Контрольным животным

вводили стерильный Физиологический раствор.Посла заражения

*

ежедневно проводили клинический осмотр в течение} .30 суток (срок наблюдения)

Таблица 2

Результаты изучения биохимических свойств культур РшпесгорЬогит

Название культуры

Углеводы и многоатомные спирты

ара!лак!глю!гал!дуль!ину!гли!ман!кси!маль! сах!сорб

0-1 0-2 Т-10 ЯГ КАЗ ЯР

+ + +

+ >-• + -

_+ +

Примечание» Оценка результатов! "-»-"-положительный,

отрицательный.

".¿"-слабоположительный,"-Условные сокращения:ара-арабиноэа,лак-лактоза,глю-глмкоза,гал-галактоза,дуль-дульцит,ину-инулин,гли-глицерин,ман-маннит,кси-ксилоза,маль-мальтоза,сах-сахароэа,сор-сорбит

Кроликов и белых мышей заражали подкожно! кроликов - в область уха, белых мышей - в корень хвоста. На месте сведения культуры через сутки отмечался небольшой инфильтрат, увеличивавшийся с каждым днем и достигший величины голубиного яйца при заражении штаммом 0-1.При введении других штаммов реакция у животных была менее выраженной. Все испытуемые культуры были патогенными для белых мышей и кроликов и вызывали их гибель при введении в дозе 0,5 мл. Наибольшей вирулентностью обладали штаммы 0-1 и 0-2. При их введении кролики погибали черев 12 и14 дней,соответственно,« белые мыши~7. *

+

+

+

+

+

Подбор оптимального метода концентрирования экпотоксина • песгорЬогит. В доступной нам литературе мы не нашли данных концентрировании экзотоксина Р.песгорИогит химическими регентами, кроме данных И.И. Писаренко (1976), которая оса*-

ала его 96"/.-ным этиловым спиртом. С целью подбора оптималь-*

ого мотода концентрирования экзотоксина Р. песгор1">огит ис-ользовали сульфат аммония, хлористый натрий и полиэтилен-ликоль (ПЭГ).

Материалом дли исследования служили центрифугаты суточной ультуры Р.песгорЬогит , полученные на среде Китт-Тароци.

Осаждение сернокислым аммонием. Метод прост по технике ыполнения и заключался в прибавлении сухой мелкопротертой оли к центриФугату культуры в количестве 40Х к объему цен-риФугата.

Осаждение полиэтиленгликолем в сочетании с хлог-исть'м атрием. К центяиФугату культуры прибавляли 70'/.-ный ПЭГ и 37,-ный хлористый натрий (из расчета 173 мл 70'А-ного ПЭГ 'и 0,3 мл 23%-мого раствора хлористого натру)я ра 1 л центриФу-ата.

Осатдонпо хлористым натрием.К центриФугату культуры до£а-ляли хлористый натрий из расчета 20'/. к объему центриФуг£.та.

После добавления осадителей центриФугаты перемешивали и ставляли на холоде при ФС а течение суток. По истечении казанного срока материалы центрифугировали повторно, при . ООО об/мин. в течение 30 мин..Осадок растворяли о минималь-ом объеме Физиологического раствора (рН 7,2-7,4). При ис-□льзоаании 'хлористого натрия на удалось осадить экзотоксин . пасгорЬогит. .' '

Экзотоксин, осажденный сульфатом аммония, диалидировали ротив Физиологического; раствора.При увеличении объема жид-

кости ■ диализной трубке ее погружали в насыщенный раствор ПЭГ. ' ч

'В полученных концентрированных вквотоксинах определяли содержание общего «елка по методу Лоури.,Также определяли содержание белка (по Лоури) в нативных токсинах до концентрирования.

Активность концентрированных »каотоксиное и нативного ' екаотоксина определяли на кроликах путем внутривенного введения антигена. Результаты опыта представлены в таблице 3.

Таблица 3 ,

Результаты изучения активности экзотоксина на кроликах

Реагенты ис- N Кол-во '.Доза 'Кол- Время нас- ¡Содержа-

польаованные групп кроликов !анти- во пления ле- ние белк*

для осажде- ! гена пав- тального !по Лоури

ния токсина ! (мл) ших исхода !(мг/мл)

ж-х (час) ;

СульФат 1 3 2,0 з 2,5-3,0

аммония 2 3 1,5 3 4,3-0 27,5

3 3 1,0 3 0,5-12

4 3 0,5 - -

.ПЭГ . 5 3 2,0 2 16-16,3

6 1,5 - -

• 7 3 1,0 - - 11,2

8 3 0,5 - - ,

Нативный 9 3 2.0 - - 0,001

токсин

Контроль 10 3 2,0 - . - -

Кролики погибали е течение 2,5-16,5 час.Между доаой вве-

денного токсина и временем наступления летального исхода

выявлена прямая зависимость. Контрольные оставались живыми в течение 30 суток (срок наблюдения).

В дальнейшей работе для концентрирования »каотоксина Р.песгорИогит был использован сульфат аммония, т.к. он вызывал максимальное осаждение антигена. Гемолитические свойства

кэотоксинов всех научаемых штаммов определяли на эритроци-

ах лошади, барана и кролика.

Осадок отмытых эритроцитов доводили до 10( 5( 2,5 i 1,251

,6 процентной концентрации фиэ1 логическим раствором <рН #

,2). Экзотоксины также разводили Физиологическим раствором

о И 101 1120(1110) IIB0S -11160 и П320. Результаты'реакции

* ,

окаоани в таблица 4. ' .

Таблица 4

Изучение гемог-лтических свойств вкзотоксина

ид ¡Концзнтр -

ивотно-!чия эрит-о ¡роцитов в7.

i

Разведение экзотоксина НЮ ! 1>20 ! 1 s 40 ! 1 '■ 80 !lsl60! 1:320

- цельные + + + + + - ,

10 + + + + -

ошадь 5 + + + +

— 2, 5 -t- + + + +

1, + + + + т

0,6 -f + + + +

цельные ) + + + -

10 + + + + Т.

5 ч- + 4 + ■г +

арен 2,5 + + + +

1,25 + + + + + +

0,6 + . + + +

цельные + + 'Г

10 + + + + +

+ f + •V

ролик 2,5 ' + + + ■+ ■' + ■ • +

1,25 ';, + + ' < ' ;

0,6 + • + + + - • ■ +" г

|римечаниа». " + "- гемолиз эритроцитов

•> -f. « _ частичный г»мо/1иэ

•» — и отсутствие гемолиза

Кг.к видно из представленной таблицы экзотоксин а разаед нии 1:320 не вызывал гемолиз цельным эритроцитов лошади и барана, а также 107. суспензии эритроцитов лошади.

В тоже? время экзотоксин Р.песгорЬогия» при всех других разведениях вызывал гемолиз эритроцитов лошади, барана и . кролика. Экзотоксины Р.песгорЬогит изученных штаммов вызывали гемолиз эритроцитов лошади, банана и кролика.

Получение эндотоксина .Помимо экзотоксина бактерии нэкрс за продуцируют и эндотоксин.Он прочно связан с бактериальной клеткой и освобождается лишь при ее разрушении и облад< ет сильным некротиэирующим действием.

Для получения вндотоксина суспензию бактерий дезинтегрировали ча ультразвуковой установке МЗЕ в течение 30 мин. при частоте 20 кГц, мощности 100 ватт, амплитуда колебаний 13-30 мкм, или на ультразвуковом дезинтеграторе УЭДН-2Т в течение 2 мин. при амплитуде 50-70 мкм.

Очистку суспензии от разрушенных клеточных стенок проводили низкоскоростным центрифугированием. Осадок удаляли, а в надосадочной жидкости определяли содержание общего белка по методу Лоури.

Для определения активности эндотоксина его вводили белы! мышам внутрибрюшинно в дозе 0,5 мл.Концентрация белка » вн-дотоксине составляла 7,5 мг/мл. Контрольным белым мышам вво' дили Физиологический раствор тем жа методом и а той' ж» дозе, Миши опытной группыл погибали в течение суток, а контрольны! оставались живыми.

Дермонекротическу» пробу с эндотоксином проводили ма кроликах. Эндотоксины различных штаммов ввйдили внутрикожно в дозе 0,2 мл. На месте введения черрэ сутки отмечали покраснение, повышение местной температуры, припухлость и утолще-

иле кожной складки. Особенно сильными дермонекротическими :войствами обладал штамм 0-1. Через 8 суток после введении ■ндотоксина штамма 0-1 образовывалась обширная язва. С 15 |ня шел процесс заживления раны, который завершился к 21 уткам. ,

Следует отметить, что не все штаммы образовывали дерпоне-;ротиче~кую язву. Штаммы КАЗ и ЯГ-1 при внутричожцом введе-|ии вызывали лишь небольшое увеличение кожной складки. У с<?х кроликов повышалась температура на 0,3°р.

Гемолитические свойства эндотоксина определяли на вритро-итах лошади, барана и кролика таким хе образом как у вкзо-оксинов. Эндотокгпн в разведении 1:320 не вызывал гемолиз ельных эритроцитов лошади и барана,а также 10% суспензии ритроць-тов лошади.

Эндотоксин Г.песгорЬогит изученных штаммов вызывал гемо— из ьритроцитов указанных животных.

Разработка одуимального парианта инактивации экзотоксина эндотоксина. Бактерийные токсины под одноврэиен-

ого воздействия Формалина и тепла полностью утрачивают свои оксичвские свойства и сохраняют иммумоггнныа свойства. На том основан принцип изготовления анатоксинов для активной роФилактики токсикоиноекционных болезней.

В доступной нам литературе мы не нашли описания способ? нактивации экзотоксина и эндотоксина бактерии некроза крс-в сообщений канадских исследователей 0. С. Й1ехапс1т, М. II. Баг-1а еЪ.аК <1973), которые инактивировали промытые цельные актериальмые клетки, лизированные- звуком бактериальные ; петки и цитоплааматическую фракцию бактерий добавлением .-,5% Формальдегида и выдерживанием при комнатной темпера-^ре не менее 2 недель перед соединением с адъювантом.Эти же ,

исследователи (1970) детоксиФицировали вндотоксин посредством выдерживания при температуре 6-8 С в присутствии 0,37. Формалина в течении 6 недель до начала его применения.

- Активность полученных нами токсинов определяли перед их инактивацией на белых мышах, кроликах и эритроцитах банана. Инактивацию проводили 0,4V. Формалина при температуре 41-

Формалин добавляли дробно с интервалом в сутки! сначала 0,37., а затем- 0,17.. .Степень инактивации токсинов определяли с интервалом в 24 часа в реакции гемолиза.При постановке последней вритрсциты в концентрации цельные;101 51 2,51 1,25 и 0,6 7. и токсины в разведении 11101 1«20| 1140| 1'б0(И 16011*320 смешивали в равных объемах по 0,25 мл,

Череи каждые 1, ¿, 10,15 суток инактивации определяли то-ксигенность вкзотоксина (путем внутривенного введения кроликам 1,0 мл антигена), и вндотоксина (внутрибрюшинным введением белым'мышам 0,5 мл антигена). Степень инактивации вндо-'токсина череч 15 суток инактивирования определяли и по двр-монекротической пробе на кроликах.

По истечении 15 суток наступала полная инактивация токсинов при температуре 42®С, о чем свидетельствовало .отсутствие гемолиза вгйтроцитоа и отрицательные результаты тестов, проведенных на белых мышах и кроликах.

Хранение токсинов при температуре

не приводила к их инактивации в течение 15 дней ( срок наблюдения).

Бактерии инактивирорали тем же способом, но при комнатной температуре в течение 6 суток. Степень инактивации бактерий определяли путем посева на среду Китт-Тароцци по отсутствию роста культуры.

Подбор адъютант*.Провели сравнительное изучение активности препаратов, изготовленных с использованием в качестве

дъювантоа гидрата окиси алюминия, минерального наела с ла-олином и аэросиля.

Гидг>ат окиси алюминия, содержащий 5, 17'/. сухого остатка, обсалили а Антигены из расчета 114 и тщательно перемешива-и. Такое количество адъншанта обеспечивало полную сорбцию

у ,

нтигена при комнатной температуре. Гидроокись алюминия рочмо связывалась с антигеном и оставалась совершенно ста— ильной при хранении.

В состав масляного адьванта входили легкое минеральное ксло и ланолин, которые брали в соотношении -£5'15.Масляный дъюоант смешивали с антигь.юм в соотношении 1I1.

Лэросил марки А-300 по ГОСТ'14922-77, простерилизованный стеклянной посуде в сухожаре при 18сРс в течение 1-1,5 ас., вносили в антиген в концентрации 1'/..

Для подбора адъюванта и изучения иммуногенной активности (активированных антигенов использовали несколько оариантои акции, которые"испытали на кроликах, (таблица 5).Вакцины зодили дпукратно с интервалом в 2 нед.ладконо в дозе 1 мл.

В параллельном опыте кроликов иммунизировали перечислении в таблице 5 антигенами без адъювантоа в той же дозе и ?м же методом. Перед иммунизацией у кроликов брали сыаорот-' крови и определяли а ней титр агглютининов. Нормальная ^воротка крови не содержала агглютининов. Черве каждые 7, V, 21, 30, 45, 60 и 90 и 120 дней после иммунизации у хи-)тных брали кровь для серологического исследования по опрс-•лению титра антител а реакции агглютинации.

Антиге'н Аля реакции агглютинации .готовили из 24-36-часо-', ¡й культуры возбудителя некроба'ктериова, выращенной■ на сро-• Китт-Тароцци при температуре 37°С. Бактерии двукратно : <;' :аждали центрифугированием (3500 об/мин в течение ЗО мим.)

с последуйщин рпсуспендированием Физиологическим раствором

<рН 7,2-7,4) до конечной концентрации 10 млрд. микробных таг в ). мл". Последнюю определяли по оптическому стандарту мутности. Антиген инактивировали 0,4% Формалина по методике', описайной выше.

Таблица 5

Образцы изготовленных ¡экспериментальных вакцин с различными

антигенами и адъишантами

Вариант! вакцины! Антиген ! Адъювант ! Содержание антигенов !в 1 мл препарата в иг

1- экзотоксин масляный 5,5-6,0

2 эндотоксин масляный ... 2,5-3,0

3 вкзотоксин+

эндотоксин масляный 5,5+2,5

4. экзотоксин+ 5,5+

эндотихи!- 2,5+

бактерии масляный .20 млрд м.т.

5. цельные масляный 20 млрд.м.т.

бактерии

экзотоксин ГОА 5,5+6,0

7. эндотоксин ГОА 2,5-3,0

8. 5кзотоксин+

эндотоксин ГОА 5,5+2,5

9. экзотоксин+ ГОА 5,5+

энр токсин+ 2,5+ •

бактерии 20млрд.м.т.,

10. цельные

бактерии ГОА 20млрд;м.т.

11. экзотоксин аэросил 5,5-6,0

12. эндотоксин аэросил 2,5-3,0

13. . экзотоксин+

эндотоксин аэросил 5,5+2,5

14. экзотоксин+ аэросил 5,5+ ■

эндотоксин+ 2,5+

бактерии 20млрд.м.т.

15. цельные

бактерии аэросил 20млрд м.т.

Сыворотки. Нормальные сыворотки получали от кроликов. •Сыворотки крови от клинически здоровых и больных некробакте-

риозом крупного рогатого скота и овец получали из неблагополучных по атому заболеванию'хозяйств. Были исследованы и испытуемые сыворотки. Реакцию ставили по общепринятой методике.

При серологическом исследовании антитела к антигенам а гызорстке крови иммунизированные кроликов выявляли на 7 сут-си после иммунизации.

Наиболее высокий уровень антител и их длительное сохране-<'/1е наблюдали у кроликов, привитых маеляно-адъюэантной вак-

1.иной. *

Максимальные титры антител регистрировали у кроликов при-итых сакциной N3! они достигали через 30 дней'после второй акцинации 9,66+0,4 1од2 , а затем постепенно снижались и на 20 день составляли 7,4 ¿0,1 1од9 •

Для дальнейшей нашей работы мы применяли вакцину, изгото-ленную по этой методике.

■* Вакцины с аэро-илем и гидроокисью алюминия были менее ан-игенны,чем аналогичные препараты с масляным адыовантом. Че-ез 30 , ч. после второй вакцииаци' они продуцировали антите-а в титрах от 0,3+0,4 и 7> 6 _+ 0,4 » а ма сутки -

,6_+ 0,4 и 6,0 1од2 ,соответственно.При сравнении антигенов гз адыовантов установили,что наибольшей, антигенностьк облаяла смесь экзотоксина с эндотоксином.Титр сывороточных ан-ггеп у кроликов, привитых этим препаратом, на 30 день сос-»олпл 5, 3 + 0,4 1од ,а у животных , иммунигироваиных другими (тигенами титр варьировал от 2,3^ 0,4 - 3,6+ 0,4 1од£ - •

У кроликоз контрольной группы антитела к возбудители нек-[бактериоэа а сыворотке крови не обнаружили.

Сравнительное изучение, иммуногенных свойств вакцины и . атоксиноа.Для сравнительной оценки антигенной активности штаммов 0-1,0-2, Т-10 и ЯГ-1 приготовили 4 серии ин&к-вированных антигенов с масляно-ланолиноаым адъювантом. • Кроликов иммунизировали этими препаратами двукратно с ин— реалом ¿4 суток в дозе 1 мл подкожно. '-

Антигенныи ответ иммунизированных животных оценивали по титру сывороточных агглютининов.

Наибольшую антигенность проявил штамм 0-1, при иммуниза-

>

ции которым титр агглютининов улавливался на 30 и 45 дн. 'й разведениях сыворотки 7,6 + 0,33 и 7,0+0,0 »с°°тветст-

' веино,в то время, как штаммы 0-2, Т-10 и ЯГ в втот период времени выз.^али образование агглютининов в разведении от 5,6+ 0,43 до 6,3+ 0,4 1од2 .'

Учитывая более высокую антигенную активность штамма 0-1 возбудителя некробактериоза, мы решили провести дальнейшее изучение, его иммуногенных свойств на естественно восприимчивых животных.

С целью дальнеСЯшей оценки иммуногенных свойств перечи-сленныхи р таблице 5 пяти вариантов вакцин ( N 1,2,3,4 и 5) ими иммунизировали молодняк крупного рогато!о скота черно-пестрой породы в возрасте 8-10 мес,принадлежащих колхозу "Новая жизнь" им.Семенова Щекинского района Тульской области, и овец дагес.анской горной породы а возрасте до 1 года, принадлежавших совхозу "Акушинский".Акушинского района Республики Дагестан. Перед вакцинацией сыьаротку крови , взятых в опыт животных исследовали в реакции агглютинации на наличие антител к возбудителю некробактериоаа.

Опытные и'контрольные группы состояли из 20 животных. Телят опытных групп привили 2 мл испы+уемых препаратов. Спустя 6 нед. половину животных каждой опытной группы ревакциниро-вали теми же препаратами в дозе 3 мл. Вакцины вводили подкожно в область средней трети шеи.

Овец опытных групп иммунизировали 1 мл испытуемых препаратов.Спустя 6 нед. половину животных опытных групп ревакци-

пировали теми же вакцинами в дозе 2 мл. Вакцины вводили -юдкозно в область внутренней поверхности бедра. _____Через 15, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150 и-165 дн вакцина----------

ции исследовали сыворотку крови на наличие титра антител.

Спустя 3 недели после второй вакцинации опытных и контрольных животных поставили на кйнтакт с клинически больньщ поголовьем.

В результате проведенных исследований установлено,что наиболее эффективной был вариант вакЦины N 3.

В Ы С 0 Д Ы

1. Штампы Р. песгор1лаплт , выделенные от различных видай ш/шотных. из хозяйств, расположенных в разных природно—географических зонах страны, сходны по биологическим свойствам

; эталонными.

2.Эг,зо- и эндотоксина г . песгорМогига ипиуногенны длп естественно восприимчивых «шатмык.

З.Выпзлено преимущество концентрирования экзотоксина - . песгар(-югит 40% сульфатом гиньнии.

Полная инактивация экзотоксина и эндотоксина 0,4Х Формалина наступала.через 15 суток при температуре 42'С, в тоже ареин инактивация бактерий происходила при комнатной температуре < 20-22'С> в течение 6 суток.

5. Экзотоксин, выделенных штампов, вызывает гибель кро,ти-<ав при внутривенном оевдгнии. Эндотоксин Р.песгорЬсгит обладает дер^онекротическими свойствами.Оба токсина обладают гемолитической активностью.

6. Штамп 0-1 по сравнению с Другими обладает наиболее выраженными иммуногенными свойствами и может быть рекомендован для изготовления вакцины.

• 7. Масляный адъювант способствует выработке наиболее напряженного иммунитета по сравнению с'препаратами, где в качестве ад1,юзантов были, использованы ГОА и аэросил. )

8.' Вакцина, состоящаяиэ цельных бактериальных клеток;■вы-зыаала образование менее напряженного иммунитета.

9. Разработана оптимальная технология изготовления инак-тивированний змульсин вакцины, включающая культивирование штамма 0-1 возбудителя некробактериоза на жидкой питательной среде, концентрацию бактерий путем центрифугирования с пос*-ледующей их дезинтеграцией, концентрацию экзотоксина и эндотоксина и их эмульгирование масляным адыовантом.

10.В экспериментальных условиях показана эффективность вакцины!при двукратной вакцинации животных она составила 7530%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы диссертации вошли в !

а) Технические условия "Вакцина для профилактики некро-бактериоэа рогатого скота,

б) Временную инструкцию по изготовлению и контролю вакцины для профилактики некробактериоза рогатого скота. Нормативно-техническая документация утверждена Ученым Советом ВИЭВ (протокол N15 от 21 октября 1992 г.).

А е) Инструкцию по мерам борьбы и профилактики некробакте-риоэа"животных ( утверждена ГУВ РФ.....1993 г.).

Список опубликованных работ по теме диссертации____________

1. Пусаов А.Р., Семенова И.Н., Караваев Й.Д. Некробактериоз крупного рогатого ската в Рязанской ойласти.//Бюлл.

ВИЭВ.1991. Выл. 77-80.С.58-60.

2. Мусг.ев А. Р. , Семенсе'а И. Н. , Караааев Й.Д. Концентр и? се ¿ние •квотоксина Р.пеагорЬогиа различными методами. //Ьслл. ( ВИЭВ. 1991. Рыл. 77-а0.с.Ь0-Ы.

3. Мусаев Д.Р., Семенова И.Н. , Караваев В.Д. Способ '

Ии^встивации токсинов Р. песгорЬогиА.// Билл. £ЯЭВ. Вып. 77—00.

1

с.62-63.

Зак. -1,5-ПЛ. ~ и О