Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Совершенствование определения видовой принадлежности баранины и козлятины на основе иммуно- и ДНК-диагностики
- Ученая степень
- кандидата ветеринарных наук
- ВАК РФ
- 16.00.06
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Совершенствование определения видовой принадлежности баранины и козлятины на основе иммуно- и ДНК-диагностики
На правах рукописи
ПЕРМЯКОВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ
003463816
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ БАРАНИНЫ И КОЗЛЯТИНЫ НА ОСНОВЕ ИММУНО- И ДНК-ДИАГНОСТИКИ
16.00.06 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
Москва - 2009
003463816
Работа выполнена в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Светличкин Вячеслав
Владимирович
(ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)
Официальные оппоненты:
- доктор ветеринарных наук, профессор
Долгов Виктор Андреевич (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)
- кандидат ветеринарных наук, профессор Боровков Михаил Федорович
(ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина)
Ведущая организация: Российский Университет Дружбы Народов (РУДН) Защита состоится « Л> <? ¡г/0>мЯ 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии.
Автореферат разослан «_ ¿У » /ЩС^Ш^Ь <4Л> 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук - Н.С. Павлова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
Повышение защиты рынка от опасной и контрафактной продукции является одним из главных направлений реформы технического регулирования.
В этой связи разработка эффективных методов и тест-систем идентификации мяса способствует исключению из торговли недоброкачественной и фальсифицированной продукции, представляющей серьезную угрозу для здоровья населения.
Идентификация баранины и козлятины в сырье и продуктах питания, а также определение фальсифицирующих примесей, таких, например; как мышцы собаки, является одним из указанных направлений.
При идентификации используются различные методические подходы, основанные на органолептических, биохимических и гистологических показателях, электрофоретическом анализе белков (Хвыля С.И. и др., 1994; Писарева В.М., 1996; Кузнецова Т.Г., 1997; Kim Н. et al., 1986; Jman I.M., 1990; Rehben H., 1990; Helle A. et al., 1996; Taylor H. et al. 2000).
Экспрессны и достаточно специфичны тест-системы на основе иммунологического анализа (Серегин И.Г. и др., 1997; Mecedo-Silva ., Bardos S.F., 2000).
Методы ДНК-диагностики показали себя весьма чувствительными и специфичными способами идентификации мяса, позволяющими проводить анализ термообработанных образцов (Комаров A.A., Обухов И.Л., 2000; Комаров A.A., 2001, Комарова И.Н.,2005; Chikuni К. et al., 1990; Hunt D.J., 1997; Kappes S.M. et al., 1997; Jamamato M. et al., 1998; Tortaglia M. et al., 1998; Buntjer J.B., Lamine A., 1999; Lockhart D. J., Winzeier E. A., 2000.).
Однако актуальными остаются задачи оптимизации методов и тест-систем применительно к конкретным видам мяса, а также к различным образцам сырья и продукции. При этом задачи технического регулирования
предусматривают как внедрение уже известных стандартизованных по международным требованиям тест-систем идентификации, так и разработку новых методов и тест-систем, отвечающих международным стандартам.
Весьма важным является изучение влияния биологических и физико-химических факторов, возникающих при хранении и термической обработке мяса, на эффективность тех или иных методов и тест-систем идентификации.
Цель и задачи исследований.
Целью исследований являлось совершенствование определения видовой принадлежности баранины и козлятины на основе иммуно - и ДНК-диагностики.
В задачи исследований входило:
- усовершенствовать идентификацию мяса мелкого рогатого скота на основе иммунодиагностики;
- усовершенствовать методы идентификации баранины и козлятины на основе амплификации и ДНК - гибридизации, а также ПЦР в режиме «реального времени»;
провести сравнительные исследования по определению специфичности и чувствительности методов и тест-систем на основе иммуно- и ДНК-диагностики для определения видовой принадлежности мяса в сырье и мясопродуктах;
- провести сравнительный анализ влияния условий хранения и термической обработки баранины и козлятины на эффективность методов идентификации;
- разработать методические рекомендации по определению видовой принадлежности мяса и мясопродуктов.
Научная новизна
Проведено совершенствование метода идентификации баранины и козлятины с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем SOFT (США) на основе иммунодиффузии с пропитанными моноклональными антителами фильтрами. Методика
позволяет дифференцировать не термообработанную баранину от козлятины. Определена чувствительность методики, которая составляла 5% в смеси с другими видами животных, при этом время анализа сократилось в 1,5 раза.
Разработана модифицированная методика идентификации баранины и козлятины, включающая выделение ДНК с использованием протеолитичесих ферментов, иммуносепарацию, амплификацию ДНК с биотинилированными праймерами, гибридизацию меченных ампликонов с иммобилизованными ДНК-зондами и фотоколориметрическое детектирование гибридных молекул по интенсивности окрашивания после реакции с конъюгатом и субстратом.
Показана высокая чувствительность и специфичность метода на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, позволяющего проводить идентификацию до 0,5% баранины или козлятины в сырье и продуктах питания, в том числе термообработанных.
Проведена валидация методов пробоподготовки с сорбентом «силико» и постановки ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР - РВ) с компонентами тест-систем БигеРоосЗ® для идентификации баранины и козлятины. Данная методика позволяет дифференцировать мышцы баранины, козлятины и собачатины и сократить время анализа в 3 раза.
Проведен сравнительный анализ влияния способов технологической обработки баранины и козлятины на эффективность методов идентификации и показано, что наиболее эффективными для идентификации как термообработанных, так и не термообработанных продуктов являются методы ДНК - диагностики.
Практическая ценность.
На основе проведённых исследований разработаны "Методические рекомендации по вдентификации козлятины и баранины на основе иммунодиффузии", утверждённые Отделением ветеринарной медицины РАСХН 07.04.2008г.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены
на:
- VI Международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007г.);
-заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2008г.);
-межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2008 г.).
Публикации Результаты исследований отражены в 4 научных статьях.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений.
Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 193 источника отечественных и зарубежных авторов.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследований
Работа проводилась в период с 2006 но 2009 гг. в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации ГНУ ВНИИВСГЭ, а также в лаборатории "Союзэкспертиза" Торгово-промышленной палаты РФ.
В качестве объектов исследования использовали образцы охлажденного или замороженного мяса соответствующих видов животных.
Из образцов готовили мясные фаршевые смеси и, в зависимости от способа обработки, разделяли их на группы:
Первая группа - фарш однократно замораживали при - 20°С, хранили 14 суток при - 12°С, затем размораживали в воздушной среде.
Вторая группа - фарш замораживали при - 20°С, ежедневно в течение 14 суток подвергали размораживанию и повторному замораживанию.
Третья группа - фарш хранили в закрытых пробирках в течение 14 суток при комнатной температуре.
Фаршевыс смеси четвертой и пятой групп использовали для изготовления модели вареных колбасных и консервных изделий.
Шестая группа - образцы мясных смесей подвергали термической обработке при 55 -120°С в течение 10-120 минут, включая процедуру автоклавирования (120°С), 2атм.
Седьмая группа - контроль - образцы не подвергали обработке.
В экспериментальных исследованиях использовали тест-наборы серии SureFood на основе ПЦР и ИФА производства Германии, предоставленные фирмой "Стайлаб", для идентификации баранины и козлятины, а также тест-системы серии SureFood на основе ПЦР в режиме «реального времени» и тест-наборы систем SOFT (США) для идентификации баранины и козлятины на основе иммунодиффузии.
В исследованиях использовали образцы мясосырья, готовые и искусственно приготовленные фарши, мясные не термообработанные и термообработанные продукты.
Иммунодиффузию проводили на фильтрах, пропитанных специфичными растворами антител. Результаты анализа оценивали по линии преципитации между лунками со специфичными антигенами и антителами.
Выделение ДНК животных проводили с помощью тест-набора SureFood® PREP Animal.
Выделение и очистку ДНК животных из проб продовольственного сырья и пищевых продуктов, подвергнутых термической обработке, проводили с помощью тест-набора SureFood® PREP Animal X аналогичным образом.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с помощью комплекта для амплификации ДНК, включающего:
- смесь для ПЦР - реакционная смесь для ПЦР референс-гена;
- раствор ДНК-мишени - референс-ген, положительный контроль ПЦР на ДНК животного происхождения;
- раствор без ДНК-мишени - отрицательный контроль ПЦР (контроль контаминации);
- tag - pol (термостабильная ДНК-полимераза). ПЦР проводили по следующей программе (рис. 1)
Время, мин Температура
Начальная денатурация 1 мин 95 "С
Дена1урация 20 сек 95 °С
Отжиг 20 сек 48 °С
Элонгация ЗОсек 72 °С
Окончательная 3 мин 72 °С
элокгацкя
Выдержка 4 °С
Рис. 1. Режимы ПЦР.
Идентификацию ПЦР-амшшконов проводили путем гибридизации со специфическими гибридизационными зондами в лунках ИФА-планшета по следующей схеме:
- связывание биотинилированных продуктов ПЦР в лунках стрептавидин-покрытого планшета;
- денатурирование связанных продуктов ПЦР и удаление несвязанных нитей ДНК;
- гибридизация связанных продуктов ПЦР с помощью специфических меченных зондов;
- детекция гибридизационных зондов с помощью иммуносорбции антител с последующей цветной реакцией;
- измерение оптической плотности в лунках планшета после добавления стоп-раствора при 450 нм, длина волны сравнения - 620 нм.
Идентификацию мяса с помощью ПЦР в «реальном времени» проводили после выделения ДНК магнитосорбцпей в мультиплексной системе с реагентами SureFood®.
Метод ПЦР в «реальном времени» (ПЦР-РВ) наиболее распространенный метод количественного определения трансгенной ДНК.
Современные методы детекции основаны на изменении флуоресценции, которое пропорционально увеличению количества ПЦР-продукта в ходе реакции. Флуоресценция измеряется в течение каждого цикла ПЦР и на основании данных измерения строится график, позволяющий следить за ходом реакции.
В своих исследованиях мы использовали два подхода для количественного определения ДНК методом ПЦР-РВ. Первый основан на неспецифическом детектировании любого двухцепочечного фрагмента ДНК, амплифицированного в ходе ПЦР-РВ. Второй использует специфическое детектирование исследуемого ПЦР фрагмента (позволяющее отличить исследуемый фрагмент от димера праймеров или продукта неспецифической амплификации).
В наиболее распространенном методе неспецифического детектирования продукта с помощью ПЦР использовался интеркалирующий (связывающийся с ДНК) флуоресцентный краситель SYBER Green I. Он начал применялся, как более специфичный и менее токсичный краситель по сравнению с бромистым этидием. При связывании с возникающим в ходе ПЦР фрагментом ДНК интенсивность флуоресценции этого красителя возрастает на несколько порядков.
Использовались также олигонуклеотидные зонды. Изменение сигнала флуоресценции в этом случае связано с реакцией зонда на возникновение специфического ДНК фрагмента в ходе ПЦР. Наиболее распространенными являются зонды, содержащие два красителя, по флуоресценции одного из которых ведется детекция, а второй используется для гашения флуоресценции первого (TaqMan зонды и их модификации, молекулярные
маяки, скорпионы). Однако есть варианты, где используются зонды с одним или с тремя красителями.
Линейные зонды, содержащие два красителя (ТачМап), представляют собой олигонуклеотиды, комплементарные одной- из цепей ампликона. Флуорофор возбуждается источником света, и поглощенный квант и переносится на акцептор или гаситель. Наиболее распространенным дуплетом красителей являются карбоксифлуоресцеин (РАМ) в качестве донора и карбокситетраметиламинородамин (ТАМКА) в качестве акцептора. Зонд связывается с одной из цепей амгшикона в ходе отжига. Фермент Taq ДНК полимераза расщепляет связавшийся зонд в ходе удлинения специфически связавшегося праймера за счет 5'-3' экзонуклеазной активности. В результате молекулы красителей уже не связаны между собой цепочкой олигонуклеотида и флуоресценция карбоксифлуоресцеина увеличивается. Часто, вместо красителя ТАМЯА, который сам является флуорофором, используют нефлуоресцирующий гаситель метиловый красный, ОАВСУЬ, ВНС>-1, ВНО-2, ВН(2-3.
В наших исследованиях мы использовали, как интерколирующие красители, так и флуоресцентные меченые зонды.
Статистическую обработку результатов исследований проводили по Стьюденту.
Результаты исследований.
1. Усовершенствование идентификации мяса мелкого рогатого скота на основе иммунодиффузии.
На первом этапе экспериментальных исследований мы проводили идентификацию по модифицированной методике иммунодиффузии.
Принцип реакции (метод иммунодиффузии по Оухтерлони) основан на диффузии диагностических антител и испытуемого антигена из лунок в гель, при этом в случае их взаимодействия образуется полоса преципитации между лунками со специфичными антигенами и антителами.
В наших исследованиях диски из ацегатцеллюлозы пропитывали отечественными сыворотками. Фильтры помещали на агарозный гель и инкубировали 24 часа при 37°С. Результаты исследований показали, что чувствительность метода позволяла выявлять до 5% искомого вида мяса. При этом перекрестных реакций между сырой бараниной или козлятиной и мышцами собаки не наблюдалось. Однако дифференциации между бараниной и козлятиной не было.
Методика дает возможность сократить время анализа за счет предварительной подготовки фильтров. Кроме того, использование отечественных реагентов делает анализ приблизительно в два раза экономичнее.
Разработанная методика пригодна для дифференциации баранины или козлятины от мяса собаки.
Для дифференциации баранины от козлятины необходимо использование моноклональных антител.
В своих исследованиях мы использовали тест-системы серий SOFT (США), которые выпускаются по международным требованиям систем сертификации качества серии ИСО - 9000.
В результате полученных нами данных установлено, что применение этих систем позволяет проводить дифференциацию не термообработанной баранины от козлятины с чувствительностью до 5% в фаршах из этих продуктов, и 100% при исследовании отдельного сырого мяса. Фильтры тест - системы серий SOFT (США), пропитанные моноклональными антителами, не дают перекрёстных реакций.
2. Усовершенствование методов идентификации баранины и козлятины на основе ДНК-диагностики.
2.1 Усовершенствование методов идентификации баранины и козлятины на основе амплификации с последующей ДНК-
гибридизацией с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем SureFood (Германия).
Задачей данного этапа наших исследований являлась апробация методов определения видовой принадлежности мяса с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем на основе ДНК - диагностики.
Для решения этой задачи использовали тест-системы серии SureFood (производства Германии) для идентификации мяса и мясных продуктов.
Набор SureFood® дает возможность ускоренно и эффективно идентифицировать видоспецифичную ДНК различных животных в составе продовольственного сырья, кормов и готовой пищевой продукции посредством полимеразой цепной реакции (ПЦР), ДНК-гибридизации и детектирования гибридных молекул на основе иммуноферментного анализа (ИФА).
Благодаря короткому размеру продукта ПЦР (размер ампликона составляет 125 пар оснований), определение видоспецифичной ДНК может выполняться не только в продовольственном сырье, но и в образцах, подвергнувшихся глубокой переработке.
ДНК выделяли и очищали из исследуемой пробы (использовались реагенты наборов SureFood® PREP Animal) для проб продовольственного сырья и не термообработанных пищевых продуктов и SureFood® PREP Animal X для проб продовольственного сырья и пищевых продуктов, подвергнутых термической обработке.
Проводили ПЦР амплификацию ДНК с помощью биотинилированных праймеров и полученные ампликоны гибридизовали со специфическими меченными ДНК- зондами.
Результаты гибридизации определяли после реакции с субстратом и красителем по степени окрашивания визуально или по измерению оптической плотности в лунках планшета после добавления стоп-раствора по оптической плотности (таблица 1).
Таблица 1.
Идентификации баранины и козлятины с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем на основе ДНК - диагностики
Источник выделения матричной ДНК Результаты гибридизации со специфическими ДНК-зондами
ДНК-зонд на баранину ДНК-зонд на козлятину
1 2 3
Сырая баранина +
Сырая козлятина - +
Сырая свинина _
Сырое мясо кур -
Сырое мясо собаки -
Вареная баранина + _
Вареная козлятина _ +
Вареная свинина - _
Фарш: баранина 5%, козлятина 95% + +
Фарт: баранина 1%, козлятина 99% + +
Фарш: баранина 0,5 %, козлятина 99,5% + +
Фарш: баранина 0,1 %, козлятина 99,9% +
Фарш: козлятина 5%, баранина 95% + +
Фарш: козлятина 1%, баранина 99% + +
Фарш: козлятина 0,5 %, баранина 99,5% + +
Фарш: козлятина 0,1 %, баранина 99,9% +
+ - положительная реакция гибридизации - - отрицательная реакция гибридизации
Результаты исследований показали высокую чувствительность и специфичность метода с использованием тест-системы серии БигеРоос!, позволяющего проводить идентификацию до 0,5% баранины и козлятины в сырье и продуктах питания, в том числе термообработанных (таблица 1).
При этом не наблюдалось перекрестных реакций между ДНК, выделенной из баранины и козлятины, а также с ДНК, выделенной из мышечной ткани собаки.
ДНК-гибридизация со специфическими ДНК-зондами позволяла проводить дифференциацию баранины и козлятины в смешанных мясных фаршах. Эти данные хорошо согласуются с результатами идентификации свинины с использованием тест- систем данной фирмы.
2.2. Разработка модифицированной методики идентификации баранины и козлятины на основе амплификации и последующей ДНК-гибридизации.
Как было показано в предыдущем разделе, тест-набор серии БигеРоос! позволял с высокой чувствительностью и специфичностью проводить идентификацию баранины и козлятины. Однако методика пробоподготовки включает много этапов с использованием дорогостоящих препаратов протеиназы К и хроматографических колонок для очистки ДНК.
С целью оптимизации способа идентификации баранины и козлятины нами разработана модифицированная методика на основе ДНК-гибридизации.
1 г мяса или мясной продукции гомогенизировали с 10 мл нагретого до 60 °С СТАВ-буфера. Гомогенат инкубировали при температуре 60 °С 30 мин. Остатки разрушенных тканей осаждали центрифугированием в течение 2 мин. при 500g. К супернатанту добавляли равный объем хлороформа и встряхивали в течение 10 мин. Центрифугировали 5 мин при 500£. Отбирали верхнюю водную фазу и еще раз повторяли обработку хлороформом. К
полученному объему раствора ДНК добавляли двойной объем охлажденного до 0°С этанола и осаждали ДНК центрифугированием при 5 ООО § в течение 10 мин, осадок ДНК подсушивали и растворяли в дистиллированной воде.
При анализе термообработанных продуктов проводили экстракцию ДНК с помощью СТАВ-буфера, однократную депротеинизацию изопропанолом и дальнейшую очистку ДНК проводили с компонентами набора БигеРоос!, как описано выше. Выделенные ДНК амплифицировали с неспецифическими гексануклеотидными меченными биотином праймерами, полученные ампликоны гибридизовали со специфичными ДНК-зондами из тест-набора БигеРоос! и детектирование гибридных молекул проводили после реакции с конъюгатом и субстратом фотоколориметрированием.
Схема анализа представлена на рисунке 2.
Сырые продукты Термообработанные продукты
\ / Гомогенизирование проб
лзи
Солюбилизация проб
СТАВ-буффер, 60°С V Ч
Депротеинизация ДНК Выделение ДНК
Хлороформ гуанидинизоционат, протеиназаК
| хроматографические колонки
Осаяадсиие ДНК Этанол, центрифугирование
Амплификация ДНК с неспецифическими меченными праймерами
I I
Гибридизация ДНК со специфическими ДНК- зондами \ /
ИФА-детектирование гибридных молекул
Рис. 2 Схема модифицированной методики идентификации баранины и козлятины
Как показали наши исследования, выход ДНК по модифицированной методике был на уровне с препаратами ДНК, полученными при использовании тест-набора 8игсРоос!. При этом соотношения оптических плотностей Е 2ыта и Е гбо/гзо свидетельствовали о достаточной очистке ДНК.
Приведенные данные показывают высокую специфичность идентификации баранины и козлятины по модифицированной методике и корреляцию результатов с данными, полученными с использованием тест-набора БигеРоос!.
Разработанная модифицированная методика позволяет оптимизировать пробоподготовку при идентификации, сократив при этом в 1,5 раза количество этапов пробоподготовки и исключив использование дорогостоящих препаратов К протеиназы, а для сырых продуктов - и хроматографических колонок.
Неспецифическая амплификация с гексануклеотидными праймерами и последующая гибридизация со специфическими ДНК-зондами позволяют проводить одновременно идентификацию баранины и козлятины из одной пробы. Чувствительность метода составляла 0,1% в смеси с гетерологичными ДНК (таблица 2).
17
Таблица 2.
Идентификация баранины и козлятины с использованием методов ДНК-диагностики (+-положительная реакция гибридизации; - - отрицательная реакция гибридизации)
ледуемых образцы
Модифицированная
метппика
Зонд на баранину
Зонд на козлятину
тест-набор БигеРоос!.
Зонд на баранину
Зонд на козлятину
рая баранина
рая козлятина
>ая говядина
>ое мясо кур
)ые мышцы собаки
рой фарш (баранина, козлятина, дцина, мясо кур, мышцы собаки, :3:4:5)
фой фарш (козлятина, говядина, со кур, мышцы собаки, 1:2:3:4)
фой фарш (баранина, говядина, со кур, мышцы собаки, 1:2:3:4)
+
фой фарш (говядина, мясо кур, 1шцы собаки, 1:2:3)
рмообработанная козлятина
. мообработанная баранина
+
мообработанная говядина
»мообработанное мясо кур
¡мообработаные мышцы собаки
рмообработанный фарш
ранина, козлятина, говядина, со кур, мышцы собаки, 1:2:3:4:5)
+
+
рмообработанный фарш
злятина, говядина, мясо кур, 1шцы собаки, 1:2:3:4)
рмообработанный фарш
ранина, говядина, мясо кур, 1шцы собаки, 1:2:3:4)
рмообработанный фарш вядина, мясо кур, мышцы баки, 1:2:3)__
2.3 Усовершенствование метода идентификации баранины и козлятины на основе ПДР в режиме «реального времени».
Возможность проведения ПЦР в режиме «реального времени» была теоретически обоснована и возможность ее реализации практически продемонстрирована достаточно недавно. Технология ПЦР в режиме «реального времени» объединяет в себе амплификацию ДНК с детекцией ПЦР продукта в одной пробирке. Такой подход позволяет проводить несколько реакций в одной пробирке, снижает риск контаминации и не требует постановки электрофореза для детекции результатов. При использовании ПЦР-РВ существенно уменьшается время, затрачиваемое на анализ, а главное, возможно проведение количественной оценки результатов.
Идентификацию мяса с помощью ПЦР-РВ проводили после выделения ДНК магнитосорбцией в мультеплексной системе с реагентами ЗигеБоос!®.
Как показали исследования, тест-система БигеРоос!* позволяет дифференцировать баранины от козлятины и от мышц собаки, при этом положительный результат анализа наблюдается как с термообработанной, так и не с термообработанной продукцией. Чувствительность метода составляла 0,01%. Применение иммуномагнитосорбциии для выделения ДНК значительно ускоряет скорость анализа. Общее время реакции на порядок ниже, чем при иммунодиффузии, и в 2-3 раза меньше, чем при методе на основе амплификации с последующей гибридизацией.
3. Сравнительный анализ методов идентификации баранины и козлятины при различных условиях температурной обработки.
Оценку эффективности анализируемых методов идентификации мы проводили на образцах мясного сырья, подвергнутых таким воздействиям, как замораживание, размораживание и тепловая обработка.
3.1 Влияние условии хранения баранины и козлятины на эффективность методов видовой идентификации иа основе ДНК-диагностики и иммунодиффузии.
В задачи наших исследований входила оценка влияния процессов замораживания/размораживания на эффективность методов идентификации баранины и козлятины.
Мясные смеси из первой группы однократно подвергали замораживанию при 20°С, хранили, а затем размораживали в воздушной среде. Мясные смеси из второй группы, замороженные при - 20СС, ежедневно в течение 14 суток подвергали размораживанию и повторному замораживанию. Образцы мяса из третьей группы в течение 14 дней хранили в закрытых пробирках при комнатной температуре.
Полученные данные показывают, что диагностические антисыворотки к белкам мелкого рогатого скота специфичны и позволяют установить видовую принадлежность мяса по результатам реакции иммунодиффузии в фаршевой смеси баранина/говядина. Чувствительность реакции составляла 5%. Двухкратная процедура замораживания/размораживания не влияла на чувствительность идентификации баранины. Однако дальнейшие процедуры замораживания/размораживания приводили к снижению чувствительности и позволяли проводить идентификацию только при содержании в фаршевой смеси до 45% баранины.
Практически аналогичные результаты были получены при исследовании козлятины. Однократная процедура
замораживания/размораживания не сказывалась на чувствительности идентификации козлятины в фаршевой смеси козлятина/говядина. Увеличение числа операций по замораживанию/размораживанию приводило к снижению чувствительности до 40%.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что многократная процедура замораживания/размораживания снижает чувствительность методов идентификации баранины и козлятины на основе иммунодиффузии.
Причиной этого, вероятно, является нарушение антигенных свойств видоспецифичных белков, происходящее в результате вымерзания влаги в тканях и образования крупных кристаллов льда, нарушающих антигенную структуру
Чувствительность методов идентификации баранины и козлятины на основе ДНК-диагностики практически мало зависела от многократного замораживания и размораживания фаршевых смесей.
Так, чувствительность идентификации баранины и козлятины с использованием тест-систем 8игеРоос1 составляла 0,5%. Чувствительность ПЦР-РВ составляла 0,01%, в то время как метод иммунодиффузии позволял определять до 5% мяса в смешанных фаршах и при этом только в не термообработанных продуктах. Однако преимущество этого метода было в простоте исполнения, не требующим специального оборудования, кроме того себестоимость анализа была на 2-3 порядка меньше, чем себестоимость методов ДНК-диагностики.
Процент определения баранины и козлятины с применением модифицированной методики идентификации на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией снижался после 11-13 - кратного замораживания/размораживания всего на единицу.
Длительное хранение баранины и козлятины при комнатной температуре привело к полной утрате антигенных свойств мышечными белками и, как следствие, к невозможности определения видовой принадлежности мяса методами иммунодиффузии. Исходя из этого, можно заключить, что процессы, возникающие при порче мяса, оказывают выраженное отрицательное воздействие на эффекгавность методов, основанных на анализе видоспецифичных белков.
Чувствительность методов идентификации баранины и козлятины на основе ДНК-диагностики после длительного хранения менялась значительно меньше и варьировала в пределах 5-10 %.
Полученные данные свидетельствуют о том, что методы на основе ДНК-диагностики более пригодны для идентификации баранины и козлятины при нарушении режимов храпения.
3.2 Влияние термической обработки мяса на эффективность методов идентификации баранины и козлятины
На следующем этапе исследований была проведена оценка влияния различных режимов температурной обработки на эффективность методов определения видовой принадлежности баранины и козлятины. С этой целью готовили образцы мясных фаршевых смесей и подвергали их термической обработке при 55, 65, 75, 80,100 и 120°С в течение 10 - 120 мин. Дополнительно осуществляли обработку отдельных мясных смесей при 120°С под давлением (2 атм.). В качестве контроля использовали необработанные мясные смеси.
Полученные результаты, свидетельствуют о том, что термическая обработка мясных проб оказывает существенное влияние на показатели чувствительности методов видовой идентификации баранины и козлятины на основе иммунодиффузии и ДНК-диагностики.
Непродолжительная обработка мясного сырья при сравнительно невысоких температурах (55-65°С) практически не влияла на показатели чувствительности иммунологических методов. Порог чувствительности реакции иммунодиффузии при идентификации фаршевых мясных смесей, подвергавшихся прогреванию при 55°С в течение одного часа или при 65°С в течение 30 минут, соответствовал чувствительности в контролях.
Повышение температурной экспозиции до двух часов при 55°С или одного часа при 65°С приводило к небольшому снижению антигенной активности видоспецифичных белков, которое выражалось в уменьшении порога чувствительности иммунологических реакций с 5 до 10%. Дальнейшее понижение чувствительности наблюдалось при длительном (2 часа) прогревании мясных фаршей при 65°С.
Увеличение температурной обработки до 75°С приводило к резкому снижению чувствительности иммунологических тестов. При этом удавалось выявить только 35- 40% баранины или козлятины от общей массы фаршевой смеси.
Обработка мясного сырья при 80°С приводила к утрате белками своих антигенных свойств до 80%.
Таким образом, чувствительность методов видовой идентификации баранины и козлятины на основе иммунодиффузии сильно зависела от режимов температурной обработки.
Эффективность методов ДНК-диагностики менее чувствительна к термической обработке.
В результате тепловой обработки баранины и козлятины в течение двух часов при 80°С и в течение часа при 100°С чувствительность методов ДНК-диагностики оставалась неизменной и составляла 0,1% мясной примеси анализируемого вида от общей массы мясного фарша.
Более жесткая термическая обработка приводила к снижению порога чувствительности до 0,5-1,0 %.
Автоклавирование сильно не препятствовало идентификации с помощью методов ДНК-диагностики. Чувствительность составляла 2-2,5%.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что термическая обработка мясного сырья отрицательно влияет на эффективность методов видовой идентификации баранины и козлятины. Однако, благодаря большей термостабильности ДНК, методы ДНК-диагностики более устойчивы к негативному воздействию высоких температур по сравнению с иммунологическими тестами.
Полученные данные свидетельствуют о пригодности разработанных нами методов на основе ДНК-диагностики для видовой идентификации изделий из баранины и козлятины, прошедших термическую обработку.
ВЫВОДЫ.
1. Проведено совершенствование методов идентификации баранины и козлятины на основе методов иммунодиффузии, амплификации с последующей ДНК-гибридизацией и ПЦР в режиме реального времени.
Чувствительность метода иммунодиффузии была на порядок ниже, чем чувствительность методов ДНК-диагностики, и позволяла определять только не термообработанную продукцию, однако преимуществом метода являлась простота анализа, не требующего специального оборудования.
2. Разработана модифицированная методика идентификации баранины и козлятины, а также дифференциации их от мышечной ткани собаки, которая включала выделение ДНК с использованием 3% СТАВ-буфера, амплификацию ДНК с биотинилированными праймерами, гибридизацию меченных ампликонов с ДНК-зондами, иммобилизованными на планшетах, и детектирование гибридных молекул по интенсивности окрашивания после реакции с коньюгатом и субстратом.
3. Показана высокая чувствительность и специфичность методов на основе амплификации с последующей гибридизацией, позволяющих проводить идентификацию до 0,5% баранины и козлятины в сырье и продуктах питания, в том числе термообработанных.
4. Усовершенствована методика идентификации баранины, козлятины и дифференциации их от мышечной ткани собаки на основе ПЦР-РВ с использованием тест-системы БигеРоос!® к выделением ДНК с помощью иммуномагнитосорбции. Данная методика позволяла проводить анализ в течение 1-2 часов, включая термообработанную продукцию. Чувствительность метода составляла 0,01%.
5. В результате экспериментальных исследований по влиянию различных способов термической обработки мясного сырья (размораживание/оттаивание и термическая обработка) на показатели чувствительности и специфичности методов идентификации баранины и
козлятины показаны преимущества метода на основе ДНК-диагностики и возможности их практического использования.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.
Для использования в научных учреждениях и исследовательских лабораториях могут быть рекомендованы разработанные нами: «Методические рекомендации по идентификации козлятины и баранины на основе иммунодиффузии», утверждённые Отделением ветеринарной медицины РАСХН 07.04.2008г.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
1. Пермяков А.Н. /Сравнительный анализ методов идентификации мясного сырья и продукции при различных условиях хранения и термообработки //Живые системы и биологическая безопасность населения. Материалы VI международной научной конференции студентов и молодых учёных, Москва-2007, С. 309.
2. Пермяков А.Н./Идентификация баранины и козлятины на основе ДНК-диагностики/Юсновные проблемы ветеринарной медицины и стратегии борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных животных в современных условиях. Сборник научных трудов, Махачкала-2007.
3. Пермяков А.Н./ Идентификация баранины и козлятины на основе амплификации ДНК//Вестник Российского Университета Дружбы Народов. Серия агрономии и животноводства//2008г. №4, С. 31-33.
4. Пермяков А.Н./Идентификация баранины и козлятины в реакции ПЦР//Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии сборник научных трудов, Москва-2008, том 119, С. 66-69.
ВНИИВСГЭ. г. Москва, Звенигородское шоссе, 5 Заказ . Тираж 80 экз.
Оглавление диссертации Пермяков, Александр Николаевич :: 2009 :: Москва
ВВЕДЕНИЕ.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
1.1. Значение идентификации продукции
1.2. Методы определения видовой принадлежности мяса.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы и методы исследования.
2.1.1. Материалы исследований.
2.1.2. Методика идентификации мяса на основе иммунодиффузии.
2.1.3. Выделение ДНК из нетермообработанных образцов баранины и козлятины с помощью тест-системы SureFood® PREP Animal
2.1.4. Выделение ДНК из баранины и козлятины, подвергнутых термической обработке, с помощью тест-набора SureFood® PREP
Animal X.
2.1.5. Методика идентификации козлятины и баранины на основе ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией.
2.1.6. Модифицированная методика идентификации баранины и козлятины на основе амплификации с последующей гибридизацией.
2.1.7. Методика идентификации баранины и козлятины с помощью ПЦР в режиме «реального времени».
2.2. Результаты исследований.
2.2.1. Усовершенствование идентификации мяса мелкого рогатого скота на основе иммунодиффузии.
2.2.2. Усовершенствование методов идентификации баранины и козлятины на основе ДНК-диагностики
2.2.2.1. Усовершенствование методов идентификации баранины и козлятины на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем SureFood (Германия)
2.2.2.2. Разработка модифицированной методики идентификации баранины и козлятины на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией.
2.2.2.3. Усовершенствование методов идентификации баранины и козлятины на основе ПЦР в режиме «реального времени».
2.2.3. Сравнительный анализ методов идентификации баранины и козлятины при различных условиях температурной обработки.
2.2.3.1. Влияние условий хранения баранины и козлятины на эффективность методов видовой идентификации на основе ДНК-диагностики и иммунодиффузии.
2.2.3.2. Влияние термической обработки мяса на эффективность методов идентификации баранины и козлятины.
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
ВЫВОДЫ.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.
Введение диссертации по теме "Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза", Пермяков, Александр Николаевич, автореферат
Актуальность темы.
Определение видовой принадлежности мяса является одной из основных характеристик технических регламентов. Замена одного вида мяса другим является фальсификацией, что может представлять, в некоторых случаях, угрозу жизни и, с другой стороны, имеет эстетические и религиозные аспекты.
Идентификация баранины и козлятины в сырье и продуктах питания, а также определение фальсифицирующих примесей, таких, например, как мышцы собаки, является актуальной проблемой.
Для идентификации используются различные методы исследований-биохимические, органолептические, микроморфологические, электрофоретические, методы ДНК- и иммунодиагностики (Писарева В.М., 1996; Кузнецова Т.Г., 1997; Комаров А.А., Обухов И.Л., 2000; Комаров А.А., 2001, Комарова И.Н., 2005; Узунян Д.Г., 2006 г.; Kappes S.M. et al., 1997; Taylor Hi et al., 2000), дальнейшая разработка и совершенствование которых имеет как научное, так и практической значение.
Для решения вопросов идентификации используются тест-системы, стандартизованные по международным требованиям ИСО, а также отечественные тест-системы.
Закон «О техническом регулировании» предусматривает, в первую очередь, применение международных стандартов, что способствует повышению качества идентификации мяса.
Эффективность тех или иных методов идентификации зависит от различных технологических воздействий на мясо (высокой и низкой температур, длительности хранения и т.д.), что может существенно влиять на чувствительность и специфичность тест-систем определения видовой принадлежности баранины и козлятины. Данная проблема является актуальной и требует дальнейшего изучения.
Цель и задачи исследований.
Целью исследований являлось совершенствование определения видовой принадлежности баранины и козлятины на основе иммуно - и ДНК-диагностики.
В задачи исследований входило:
- усовершенствовать идентификацию мяса мелкого рогатого скота на основе иммунодиагностики;
- усовершенствовать методы идентификации баранины и козлятины на основе амплификации и ДНК - гибридизации, а также ПЦР в режиме «реального времени»; провести сравнительные исследования по определению специфичности и чувствительности методов и тест-систем на основе иммуно- и ДНК-диагностики для определения видовой принадлежности мяса в сырье и мясопродуктах;
- провести сравнительный анализ влияния условий хранения и термической обработки баранины и козлятины на эффективность методов идентификации;
- разработать методические рекомендации по определению видовой принадлежности мяса и мясопродуктов.
Научная новизна
Проведено совершенствование метода идентификации баранины и козлятины с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем SOFT (США) на основе иммунодиффузии с пропитанными моноклональными антителами фильтрами. Методика позволяет дифференцировать не термообработанную баранину от козлятины. Определена чувствительность методики, которая составляла 5% в смеси с другими видами животных, при этом время анализа сократилось в 1,5 раза.
Разработана модифицированная методика идентификации баранины и козлятины, включающая выделение ДНК с использованием 3% СТАВ-буфера, амплификацию ДНК с биотинилированными праймерами, гибридизацию меченных ампликонов с иммобилизованными ДНК-зондами и фотоколориметрическое детектирование гибридных молекул по интенсивности окрашивания после реакции с конъюгатом и субстратом.
Показана высокая чувствительность и специфичность метода на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, позволяющего проводить идентификацию до 0,5% баранины или козлятины в сырье и продуктах питания, в том числе термообработанных.
Проведена валидация методов пробоподготовки с сорбентом «силико» и постановки ПЦР в режиме «реального времени» (ПНР - РВ) с компонентами тест-систем SureFood® для идентификации баранины и козлятины. Данная методика позволяет дифференцировать баранину, козлятину и мышцы собаки и сократить время анализа в 3 раза.
Проведен сравнительный анализ влияния хранения и различных способов технологической обработки баранины и козлятины на эффективность методов идентификации и показано, что наиболее эффективными для идентификации как термообработанных, так и не термообработанных продуктов являются методы ДНК — диагностики.
Практическая ценность.
На основе проведённых исследований разработаны "Методические рекомендации по идентификации козлятины и баранины на основе иммунодиффузии", утверждённые Отделением ветеринарной медицины РАСХН 07.04.2008г.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
- VI Международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва,
2007г.);
- заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2008) -межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2008 г.). Публикации Результаты исследований отражены в 5 научных статьях.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Заключение диссертационного исследования на тему "Совершенствование определения видовой принадлежности баранины и козлятины на основе иммуно- и ДНК-диагностики"
ВЫВОДЫ.
1. Усовершенствованный метод идентификации баранины и козлятины на основе иммунодиффузии позволяет существенно сократить затраты времени на проведение анализа не термообработанной продукции. Чувствительность метода составляет 5%.
2. Модифицирована методика идентификации баранины и козлятины, а также дифференциации их от мышечной ткани собаки, которая включала выделение ДНК с использованием 3% СТАВ-буфера, амплификацию ДНК с биотинилированными праймерами, гибридизацию меченных ампликонов с ДНК-зондами, иммобилизованными на планшетах, и детектирование гибридных молекул по интенсивности окрашивания после реакции с коньюгатом и субстратом.
3. Показана высокая чувствительность и специфичность методов на основе амплификации с последующей- гибридизацией, позволяющих проводить идентификацию до 0,5% баранины и козлятины в сырье и продуктах питания, в том числе термообработанных.
4. Усовершенствована методика идентификации баранины, козлятины и дифференциации их. от мышечной ткани собаки на основе ПЦР-РВ с использованием тест-системы SureFood® и выделением ДНК с помощью иммуномагнитосорбции. Данная методика позволяла проводить анализ в течение 1-2 часов, включая термообработанную продукцию. Чувствительность метода составляла 0,01%.
5. Воздействие различных факторов на сырье (высоких и низких температур, повторного замораживания, порчи) отражается на чувствительности и специфичности методов определения видовой принадлежности баранины и козлятины, но в разной степени. По сравнению с иммунологическими тестами, методы ДНК-диагностики более устойчивы к влиянию внешних факторов, что свидетельствует о высокой стабильности ДНК по сравнению с белковыми структурами.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ
Для использования в научных учреждениях и научно-исследовательских лабораториях могут быть рекомендованы разработанные нами «Методические рекомендации по определению видовой принадлежности мяса и мясопродуктов на основе иммунодиффузии» (утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 07.04.2008г.).
Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Пермяков, Александр Николаевич
1. Александрова Н.А. и др. Методы оценки качества мяса и мясопродуктов за рубежом // М., 1997, с. 156.
2. Алехина Л.В., Андреенко В.И., Ивашов В.И. Современные методы анализа качества мяса и мясопродуктов // Мясная промышленность, АгроНИИТЭИММП, М., 1991, с. 35.
3. Беляев Е.Н., Тутельян В.А. Качество и безопасность продуктов детского питания в России: медико-биологические требования и результаты мониторинга // Вопросы питания, 1996, № 5, с. 8-12.
4. Бутко М.П. Организация и современные методы проведения ветеринарно-санитарной экспертизы. Киев, 1984.
5. Бутко М.П., Шапкина Л.П. Санитарно-гигиенические проблемы экспертизы мяса пернатой дичи // Сб.трудов 7-го Всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России». Москва, 2003, с.90.
6. Бурков В.И., Боровков М.Ф., Колесниченко И.С., Касаткин B.C. Ветсанэкспертиза мяса и жира диких животных и пернатой дичи // Ветеринария, Москва, 2003, №2, с. 55 60.
7. Ю.Версан В.Г. Актуальные проблемы введения в действие Федерального закона «О техническом регулировании» // Стандарты и качество, 2003, № 5, с. 30-32.
8. П.Витт С.В., Сапоровская М.Б., Беликов В.Н. Об анализе аминокислот методом газо-жидкосткой хроматографии // Журнал аналитической химии, 1966, т. 21, № 2, с. 227-231.
9. Долгов В.А., Лавина С.А. Методические аспекты оценки качества и безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья // Сб.трудов 7-го Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России». Москва, 2003, с. 162.
10. Донченко J1.B., Надыкта В.Д. Безопасность пищевого сырья и продуктов питания // М., Пищепромиздат, 1999, с. 352.
11. Донченко JI.B., Надыкта В.Д. Безопасность пищевой продукции // М., Пищепромиздат, 2001, с.525.
12. Дубцова Г.Н., Кирюхина М.Н., Дубцов Г.Г. Мясные кулинарные изделия, обогащенные растительным белком // Сб.трудов 7-го Всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России». Москва, 2003, с. 166-168.
13. Езерская Е.Я., Галочкин В.А. Идентификация видоспецифичных мышечных белков сельскохозяйственных животных и птицы.// Сельскохозяйственная биология. Сер.биология животных, 1999, № 6, с.3-9.
14. Журавская Н.К., Алехина Л.Т., Опряшенкова Л.М. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов // М., Агропромиздат, 1985, с. 296.
15. Заяс Ю.Ф. Качество мяса и мясопродуктов // М., Легкая и пищевая промышленность, 1981, с. 312.
16. Кабанова Е.М. Определение видовой принадлежности мяса домашних и диких животных.// Автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук. Чебоксары, 1999, с.23.
17. Карелин А.И., Макаров В.А., Боровков М.Ф. Словарь ветеринарных, зоогигиенических и санитарных терминов. М.: Росагропромиздат., 1990.
18. Комаров А.А. Методы оценки качества и безопасности кормов и кормовых добавок // Ветеринария, №1, 2001, с. 51-56.
19. Комаров А.А., Обухов И.Л. Определение видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах для собак и кошек методом ПЦР // Восьмой Международный конгресс по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных. М., 2000, е., 27-28.
20. Комаров А.А., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных.// Ветеринария, 2000., №3., с. 59-62.
21. Комаров А.А., Панин А.Н., Вылегжанина Е.С. Методы контроля анаболиков в продукции животноводства // Сб.трудов 7-го Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России». Москва, 2003, с.251-252.
22. Кривононосов М.В. Организация защиты качества продуктов питания // Международный медицинский журнал (г. Харьков), 1998, -4, №4, с. 104-106.
23. Крылова Н.И., Лесковская Ю.Н. Физико-химические методы исследования продуктов животного происхождения // М., Пищевая промышленность, 1968., с. 316.
24. Кузнецова Т.Г. Оценка морфологических свойств мясного сырья и колбасных изделий по микроструктурным показателям // Автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук. М., 1997.
25. Лабораторные исследования в ветеринарии: химико-токсикологические методы. Под ред. Антонова Б.И. // М.: Агропромиздат, 1989, с. 319.
26. Лори Т.А. Наука о мясе // М., Пищевая промышленность, 1973, с. 198.
27. Маниатис Т, Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М., изд. «Мир»., 1994, с. 159-172.
28. Могильный М.П., Калашнова Т.В. Пути повышения качества продуктов питания // Сб.трудов 7-го Всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России». Москва, 2003, с. 363-364.
29. Мысик А.Т., Белова С.М., Фомичев Ю.П. и др. Справочник по качеству продуктов животноводства // М., Агропромиздат, 1986, с. 254.
30. Нечаев А.П. Научные основы и технологические решения получения жировых продуктов для здорового и лечебно-профилактического питания // Сб.трудов 7-го Всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России». Москва, 2003, с. 377-379.
31. Николаева М.А., Лычников Д.С., Неверов А.Н. Идентификация и фальсификация пищевых продуктов // М., Экономика, 1996, с. 84-95.
32. Новоселов В.П., Шаронова Д.А. Методы геномной «дактилоскопии» в экспертизе идентификации личности и кровного родства//Новосибирск, «Наука» РАН, 1999, с. 1- 134.
33. Остерман М.Б. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами // М., Наука, 1983, с. 4-45.
34. Парук А.П., Курмакаева Т.В. Использование биофизических методов при определении фальсификаций мяса // Практик, Москва, 2004, №7-8, с. 14-17.
35. Писарева В.М. Идентификация белков животного происхождения в пищевых продуктах электрофоретическим методом // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 1999.
36. Правила ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов. Утв. Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 27 декабря 1983 г. М., ВО «Агропромиздат», 1988.
37. Правила проведения сертификации пищевых продуктов и продовольственного сырья.//М., 1999.
38. Производственно-технический контроль и методы оценки качества мяса и птицепродуктов. Под ред. Горбатова В.М. // М., «Пищевая промышленность», 1974, с. 274.
39. Попова М.Ю., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Жаринов А.И., Рогов И.А., Скрябин К.Г. Определение содержания и выделение ПЦРпригодной ДНК из коммерческих препаратов переработки сои // Биотехнология, Москва, 2003, № 2, с. 86-94.
40. Рогов И.А. Новые технологии производства продуктов здорового питания // Сб.трудов 7-го Всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России». Москва, 2003, с. 440-441.
41. Родин В.И. Сравнительная оценка методов ветеринарно-санитарного контроля пищевого сырья и готовых продуктов.// Материалы Международной научно-технической конференции «Пищевой белок и экология». М., 2000, с. 188-189.
42. Романов Г.А. Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности // Физиология растений, Москва, 2000, том 47, № з, с. 342-353.
43. Романенко Г.А. Обеспечение качества и безопасности сельскохозяйственной продукции // Сб.трудов 7-го Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России». Москва, 2003, с.444-445.
44. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. Под редакцией Скурихина И.М., Тутеляна В.А. // М., Изд. «Брандес», « Медицина», 1998, с. 232.
45. Самуйленко А .Я., Кузнецов Д.П., Кузнецова С.В. Иммуноферментный анализ в ветеринарной медицине // Ветеринария, № 12, с. 20-24.
46. Санитарные правила и нормы. СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов // М., 2001.
47. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды // М., изд. «Мир», 1987, с. 47-64.
48. Сафронова A.M., Батурин А.К., Старовойтов M.JI. Анализ потребления мясопродуктов населением России // Сб.трудов 7-го Всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России». Москва, 2003, с.464-466.
49. Светличкин В.В. Сертификация животноводческой продукции // Материалы Международной научной конференции «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. Москва, 1999, с. 2131.
50. Сенченко Б.С., Кабанова Е.М. Определение видовой принадлежности мяса по температуре вспышки наружного и внутреннего жира некоторых видов животных.// Сб. трудов Кубанского государственного аграрного университета, 1999, Вып.375, с.119-121.
51. Системы анализа рисков и определения критических контрольных точек: НАССР/ХАССП // Москва, 2002, с.593.
52. Скалинский Е.И., Белоусов А.А. Микроструктура мяса.// М., Пищевая промышленность, 1978, с. 155-175.
53. Слесаренко Н.А., Курмакаева Т.В., Якушев С.В. Морфологические критерии определения видовой принадлежности мяса.// Современные вопросы интенсификации кормления, содержания животных и улучшения качества продуктов животноводства. М.,1999, с.103-105.
54. Смирнов A.M., Симецкий М.А., Таланов Г.А. Состояние и перспективы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии // Ветеринария, 2001, № 10, с. 3-7.
55. Стент Г. Молекулярная генетика // М., изд. «Мир», 1974, с. 535.
56. Татулов Ю. Качество свинины одного из основных видов сырья мясной промышленности // Свиноводство, 1997, № 6, с. 24-26.
57. Узунян Д.Г. Разработка методов и технических средств идентификации мяса на основе ДНК-и иммунодиагностики. Автореф. конд. дисс., Москва 2006
58. Указания по организации Государственного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения № 12-7/900 // Утверждены Главным государственным ветеринарным инспектором РФ 4 октября 1999.
59. Фомичев Ю.П. Техническое регулирование и контроль качества молока в процессе производства // Практик, Москва, 2004, № 7-8, с.8 -13.
60. Фрумгарц Л.Ф., Киприянов С.М., Калачиков С.М. и др. Получение флуоресцентной меченой ДНК и использование ее в качестве зонда при молекулярной гибридизации // Биоорганическая химия, 1986, №11, с. 1508-1513.
61. Хвыля С.И. Микроструктурный анализ, идентификация и фальсификация мясных продуктов// Пищевая промышленность, 1998, № 5, с. 68-69.
62. Хвыля С.И. Соевые белковые продукты и возможности их идентификации // Сб.трудов 7-го Всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России». Москва, 2003, с. 539-540.
63. Хвыля С.И., Авилов В.В., Кузнецова Т.Г. Практическое применение гистологических методов анализа// Мясная промышленность, 1994, №6, с. 9-11.
64. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика // М, изд. «Мир», 1999, с.558.
65. Чан Т.В.Т. Гибридизация нуклеиновых кислот // В кн. Молекулярная клиническая диагностики. Методы. М., 1998, изд. «Мир», с. 374-394.
66. Черняева М.Н. Анализ видовой принадлежности мяса и мясопродуктов. // Ветеринария, 2001, №6, с.47-50.
67. Чумак P.M. Иммуноферментный анализ и рекомбинантные антигены // Лаб. диагностика, 1999, № 3, с. 3-6.
68. Чуркина И.В., Сазонова А.А., Черепанов С.В., Смирнов А.Ф. Геномная дактилоскопия кур с использованием в качестве зонда ТГ-обогащенной минисателлитной ДНК // Сельскохозяйственная биология, 1995, №2, с. 53-55.
69. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биотопов // В кн. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М., изд. «Мир», 1999, с. 395-425.
70. Экологическая биотехнология (Под ред. Форстера К.Ф., Вейза Д.А.) //Л., изд. «Химия», 1990, с. 21-39.
71. Яшин Я.И., Яшин А.Я. Анализ пищевых продуктов и напитков с помощью хроматографических методов // Сб.трудов 7-го Всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России». Москва, 2003, с. 595-596.
72. Abraham J., Rajulu P.V. Species identification in unprocessed meats through agarose isoelectric focusing of urea-extracted proteins and myoglobin // Indian J.anim.Sc., 1992, v. 62, № 1, p. 69-74.
73. Adessi C., Matton G., Turcatti G., Mermod J., Mayer P., Kawashima E. Solid phase DNA amplification: characterisation of primer attachment and amplification mechanisms // Nucleic Acids Research, 2000, 28, 20, p. 87.
74. Agrowal S., Cristodoulou C., Gait M. Efficient methods for attaching nonradioactive labels to the 5 ends of syntheticaligodeoxy ribonucleotides // Nucl. Acid. Res. 1986. V. 14, p. 6227-6245.
75. Araki H. Et al. Histochemical properties of muscle fiber in breiler chickens // Jap. Soc of Sci Fish. 1993, v.34, № 2, p. 137-144.
76. Bauer F., Rippel-Rachle B. Tierartenidentifizierung bei Fleisch und Fleischwaren.// Wien.tierarztl.Mschr., 1998, Jg.85,H.8.-S.260-266.
77. Beard J. Gene probes Locate waterborne diseases // New Sci, 1987, № 1562, p. 237.
78. Beneke В., Hagen M. Eignung der PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion): Tierartennachweis in erhitzten Fleischerzeugnissen.// Fleischwirtschaft, 1998, Jg.78,N 9.-S.1016-1019.
79. Bennet H.S. The structure and functional muscle // Academic Press, New York, v.l, 1960, p. 137.
80. Berger C., Melchers F. In situ hybridization ofmRNA molecule in single cells // Annu rep, 1985, Basel Inst. Immunol, Basel, p. 1-10.
81. Boom R, Sol C, Beld M., Weel J., Goudsmit J., Wertheim-van Dillen. Improved Silica-Guanidiniumthiocyanate DNA isolation Procedure Based on Selective Binding of Bovin Alpha-Casein to Silica Particles // J. Clin. Microbiol, 1999, v.37, № 3, p.615-619.
82. Buntjer J.B.,Lamine A.,Haagsma N.,Lenstra J.A. Species identification by oligonucleotide hybridisation: the influence of processing of meat products // J.Sc.Food Agr., 1999, v. 79, № 1, p. 5357.
83. Calvo J.H.,Zaragoza P.,Osta R. Random amplified polymorphic DNA fingerprints for identification of species in poultry pate // Poultry Sc., 2001, v. 80, № 4, p. 522-524.
84. Cassiman I. Diagnosis of genetic diseases by probes // Acta clin. Belg, 1988, p. 181-184.
85. Chikuni К, Matsunaga T, Tanabe R. Determination of mitochondrial cytochrome В gene sequence for red deer and the differentiation of closely related deer meat // Meat Sci, 1990, v. 49, № 4, p. 379-385.
86. Church R.B. Method for study of hybridization and reassociation of nucleic acids axtracted from cells of higher animals // In: Molecular techniques and approach in developmental biology, ed. by M. J. Chrispeels. N. Y., 1973, p. 223-301.
87. Codex Alimentarius // Vol. 10, FAO, WHO, 1991, 223 p.
88. Codex Alimentarius Volume Thirteen. Methods of analysis and sampling // Vol. 13, FAO, WHO, 1994, 134 p.
89. Codex Alimentarius Volume Ten. Meat and meat products including soups and broths // Vol. 10, FAO, WHO, 1994, 222 p;
90. Cooper M.G. Species identification of meat product by standard methods //Ed.Patt., 1985, v 6, p. 135-141.
91. Сох K.H., DeLeon D.V., Angerer L.M. Detection of mRNAs in sea unchin embryos by in situ hibridization using asymmetric RNA probes // Developmental Biology, 1987, v. 101, p.485-502.
92. De Ley I., Cattoir H., Reynaerts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturatiun rates // Europ. J. Biochem., 1970, v. 12, p.133-142.
93. Denhardt D.T. A membrane filter technique for the detection of complementery DNA // "Biochem. Biophys. Res. Commun.", 1966, v.23, p. 641-646.
94. Ding H.,Xu R.-J.,Chan D.K.O. Identification of broiler chicken meat using a visible/near-infrared spectroscopic technique // J.Sc.Food Agr., 1999, v. 79, № 11, p. 1382-1388.
95. Erlich H.A. PCR technology.// Stockton Press, New York, 1989.
96. Fairbrother K.S.,Hopwood A.J.,Lockley A.K.,Bardsley R.G. Meat speciation by restriction fragment length polymorphism analysis using an alpha-actin cDNA probe // Meat Sc., 1998, v.50, № 1, p. 105-114.
97. Fei S.,Okayama T.,Yamanoue M.,Nishikawa I.,Mannen H.,Tsuji S. Species identification of meats and meat products by PCR // Anim.Sc.Technol., 1996, v.61, № 10. p. 900-905.
98. Fleming I., Lumbley J. Validation of new techniques for the analysis of foods // Food Sciens and technology today, v. 9., № 2, 1995, p. 84-85.
99. Forster A., Modness J., Skingle D. Non-radioactive hybridization probes prepared by chemical labeling of DNA and RNA with novel reagent, photobiotin // Nuc. Acid Res., 1985, № 3, p.745.
100. Gillespie D., Spiegelman S. A quantive assay for DNA-RNA hybrids with DNA-RNA immobilized on a membrane // J. Molecul. Biol., 1965, v.12, p.829-842.
101. Gudibande R., Kenten J. Electrochemiluminescen T-label for DNA probe assays // Biotechnol Adv, 1997, v. 15, № 3-4, p. 721.
102. Harbing S., Harbing M. Detection of DNA via an ion channel switch biosensor // Analytical Biochemistry, 2000, 282, p. 70-79.
103. Harris S., Jonet D. Optimisation of the PCR // Brit. J. Biomid. Sci., 1997, v. 54, №3, p. 166-173.
104. Hayashi K. Manipulation of DNA by PCR. In. PCR the Polimerase chain reaction, Eds // Mullis K.B., Ferre F. & Gibbs R.A., Birkhauser, 1994, p. 3-14.
105. Heinert H.H. et al. The analysis of the beef forcemeat on the contents of the alimentary components // Fleischwirtschaft, 1980, v. 2, p. 421240.
106. Heinzelmann R. Beurteilung von Eber-, Zwitter-und Kryptorchiden (Binneneber) fleisch.// Fleischwirtschaft, 1999, Jg.79,N 9.-S.34-39.
107. Helle N. Et al. Methods of allocation DNA from chicken. // Arch. Fur Lebensmittelhygiene, 1996, v. 3, № 2, p. 48-51.
108. Herrick J., Michalet X., Conti C., Schurra C., Bensimon A. Quantifying single gene copy number by measuring fluorescent probe lengths on combed genomic DNA // Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, v. 97 (l),p 222-227.
109. Hoffmann K. Identification and determination of meat and foreign proteins by means of dodecylsulfat poliacrylamid gel electrophoresis // Ann. Nutr. Alim., v. 31, № 2, 1997, p. 207-215.
110. Hopmar A., Wiegant J., Tesser G. A no-radioactive in situ hybridization method based on mercurated nucleic acid probes and sulfhydryl-hapten ligands // Nucl. Acud. Res., 1986, v. 14, № 16, p. 6471-6488.
111. Hopwood A.J., Fairbrother K.S., Lockley A.K., Bardsley R.G. An actin gene-related polymerase chain reaction (PCR) test for identification of chicken in meat mixtures // Meat Sc., 1999, v. 53, № 4, p. 227-231.
112. Hunt D.J. et al. Fatty acid changes deering development of zygotic // Physiol. Plantarium. 1997, v.81, № 4, p. 447-454.
113. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J. Optimization of PCRs. In: PCR protocols, a guide to methods and applications // Academic Press, San Diego, California, 1990, p. 16-21.
114. ISO 9001. Quality systems models for quality assurance in design, 1987, pp. 6-8.
115. Jannsen E. Method adapted to PhastSystem // Z. Lebensm. Unterrs. Forsh.1986.-v. 182,-p.479-483.
116. Jremstein M. and Hognes D. Colony hybridization: A method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene // Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 1975, p. 3961-3965.
117. Kim H. et al. Applying of different methods for allocation DNA // J. of Food Sci., 1986, v. 5, № 3, p. 68-71.
118. King N.L. Kurt L. Analysis of raw beef samples for adulterant meat species by enzyme staining of isoelectric focusing gels // J. Food Sci.,— 1982.-v.47,-p.l608-1612.
119. Kofoth M. Aktuelles aus der internationalen Fleischforschung // Fleischwirtschaft, 1999, № 8, p. 68-69.
120. Koh M.C.,Lim C.H.,Chua S.B.,Chew S.T.,Phang S.T.W. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprints for identification of red meat animal species // Meat Sc., 1998, v. 48, № 3/4, p. 275-285.
121. LeProust E., Pellois J., Yu P., Zhang H., Gao X. Digital light-detected synthesis. A microarray platform that permits rapid reaction optimization on a combinatorial basis // Journal of Combinatorial Chemistry, 2000, 2, p. 349-354.
122. Liberona H.E., Moxham J.M., Timbs D.V. Qualitty controlprocedures in an automated serological testing laboratory // N.Z. Vet. J., 1978, 26, № 23, p. 60, 65-66.
123. Longer P. Enzymatic synthesis of biotin-labelekl polynucleotides novel nucleic acid affinity probes // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1981, №11, p. 6633.
124. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. et al. The classical and sensitive methods for measuring the concentration of proteins // J. Biol. Chemistry., v. 193, 1951, p. 265-270.
125. Ludke H.,Bargholz J.,Leiterer M. Wertbestimmende und Einige toxische Inhaltsstoffe in Fleisch und Verarbeitungsprodukten von Pute und Schwein. Schr.-R // Verb.Dt.Landw.Unters.Forsch.-Anst., Darmstadt, 1993, № 37, -S. 669-672.
126. Macedo-Silva A.,Barbosa S.F.C.,Alkmin M.G.A.,Vaz A.J.,Shimokomaki M., Tenuta-Filho A. Hamburger meat identification by dot-ELISA // Meat Sc., 2000, v. 56, № 2, p. 189-192.
127. Marmur J., Doty P. Heterogeneity in deoxyribonucleic acids. I. Dependens on composition of the configurational stbility of deoxyribonucleic acid // Nature, 1959, v.183, p.1427-1431.
128. Marmur J., Doty P. Thermal renaturation of deoxyribonucleic acid. // J. Molecul. Biol., 1961, v.3, p.585-594.
129. Martin R., Haza A.I., Horales P. Detection and quantification of goats chees in ewes chees using a monoclonal antibody and two ELISA formats // J. Sc. Food Agr. 1997, v.79, № 7, p. 35-41.
130. Martm R. H. Non-radioactive techiques for the labelling of nucleic acids // Biotech. Adv., 1991, v.9, p. 185-196.
131. Moio L., DiLuccia A., Addeo F. Fast isoelectric focusing of milk proteins on small ultrathin polyacrylamide gel containing urea // Electrophoresis. 1989, v. 10, p.535-539.
132. Moio L., Sasso M.L., Chianese L., Addeo F. Rapid-detection of bovin milk in ovine, caprine and water buffalo milk or cheese by gel isoelectric focusing on PhastSystem. // Ital. J. Food Sci., 1990, v.3, p. 71-176.
133. New analytical system to improve food quality management // Int. Labmate, 2001, 25, № 7, p. 36.
134. Ouchterlony O. // Progress in Allergy. 1958, v. 6, p. 30
135. Partis L.,Croan D.,Guo Z.,Clark R.,Coldham T.,Murby J. Evaluation of a DNA fingerprinting method for determining the species origin of meats // Meat Sc., 2000, v. 54, № 4, p. 369-376.
136. Paz de Репа M., Concepcion Gid M., Bello J. A method for identification of frozen meat used for production of cooked ham // Meat Sc., 1998, v. 48, № 3/4, p. 257-264.
137. Ranki M. Sandweich hybridization as a convmient method for detection ofnucleic acids in crude samples // Gene, 21, 1983, p. 77.
138. Rehbein H., Kress G., Schmidt T. Application of PCR-SSCP to cpecies identification of fishery products // J. of the Sci of Food and Agric., 1997, v. 74, № 1, p. 35-41.
139. Rehben H. Electrophoretic techniques for species identification of fichery products. -Z, Lebensm. Unters Forsch., 1990, v. 191, p. 1-38.
140. Renand G. Perspectives d'amelioration genetique de la qualite de la viande// Elevages beiges, 1993, № 12, p. 9-11.
141. Renz M., Kiirz C. A colorimetric method for DNA hybridization // Nlicleic Acids Res., 1984. v. 12, № 8, p. 13435-13444.
142. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Erlich H.A. Genetic ahalisis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, p. 6230-6234.
143. Sakurai M., Hikono H., Ohta M. Production and characterization of monoclonal antibodyes that zecognize bovine kit zeceptor //Veter. Immunol. Immunopathol. 1997, v. 68, № 2/4, p. 101-112.
144. Sausern J. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electroohoresis // J.Molec.Biolog., 1975, 98, p. 503.
145. Seymour C. Electrophoresis technology: food and reverage analysis // Food Tech. Europe, 1993, Sept/Nov., p.127-152.
146. Skarpeid H.-J.,Moe R.E.,Indahl U.G. Detection of mechanically recovered meat and head meat from cattle in ground beef mixtures by multivariate analysis of isoelectric focusing protein profiles // Meat Sc., 2001, v. 57, №3, p. 227-234.
147. Smith D.M. Immunoassays in Process Control and Speciation of Meats // Food technologi, 1995, № 2, p. 116-117.
148. Sperner В., Schalch В., Gabert J., Greil. В., Stolle A Einsatz des Salmotyre fleischsaft ELISA // Fleischwirtschaft, 1999, № 8, p. 81-84.
149. Swatland H.J. Early PSE detection.Ontario swine research rev // Guelph,1997, 1997, p. 50-51.
150. Tartaglia M., Saulle E., Pestaloza S. Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds: a molecular approach to test for the presence of bovine-derived material // Journal of food protection, vol. 61, №5, 1998, p. 513-518.
151. Taylor A. Et al. Extraction and ESI-CID-Ms/Ms analysis of myoglobins fran different meat species // Food Sci. &Techn. Tod., 2000, v. 69, № 1, p. 81-86.
152. Tchen P., Ranki M. Time-resolved fluoromentri, a sensitive method to quantify DNA-hybrids // Nucl. Acid Res., 1986, № 2, p. 1017-1028.
153. Todd D., Creelan J. L., MeNulty M. S. Dot-hybridization assay for chicken anemia agent using a cloned DNA probe // J. Clin. Microbiol., 1991, v.29,№5,p. 933-939.
154. Varga C.,Strelec V.,Volk M. Poultry meat in the production of meat products // Agriculture, 2000, v. 6, № 1, p. 49-52.
155. Vermer Wheelock. Food safety: A key issue for consumers // Int. J. . Dairy Technol., 1998, 51, №1, p. 11-14.
156. Vo-Dinh t., Anarie J., Isola N., Landis D., Wintenberg A., Ericson M, DNA biochip using a phototransistor integrated circuit // Analytical Chemistry, 1999, 71, p. 358-363.
157. Vollenhofer S., Burg K., Schmidt J., Kroath H. Genetically modified organisms in foods screening and specific detection by polymerase chain reaction // J.Agric.Food Chem/1999,47 (12): 50385043.
158. Westin L., Xu X., Miller C., Wang L., Edman C., Nerenberg M. Anchored multiplex amplification on a microelectronic chip array // Nature Biotechnology, 2000, 18, 2, p. 199-204.
159. Wolf C., Burgener M.,Hubner P.,Luthy J. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: differentiation of fish species // Food Sc.Technol., 2000, v .33, № 2, p. 144-150.
160. Wolf C.,Rentsch J.,Hubner P. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification // J.agr.Food Chem., 1999, v. 47, № 4, p. 1350-1355.
161. Yamanaka M.,Kudo T.,Itagaki Y.,Sato S.,Nakamura T. Sex identification of beef by polymerase chain reaction // Anim Sc.J., 1999, v.70, № 8, p. 111-113.
162. Yman I. M. Meat and fish species identification by isoelectric focusing // Food laboratory news, v.6, N2, 1990, p. 28-45.
163. Zimmermann S., Zehner R.,Mebs D. Tierartenidentifizierung aus Fleischproben mittels DNA-Analyse // Fleischwirtschaft, 1998, Jg.78, № 5.-P.530-533.