Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 16.00.03
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции
На правах рукописи
СОРОКИНА МАРИЯ ЮРЬЕВНА
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ МЯСНЫХ ИНГРЕДИЕНТОВ В КОРМАХ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2004
Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики Федерального государственного учреждения Всероссийского государственного Центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов МСХ РФ (ФГУ ВГНКИ) и научно-производственной лаборатории Государственного учреждения Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии МЗ РФ (ГУ ЦНИИЭ).
Научные руководители:
Доктор биологических наук, профессор Обухов И. Л.
Кандидат биологических наук Комаров А. А.
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор Гуненков В. В. (ФГУ ВГНКИ)
Доктор ветеринарных наук, профессор Белоусов В. И.
(Федеральная служба по ветеринарному и фнтосанитарному надзору МСХ РФ)
Ведущая организация:
Федеральное государственное
учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных»
(ФГУ «ВНИИЗЖ»)
Защита диссертации состоится «_»_2004 г. в_часов на
заседании диссертационного совета Д 220.011.01 в Федеральном государственном учреждении Всероссийском государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов МСХ РФ по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ВГНКИ.
Автореферат разослан «_»_2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент, Заслуженный ветеринарный врач РФ
Козырев Ю.А.
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность темы.
Ветеринарная служба, защищая потребителя от фальсификации мясной продукции, постоянно проводит видовую дифференциацию мяса в продуктах питания и кормах, подвергавшихся термической обработке. Значение этих мероприятий в последние годы особенно возросло в связи с открытием новых видов прионных болезней сельскохозяйственных и домашних животных, относящихся к группе трансмиссивных губкообразных энцефалопатии (ГЭ) (Prusiner S.B., 198l).
Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭ КРС) впервые выявлена в Великобритании в ноябре 1986 года (Wells G.A. et al, 1987). По данным международного эпизоотического бюро за 1989-2002 годы в мире зарегистрировано 3611 случаев ГЭ КРС, и более 177 000 случаев в Великобритании. В 2000-2001 годах отмечен рост случаев ГЭ КРС во Франции, Ирландии, а в 2001-2002 годах в Бельгии, Германии, Нидерландах, Испании, Италии, Португалии отмечено от нескольких десятков до сотен случаев в год. В 2003 году в мире зарегистрировано 777 случаев ГЭ КРС и 425 случаев в Великобритании. , .
Основной источник заражения ГЭ - мясокостная мука, полученная из жвачных животных. В Великобритании в начале 80-х годов были изменены режимы переработки сырья животного происхождения при производстве мясокостной муки, которые не обеспечивали инактивацию возбудителя болезни (Зуев В.А. с соавт., 1999).
С 1996 г. во всех странах Европейского Союза (ЕС) введен запрет на скармливание жвачным животным мясокостной муки из млекопитающих. Однако из-за незаконного сбыта мясокостной муки в страны, не являющиеся членами ЕС, и фальсификации рыбной муки добавками, протеинов млекопитающих по экономическим причинам риск заражения достаточно велик. В связи с открытием в последние годы ГЭ кошек в группу риска попали корма для домашних животных (Bradley R., 1997).
Таким образом, определение видовой принадлежности мясных ингредиентов в составе кормов актуально. Однако такие методы как иммунодиффузия в геле, изоэлектрическое фокусирование, иммуноферментный анализ (ИФА), реакция кольцеприципитации (РК) применяемые для видовой идентификации сырого мяса не эффективны, т.к. термическая обработка приводит к денатурации белков и потере ими видовой специфичности (Hoffman et al., 1996). В отличие от белков ДНК более устойчива и не утрачивает своей информативной функции. Поэтому применение молекулярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР), является перспективным для. определения видовой принадлежности ДНК в составе продуктов и кормов подвергавшихся термической обработке.
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ i БИБЛИОТЕКА
CIltTcpfl
\ ' оз ?оо&«т77 У»
Шй
1.2. Цель и задачи исследований.
Целью настоящей работы являлась разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом ПЦР.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Сконструировать олигонуклеотидные праймеры и разработать оптимальные параметры ПЦР для идентификации и дифференциации ДНК говядины и баранины в кормах.
2. Оценить эффективность различных способов выделения ДНК из кормов (рыбная и мясная мука), комбикормов для крупного, мелкого рогатого скота и птицы, сухих и консервированных кормов для домашних животных (собак, кошек).
3. Сравнить чувствительность и специфичность разработанной ПЦР-тест-системы с ИФА-набором фирмы Cortecs Diagnostics Limited (Великобритания).
4. Определить эффективность ПЦР-тест-системы для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом ПЦР при тестировании кормов, поступающих по импорту в Россию.
1.3. Научная новизна.
Впервые сконструированы олигонуклеотидные праймеры для дифференциальной амплификации специфических последовательностей ДНК жвачных животных (крупного и мелкого рогатого скота) в варианте мультиплексной ПЦР, на основе которых разработана тест-система, обладающая 100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 0,1% примеси мясокостной муки жвачных в исследуемом материале или 10 пг ДНК жвачных в пробе ПЦР.
Установлено, что наиболее универсальным методом пробоподготовки является протеиназная обработка с последующей сорбцией ДНК на силикагеле в присутствии высокой концентрации солей гуанидина. Данный метод выделения ДНК обеспечивает высокую чувствительность тест-системы.
Создан,внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в ПЦР пробе, который добавляется на этапе выделения ДНК и полностью исключает ошибки исследователя при постановке реакции.
Разработаны положительные контрольные образцы ДНК bovis и ДНК ovis, являющиеся индикатором работы амплификационной смеси и маркером: длины ПЦР-продуктов (680 и 350 п.н. соответственно).
1.4. Практическая значимость работы.
Разработана и впервые внедрена в ветеринарную практику тест-система «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом ПЦР.
Установлено, что ПЦР-анализ для выявления тканей жвачных животных в кормах, значительно превосходит по чувствительности и специфичности традиционные методы (ИФА и РК) и позволяет дифференцировать ДНК крупного и мелкого рогатого скота в варианте мультиплексной ПЦР.
Внедрение в систему государственного контроля ПЦР-тест-системы «БИГ» с декабря 2000 года по январь 2004 года позволило снизить фальсификацию рыбной муки и кормов тканями жвачных животных с 30,3% до 6,1%, что имеет важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение.
Результаты проведенных исследований вошли в разработанные нормативные документы: .
1. Наставление по применению тест-системы «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (№ 13-5-02/0161);
2. Технические условия на тест-систему «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (ТУ № 9388-029-00494189-01).
1.5. Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета ФГУ ВГНКИ (1999-2003 гг.)..
Материалы диссертации доложены на 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (Москва, 2000 г.); на Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (Москва, 2001 г.); на международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002 г.); на 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002 г.); на научно-проблемных методических комиссиях ФГУ ВГНКИ (1999-2003 гг.).
1.6. Публикации.
По теме диссертации опубликовано 4 научных статьи.
1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на зашрту. . -
1. Выбор праймеров для идентификации и дифференциации ДНК говядины и ДНК баранины в кормах.
2. Определение чувствительности и специфичности метода П1ДР.
3. Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом ПЦР.
4. Сравнение эффективности ПЦР-тест-системы «БИГ» с коммерческим ИФА-набором зарубежного производства.
5. Мониторинг тестирования кормов методом ПЦР.
1.8. Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена 104 страницах компьютерного текста, и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 162 источника, в том числе 148 иностранных). Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и 9 таблицами. Прилагаются разработанные нормативные и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Поиск нуклеотидных последовательностей генома жвачных животных проводили по базам данных GeneBank - Национального института здоровья США, EMBL - Европейской молекулярно-биологической лаборатории, DDBJ -Национального института генетики Японии и PDB - базы данных белковых последовательностей при помощи поисковой системы Entrez Национального центра биотехнологической информации США.
Анализ выбранных нуклеотидных последовательностей на вариабельность и поиск консервативных участков, необходимых для выбора праймеров проводили on-line с помощью системы ClustalW Multi Sequnce Alignment. Специфичность выбранных праймеров теоретически изучали с помощью компьютерных программ FASTA и BLASTA on-line.
Выбранные праймеры были синтезированы ЗАО "Синтол" (г.Москва) фосфоамитидным методом на синтезаторе ASM-102 (г. Новосибирск).
Экспериментально специфичность праймеров подтверждали на коммерческих и самостоятельно полученных референс-препаратах ДНК. Коммерческие препараты ДНК: ДНК тимуса теленка "ICN", США, кат.№ 195129; ДНК спермы лосося "ICN", США, кат.№ 101501; ДНК эритроцитов • цыпленка "Reanal", Венгрия, кат.№ D-28; ДНК фага лямбда «СибЭнзим», г. Новосибирск, кат.№ D11. Лиофилизированные образцы ДНК разводили в ТЕ-буфере (трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид (трис-НС1) 10 мМ, динатриевая соль этилендиамин-тетрауксусной кислоты (ЭДТА) 1 мМ, рН=8,0) до концентрации 0,5 мг/мл. Образцы ДНК коровы, овцы и свиньи получали из цельной крови животных (Maniatis Т. et al.,. 1982). Пробу крови подвергали выборочному лизису эритроцитов, лейкоцитарную фракцию обрабатывали протеиназой К. Из полученного лизата при помощи < фенол-хлороформной обработки экстрагировали ДНК и преципитировали ее этанолом. Осадок ДНК растворяли в ТЕ-буфере.
Концентрацию полученного препарата ДНК оценивали спектрофотометрически (Maniatis Т. et al., 1982), используя соотношения (1)и(2).
OD=\gij = Ecd (I)
где OD — оптическая плотность данного раствора, /„ - интенсивность падающего света, I — интенсивность света прошедшего через поглощающий слой, - молярный коэффициент поглощения (экстинкции), зависящий от природы растворенного вещества, - концентрация вещества в растворе, -толщина поглощающего слоя.
Максимум поглощения нуклеиновых кислот приходится на 260 нм и создается суммой поглощений каждого из нуклеиновых оснований. Для больших молекул двухцепочечной ДНК установлен средний коэффициент экстинкции (2) позволяющий оценить концентрацию ДНК без вычисления суммы экстинкции каждого из нуклеотидов.
мкг х см ^ ^
Соотношение (2) означает, что концентрация раствора ДНК, имеющего при длине волны 260 нм оптическую плотность равную 1 составляет 50 мкг/мл. Пользуясь этим соотношением рассчитывали концентрацию полученных препаратов ДНК. Образцы ДНК хранили в аликвотах при минус 70°С. Разные концентрации ДНК получали при помощи последовательных 10-ти кратных разведений в ТЕ-буфере.
Для изучения чувствительности разрабатываемой тест-системы готовили смеси из кормовой муки разного состава. Образцы муки отбирали согласно ГОСТ 13496.0 «Комбикорма, сырье. Методы отбора проб». От средней пробы отбирали 10-15 г. Чтобы исключить случайное загрязнение (контаминацию) проб муки, соблюдали следующие меры предосторожности: каждый образец муки. отбирали одноразовой медицинской перчаткой и помещали в новый полиэтиленовый пакет. Каждый пакет отдельно вскрывали в боксе и специальным одноразовым шпателем переносили 1 г корма в несколько (не менее 5-ти) плотнозавинчивающихся пробирок типа «эппендорф». Пробирки маркировали. Образцы муки хранили при комнатной температуре.
Образцы коммерческих гранулированных и консервированных кормов для животных отбирали по ГОСТ 13496.0 «Комбикорма, сырье. Методы отбора проб», ГОСТ 8756.0 «Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытаниям» и ГОСТ 2671 «Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов», соблюдая все меры предосторожности препятствующие контаминации. Каждый образец корма предварительно измельчали и растирали до гомогенного состояния в стерильной посуде в количестве 1-2 г. Измельченный образец аккуратно переносили в пробирки типа «эппендорф». Образцы консервированных кормов хранили при минус 20°С, образцы сухого корма - при (18-25)°С.
Исследования рыбной муки и кормов проводились согласно Наставлению по применению тест-системы «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом ПЦР (№ 13-5-02/0161).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Выбор олнгонуклеотидных праймеров для дифференциальной амплификации ДНК говядины и баранины.
На основе литературных данных в качестве гена-мишени были выбраны: а) ген гормона роста; б) ген митохондриального цитохрома. По базам данных, указанным в разделе 2 были выбраны более 30 последовательностей гена гормона роста крупного рогатого скота, овец, свиней, коз, оленей, крысы, человека и такое же количество нуклеотидных последовательностей генома митохондриального цитохрома Ь тех же животных.
Анализ вариабельности выбранных последовательностей показал, что ген гормона роста отличается выраженной вариабельностью и не подходит на роль мишени. В то же время, удалось обнаружить достаточно консервативные участки в геноме митохондриального цитохрома Ь. С помощью компьютерной программы ClustalW Multi Sequence Aligment было выполнено выравнивание нуклеотидных последовательностей гена митохондриального цитохрома b вышеперечисленных животных. Однако, даже выбранные участки у животных разных пород содержали нуклеотидные замены, поэтому структура праймеров была задана так, чтобы наиболее вариабельные позиции содержали два наиболее часто встречающихся нуклеотида.
Чтобы определить вид жвачного животного (крупный рогатый скот или овцы) с помощью одностадийного анализа был сделан следующий дизайн праймеров. Для ДНК bovis и ДНК ovis были подобраны два разных специфических прямых праймера («Г» - говядина, «Б» - баранина) и один общий обратный: праймер («О» - общий). Прямые праймеры находились на разном расстоянии от обратного праймера, поэтому длина ПЦР-продукта для ДНК bovis составила 680 п.н., а для ДНК ovis - 350 п.н. Каждый праймер представлял собой олигонуклеотид длиной 25, 29 и 26 п.н., соответственно, и имел 36; 41 и 48% GC-nap в своем составе..
3.2. Изучение специфичности выбранных праймеров.
С помощью специализированных программ FAST А и BLASTA on-line была показана гомология- выбранных олигонуклеотидов только с генами-митохондриального цитохрома крупного рогатого скота • и овец, и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других животных. Поиск был проведен по 733065 последовательностям. Таким образом; предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью.
3.3. Подбор условий ПЦР.
Известно, что эффективность ПЦР зависит от температуры отжига праймеров, их количества, концентрации ионов Mg2+, а также от количества циклов амплификации и концентрации ДНК-матрицы.
Эффективность амплификации при разных температурах отжига изучали отдельно для каждой пары праймеров (смеси «ГО» и «БО»). В качестве ДНК-матрицы использовали последовательные 10-ти кратные разведения» ДНК баранины и говядины с концентрацией от 100 пг до 1 пг ДНК (т.е. от 102 до 1 генома) в ПЦР-пробе. Количество ДНК, соответствующее одной копии генома принимали равным 7 пг (Херрингтон С. с соавт., 1999). В качестве отрицательного контроля ПЦР использовали деионизованную воду или ТЕ-буфер.
В результате проведенных экспериментов была определена оптимальная температура отжига, равная (60-62)°С, при которой одинаково успешно работают как праймеры «БО», так и праймеры «ГО», что позволило в дальнейшем объединить все праймеры в одной реакционной смеси. Установлено что, оптимальное количество праймеров «БО» и «ГО» при температуре отжига (60-62)°С составило 15 пмоль.
При объединении прямых праймеров для ДНК ovis («Б») и ДНК bovis («Г») и общего обратного праймера (смесь «БиГ») необходимо было установить минимальное количество общего праймера, т.к. при недостатке его возможна конкуренция между матрицами ДНК ovis и ДНК bovis. С этой целью были приготовлены разведения ДНК которые содержали как матрицу ДНК ovis, так и ДНК bovis в следующих соотношениях: 10 пг ДНК ovis и 1 пг ДНК bovis, 1 пг ДНК ovis и 1 пг ДНК bovis, 1 пг ДНК ovis и 10 пг ДНК bovis в ПЦР-пробе. Амплификацию проводили в присутствии 15 пмоль каждого прямого праймера и 15; 22,5 и 30 пмоль общего праймера.
Во всех случаях ПЦР позволяла детектировать по 1 пг каждой ДНК как отдельно, так и в одной пробе (рис. 1).
Количество праймеров: 1-8 — 30 пмоль обратного праймера в реакционной смеси; 9-16 — 22,5пмоль; 17-24 — 15пмоль; 25-26 — амппификация спраймерами«ГО»;27-28— амплификация спраймерами«БО».
Концентрация ДНК в ПЦР-пробе: 1,9, 17 и 3, 11. 19 - 10 пг ДНК bovis и ovis; 2, 10, 18, 25 и 4, 12, 20, 27-1 пг,ДНК bovis и ovis; 5, 12. 31 - Ют ДНК ovis и 1 пгДНКbovis; 6, 14, 32-1 пг ДНКovis и 1 пг ДНК; 7, 15, 33 -1 пгДНК ovis и 10 пг ДНК bovis; 8, 16, 24, 26, 28 - отрицательный контроль ПЦР (ТЕ-буфер).
М—маркер:набор фрагментовДНКдлиной 630, 450и330п.н.
В результате проведенных экспериментов было подобрано оптимальное количество праймеров «БиГ», равное 15 пмоль каждого, обеспечивающее максимальную чувствительность при минимальном расходе реактивов.
Для исключения неспецифических реакций и увеличения чувствительности ПЦР была использована методика «горячего старта». В
качестве ДНК-матрицы использовали 10 пг ДНК тимуса теленка (ICN), ДНК bovis, ДНК ovis (рис. 2).
МП234 5 6 7 8 9 10 Ш 12 13 14 М ff f > * ' «
Рис. 2. Влияние «горячего старта» на эффективность амплификации праймеров «БиГ».
Рис. 2. Влияние «горячего старта» на эффективность амплификации праимеров «БиГ».
/-б, 14 - амплификация без «горячего старта»; 7-13 — амплификация с «горячим стартом».
Исследуемые пробы: 13, N - отрицательный контроль ПЦР (ТЕ-буфер); 1-2 и 7-8 — 10 пг ДНК bovis в ПЦР-пробе; 3 и 9 — 10 пг ДНКтимуса теленка (1CN) в ПЦР-пробе; 4-6 и 10-12 - 10пгДНКovis в ПЦР-пробе. .
Л/-маркер: набор фрагментовДНКдлиной 1200, 550, 450и 200п.н.
Как видно из рис. 2 амплификация без «горячего старта» дает дополнительные полосы на электрофореграмме отличные от специфических полос. Во всех дорожках геля (включая отрицательный контроль ПЦР -ТЕ-буфер), соответствующих амплификации без «горячего старта» отмечалось наличие полосы ниже уровня 200 п.н., что соответствовало побочному продукту амплификации - пранмер-димерам. Очевидно, взаимодействие Taq-полимеразы с праймерами ниже температуры отжига приводит к их самодостройке, несмотря на то, что при выборе праимеров они были проверены на отсутствие самокомплиметарности на З'-концах. Следует отметить, что интенсивность специфических полос, особенно высокомолекулярной полосы ДНК bovis (680 п.н.), при амплификации без «горячего старта» уступает таковой при его наличии, что подтверждает преимущественное накопление низкомолекулярного побочного продукта реакции при отсутствии «горячего старта» (Innis MA. et al., 1990). Таким образом, применение методики «горячего старта» позволяет добиться стабильных результатов и увеличивает эффективность накопления специфического ПЦР-продукта.
3.4: Определение' чувствительности н специфичности выбранной системы амплификации.
Для определения чувствительности использовали разведения ДНК с концентрациями; от 105 до 1 генома в ПЦР-пробе (рис. 3). Специфичность праимеров проверяли на ДНК крови свиньи, ДНК эритроцитов цыпленка, ДНК спермы лосося в концентрации 0,1 мкг (105 геномов) в ПЦР-пробе. Амплификацию проводили с использованием методики «горячего старта».
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 М
1-8 — ПЦР с праймерами «БО»; 9-16 - ПЦР с праймерами «ГО»; 1,10— отрицательный контроль ПЦР (деионизованная вода); 2, 9 — 0,1 мкг ДНК ovis в ПЦР-пробе (10* геномов); 3 - 10 нг ДНК ovis в ПЦР-пробе (10* геномов); 4-1 нг ДНК ovis в ПЦР-пробе (10 геномов); 5-0,1 нг ДНК ovis в ПЦР-пробе (10 геномов); б - 0,01 нг ДНК ovis в ПЦР-пробе (10' геномов); 7, 11 - 0,1 мкгДНКbovis в ПЦР-пробе (10 геномов); 8, 16 - 0,1 мкг ДНКsuis в ПЦР-пробе (10 геномов); 12 - 10 нг ДНК bovis в ПЦР-пробе (10* геномов); 13 - 1 нг ДНК bovis в ПЦР-пробе (10 геномов); 14-0,1 нг ДНК bovis в ПЦР-пробе (10 геномов); 15— 0,01 нгДНКbovis в ПЦР-пробе (10 геномов);
М—маркер: набор фрагментов ДНКдлиной 1000, 800, 630, 500, 330п.н.
Во всех случаях амплификация 10 пг специфической ДНК (а иногда и 1 пг) давала яркий сигнал, легко > учитываемый при электрофоретическом методе детекции. Таким образом, чувствительность ПЦР составляла 10 и менее копий ДНК в ПЦР-пробе, как в мультиплексной смеси, так и в отдельных смесях.
Амплификация с ДНК крови свиньи,. эритроцитов цыпленка, спермы лосося давала отрицательные результаты. Кроме того, перекрестных реакций праймеров на баранину с ДНК говядины и праймеров на говядину с ДНК баранины не наблюдали.
3.5. Подбор методов выделения (очистки) ДНК из кормовой муки.
Классическим методом выделения ДНК из биологического материала является фенол-хлороформная экстракция с предварительной обработкой протеиназой К (Maniatis T. et al., 1982). Эта методика позволяет получать высокоочищенную ДНК, однако трудоемка,, к тому же включает стадии переноса материала из пробирки в пробирку, что значительно увеличивает риск контаминации от пробы к пробе (Saiki R.K. et al., 1985; Saiki R.K. et al., 1988).
Альтернативой классической методике является метод аффинной сорбции ДНК на силикагеле (BoomR.et al., 1990). В данном случае сорбент вносится в пробирку с лизированным материалом, ДНК связывается с сорбентом, затем отмывается от ингибиторов промывочными растворами и элюируется с сорбента ТЕ-буфером. Так как выделение ДНК происходит в одной пробирке, это препятствует возникновению перекрестной контаминации и упрощает процесс.
Поэтому использовали методику сорбции ДНК по Boom с соавт. (1990). Проводили, как вариант непосредственного лизиса сухого материала в хаотропном агенте, так и с предварительной его обработкой протеиназой К.
Прежде всего необходимо было определить объемное соотношение исследуемой пробы и лизирующего буфера. Boom с соавт. в своей работе (1990) дает соотношение 1:4,5 для плазмы крови или другой биологической жидкости. Сухие корма представляют собой концентрат ингибиторов (белки, жиры, соли), следовательно, соотношение пробы и лизирующего раствора должно быть увеличено в сторону последнего.
Установлено, что оптимальное соотношение составило: 40-80 мкг корма и 900 мкл лизирующего раствора. Это позволило снизить вязкость белкового лизата, однако не приводило к значительному уменьшению нерастворенного осадка. Поэтому было решено предварительно обрабатывать пробу протеиназой К в экстрагирующем буфере с детергентом, а полученный лизат подвергать обработке лнзирующим раствором. Соотношение исследуемого материала и экстрагирующего буфера составило 1:10, как для методики выделения ДНК из лейкоцитарного осадка (Maniatis T. et al., 1982).
Разработанный метод обработки исследуемого материала позволял в ПЦР обнаружить 0,1% примеси мясокостной муки жвачных (рис. 6) в различных видах кормов.
3.6. Внутренний контрольный образец (ВКО).
Для исключения г ложноотрицательных результатов, связанных с ошибками исследователя при выделении ДНК или постановке ПЦР, в состав тест-системы был включен внутренний контрольный образец: (ВКО). ВКО добавляли в исследуемый образец корма на этапе выделения ДНК. В качестве матрицы ВКО использовали ДНК фага лямбда.. Для амплификации фага применяли праймеры и условия амплификации предложенные фирмой Perkin Elmer Cetus (США) в наборе GeneAmp kit. Предложенная система амплификации ДНК жвачных представляет мультиплексный вариант, поэтому амплификацию ВКО проводили в отдельной' пробирке с праймерами, специфичными для ВКО.
Установлено, что оптимальная концентрация ВКО составляет 1 пг в ПЦР пробе или 100 фг/мкл. Это позволяет выявлять ложноотрицательные результаты при постановке ПЦР-анализа. Так при тестировании проб с разным содержанием мясокостной муки; в муке другого происхождения (рис. 4) образцы, содержащие 0,5 и 1 % мясокостной муки жвачных в рыбной муке не давали положительного результата при амплификации с праймерами на ВКО, баранину и говядину, в то время как образцы с содержанием 0,1%, 0,5% и 1% мясокостной муки жвачных в рыбной или кукурузной муке давали положительный сигнал. Полученный результат свидетельствует об ошибках при пробоподготовке образцов 7 и 8, приводящих к ингибированию ПЦР. Повторная обработка данных проб позволила исключить ложноотрицательный результат, что подтверждает наличие специфических фрагментов ВКО, ДНК баранины и говядины.
17 18 19 20 21 22 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 К- К- ВК+
17 18 19 20 21 22 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 К-Б+Г+ Рис. 4. Результаты исследования кормов с использованием ВКО.
Верхняя полоса геля - амплификация ВКО; нижняя полоса геля -амплификация «БиГ».
1-5 — 0,1%; 0,5%; 1,0%; 10% и 50% мясокостной муки - наполнитель куриная мука; 6-10 — 0,5-50% мясокостной муки — наполнитель рыбная мука; 11-15 — 0,5-50% мясокостной муки - наполнитель кукурузная мука; 16— 100% мясокостная мука; 17 - 100% куриная мука; 18- 100% рыбная мука; 19 — 100% кукурузная мука; 20 - смесь 50% куриной и 50% рыбной муки; 21 — смесь 50% куриной и 50% кукурузной муки; 22 - смесь 50% кукурузной и 50% рыбной муки; К- - отрицательный контроль ПЦР (ТЕ-буфер); Б+ - положительный контроль амплификации ДНК ovis; Г+ - положительный контроль амплификации ДНК bovis; BK+ - положительный контроль амплификации ВКО.
3.7. Отрицательные и положительные контрольные образцы.
В связи с многоступенчатостью ПЦР-анализа необходимо контролировать каждую его стадию. Важной задачей является не только исключение ложноотрицательных, но и ложноположительных результатов. Для этого на этапе выделения ДНК использовали отрицательный контрольный образец (ОКО), а на этапе амплификации - отрицательный контроль ПЦР (К-). ОКО служит для оценки возможной контаминации реактивов при выделении ДНК, а К- - реактивов для ПЦР.
Контроль работы амплификационной смеси и амплификатора осуществляли с помощью положительных контрольных образцов (ПКО). Амплификат положительного контрольного образца являлся маркером длины ПЦР-продуктов для последующей электрофоретической детекции, т.е. позволял контролировать последний этап ПЦР-анализа.
Особое внимание уделяли подбору концентрации ПКО, т.к. большой избыток ДНК-матрицы приводит к наработке большого количества ампликонов (Newton C.R., 1995). Установлено, что ПКО в концентрации 1 нг позволяет
исключить контаминацию реагентов и ошибки сотрудника при выделении ДНК и постановке ПЦР.
3.8. Состав разработанной тест-системы.
Разработанная тест-система включает в себя четыре комплекта реагентов (рис.5).
ЭтапГ
Этап 2
ЭтапЗ
+ Протеинам К ♦ Гуанидим тиоционат . : ♦ ВКО Люкс Сорбция Эпюция ДНК -
Комплект для выделения ДНК
й^шшттш^п
Баранина Говядина ВКО ; 4 Праймеры >' ♦ Тач-лопимвраза • амплификация -
г ■
Агарозный гель 10 В/см, № шт УФ облучение -
г
Комплект для ПЦР
Комплект для ЭФ
Рис. 5. Схема анализа кормов на ДНК жвачных.
Первый — набор для выделение ДНК из корма сочетающий в себе метод протеиназной обработки исследуемого материала с последующей сорбцией ДНК на силикагеле.
Второй - набор для амплификации выделенной ДНК, включающий смеси для амплификации ДНК баранины, говядины и ВКО. Амплификация проводится с «горячим стартом». ПЦР-смесь-1 (праймеры и нуклеотиды) отделяется от буфера с Taq-пелимеразой (ПЦР-смесь-2) и ДНК-матрицы прослойкой воска.
Третий - набор для электрофоретической детекции; ПЦР-продукта. Наличие бромистого этидия в составе концентрата ТБЕ-буфера для проведения электрофореза и лидирующего красителя в составе ПЦР-смеси дает возможность сразу вносить ПЦР-продукт в лунки агарозного геля, что значительно сокращает количество манипуляций и упрощает процесс.
Четвертый - набор контрольных образцов, включающий в себя положительные контрольные образцы (ПКО) ДНК bovis, ovis, BKO и отрицательный контрольный образец (ОКО).
3.9. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы.
Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы проводили, с образцами мясокостной муки, содержащими различные наполнители (рис. 6) с концентрацией 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10% и 50% мясокостной муки. В процессе выделения ДНК в каждую пробу добавляли ВКО. Амплификацию полученной ДНК проводили с. праймерами «БиГ» и праймерами «ВКО».
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 К- Б+Г+
—íiczz¿mSW ■ —
Рис. б. Аналитическая чувствительность и специфичность тест-системы «БиГ».
1-5 - 0,1%; 0,5%; 1,0%; 10% и 50% мясокостной муки в куриной муке; 6-10 — 0,5-50% мясокостной муки в рыбной муке; 11-15 - 0,5-50% мясокостной муки в кукурузной муке; 16 — 100% мясокостная мука; 17 — 100% куриная мука; 18 — 100% рыбная мука; 19 - 100% кукурузная мука; 20 — смесь 50% куриной и 50% рыбной муки; 21 - смесь 50% куриной и 50% кукурузной муки; 22 — смесь 50% кукурузной и 50% рыбной муки; К- — отрицательный контроль ПЦР (деионизованная вода); Б+ — положительный контроль амплификации ДНК ovis; Г+ - положительный контроль амплификации ДНК bovis.
ПЦР-анализ позволял обнаруживать примесь мясокостной муки в количестве 0,1% и более в составе различных матриц (рыбная, куриная, кукурузная, мука), что свидетельствует о высокой чувствительности разработанного теста.
Проведенный анализ так же подтвердил высокую специфичность разработанного ПЦР-теста: неспецифических реакций с 100% рыбной, куриной и кукурузной мукой, а также их смесями обнаружено не было.
3.10. Сравнение чувствительности методов ПЦР и ПФА.
Чувствительность и специфичность разработанной ПЦР-тест-системы сравнивали с ИФА-тест-системой «Beef Cooked Meat Species Identification Kit, Cat No. 902013L» («Cortees Diagnostics Limited», Великобритания). Специфичность данной тест-системы проверялась ее производителем на панели образцов говядины, конины, баранины, курятины, крольчатины и мяса кенгуру. Неспецифических реакций отмечено не было.
Определение аналитической чувствительности, наборов проводили на образцах куриной и рыбной муки содержащей от 1 до 50% мясокостной. Установлено, что метод ИФА позволял выявлять только 50%-ную контаминацию куриной муки. Метод ПЦР выявлял 0,1% примеси мясокостной муки, как в куриной, так и в рыбной муке. Таким образом, чувствительность ПЦР при обнаружении примеси тканей жвачных животных в 100 раз выше, чем ИФА.
3.11. Комиссионные испытания ПЦР-тест-снстемы «БнГ».
В периоде 21.05.1999 г. по 11.06.1999 г. в соответствии с приказом № 15 Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ были проведены комиссионные испытания наборов для определения тканей крупного рогатого скота в рыбной муке методом ИФА (ВНИИЗЖ, г.Владимир), РК (ВНИВИ, г.Казань) и тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом ПЦР (ВГНКИ, г.Москва).
Было сформировано две стандартизированные панели шифрованных образцов. Панель № 1 включала пробы, состоящие из куриной, рыбной и кукурузной муки в разных соотношениях с мясокостной. Панель № 2 состояла: из консервированных и сухих кормов и предназначалась для апробации тест-системы «БИГ». Результаты комиссионных испытаний представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Результаты комиссионных испытаний тест-систем для определения тканей крупного рогатого скота в рыбной муке_
Тест-система
Чувствительность, %
Специфичность, %
Ложнополо-жительные результаты, %
Ложноотри-цательные результаты, %
ИФА
(ВНИИЗЖ)
76
57,2
28,5
14,3
РК
(ВНИВИ)
29,4
21
25
54
ПЦР
(ВГНКИ)
100
100
Как видно из таблицы 1, методы ИФА и РК обладают низкой чувствительностью • и специфичностью и не могут использоваться для выявления примеси тканей крупного рогатого скота в рыбной муке.
Тест-система для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах и рыбной муке методом ПЦР обладала высокой чувствительностью (обнаруживала примесь 0,1% мясной муки в составе рыбной муки) и 100% специфичностью при испытаниях как стандартизованной панели № 1 (на образцах рыбной и мясокостной муки), так и № 2 (на образцах сухих и консервированных кормов для животных).
3.12. Изучение активности и стабильности- ИЦР-тест-снстемы в зависимости от срока хранения.
Ежемесячно в течение года тест-систему «БИГ» проверяли по параметрам заложенным в ТУ 9388-029-00494189-01.
Все компоненты тест-системы сохраняли высокую активность и стабильность в течение всего срока хранения при температуре (2-8)°С.
3.13. Эпизоотическая обстановка при тестировании кормов на ДНК жвачных животных методом ПЦР в России.
Согласно Указанию Главного госветинспектора РФ № 13-5-1/1239 с декабря 2000 г. в России введен государственный контроль всей ввозимой на территорию РФ рыбной муки, кормов и кормовых добавок на наличие примесей тканей жвачных животных с использованием тест-системы «БИГ».
С декабря 2000 г. по январь 2004 г. было исследовано 4797 проб рыбной муки, кормов и кормовых добавок. В 4566 образцах (95,2%) ДНК жвачных животных была не обнаружена и обнаружена в 184 (3,9%) - ДНК к.р.с, в47(1,0%)-ДНКм.р.с.
общее количество образцов количество фальсифицированных образцов
Рис. 7. Динамика выявления образцов, содержащих ДНК жвачных в период с 14 декабря 2000 года по 1 января 2004 года.
При исследовании за отчетный период 2959 проб кормов и кормовых добавок ДНК жвачных не обнаружена в 2817 образцах, что составило 59,9% и обнаружена в 113 пробах (2,4%) - ДНК к.р.с, в 29 пробах (0,6%) - ДНК м.р.с. При тестировании 1784 проб рыбной муки ДНК жвачных не обнаружена в 1695 образцах, что составило 35,3% и обнаружена в 71 пробе (1,5%) — ДНК к.р.с, в 18 пробах (0,4%) - ДНК м.р.с.
С момента введения тестирования рыбной муки и кормов на наличие ДНК жвачных животных зафиксирована следующая динамика выявления кормов контаминированных ДНК жвачных (рис. 7).
В период с декабря 2000 года по февраль 2001 года протестировано 557 образцов кормов и рыбной муки. Из них выявлено 169 образцов контаминированных ДНК жвачных, что составило 30,3%. В период с марта 2001 года по апрель 2001 года протестировано 338 образцов, из них оказались положительными на наличие ДНК жвачных 14 (4,1%). В период с мая 2001 года по июль 2001 года количество фальсифицированных образцов составило 0,9%. С октября 2001 года по июнь 2003 года ежеквартально выявлялось от 0 до 0,6 % образцов контаминированных ДНК жвачных. В июле - сентябре 2003 года из 421 исследованного образца выявлено 8 образцов содержавших ДНК жвачных (1,7%), а в октябре-декабре 2003 года - 6,1% (23 образца из 380 протестированных). За отчетный период количество контаминированных образцов уменьшилось с 30,3% до 6,1%.
Таким образом внедрение в систему государственного контроля ПЦР-тест-снстемы;«БИГ» с декабря 2000 года по январь 2004 год значительно уменьшило фальсификацию рыбной муки и кормов мясокостной мукой, что имеет важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение.
4. ВЫВОДЫ
1. На. основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей генов гормона роста (ГР) и митохондриального цитохрома (МЦ) жвачных животных, установлено, что ген МЦ является оптимальной генетической мишенью для идентификации и дифференциации ДНК крупного и мелкого рогатого скота в кормах.
2. Предложен универсальный способ выделения хромосомной ДНК жвачных животных из корма с использованием протеиназной обработки с последующей сорбцией ДНК на силикагеле в присутствии высокой концентрации солей гуанидина.
3. Внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в ПЦР пробе добавляется на этапе выделения ДНК и позволяет исключить ошибки исследователя при постановке реакции.
4. Разработаны положительные контрольные образцы ДНК bovis и ДНК ovis, являющиеся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов (680 и 350 п.н. соответственно).
5. Тест-система «БиГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом ПЦР обладает 100% специфичностью и
имеет предел аналитической чувствительности 0,1% примеси мясокостной муки жвачных в исследуемом материале или 10 пг ДНК жвачных в пробе ПЦР.
6. Установлено, что ПЦР-анализ для выявления тканей жвачных животных в кормах, превосходит в 100 раз по чувствительности метод ИФА и позволяет дифференцировать ДНК крупного и мелкого рогатого скота в варианте мультиплексной ПЦР.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Наставление по применению тест-системы «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 15.08.01. № 13-5-02/0161);
2. Технические условия на тест-систему «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (ТУ № 9388-029-00494189-01).
6. СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Обухов И.Л., Комаров А.А., Шипулин ГА., Сорокина М.Ю., Панин А.Н. Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). // Генодиагностика в современной медицине: тезисы докладов 3-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 2000 г. - С. 326-328.
2. Комаров А.А., Обухов ИЛ., Сорокина М.Ю., Панин А.Н., Шипулин Г.А. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных. // Ветеринария. - 2000. - № 3. - С. 25-28.
3. Сорокина М.Ю., Обухов И.Л., Комаров А.А., Шипулин Г.А., Панин А.Н. Применение полимеразной цепной реакций для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных. // Биотехнология -состояние и перспективы развития: тезисы докладов I международного конгресса. Москва, 2002 г. - С. 183.
4. Сорокина М.Ю., Обухов И.Л., Комаров А.А., Шипулин Г.А., Панин А.Н. Эпизоотическая статистика при тестировании кормов на ДНК жвачных животных методом ПЦР в России. // Генодиагностика инфекционных заболеваний: тезисы докладов 4-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 2002 г. - С. 368-369.
ВНИИВСГЭ, 2004. г. Москва. Звенигородское Ц1.-/5 Заказ.. 91/2 .тираж 100 экз.
»10585
Оглавление диссертации Сорокина, Мария Юрьевна :: 2004 :: Москва
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность проблемы.
Цель и задачи исследования.
Научная новизна работы.
Практическое значение работы.
Апробация диссертации.
Объем и структура диссертации.
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Проблема определения видовой принадлежности мясных ингридиентов.
2. Молекулярные методы определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах.
3. Принцип полимеразной цепной реакции.
4. Подбор праймеров.
4.1. Дизайн праймеров.
4.2. Температура отжига.
4.3. Длина праймеров.
4.4. Вырождение праймеры.
5. Факторы воздействующие на ПЦР.
5.1. Температура и время денатурации.
5.2. Температура и время элонгации.
5.3. Реакционный буфер.
5.4. Количество циклов амплификации.
5.5. «Горячий старт» ПЦР.
5.6. Контаминация в ПЦР и предложения по обустройству ПЦР-лаборатории.
5.8. Внутренний контрольный образец (ВКО).
ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Базы данных нуклеотидных последовательностей ДНК и компьютерные программы для обработки этих данных.
2. Образцы-сравнения ДНК.
2.1. Коммерческие препараты ДНК.
2.2. Самостоятельно полученные образцы ДНК из цельной крови животных.
3. Образцы кукурузной, куриной, рыбной и мясокостной муки.
3.1. Отбор образцов.
3.2. Приготовление смесей.
3.3. Перечень видов смесей кормовой муки.
4. Образцы сухого и консервированного корма для животных.
5. Образец сыворотки лошадей.
6. Методика выделения ДНК из цельной крови по Maniatis (94).
6.1. Выборочный лизис эритроцитов.
6.2. Обработка лейкоцитарного осадка протеиназой К.
6.3. Экстракция ДНК фенол-хлороформом с последующей преципитацией этанолом.
7. Оценка концентрации ДНК спектрофотометрическим методом (94).
8. Методика выделения ДНК сорбцией на селикагеле по Boom (24).
9. Методика проведения реакции амплификации.
9.1. Состав реакционной смеси, условия амплификации.
9.2. «Горячий старт».
10. Методика проведения электрофореза в агарозном геле.
11. Методика определения говядины в образцах методом ИФА.
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Выбор олигонуклеотидных праймеров для дифференциальной амплификации ДНК говядины и баранины.
2. Изучение специфичности выбранных праймеров.
3. Подбор условий ПЦР.
3.1. Оптимизация температуры отжига специфических олигонуклеотидов (праймеров).
3.2. Подбор концентрации праймеров.
3.3. Применение «горячего старта».
4. Определение чувствительности и специфичности выбранной системы амплификации.
5. Подбор методов выделения (очистки) ДНК из муки.
6. Внутренний контрольный образец (BKO).
7. Отрицательные и положительные контрольные образцы.
8. Состав разработанной тест-системы.
9. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы.
10. Сравнение чувствительности методов ПЦР и ИФА.
11. Комиссионные испытания ПЦР-тест-системы «БИГ».
12. Изучение активности и стабильности ПЦР-тест-системы в зависимости от срока хранения.
13. Эпизоотическая статистика при тестировании кормов на ДНК жвачных животных методом ПЦР в России.
ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
РИСУНКИ.
ТАБЛИЦЫ.
Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Сорокина, Мария Юрьевна, автореферат
Актуальность проблемы
Ветеринарная служба, защищая потребителя от фальсификации мясной продукции, постоянно проводит видовую дифференциацию мяса в продуктах питания и кормах, подвергавшихся термической обработке. Значение этих мероприятий в последние годы особенно возросло в связи с открытием новых видов прионных болезней сельскохозяйственных и домашних животных, относящихся к группе трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (ГЭ) (10).
Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭ КРС) впервые выявлена в Великобритании в ноябре 1986 года (148). По данным международного эпизоотического бюро за 1989-2002 годы в мире зарегистрировано 3611 случаев ГЭ КРС, и более 177 ООО случаев в Великобритании. В 2000-2001 годах отмечен рост случаев ГЭ КРС во Франции (134), Ирландии, а в 2001-2002 годах в Бельгии, Германии, Нидерландах, Испании, Италии, Португалии отмечено от нескольких десятков до сотен случаев в год. В 2003 году в мире зарегистрировано 777 случаев ГЭ КРС и 425 случаев в Великобритании.
Основной источник заражения ГЭ - мясокостная мука, полученная из жвачных животных. В Великобритании в начале 80-х годов были изменены режимы переработки сырья животного происхождения при производстве мясокостной муки, которые не обеспечивали инактивацию возбудителя болезни (3).
С 1996 г. во всех странах Европейского Союза (ЕС) ввели запрет на скармливание жвачным животным мясокостной муки, приготовленной из млекопитающих. Однако из-за незаконного сбыта мясокостной муки в страны, не являющиеся членами ЕС, и фальсификации рыбной муки добавками протеинов млекопитающих по экономическим причинам риск заражения достаточно велик. В связи с открытием в последние годы ГЭ кошек в группу риска попали и корма для домашних животных (25).
Таким образом, определение видовой принадлежности мясных ингредиентов в составе кормов актуально. Однако такие методы как иммунодиффузия в геле, изоэлектрическое фокусирование, иммуноферментный анализ (ИФА), реакция кольцеприципитации (КП) применяемые для видовой идентификации сырого мяса не эффективны, т.к. термическая обработка приводит к денатурации белков и потере ими видовой специфичности (62).
В отличие от белков ДНК более устойчива к термической обработке и не утрачивает своей информативной функции. Поэтому применение молекулярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР) является перспективным для определения видовой принадлежности ДНК в составе продуктов и кормов подвергавшихся термической обработке.
Цель и задачи исследования
Цель исследования — разработать тест-систему для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Сконструировать олигонуклеотидные праймеры и разработать оптимальные параметры ПЦР для идентификации и дифференциации ДНК говядины и баранины в кормах.
2. Оценить эффективность различных способов выделения ДНК из кормов (рыбная и мясная мука), комбикормов для крупного, мелкого рогатого скота и птицы, сухих и консервированных кормов для домашних животных (собак, кошек).
3. Сравнить чувствительность и специфичность разработанной ПЦР-тест-системы с ИФА-набором фирмы Cortees Diagnostics Limited (Великобритания).
4. Определить эффективность ПЦР-тест-системы для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом ПЦР при тестировании кормов, поступающих по импорту в Россию.
Научная новизна работы
Впервые сконструированы олигонуклеотидные праймеры для дифференциальной амплификации специфических последовательностей ДНК жвачных животных (крупного и мелкого рогатого скота) в варианте мультиплексной ПЦР, на основе которых разработана тест-система, обладающая 100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 0,1% примеси мясокостной муки жвачных в исследуемом материале или 10 пг ДНК жвачных в пробе ПЦР.
Установлено, что универсальным методом пробоподготовки корма является протеиназная обработка с последующей сорбцией ДНК на силикагеле в присутствии высокой концентрации солей гуанидина. Данный метод пробоподготовки исследуемого материала обеспечивает высокую чувствительность тест-системы.
Создан внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в ПЦР-пробе, который добавляется на этапе выделения ДНК и полностью исключает ошибки исследователя при постановке реакции.
Разработаны положительные контрольные образцы ДНК bovis и ДНК ovis, являющиеся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов (680 и 350 п.н. соответственно).
Практическое значение работы
Разработана и впервые внедрена в ветеринарную практику тест-система «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции.
Установлено, что ПЦР-анализ для выявления тканей жвачных животных в кормах, значительно превосходит по чувствительности и специфичности традиционные методы (ИФА и реакция КП) и позволяет дифференцировать ДНК крупного и мелкого рогатого скота в варианте мультиплексной ПЦР.
Внедрение в систему государственного контроля ПЦР-тест-системы «БИГ» с декабря 2000 года по январь 2004 года позволило снизить фальсификацию рыбной муки и кормов тканями жвачных животных с 30,3% до 6,1%, что имеет важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение.
Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные нормативные документы:
1. Наставление по применению тест-системы «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (№ 13-5-02/0161);
2. Технические условия тест-система «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (ТУ № 9388-029-00494189-01).
Апробация диссертации
По теме диссертации опубликовано 4 научных статьи.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ФГУ ВГНКИ 1999-2003 гг.
Материалы диссертации доложены на 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (Москва, 2000 г.); на Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (Москва, 2001 г.); на международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002 г.); на 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002 г.); на научно-проблемных методических коммисиях ФГУ ВГНКИ (1999-2003 гг.).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена 104 страницах компьютерного текста, и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 162 источника, в том числе 148 иностранных). Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и 9 таблицами. Прилагаются разработанные нормативные и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.
Щ *
Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2004 года, Сорокина, Мария Юрьевна
1. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. — 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987 - 336 е., ил.
2. Гусева Е.В., Сатина Т.А., Рыбаков С.С. Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (обзор литературы). Владимир, 1997.
3. Зуев В.А., Завалишин И.А., Ройхель В.М. Прионные болезни человека и животных. / Руководство для врачей. М.: Медицина, 1999. —192 е.: ил.
4. Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н., Шипулин Г.А. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных. // Ветеринария. 2000. - № 3. - С. 25-28.
5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская миробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. вузов. — СПб.: СпецЛит, 2002. 591 е.: ил.
6. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: пер. с англ. / Под ред. С.Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир, 1999. - 558 е., ил.
7. Монкс О., Костелло А., Вивере Э., Авилов В.М., Рыбаков С.С. Контроль губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в Ирландии. // Ветеринария. 1998. -№ 1. - С. 16-22.
8. Орлянкин Б.Г. Структура и биология прионов (обзор). // С.-х. биол. 1998. -№2.-С. 46-58.
9. Устин А.В., Макаров В.В.// С.-х. биол., 1994, 2:20-25.
10. Хохрин С.Н. Корма и кормление животных: Учебное пособие. СПб.: Издательство "Лань", 2002. 512 с.
11. Altschul S.F., Boguski M.S., Gish W., Wootton J.C. Issues in searching molecular sequence databases. // Nature Genet. 1994. - V. 6. - P. 119-129.
12. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool. // J. Mol. Biol. 1990. - V. 215. - P. 403-410.
13. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 3389-3402.
14. Barttlett S.E., Davidson W.S. FINS (forensically informative nucleotide sequencing): A procedure for identifying the animal origin fo biological speciements. // Biotechniques. 1992. - V. 12. - P. 408-411.
15. Bassam B.J., Caetano-Anolles G. Automated "hot start" PCR using mineral oil and paraffin wax. // Biotechniques. 1993. - V. 14(1). - P. 30-34.
16. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank: update. // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32(Database issue). - P. D23-D26.
17. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank. // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 23-27.
18. Berger R.G., Mageau R.P., Schwab В., Johnston R.W. Detection of poultry and pork in cooked and canned meat foods by enzime-linked immunosorbent assays. J.Assoc, of anal. chem. 1988 - V.71. - P. 406-409.
19. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M.E., Van Der Noordaa J. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. // Journal of Clinical Microbiology. 1990. - V. 28(3). - P. 495-503.
20. Bradley R. Animal prion diseases. In: Prion deseases (by ed. Collinge J., Palmer M.S.). Oxford University Press. - 1997.
21. Brownie J., Shawcross S., Theaker J., Whitcombe D., Ferrie R., Newton C., Little C. The elimination of primer dimer-accumulation in PCR. // Nucleic Acids Res. —1997. V. 25. - P. 3235-3241.
22. Bruce M.E., Will R.G., Ironside J.W et al. Transmissions to mice indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent. // Nature. 1997. - V. 389 (6650). - P. 498-501.
23. Budowle B., Chakraborty R., Giusti A.M., Eisenberg A.J., Allen R.C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. // Am. J. Hum. Genet. 1991. V. 48(1)-P. 137-144.
24. Buntjer J.B., Lenstra J.A., Haagsma N. Rapid species identification in meat using satellite DNA probes. // Z. Lebesm. Unters. Forseh. 1995. - V. 201. - P. 577582.
25. Butler D. Brain mix-up leaves BSE research in turmoil. // Nature. 1998. - V. 413.-P. 760.
26. Butler D. Doubts over ability to monitor risks of BSE spread to sheep. // Nature.1998.-V. 395.-P. 6-7.
27. Chen H., Zhu G. Computer program for calculating the melting temptrature of degenerate oligonucleotides used in PCR or hybridization. // Biotechniques. -1997.-V. 22(6).-P. 1158-1160.
28. Chenna R, Sugawara H, Koike T, Lopez R, Gibson TJ, Higgins DG, Thompson JD. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31(13). - P. 3497-3500.
29. Chikuni K., Tabata T., Kosugiyama M., Monma M., Saito M. // Meat Sciense. -1994.-V. 37.-P. 337-345.
30. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extractoin. // Anal. Biochem. 1987. -V. 162.-P. 156-159.
31. Cimino C.D., Metchette K.C., Tessman J.W., Hearst J.E. Isaacs S.T. Post-PCRsterilisation: a method for the polymerase chain reaction. // Nucleic Acids Res. -1991.-V. 19(1).-P. 99-107.
32. Collinge J., Sidle K.C.L., Meads J.E.A. Molecular analysis of prion stain variation and the aetiology of new variant CJD. // Nature. 1996. - V. 383 (6602) - P. 685690.
33. Compton T. Degenerate primers for DNA amplification. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.). New York: Academic Press. -1990.-P. 39-45.
34. Court of auditors. Special report No 14/2001 on BSE. // Official Journal of European communities. 20.11.2001 - C 324/1.
35. Coyne V.E., James M.D., Reid S.J., Rybicki E.P. (ed.). Molecular Biology Techniques Manual. Departament of Molecular and Cell Biology, University of Cape Town.-2001.
36. Dang C., Jayasena S.D. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. // J.Mol.Biol. 1996. - V. 264(2).-P. 268-278.
37. DAquila R.T., Bechtel L.J., Videler J.A., Eron J.J., Gorczyca P, Kaplan J.C. Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. // Nucleic Acids Res. 1991. - V. 11;19(13). - P. 3749.
38. Deslys J.P., Comoy E., Hawkins S., Simon S., Schimmel H., Wells G., Grassi J., Moyagh J. Screening slaughtered cattle for BSE. // Nature. 2001. - V. 409. - P. 476-477.
39. Dielfenbach C.W., Lowe T.M.F., Dveksler G.S. General concepts for PCR primer desin. // PCR Methods Appl. 1993. - V. 3. - P. S30-S37.
40. Dupont M., Goldsborough A., Levayer T., Savare J., Rey J.M., Rossi J.F.,1.Demaille J., Lavabre-Bertrand T. Multiplex fluorescent RT-PCR to quantity leukemic fusion transcripts. // Biotechniques. 2002. -V. 33(1). -P. 158-164.
41. Ebbehoj K.F., Thomsen P.D. Species differentiations of heated meat product by DNA hybridization. // Meat Sei. 1991. - V. 30. - P. 221-234.
42. Eggert A., Brodeur G.M., Ikegaki N. Relative quantitative RT-PCR protocol for TrkB expression in neuroblastoma using GAPD as an internal control. // Biotechniques. 2000. - V. 28(4). - P. 681-691.
43. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. Recent advances in the polymerase chain reaction. // Science. 1991. -V. 252(5013). - P. 1643-1651.
44. Frankel G., Giron J.A., Valmassoi J., Schoolnik G.K. Multi-gene amplification: simultaneous detection of three virulence genes in diarrhoeal stool. // Mol. Microbiol. 1989. - V. 3(12). - P. 1729-34.
45. Fugate H.G., Penn S.R. Immunodiffusion technique for the identification of animal species. // J. Assoc. Off Anal. Chem. 1971. - V. 54(5). - P. 1152-1156.
46. Fuqua S.A.W., Fitzgerald S.D. and McGuire W.L. A simple polymerase chain reaction method for detection and cloning of low-abundance transcripts. // BioTechniques. 1990. - V. 9(2) - P. 206-211.
47. Gelfand D.H., White T.J. Thermostable DNA polymeases. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.) New York: Academic Press. -1990.-P. 129-141.
48. Gordon D.F., Quick D.P., Erwin C.P., Donelson J.E., Maurer R.A. Nucleotide sequence of the bovine growth hormone chromosomal ; gene. // Mol. Cell Endocrinol. 1983. -V. 33(1). P. - 81-95. Review.
49. Gorelenkov V., Antipov A., Leinine S., Daraselia N., Yuryev A. Set of novel tools for PCR primer design. // Biotechniques. 2001. - V. 31(6). - P. 1326-1330.
50. Grennan B., O'Sullivan N.A., Fallon R., Carroll C., Smith T., Glennon M., Maher M. PCR-ELISAs for the detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in poultry samples. // Biotechniques. 2001. - V. 30(3). - P. 602-610.
51. Hayden A.R. // J. Food Sei. 1981. - V. 46. - P. 1810-1813.
52. Henegariu O., Neerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H. Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. // Biotechniques. 1997. - V. 23.-P. 504-511.
53. Hoffman K., Fischer K., Muller E., Kemper V. Experiments to demonstrate the effectiveness of heat treatments applied to canned meats and meat-ans-bone meals. // Fleischwirtschaft. 1996. - V. 76. - P. 920-923.
54. Horton R.M., Hoppe B.L. Conti-Tronconi B.M. AmpliGrease: "hot start" PCR using petroleum jelly. // Biotechniques. 1994. - V. 16(1). - P. 42-43.
55. Innis M.A., Gelfand D.H. Optimisation of PCR Protocols. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.) New York: Academic Press. -1990.-P. 3-12.
56. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J. (ed.). PCR protocols, a guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, California. - 1990. - 523 P
57. Innis M.A., Myambo K.B., Gelfand D.H., Brow M.A.D. DNA sequencing with Thermus aquaticus SNA polymerase and direct sequensing of polymerase chain reaction amplified DNA. // Proc.Natl. Acad. Sei. USA. - 1989. - V. 85. - P. 9436-9440.
58. Jensen J.S., Uldum S.A., Sondergard-Andersen J., Vuust J., Lind K. Polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma genitalium in clinical samples. // J Clin Microbiol. 1991. - V. 29(1). - P. 46-50.
59. Jobse C., Buntjer J.B., Haagsma N., Breukelman H.J., Beintema J.J., Lenstra J.A. Evolution and recombination of repetitive DNA from the ruminants. // J.Mol.Evol. -1995.-V. 41.-P. 277-283.
60. Kaboev O.K., Luchkina L.A., Tret'iakov A.N., Bahrmand A.R. PCR hot start using primers with the structure of molecular beacons (hairpin-like structure). // Nucleic Acids Research. 2000. - V. 28 (21). - P. 94-95.
61. Kaboev O.K., Shevelev I.V., Luchkina L.A., Tret'iakov A.N., Shcherbacova O.G.Bioorg. Khim. 1999. - V. 25. - P. 398-400.
62. Kainz P., Schmiedlechner A., Strack H.B. Specifity-enhanced hot-start PCR: addition of double-strand DNA fragments adapted to the annealing temperature. // Biotechniques. 2000. - V. 28(2). - P. 278-282.
63. Kang'ethe D.K., Lindquist K.J., Gathuma J.M. In: Biochemical identification of meat species, (ed. Patterson R.L.S.). NY: Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York. - 1985. - P. 129-144.
64. Karlin S., Altschul S.F. Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. — V. 90. -P. 5873-5877.
65. Kellogg D.E., Snisky J.J., Kwok S. Quantitation of HIV1 proviral DNA ralative to cellular SNA by the polymerase chain reaction. // Anal.Biochem. 1990. - V. 189. -P. 202-208.
66. Kidd K.K., Ruano G. Optimizing PCR. In: PCR 2. A pracrical approach, (ed. McPherson M.J., Harnes B.D., Taylor G.R.). Oxford University Press. - 1995.
67. Kim S., Kim T. Selection of optimal internal controls for gene expression profiling of liver disease. // Biotechniques. 2003. - V. 35(3). - P. 456-460.
68. Kimberlin R.H., Wilesmith J.W. Bovine spongioform encephalopathy: epidemiology, low dose expose and risk. // Ann. N.Y. Acad. Sei. — 1994. V. 724. -P. 210-220.
69. Knoth K., Roberts S., Poteet C., Tamkun M. Gugkt degenerate, inisine-containing primers specifically amplkfy rare cDNA using the polymerase chain reaction. // Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16. - P. 10932.
70. Krawetz S.A., Pon R.T., Dixon G.H. Increased efficiency of the Taq polymerase catalysed polymerase chain reaction. // Nucleic Acids Research. 1989. — 17(2) -P. 819.
71. Kuipler M., Sanches R., Gaken J.A., Bignon Y.-J. Cloning and characterization of retroviral plasmid, pCCl, for combination suicide gene therapy. // Biotechniques. 2000. - V. 28(3). - P. 572-576.
72. Kwok S. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.). Academic Press, San Diego, California. - 1990. - P. 142-5
73. Kwok S., Higuchi R. Avoiding false positives with PCR. // Nature (London).1989.-V. 339.-P. 237-238.
74. Lasmezas C.I., Deslys J.P., Demainay R. et al. BSE transmission to macaques. // Nature 1996. -V. 381. - P. 743-744.
75. Latora D., Hopkins D., Campbell K., Hurley J.M. Multiplex allele-specific PCR with optimized locked nucleic acid primers. // Biotechniques. 2003. - V. 34(6). -P. 1150-1158.
76. Lee M.S., Chang K.S., Cabanillas F., Freireich E.J., Trujillo J.M., Stass S.A. Detection of minimal residual cells carrying the t(14;18) by DNA sequence amplification. // Science. 1987. - V. 237(4811). - P. 175-8.
77. Loh E.Y., Elliot J.F., Cwirla S., Lanier L.L., Davis M.M. Polymerase chain reaction with single-sided specificity: analysis of T cell receptor delta chain. // Science. 1989. - V. 243(4888). - P. 217-20.
78. Lopez R., Robinson S., Kibria A., Harte N., Patel G., Harper R., Quevillon E., Silventoinen V., Kallio K., Jokinen P. The European Bioinformatics Institute web site: a new view. // Bioinformatics. 2003.- V. 19(4). - P. 546-547.
79. MacCallum L.J. Detection of PCR amplified products In: PCR essential data (ed. Newton C.R.). Oxford: John Wiley & Sons Ltd. - 1995.
80. Maddison D.R., Swofford D.L., Maddison W.P. NEXUS: an axtendible file format for systematic information. // Syst. Boil. 1997. - V. 46. - P. 590-621.
81. Malo M.S., Abedrapo M., Chen A., Mozumder M., Pushpakaran P., Alkhoury F., Zhang W., Fleming E., Hodin R.A. Improved eukaryotic promoter-detection vector carrying two liciferase reporter genes. // Biotechniques. 2003. - V. 35(6). - P. 1150-1154.
82. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. (ed.). Molecular cloning, a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor - 1982.
83. Manos M.M., Ting Y., Wright D.K., Lewis A.J., Broker T.R., Wolinsky S.M.Molecular Diagnostics of Human Cancer. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. - 1989. - 7. - P. 209-14.
84. Manz J. // Fleischwirtsch 1985. - V. 65. - P. 497-499.
85. Matthews J.L.K., Chung M., Matyas J.R. Persistent DNA contamination in competitive RT-PCR using cRNA internal standards: identity, quantity and control. // Biotechniques. 2002. - V. 32(6). - P. 1412-1417.
86. McPherson M.J., Hames B.D., Taylor G.R. (ed.) PCR 2. A Practical Approach. -Oxford University Press. — 1995.
87. Meyer R., Candrian U., Luthy J. Detection of pork in heated products by the polymerase chain reaction. // Journal of AOAC International. 1994. — V. 77. - P. 617-622.
88. Meyer R., Hofelein C., Luthy J., Candrian U. PCR-RFLP analysis: a simple method for species identification in food. // Journal of AOAC International. — 1995.-V. 78.-P. 1542-1551.
89. Milgrom F., Tuggac Z.M., Witebsky E. Studies on species specificity. // J. Immunol. 1964. - V. 93. - P. 902-909.
90. Miyazaki S., Sugawara H., Gojobori T., Tateno Y. DNA Data Bank of Japan (DDBJ) for genome scale research in life science. // Nucleic Acids Res. — 2003. -V.31.-P. 13-16.
91. Moretti T., Koons B., Budowle B. Enhancement of PCR amplification yield and specificity using AmpliTaq Gold DNA polymerase. // Biotechniques. 1998. - V. 25(4).-P. 716-722.
92. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. // Methods Enzymology (ed. R. Wu). — 1987. V. 155. -P. 335-50. Academic Press, London.
93. Nakamura Y., Carlson M., Kraspcho K., White R. Isolation and mapping of a polymorphic DNA sequence (pMCT118) on chromosome lp D1S80. // Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16(19) - P. 9364.
94. Newton C.R. (ed.). PCR essential data. Oxford: John Wiley & Sons Ltd. - 1995.
95. Orian J.M., O'Mahoney J.V., Brandon M.R. Cloning and sequencing of the ovine growth hormone gene. //Nucleic Acids Res. 1988. - V.16(18). - P. 9046.
96. Orrego C. Organizing a laboratory for PCR work. In: PCR Protocols: a guide to methods and applications. Academic Press. 1990.
97. Oste C. Amplifications. 1989 - V. 1. - P. 10.
98. Pearson W. R. Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA //Methods in Enzymology. 1990. - V. 183. - P. 63-98.
99. Pearson W. R., Lipman D. J. Improved Tools for Biological Sequence Comparison. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1988. V. 85. - P. 2444- 2448.
100. Pearson W.R. Flexible sequence similarity searching with the FASTA3 program package. // Methods Mol Biol. 2000. - V. 132. - P. 185-219.
101. Polz M.F., Cavanaugh C.M. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 3724-3730.
102. Powel S.J. Protocol optimization and reaction specificity. In: PCR essential data (ed. Newton C.R.). Oxford: John Wiley & Sons Ltd. - 1995.
103. Prusiner S.B. Prions. In: Fields Virology, third edition. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia. - 1996. - P. 2901-2950.
104. Prusiner S.B. The prion diseases. // Brain Pathol. 1998. - V. 8. - P. 499513.
105. Rice P., Longden I., Bleasby A. EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. // Trends Genet 2000. 2000. - V. 16(6). - P. 276-277.
106. Ridley R.M., Baker H.F. Variation on theme of Creutzfeldt-Jakob disease: implications of new cases with a young age at onset. // J. Gen. Virol. 1996. - V. 77(12).-P.2898-2904.
107. Rosenstraus M., Wang Z., Ghang S.-Y., DeBonville D., Spadoro J.P. An Internal Control for Routine Diagnostic PCR: Design, Properties, and Effect on Clinical Perfomance.// Journal of Clinical Microbiology.- 1998.-V. 36(1). -P. 191-197.
108. Rossen L., Norskov P., Holmstrom K. and Rasmussen O.F. 1992. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction solution. // International Journal of Food Microbiology. 1992. - V. 7. -P. 37-45.
109. Ruano G., Brash D.E., Kidd K.K. PCR: the first few cycles. // Amplifications. -1991.-V. 7.-P. 1-4.
110. Ruano G., Pagliaro E.M., Schwartz T.R., Lamy K., Messina D., Gaensslen R.E., Lee H.C. // Biotechniques. 1992. - V. 13. - P. 266.
111. Rudi K., Treimo J., Moen B., Rud I., Vegarud G. Internal controls for normalizing DNA arrays. // Biotechniques. 2002. - V. 33(3). - P. 496-502.
112. Rybicki E. PCR Primer Design and Reaction optimisation. In: Molecular BiologyTechniques Manual, (ed. Coyne V.E., James M.D., Reid S.J., Rybicki E.P.) — Departament of Molecular and Cell Biology, University of Cape Town. 2001.
113. Rybicki E., Hughes F.L. Detection and typing of maize streak virus and other distanly ralated geminiviruses of grasses by polymerase chain reaction amplyfication of a conserved viral sequence. // Jornal of General Virology. 1990. -V. 71.-P.2519-2526.
114. Rychlik W., Rhoads R.E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA.//Nucleic Acids Res. 1989.-V. 17(21).-P. 8543-8551.
115. Rychlik W., Spencer W.J., Rhoads R.E. Optimization fo the annealing temperature for DNA ampification in vitro. // Nucleic Acids Research. 1990. - V. 18(21). -P. 6409-6412.
116. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymarase. // Sience. 1988. - V. 239. - P. 487-491.
117. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restiction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. // Sience. 1985. - V. 230. - P. 13501354.
118. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Erlich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86(16). - P. 6230-4.
119. Sardelli A.D. 1993. Amplifications. 9: 1
120. Sarkar G., Kapeiner S., Sommer S.S. Formamide can drastically increase the specificity of PCR. // Nucleic Acids Research. 1990. - V. 18(24). - P. 7465.
121. Schiermier Q. Testing times for BSE. //Nature. 2001. - V. 409. - P. 658-659.
122. Shams L., Kanitani Y., Shimojo S. Likely size of the French BSE epidemic. // Nature. 2000. - V. 408. - P. 787-788.
123. Shibata D., Namiki T., Higuchi R. Identification of a mislabeled fixed specimen by DNA analysis. II Am. J. Surg. Pathol. 1990. - V. 14(11). - P. 1076-8.
124. Sims R.J. Ill, Liss A.S., Gottlieb P.D. Normalization of luciterase reporter assays under condition that alter internal controls. // Biotechniques. 2003. - V. 34(5). -P. 938-940.
125. Sinclair A.J., Slattery W.J. Identification of meat according to species by isoelectric focusing. // Aust. Vet. J. 1982. - V. 58(2). - P. 79-80.
126. Smith K.T., Long C.M. Bowman B, Manos M.M. Using cosolventa to engence PCR amplification. // Amplifications 1990. - V. 9/90(5). - P 16-17.
127. Stoesser G., Baker W., van den Broek A., Garcia-Pastor M., Kanz C., Kulikova T., Leinonen R., Lin Q., Lombard V., Lopez R. et al. (2003) The EMBL nucleotide sequence database. // Nucleic Acids Res. — 2003. V. 31. - P. 17-22.
128. Thweatt R., Goldstein S., Reis R.J.S. A universal primer mixture for sequense determination at the 3'ends of cDNAs. // Analytical Biochemisty. — 1990. V. 190. -P. 314-316.
129. Unseld M., Beyermann B., Brandt P., Hiesel R. Identification fo the species origin fo highly processed meat product by mitochondrial DNA sequences. // PCR Methods and Applications. 1995. - V. 4. - P. 241-243.
130. Vize P.D., Wells J.R.E. Isolation and characterization of the porcine growth hormone gene. // Gene. 1987. V. 55(2-3). - P. 339-44.
131. Wang A.W., Doyle M.V., Mark D.F. Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 9717-9721.
132. Weant R.S., Edmunds P., Swaninathan B. 1990. Effect of ionic and nonionic detergents on the Taq-polymerase. // Biotechniques. 1990. - V. 9. - P. 308-309.
133. Weissensteiner T., Lanchbury J.S. Strategy for controlling preferential amplification and avoiding false negatives in PCR typing. // Biotechniques. — 1996. V. 21(6). - P. 1102-1108.
134. Wells G.A., Scott A.C., Johnson C.T., Gunning R.F., Hancock R.D., Jeffrey M., Dawson M., Bradley R. A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle. // Veterinary Record. 1987. - V. 121. - P. 419-420.
135. Westbrook J., Feng Z., Chen L., Yang H., Berman H. M. The Protein Data Bank and structural genomics. //Nucleic Acids Research. -2003. Vol. 31(1). -P. 489491.
136. White T.J., Madej R., Persing D.H. The polymerase chain reaction: clinical applications. // Adv. Clin. Chem. 1992. - V. 29. - P. 161-196.
137. Wilesmith J.W., Hoinville I.J., Ryan J.B.M. et al. Bovine spongiform encephalopathy: aspects of the clinical picture and analyses of possible changes 1986-1990. // Vet. Record. -1992. V. 130. - P. 197-201.
138. Will R.G., Ironside J.W., Zeidler M.A. et al. A new variant of Creutzfeldt-Jakob desease in the UK. // Lancet. 1996. V. 347. - P. 921-925.
139. Willhauck M., Vogel S., Keilholz U. Internal control for quality assurance of diagnostic RT-PCR. // Biotechniques. 1998. - V. 25(4). - P. 656-659.
140. Williamson A.L., Rybicki E. Detection of genital human papillomaviruses by polymerase chain reaction amplification with degenerate nested primers. // J. Med., Virol. 1991.-V. 33(3).-P. 165-171.
141. Worswick R. BSE record set straight. // Nature. 2001. - V. 414. - P. 249.
142. Wright D.K., Manos M.M. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.). Academic Press, San Diego, California. - 1990. - P. 356-367.
143. Yamada M., Hudson S., Tournay O., Bittenbender S., Shane S.S., Lang B., Tsujimoto Y., Caton A.J., Rovera G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86.-P. 5123.
144. Yap E.P.H., McGee J.O.D. Short PCR products yeilds improved by lower denaturation temperatures. //Nucleic Acids Research. 1991. - 19(7). - P. 1713.
145. Набора для определения примеси тканей крупного рогатого скота в. рыбной муке иммуноферментным методом (ВНИИЗЖ, г.Владимир);
146. Набора для определения примеси тканей крупного рогатого скота в рыбной муке в реакции кольцепреципитации (ВНИВИ, г.Казань);
147. Набор для определения примеси тканей крупного рогатого скота в рыбной муке иммуноферментным методом (ВНИИЗЖ, г.Владимир) показал низкую чувствительность (76%) и специфичность (57,2%) и в существующем виде для практического применения малопригоден.
148. Набор для определения примеси тканей крупного рогатого скота в рыбной муке в реакции кольцепреципитации (ВНИВИ, г.Казань) показал низкую чувствительность (29,4%) и специфичность (21%) и в существующем виде для практического применения непригоден.