Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследования по стандартизации плодов Амми большой – источника фурокумаринов

На правах рукописи

004603983

НИКОЛАЕВА ОЛЬГА БОРИСОВНА

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ ПЛОДОВ АММИ БОЛЬШОЙ - ИСТОЧНИКА ФУРОКУМАРИНОВ

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

- 2 СЕН ?Л1Л

Москва, 2010 г.

004608988

Диссертационная работа выполнена в ИЭКЛС ФГУ НЦ ЭСМП и во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук Баландина Ирина Анатольевна Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук Нестерова Ольга Владимировна профессор

Доктор фармацевтических наук Патудин Александр Васильевич профессор

Ведущая организация:

Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ)

Защита состоится «А> 2010 г. в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д 006.d70.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан « » ¿?$и/ё///£> 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук Громакова Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия отмечается значительный рост числа дерматологических заболеваний, среди которых особое место занимают грибковые инфекции, витилиго, псориаз. По данным ВОЗ 40 % населения земного шара являются носителями грибковых инфекций, больные витилиго составляют от 0,5 до 4 % всего населения земного шара, а это около 40 млн. человек.

Причинами кожных заболеваний служат острые и хронические инфекции, травмы, снижение уровня жизни в сочетании с ухудшающейся экологической обстановкой и неблагоприятными социальными факторами, а также применение в медицинской практике антибиотиков широкого спектра действия. Множество факторов, способствующих возникновению патологий кожи, обусловливает необходимость комплексного лечения, требующего длительного времени и достаточно дорогих синтетических препаратов, обладающих не только терапевтической активностью, но и высокой токсичностью, что ограничивает возможности их приема при продолжительном лечении. Следовательно, многие пациенты, страдающие этими заболеваниями, не могут получить адекватной терапии.

В связи с этим, заметно возрастает спрос на лекарственные средства растительного происхождения, поскольку они являются менее дорогостоящими по сравнению с продуктами химического синтеза и имеют ряд преимуществ (оказывают терапевтический эффект с наименьшим количеством противопоказаний для пациента, имеют низкую токсичность), что позволяет проводить лечение этими препаратами в различных возрастных группах в течение длительного времени.

Однако, ассортимент растительных лекарственных средств, для лечения дерматологических заболеваний в настоящее время весьма ограничен.

Перспективными, в этом отношении можно рассматривать плоды Амми большой - Атт1 тсуш Ь., семейства Сельдерейные -Ар1асеае. Применение в официнальной и народной медицине России, а также наличие достаточной отечественной сырьевой базы

для промышленных заготовок сырья этого культивируемого растения представляет особый интерес для расширения номенклатуры лекарственных средств.

Плоды амми большой не описаны ни в одной фармакопее, в отечественных и зарубежных источниках имеются весьма ограниченные данные об их химическом составе и методах анализа. В Реестр лекарственных средств плоды амми большой включены с 1996 г. (№ 71/609-13) и предназначены для производства субстанции «Аммифурин» и препаратов в лекарственных формах - таблетки «Аммифурин» 20 мг (№ 70/151/48) и растворы «Аммифурин» 2% (70/151/47) и 0,3% (№ 83/914/9). Автором препаратов и разработчиком нормативной документации на лекарственное растительное сырье является Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН. Уровень имеющейся нормативной документации на плоды амми большой (ФС 42-1996-83) не соответствует современным стандартам качества на лекарственное растительное сырье. В связи с этим, плоды амми большой были нами выбраны в качестве актуального объекта исследования - в качестве сырьевого источника препаратов «Аммифурин» и «Анмарин».

Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является комплексное изучение химического состава плодов амми большой и разработка методов контроля их качества.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• провести углубленное изучение диагностических признаков плодов амми с использованием макроскопического и микроскопического анализа.

• с использованием современных физико-химических методов анализа исследовать химический состав плодов на присутствие и содержание различных групп биологически активных веществ (БАВ) в том числе кумаринов, фурокумаринов, высших жирных кислот, аминокислот, фенольных соединений, Сахаров, жирного масла, дубильных веществ, макро- и - микроэлементов;

• оценить микробиологическую чистоту и содержание радионуклидов;

• подобрать оптимальные условия для разработки методик количественного определения фурокумаринов методом ВЭЖХ;

• провести валидацию методик количественного определения суммы фурокумаринов в пересчете на ксантотоксин и мармезина в плодах амми большой;

• разработанную методику количественного определения суммы фурокумаринов применить к оценке качества субстанции «Аммифурин» и таблеток «Аммифурин»;

• разработать и оформить проект ФС «Амми большой плоды» с целью включения в ГФ XII издания.

Научная новизна работы. Информационно-аналитическими исследованиями показана необходимость проведения всесторонних исследований химического состава плодов амми большой и разработки современных методик идентификации и количественного определения фурокумаринов и мармезина.

На основании макро- и микроскопического анализа установлены диагностически значимые признаки плодов амми большой.

Методом ВЭЖХ с использованием достоверных образцов охарактеризован качественный состав и количественное содержание суммы основных фурокумаринов (бергаптен, изопимпинеллин, ксантотоксин) и количественное содержание мармезина в плодах амми большой. Методики количественного определения основных биологически активных веществ (БАВ) в плодах амми большой валидированы.

Хромато-масс-спектрометрическим методом охарактеризован компонентный состав кумаринов.

Впервые методом ВЭЖХ проведена идентификация аминокислотного состава плодов амми большой, обнаружено 20 аминокислот.

Впервые определено содержание жирного масла (18,72%).

Методом масс-спектрометрии в сочетании с хроматографи-ческим способом разделения компонентов смеси в плодах амми большой изучен состав высокомолекулярных жирных кислот, который представлен насыщенными (миристиновой, пальмитиновой, стеариновой) и ненасыщенными (олеиновой, линолевой) кислотами;

Впервые в плодах амми большой методом ВЭЖХ изучен состав Сахаров, определена сумма полисахаридов в сырье (менее 1%). Установлено наличие дубильных веществ (0,72%).

Определен макро- и микро элементный состав плодов, который представлен калием, кальцием, железом и селеном.

С учетом современных требований к растительному сырью, разработаны критерии подлинности и нормы содержания БАВ в плодах амми большой. Подобраны условия анализа фурокумаринов в растительном сырье, которые позволили разработать сквозную методику стандартизации от растительного сырья к лекарственному средству.

Практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- Проект ФС «Амми большой плоды» (Акт внедрения методики количественного определения суммы фурокумаринов в плодах амми большой во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН;

-Акт внедрения методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту в плодах амми большой в Государственном учреждении здравоохранения «Центр сертификации и контроля качества лекарств Департамента здравоохранения г. Москвы» (ГУЗ «ЦС и ККЛ ДЗ»);

Методики идентификации и количественного определения основных БАВ (фурокумаринов) апробированы и рекомендованы для включения в нормативную документацию на субстанцию и таблетки «Аммифурин».

Основные положения, выносимые на защиту

• результаты анализа номенклатуры и методов контроля качества фотосенсибилизирующих средств растительного происхождения, включенных в Реестр лекарственных средств РФ;

• результаты морфолого-анатомического изучения с установлением диагностических признаков сырья - плодов амми большой;

• результаты исследований качественного состава и количественной оценки биологически активных веществ (БАВ)

плодов амми большой с использованием современных физико-химических методов;

• итоги разработки и определение показателей качества сырья -плодов амми большой;

• методики количественного определения основных БАВ в плодах амми большой, обеспечивающие сквозную стандартизацию от растительного источника к лекарственному средству.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), VII Международном симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2009), XIX Московской Международной Гомеопатической Конференции (Москва, 2009).

Связь задач и исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР и ИЭКЛС ФГУ НЦ ЭСМП «Совершенствование нормативной базы по стандартизации лекарственного растительного сырья и препаратов из лекарственного растительного сырья» на 2006-2010 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 6 - в изданиях, рецензируемых ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 154 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 120 источников, в том числе 36 иностранных, приложений. Работа иллюстрирована 46 рисунками, содержит 31 таблицу.

В первой главе на основании данных литературы описаны этиология и патогенез различных дерматологических заболеваний (псориаз, витилиго, микозы). Изучена номенклатура фотосенсибилизирующих препаратов, применяемых для лечения дерматозов, зарегистрированных в РФ, а также номенклатура и методы контроля качества фотосенсибилизирующих средств растительного происхождения. Представлена ботаническая характеристика, даны сведения об ареале, ресурсах и возделывании амми большой, данные по химическому составу плодов. Приведена

общая характеристика, классификация, химическое строение и фармакологическое действие кумаринов.

В главе «Объекты и методы исследования» приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, используемых в экспериментах.

Третья глава посвящена фармакогностическому изучению плодов амми большой, установлению показателей, позволяющих идентифицировать данное сырье и контролировать его качество.

В четвертой главе представлены данные изучения различных групп (БАВ) плодов амми большой с использованием современных физико-химических методов.

Проведены исследования по подбору оптимальных условий и разработке рациональной методики количественного определения суммы фурокумаринов в пересчете на ксантотоксин методом ВЭЖХ и методики количественного определения мармезина методом ВЭЖХ, проведена валидация разработанных методик. Установлен качественный состав кумаринов и компонентный состав высокомолекулярных жирных кислот, количественно определено содержание жирного масла и сумма фенольных соединений, изучен аминокислотный состав плодов амми большой, установлено наличие Сахаров, дубильных веществ, радионуклидов, изучен макро - и -микроэлементный состав.

Пятая глава повествует об определении подлинности БАВ в субстанции и таблетках аммифурина с помощью разработанной методики ВЭЖХ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования, служили образцы промышленных партий плодов амми большой, которые были заготовлены, в фазу конца вегетации растения, в Белгородском филиале ВИЛАР РАСХН в 2004-2009 гг.

Отбор проб и анализ лекарственного растительного сырья (ЛРС) проводили по методикам ГФ XI [20] и разработанными нами методикам качественного и количественного определения кумаринов.

Микроскопический анализ цельного и измельченного сырья проводили согласно статье «Техника микроскопического анализа» ГФ XI изд., вып. 1., с. 277-285 [20]. Поперечные срезы плодов амми

большой сделаны на салазочном микротоме, микрофотографии -камерой Axiocam HRc на микроскопе Axiolmager Ml (объективы 2,5х - ЕС Plann-Neofluar).

Для экстракции БАВ и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «ч» и «хч». Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной части работы осуществляли согласно ГФ XII, часть 1, С. 220. Концентрирование извлечений и отгонку растворителей осуществляли в вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИР-1М.

Для хроматографии в тонком слое сорбента использовали пластинки «Силикагель-60» фирмы «Мерк», размером 10x20 см. Хроматографирование выполняли при температуре 19-23 °С в герметически закрытых вертикальных стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластинки осуществляли при помощи шприца Hamilton (10 мкл).

Для тонкослойной хроматографии использовали систему растворителей: петролейный эфир.-диэтиловый эфир в соотношении (4:1) или (по объему 20:5).

Спектры поглощения снимали на спектрофотометре «Gelios» (США) в кювете с толщиной поглощающего слоя жидкости 10 мм.

ВЭЖХ анализ фурокумаринов в сырье проводили на жидкостном хроматографе фирмы (Waters) с УФ - детектором, хроматографической колонкой из нержавеющей стали, размером 250 х 4,0 мм и размером частиц 7 мкм. В качестве подвижной фазы использовали ацетонитрил : 1% уксусная кислота в соотношении 9:16 (для суммы фурокумаринов) и в соотношении 2:18 (для мармезина) Скорость подачи элюента 1,0 мл/мин. Объем вводимой пробы-20 мкл. Детектирование проводилось при длине волны 301 нм (для суммы фурокумаринов), а также при длине волне 336 нм - для мармезина.

Идентификацию свободных Сахаров проводили методом ВЭЖХ. Аминокислотный состав определяли методом ВЭЖХ, с использованием хроматографа «GILSON».

Идентификацию высокомолекулярных жирных кислот и кумаринов плодов амми большой осуществляли методом масс-спектрометрии в сочетании с хроматографическим способом разделения компонентов смеси при помощи газового хроматографа.

Количественное определение жирного масла в плодах амми большой, проводили путем обработки сырья органическим

растворителем (иетролейным эфиром). Извлечение проводили в аппарате Сокслета.

Количественное определение суммы фенольных соединений, в пересчете на хлорогеновую кислоту в плодах амми большой, проводили методом прямого спектрофотометрирования.

Количественное определение минеральных веществ, в плодах амми большой (селена, калия, железа), проводили методом атомно-адсорбционной спектрофотометрии (ААС).

Для исследования БАВ использовали искусственную смесь стандартных образцов: ГСО ксантотоксина (ФС 42-510-00), PCO мармезина (ТУ-9369-173-04868244-2010), PCO изопимпинеллина, PCO бергаптена; СО хлорогеновой кислоты (Sigma, кат. № С3878).

Определение радионуклидов проводили согласно ОФС 42-0011-03 «Определение содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье. Стронций - 90, цезий - 137. Отбор проб, анализ и оценка результатов».

Определение суммы фурокумаринов, в субстанции и таблетках «Аммифурин» проводили методом ВЭЖХ.

1. Фармакогностическое изучение сырья - плодов амми большой и разработка методов контроля его качества

Оценка качества сырья - плодов амми большой проводилась по следующим характеристикам: внешние (макроскопические) признаки, анатомо-диагностичекие признаки при микроскопическом исследовании, качественные реакции и хроматографические исследования. В ходе морфолого-анатомических исследований определены диагностически значимые признаки JIPC, а также установлены нормативы таких числовых показателей, как сумма фурокумаринов, в пересчете на ксантотоксин, содержание мармезина, влажность, содержание минеральной и органической примесей, золы общей и золы, нерастворимой в хлористоводородной кислоте разведенной 10 %.

Исследование морфологических признаков сырья Исследования морфологических признаков проводили на цельных плодах в соответствии с разделом «Методы анализа лекарственного растительного сырья» ГФ XI, статья «Плоды, семена».

При изучении внешних признаков цельных плодов обращалось внимание на характер поверхности, число мерикарпиев, размеры, цвет, запах, вкус водного извлечения.

Исследование диагностических признаков анатомического строения плодов амми большой

На поперечном срезе плодов амми большой при увеличении (40 х, 200х, 400х) при микроскопическом исследовании (рис. 1,2, 3, 4, 5) выявлены диагностически значимые признаки анатомического строения поперечного среза мерикарпия плода амми большой: мерикарпий почковидной формы имеет 5 слабовыраженных ребер; Эпидермис околоплодника (экзокарпий) состоит из одного слоя овальных клеток. В паренхиме мезокарпия в ребрах видны пять проводящих пучков; в межреберных пространствах мезокарпий выпуклый полукруглый в очертании, в нем располагаются 6 межреберных эфирно-масличных канальцев: четыре на выпуклой стороне и два на вогнутой. Канальцы овальные, с 1-2 слоями выстилающих клеток темно-коричневого цвета. Кроме того, нами установлено, что в полости канальцев иногда, заметно зернистое содержимое желтовато-коричневого цвета. Встречаются отдельные мелкие эфирно-масличные канальцы около или внутри, проводящих пучков. Эндокарпий и семенная кожура плотно срослись в виде слоя деформированных клеток желтовато-коричневого цвета. Эндосперм состоит из многоугольных клеток, заполненных ачейроновыми зернами, каплями жирного масла и мелкими друзами оксалата кальция.

Рис. 1. — Плоды амми большой Поперечный срез мерикарпия: эфирномасличные канальцы [1]; проводящие пучки в ребрышках [2]. Увел. 40х

Рис.2. — Плоды амми большой. Поперечный срез мерикарпия. Эфирномасличный каналец с одним слоем выстилающих клеток [1]; сросшиеся эндокарпий и семенная кожура [2]; эндосперм [3]. Увел. 200х.

■НЬ > ■

........

.....'' ««й»«' ................................

Рис.3. - Плоды амми большой. Поперечный срез мерикарпия. Эфирномасличный каналец [1]; проводящий пучок в ребрышке [2], сросшиеся эндокарпий и семенная кожура [3]. Увел. 200х

I ■ 11 йш 1* ШШШтшшЯИИ

V- "ЩШ

1

■ -

Рис.4. - Плоды амми большой. Фрагмент поперечного среза эндосперма. Многоугольные клетки эндосперма с алейроновыми зернами [1]; и мелкими друзами оксалата кальция [2]. Увел.400х.

■га— 'ШШШ

Рис.5. - Плоды амми большой. Фрагмент поперечного среза эндосперма. Многоугольные клетки эндосперма с алейроновыми зернами [1] и каплями жирного масла [2]. Увел. 400х.

Проведенные исследования позволяют нам рекомендовать уточненное и дополненное описание микроскопических признаков плодов, актуализованных микрофотографиями и включить полученные материалы в проект Государственного стандарта качества (ФС) на лекарственное растительное сырье «Амми большой плоды».

Разработка методик качественного и количественного определения БАВ в сырье амми большой

Основной группой БАВ плодов амми большой, является сумма фурокумаринов (изипимпинеллин, бергаптен, ксантотоксин), обусловливающих фотосенсибилизирующее действие, и мармезин -полупродукт для получения препарата «Анмарин» антимикотического действия (рис. 6).

ксантотоксин:

о- -о-

бергаптен:

9-метоксифуро{3,2-^}хромен-7-он 4-метоксифуро{3,2-§}хромен-7-он

-Чг

ОН

мармезин

изопимпинеллин у

4,9-диметоксифуро{3,2^}хромен- (28)-2-(2-гидропропан-2-ил)-2,3-7-он дигидрофуро{3,2^}хромен-7-он

Рис.6. - Структурные формулы БАВ амми большой

Для количественной оценки основных фурокумаринов разработана методика ВЭЖХ с использованием ксантотоксина -стандартного образца. При разработке методики количественного определения суммы фурокумаринов в пересчете на ксантотоксин в первую очередь проводили подбор оптимальных условий пробоподготовки плодов (степень измельчения сырья, тип экстрагента, температура, продолжительность экстракции, соотношение сырье-экстрагент).

Установлены следующие оптимальные параметры экстракции: в качестве экстрагента выбран 80 % спирт, для обеспечения температурного режима, времени и способа экстракции оправдано применение кипящей водяной бани с обратным холодильником в течение 2-х часов, оптимальным соотношением сырья к экстрагенту является соотношение (1:100). Типовая ВЭЖХ хроматограмма извлечения из плодов амми большой представлена на рис. 7, ГСО ксантотоксина (рис.8).

3b

Рис.7. - ВЭЖХ-хроматограмма извлечения из плодов амми большой: 1-ксантотоксин; 2-изопимпинеллин; 3-бергаптен

Рис.8.-ВЭЖХ-хроматограмма reo ксантотоксина

Воспроизводимость методики количественного определения суммы фурокумаринов установлена на примере анализа одного образца сырья в 6 независимых повторностях. Метрологические характеристики методики (табл.1) свидетельствуют, что относительная ошибка единичного определения с 95 % вероятностью составляет ± 4,7%.

Таблица 1

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фурокумаринов в плодах амми большой

f Хер S Р,% t(f,P) АХ Е, %

5 0,65 ± 0,024 95 2,57 0,062 ±4,7

Количественное определение мармезина проводили методом ВЭЖХ, с использованием рабочего стандартного образца мармезина в аналогичных условиях. ВЭЖХ - хроматограмма извлечения из плодов амми большой представлена на рис. 9, PCO мармезина - на рис.10.

Рис.9. - ВЭЖХ-хроматограмма Рис.10. - ВЭЖХ-хроматограмма извлечения из плодов амми PCO мармезина большой после гидролиза (12 - мармезин)

Воспроизводимость методики количественного определения мармезина установлена на примере анализа одного образца в шести независимых повторностях. Метрологические характеристики методики (табл.2) свидетельствуют, что относительная ошибка единичного определения 95 % вероятностью составляет 2,8%.

Таблица 2

Метрологические характеристики методики количественного

определения мармезина

f Хср S Р t(p,f) . АХ е

5 2,2 ± 0,027 95 1 2,57 ±0,061 ±2,8

С использованием разработанных методик были проанализированы 5 серий плодов амми большой 2007-2009 г. заготовки.

На основании проведенных исследований было определено содержание суммы фурокумаринов в пересчете на ксантотоксин и содержание мармезина в плодах амми большой, установлена их норма: не менее 0,6% (для суммы фурокумаринов) и не менее 0,08% (для мармезина).

Методика количественного определения суммы фурокумаринов в пересчете на ксантотоксин и методика количественного определения мармезина в плодах амми большой включены в разработанный проект ФС на сырье - «Амми большой плоды».

Валидация методик ВЭЖХ количественного определения суммы фурокумаринов и мармезина в плодах амми большой

Валидация проводилась в соответствии с характеристиками, рекомендованными в проекте ФС «Валидация фармакопейных методов» и «Руководством о валидации методик анализа лекарственных средств» по показателям: специфичность, прецизионность (воспроизводимость), точность, линейность.

Основным критерием специфичности является степень разделения - Яэ, определяющаяся на основе показателей пригодности хроматографической системы.

Экспериментальные результаты, полученные при проверке пригодности хроматографических систем подтверждают соответствие показателей параметру валидации - специфичности.

Прецизионность (воспроизводимость) аналитической методики, выражает степень близости (или степень разброса) результатов для серии измерений, выполненных по данной методике на различных пробах одного и того же однородного образца.

Относительное стандартное отклонение (1180,%) значений содержания суммы фурокумаринов в случайной выборке из 6 образцов не должно превышать 2,0% и составляет в нашем случае 0,47%; относительное стандартное отклонение (КЖ,%) значений содержания мармезина в случайной выборке из 6 образцов так же не должно превышать 2,0% и составляет 0,74%.

Точность — характеризует степень соответствия между известным и истинным значением (или справочной величиной), и значением, полученным по данной методике.

Точность была определена на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества, варьируемым от 80 до 120% от номинальной концентрации в испытуемом растворе.

Открываемость определяемого вещества -100,0 ± 2,0%.

Из 10-ти модельных смесей приготовили растворы пяти различных концентраций (по 3 раствора на уровнях я 80%, 90%, 100%, 110%, 120% от номинальной концентрации испытуемого

раствора).

Приготовленные растворы анализировали в условиях, описанных в методиках количественного определения суммы фурокумаринов и мармезина в плодах амми большой. Из полученных данных вычисляли содержание суммы фурокумаринов и мармезина в каждой из модельных смесей. По значениям «взято» и «найдено» суммы фурокумаринов и мармезина опряделяли открываемость, затем, используя данные по «открываемое™», рассчитывали статистические характеристики (табл.3).

Таблица 3

Статистические характеристики

Статистический параметр Значение параметра фурокумаринов Значение параметра мармезина

Среднее выборки (значение открываемое™, %) 99,95 99,85

Стандартное отклонение отдельного результата -0,397 «0,417

Относительное стандартное отклонение, % 0,40 0,42

Табличное значение критерия Стьюдента 1 (95 %, 11) 2,26 2,26

Доверительный интервал среднего результата, Ах 0,78 0,37

Открываемость анализируемого объекта с учетом доверительного интервала, % 99,17- 100,76 99,52-100,22

Значение открываемое™ с учетом доверительных интервалов не выходит за пределы 98,0% - 102,0%. Валидируемые показатели соответствуют показателям точности для этих методик.

Линейность — это способность методики в диапазоне применения давать величины сигнала Б (площади пика) прямо пропорциональные концентрации С определяемого вещества. Значение коэффициента корреляции Я должно быть не менее 0,999.

Тест проверки линейности проводился одновременно с тестом «Правильность». Графики зависимости площадей пиков от

концентрации растворов представлены на рис. 11, 12.

Регрессирующее уравнение Б = 8,642 + 8,525-с; И = 0,9993

Регрессирующее уравнение Б = 673.8-с +0.96; 11 = 0,96

1ЕОО

шо

ШО ,1£00 'поп

"ш

1100 1100 1СОО

15

2.5

- & '"1 <1......11 А' к А ■}! 1к

Рис.11. - График Рис.12. - График зависимости площади

зависимости площади пика пика мармезина от концентрации

суммы фурокумаринов от раствора концентрации раствора

Таким образом, относительное стандартное отклонение (1180|) значений содержания суммы фурокумаринов в случайной выборке из 6 образцов не превышает 2,0%; относительное стандартное отклонение (К^ЮО значений содержания мармезина в случайной выборке из 6 образцов не превышает 2,0%;

На основании результатов, полученных нами, диапазон применения методик составляет 80-120% от номинального содержания.

Разработанные методики количественного определения суммы фурокумаринов и мармезина специфичны, характеризуются корректной точностью и воспроизводимостью, линейной зависимостью. Позволяют использовать их для достоверной и точной оценки качества сырья.

Разработка нормативной документации на сырье амми большой

Контроль качества плодов амми большой плодов предложено осуществлять по следующим показателям: внешние признаки, микроскопия, качественные реакции, числовые показатели (влажность, зола общая и нерастворимая в растворе кислоты хлористоводородной разведенной 10%; органическая и минеральная примеси); количественное определение суммы фурокумаринов в пересчете на ксантотоксин и определение мармезина; микробиологическая чистота (по ОФС 42-0016-04).

Изучение стабильности плодов амми большой по всем показателям, предусмотренным проектом ФС в условиях рекомендованных ГФ XI « В сухом, защищенном отсвета месте» позволило подтвердить срок годности сырья - 5 лет. По истечении указанного срока годности по всем показателям качества лекарственное растительное сырье отвечало требованиям проекта ФС.

Проект ФС «Амми большой плоды» подготовленный взамен ФС 42-1996-83, направлен в Центр стандартизации лекарственных средств для включения в Государственную Фармакопею XII издания.

2. Фитохимическое изучение плодов амми большой

Фитохимический состав плодов амми большой изучен недостаточно, в связи с этим нами проведено изучение различных групп природных соединений (кумаринов, жирного масла, высших жирных кислот, фенолкарбоновых кислот и аминокислот, Сахаров, дубильных веществ и микроэлементов) с использованием современных физико-химических методов.

Изучение компонентного состава кумаринов плодов амми большой

С помощью методики хромато-масс-спектрометрии изучен качественный состав кумаринов и установлено их количественное содержание в липофильной фракции плодов амми большой. Результаты исследования представлены в табл. 4.

Таблица 4

Характеристика соединений, идентифицированных в плодах амми большой

№ Время Название компонента Сод. в

удерж., мин тривиальное систематическое смеси,%

2 13,78 пальмитиновая гексадекановая 5,13

3 13,88 дибутилфталат дибутилфталат 0,94

4 14,52 ксантотоксин 8-метоксифуро-2',3':7,6-кумарин 16,44

5 14,66 бергаптен 5-метоксифуро-2',3':7,6-кумарин 8,60

6 14,76 олеиновая 9-октадеценовая 22,59

7 14,76 линолевая 9,12-октадекадиеновая 7,38

8 14,82 стеариновая октадекановая 1,82

9 15,32 кариофиллен кариофиллен 2,21

10 15,54 а-гумулен а-гумулен 0,62

11 15,73 изопимпинелин 5,8-диметоксиуро-2',3':7,6-кумарин 10,81

12 16,14 кариофиллен оксид кариофиллен оксид 0,87

13 16,31 мармезин 5'-(2-оксиизопропил)-4', 5-дигидрофуро-2',3':7,6-кумарин 1,33

14 16,71 (3-гумулен Р-гумулен 2,42

15 17,09 9,17-октадекадиенол 9,17-октадекадиенол 1,98

16 17,29 оксипейцеданин 5-(2,3-эпоксиизопен-тил-окси)-фуро-2',3':7,6-кумарин 12,90

17 17,53 3-метоксиэстра-1,3,5(10)-триен-17-ол 3-метокси-эстра-1,3,5(10)-триен-17-ол 4,73

18 18,04 прангенин 8-(2,3-эпокси-Зметил-бутокси)-фуро-2',3':7,6-кумарин 1,46

19 19,03 парафин гептакозан 0,42

20 19,08 биак-ангелицин 5-метокси-8-(2,3-диок-си-3 -мети л-бутокси)-фуро-2',3':7,6-ку марин 1,93

21 21,35 парафин эйкозан 2,80

В результате исследований нами идентифицировано 21 соединение, из которых к соединениям кумариновой природы относятся: ксантотоксин-16,44%, изопимпинеллин-10,8% и бергаптен-8,60%. Кроме того, обнаружены раннее неидентифи-цированные фурокумарины: оксипейцеданин, прангин, биак-ангелицин, мармезин).

Количественное определение жирного масла в плодах амми

большой

Плоды амми большой помимо основных фурокумаринов имеют в своем составе и другие БАВ. Впервые установлено содержание в них жирного масла (от 18,12% до 18,32%).

Изучение высокомолекулярных жирных кислот в составе липофилыюго комплекса, выделенного из плодов амми большой

Идентификацию соединений осуществляли методом масс-спектрометрии в сочетании с хроматографическим способом разделения компонентов смеси. Результаты исследования компонентного состава жирных кислот в плодах амми большой представлены в табл. 5.

Таблица 5

Компонентный состав и содержание жирных кислот в плодах амми

большой

Время удержи вания, мин Формула Название компонента Содержание в смеси, (%)

тривиальное Систематическое

12,94 С|3Н27СООН миристиновая тетрадекановая следы

13,78 С15Н31СООН пальмитиновая гексадекановая 5,13

14,76 С17НззСООН олеиновая 9-октадецено-вая 22,59

14,76 С17Н3,СООН линолевая 9,12-октадека-диеновая 7,38

14,82 С17Н35СООН стеариновая октадекановая 1,82

Определение суммы фенольных соединений в плодах амми

большой

Количественное определение проводили методом спектрофотометрирования. В результате анализа 3 серий из 5 определений установлено, что содержание суммы фенолкарбоновых

кислот в плодах амми большой в пересчете на хлорогеновую кислоту составляет от 3,64 до 4, 74%.

Относительная ошибка методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту с 95% вероятностью составляет ±3,52%.

Изучение аминокислотного состава плодов амми большой В связи с отсутствием в литературе сведений об аминокислотном составе плодов амми большой, нами исследован качественный состав и определено содержание аминокислот методом ВЭЖХ. Сумма аминокислот в сырье составила 3,9%.

Определение Сахаров в плодах амми большой Качественный и количественный состав Сахаров в плодах амми большой ранее не изучался. Нами впервые, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) идентифицированы свободные сахара: фруктоза, глюкоза, сахароза.

Установлена норма содержания полисахаридов плодов амми большой (менее 1%).

Количественное определение дубильных веществ Количественное определение дубильных веществ, проводили в соответствии с требованиями ГФ XI изд. В соответствии с полученными данными впервые в плодах амми большой установлено содержание дубильных веществ от 0,66% до 0,72%.

3. Определение подлинности БАВ в готовых лекарственных

формах

Ценность методики количественного определения методом ВЭЖХ для лекарственного растительного сырья (ЛРС) в том, что она может быть использована для оценки критериев подлинности и норм содержания основных действующих веществ в субстанции и готовых лекарственных формах. Идентификацию и количественное определение кумаринов в субстанции и таблетках проводили методом ВЭЖХ (рис. 13).

1-ксантотоксин; 2-изопимгтинеллин; 3-бергаптен

Относительная ошибка единичного определения методики количественного определения фурокумаринов в субстанции «Аммифурин» с 95% вероятностью составляет ±3,95%.

Нами также проведено количественное определение суммы фурокумаринов в пересчёте на ксантотоксин, в препарате «Аммифурин» таблетки 0,02 г.

Относительная ошибка единичного определения методики количественного определения суммы фурокумаринов «Аммифурин» таблетки 0,02 г с 95% вероятностью составляет ±5,03%.

На основании проведенных исследований показана принципиальная возможность применения разработанной методики ВЭЖХ в лекарственном растительном сырье для идентификации основных фурокумаринов субстанции «Аммифурин» и готовой лекарственной формы - «Аммифурин» таблетки 0,02 г, что позволяет осуществить сквозную стандартизацию от растительного сырья к субстанции и далее, к лекарственной форме.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено углубленное изучение диагностических признаков плодов амми с использованием макроскопического и микроскопического анализа.

2. С использованием современных физико-химических методов анализа исследован химический состав плодов на присутствие и содержание различных групп биологически активных веществ (БАВ), в том числе кумаринов, фурокумаринов, высших жирных кислот,

аминокислот и фенольных соединений, Сахаров, жирного масла, дубильных веществ, макро- и - микроэлементов.

3. Методом ВЭЖХ проведена идентификация аминокислотного состава плодов амми большой, обнаружено 20 аминокислот, из них 9-незаменимых, 10-заменимых, 1-неидентифицированная. Общая сумма аминокислот в сырье составила 3,9%.

4. Впервые спектрофотометрическим методом определена сумма фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту (3,74%).

5. Впервые изучен состав высокомолекулярных жирных кислот, которые представлены насыщенными (миристиновая, пальмитиновая, стеариновая) и ненасыщенными (олеиновая, линолиевая) кислотами.

6. Методом ВЭЖХ установлен качественный состав свободных Сахаров (глюкоза, фруктоза, сахароза); содержание полисахаридов (не более 1%).

7. Впервые установлено количественное содержание жирного масла (18,72%) и определен макро- и микро элементный состав плодов, который представлен калием, кальцием, железом и селеном.

8. Оценена микробиологическая чистота и содержание радионуклидов.

9. Подобраны оптимальные условия анализа и разработаны методики количественного определения суммы фурокумаринов в пересчете на ксантотоксин и мармезина методом ВЭЖХ в растительном сырье; валидация методик позволила подтвердить их пригодность. Норма содержания суммы фурокумаринов не менее

0.6%, норма содержание мармезина не менее 0,08%.

10. Показана возможность использования разработанной методики ВЭЖХ для количественного определения суммы фурокумаринов в субстанции «Аммифурин» и лекарственной форме «Аммифурин» таблетки 0,02 г.

12. Оформлен проект ФС «Амми большой плоды», который представлен для включения в ГФ XII издания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Анализ рынка современных противогрибковых средств растительного происхождения / О.Б. Николаева, М.А. Джавахян, Т.А. Сокольская и др.//Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2009. - № 4. - С.8-10.

2. Плоды Амми большой: микроскопическое изучение/ О.Б. Николаева, И.А. Баландина, М.Н. Лякина и др. //Фармацевтическая химия и фармакогнозия -2009.- № 5 - С.13-15.

3. Особенности стандартизации лекарственных препаратов традиционных медицинских систем/ О.Б. Николаева, И.А. Баландина, B.JI. Багирова и др.// Тезисы докладов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - М.,2009.-С.708-709.

4. Разработка проекта Фармакопейной статьи на лекарственное растительное сырье «Амми большой плоды» для Государственной Фармакопеи XII издания/ О.Б. Николаева, И.А. Баландина, В.Л. Багирова и др. // Тезисы докладов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - М., 2009. -С.709.

5. Разработка методики количественного определения ксантотоксина в плодах Амми большой/ О.Б. Николаева, Т.Б. Шемерянкина, Т.А. Сокольская и др. // Тезисы докладов VII Международного симпозиума по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты- М., 2009.-С.191

6. Изучение высокомолекулярных жирных кислот в составе липофильного комплекса, выделенного из плодов амми большой/ О.Б.Николаева, К.А. Пупыкина, Т.Д. Даргаева и др.//Башкирский химический журнал № 1-2010- С.

7. К вопросу изучения кумаринов, входящих в состав плодов амми большой/ О.Б.Николаева, К.А. Пупыкина, Т.Д. Даргаева и др.//Башкирский химический журнал № 1-2010- С.

8. Оценка качества сырья Амми большой: сборник научных трудов/ О.Б. Николаева, Т.Б. Шемерянкина, Т.А. Сокольская и др.// Пятигорск, 2010,-Вып.80.- с.235-236.

9. Николаева О.Б., Шемерянкина Т.Б., Баландина И.А. Лекарственные растения семейства-Зонтичные (Apiaceae) в гомеопатии и народной медицине// Тезисы докладов XX Московской международной гомеопатической конференции-М., 2010,-С.148-151.

10. Изучение аминокислотного состава плодов амми большой/ О.Б. Николаева, Т.Д. Даргаева, Т.Б. Шемерянкина и др. //Сборник научных трудов РАЕН. -Москва, 2010,- Вып. .

11. Определение Сахаров плодов амми большой/ О.Б. Николаева, Т.Д. Даргаева, Т.Б. Шемерянкина и др. //Сборник научных трудов РАЕН. - Москва, 2010.-Вып. .

12.Разработка методики количественного определения суммы фурокумаринов в плодах амми большой методом ВЭЖХ/ О.Б. Николаева, Т.Б. Шемерянкина, Т.Д. Даргаева и др.// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.- 2010. - №.

13. Фармакогностическое и фитохимическое изучение плодов амми большой -источника препаратов фотосенсибилизирующего и антимикотического действия / О.Б. Николаева, Т.Б. Шемерянкина, Т.Д. Даргаева и др. //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2010. - № .

Подписано в печать: 06.08.2010

Заказ № 3972 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность темы; В последние десятилетия отмечается значительный рост числа дерматологических заболеваний, среди которых особое место занимают грибковые инфекции, витилиго, псориаз. По данным ВОЗ 40% населения земного шара являются носителями грибковых инфекций, больные витилиго составляют от 0,5 до 4% всего населения земного шара, а это около 40 млн. человек [33].

Причинами кожных заболеваний служат острые и хронические инфекции, травмы, снижение уровня жизни в сочетании с ухудшающейся экологической обстановкой и неблагоприятными социальными факторами, а также применение в медицинской практике антибиотиков широкого спектра действия. Множество факторов, способствующих возникновению патологий кожи, обусловливает необходимость комплексного лечения, требующего длительного времени и достаточно дорогих синтетических препаратов, обладающих не только терапевтической активностью, но и высокой токсичностью; что ограничивает возможности их приема при продолжительном лечении. Следовательно, многие пациенты, страдающие этими заболеваниями, не могут получить адекватной терапии.

В связи с этим, заметно возрастает спрос на лекарственные средства растительного происхождения, поскольку они являются менее дорогостоящими по сравнению с продуктами химического синтеза и имеют ряд преимуществ (оказывают терапевтический эффект с наименьшим количеством противопоказаний для, пациента, имеют низкую токсичность), что позволяет проводить- лечение этими препаратами- в различных возрастных группах в течение длительного времени.

Однако, ассортимент растительных лекарственных средств, для лечения дерматологических заболеваний в настоящее время весьма ограничен.

Перспективными, в этом отношении можно рассматривать плоды Амми большой - Ammi majus L., семейства Сельдерейные - Apiaceae.

Применение в официнальной и народной, медицине России, а также наличие достаточной отечественной сырьевой базы для промышленных заготовок сырья этого культивируемого растения представляет особый интерес для расширения номенклатуры лекарственных средств.

Плоды амми большой не описаны ни в одной фармакопее, в отечественных и зарубежных источниках имеются весьма ограниченные данные об их химическом составе и методах анализа. В Реестр лекарственных средств плоды амми большой включены с 1996 г. (№71/609-13) и предназначены для производства субстанции «Аммифурин» и препаратов, в лекарственных формах - таблетки* «Аммифурин» 20 мг (№70/151/48) и растворы «Аммифурин» 2%> (№70/151/47) и 0,3% (№83/914/9). Автором препаратов и разработчиком; нормативной документации на лекарственное растительное сырье является Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХНХ[38], Уровень имеющейся^ нормативной документации на плоды амми большой (ФС 42-1996-83) не соответствует современным стандартам качества1 на лекарственное растительное сырье. В связи* с этим, плоды амми большой были нами» выбраны в качестве актуального объекта исследования — в качестве сырьевого источника препаратов «Аммифурин» и «Анмарин».

Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является комплексное изучение химического состава плодов амми большой и разработка методов контроля их качества.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. провести углубленное-изучение диагностических признаков плодов амми, с использованием макроскопического и микроскопического анализа;

2. с использованием современных физико-химических методов анализа исследовать химический состав плодов на присутствие и содержание различных групп биологически активных веществ (БАВ) в том числе кумаринов, фурокумаринов, высших жирных кислот, аминокислот, фенольных соединений, Сахаров, жирного масла, дубильных веществ, макро- и - микроэлементов;

3. оценить микробиологическую чистоту и содержание радионуклидов;

4. подобрать оптимальные условия, для разработки методик количественного определения фурокумаринов методом ВЭЖХ;

5: провести валидацию методик количественного определения суммы фурокумаринов в пересчете на ксантотоксин и мармезина в плодах амми большой;

6. разработанную- методику количественного определения суммы фурокумаринов применить к оценке качества субстанции «Аммифурин» и. таблеток «Аммифурин»;

7. разработать и оформить проект ФС «Амми большой плоды» с целью включения в ГФ XII издания:

Научная новизна, работы. Информационно-аналитическими» исследованиями показана необходимость проведения всесторонних исследований химического состава, плодов амми большой и разработки современных методик идентификации и, количественного» определения* фурокумаринов и мармезина:

На основании макро- и микроскопического анализа установлены, диагностически значимые признаки плодов амми большой.

Методом ВЭЖХ, с использованием достоверных образцов охарактеризован качественный состав и количественное содержание суммы основных фурокумаринов (бергаптен, изопимпинеллин, ксантотоксин) и количественное содержание мармезина в плодах амми большой. Методики количественного определения основных биологически активных веществ (БАВ) в плодах амми большой валидированы.

Хромато-масс-спектрометрическим методом охарактеризован компонентный состав кумаринов. Впервые методом ВЭЖХ проведена идентификация аминокислотного состава плодов амми большой, обнаружено 20 аминокислот.

Впервые определено содержание жирного масла (18,72%). Методом масс-спектрометрии в сочетании с хроматографическим способом разделения компонентов смеси в плодах амми большой изучен состав высокомолекулярных жирных кислот, который представлен насыщенными (миристиновой, пальмитиновой, стеариновой) и ненасыщенными (олеиновой, линолевой) кислотами.

Впервые в плодах амми болыпош методом ВЭЖХ изучен состав Сахаров, определена сумма полисахаридов в сырье (менее 1%). Установлено наличие дубильных веществ (0,72%).

Определен макро- и микро элементный состав плодов, который представлен калием, кальцием, железом и селеном:

С учетом современных требований к растительному сырью, разработаны критерии подлинности и нормы содержания БАВ в плодах амми большой. Подобраны условия- анализа фурокумаринов в растительном^ сырье, которые позволили разработать сквозную методику стандартизации от растительного сырья к лекарственному средству.

Практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- Проект ФС «Амми большой плоды» (Акт внедрения методики количественного определения суммы, фурокумаринов в. плодах амми большой во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН;

Акт внедрения методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту в плодах амми большой в Государственном учреждении здравоохранения «Центр сертификации и контроля; качества лекарств Департамента здравоохранения г. Москвы» (ГУЗ «ЦС и KKJ1ДЗ»);

Методики идентификации и количественного определения * основных БАВ (фурокумаринов) апробированы и рекомендованы для включения в нормативную документацию на субстанцию и таблетки «Аммифурин». Основные положения, выносимые на защиту

• » результаты анализа номенклатуры и методов контроля качества фотосенсибилизирующих средств5 растительного проис-хождения; включенных в Реестр лекарственных средств РФ;

• результаты морфолого-анатомического изучения с установлением диагностических признаков?сырья — плодов амми большой;

• результаты исследований качественного? состава; и количественной} оценки? биологически активных веществ' (БАВ) плодов амми большой с использованием современных физикогхимических методов;:

• - итоги разработки ^ определение показателей качества сырья - плодов , амми большой;

• * методики количественного определения основных БАВ в плодах амми большой, обеспечивающие сквозную стандартизацию от растительного источника'к; лекарственному средству.

Апробация работы: Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), VII Международном симпозиуме по фенольным соединениям (Москва;, 2009), XIX Московской Международной Гомеопатической Конференции (Москва, 2009);

Связь задач и исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена» в соответствии с планом НИР и ИЭКЛС ФГУ НЦ ЭСМП

Совершенствование нормативной базы по стандартизации лекарственного растительного сырья и препаратов из лекарственного растительного сырья» на 2006-2010 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 4 - в изданиях, рецензируемых ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава I), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 181 источник, в том числе 49 - на иностранных языках, 3 приложений. Работа иллюстрирована 45 рисунками, содержит 42 таблицы.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено углубленное изучение диагностических признаков плодов амми с использованием макроскопического и микроскопического анализа.

2. С использованием современных физико-химических методов анализа исследован химический состав плодов на присутствие и содержание различных групп БАВ, в том числе кумаринов, фурокумаринов, высших, жирных кислот, аминокислот и фенольных соединений, Сахаров, жирного масла, дубильных веществ, макро- и — микроэлементов.

3. Методом ВЭЖХ проведена идентификация аминокислотного состава плодов амми большой, обнаружено 20 аминокислот, из них 9-незаменимых, 10-заменимых, 1 -неидентифицированная. Общая сумма аминокислот в сырье составила 3,9%.

4. Впервые спектрофотометрическим методом определена сумма, фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту (3,74%).

5. Впервые изучен состав высокомолекулярных жирных кислот, которые представлены насыщенными (миристиновая, пальмитиновая, стеариновая) и ненасыщенными (олеиновая, линолиевая) кислотами.

6. Методом ВЭЖХ установлен качественный состав свободных Сахаров, (глюкоза, фруктоза, сахароза); содержание полисахаридов (не более 1%).

7. Впервые установлено количественное содержание жирного масла (18,72%) и определен макро- и микро элементный состав плодов, который представлен калием, кальцием, железом и селеном:

8. Оценена микробиологическая,чистота и содержание радионуклидов.

9. Подобраны оптимальные условия анализа* и разработаны методики количественного определения суммы фурокумаринов- в пересчете на ксантотоксин и мармезина методом ВЭЖХ в растительном сырье; валидация методик позволила подтвердить их пригодность. Норма содержания суммы фурокумаринов не менее 0,6%, норма содержание мармезина не менее 0,08%.

10. Показана возможность использования разработанной методики ВЭЖХ для количественного определения суммы фурокумаринов в субстанции «Аммифурин» и лекарственной форме «Аммифурин» таблетки 0,02 г.

11. Оформлен проект ФС «Амми большой плоды», который представлен для включения в ГФ XII издания.