Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ НОВЫХ ИСТОЧНИКОВ ПИЩЕВЫХ ВЕЩЕСТВ

з вт

на правах рукописи

Чернышева Ольга Николаевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ НОВЫХ ИСТОЧНИКОВ ПИЩЕВЫХ ВЕЩЕСТВ

14.00.07.-гигиена

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории по изучению новых источников пищевых веществ ГУ научно-исследовательского института питания Российской академии медицинских наук

Научные руководители;

Доктор медишшских наук, профессор,

академик РАМН Тутельян Виктор Александрович

Доктор химических наук Элл ер Константин Исаакович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН Ракитскнй Валерий Николаевич

Доктор биологических наук,

профессор Малышев» Алла Георгиевна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия им, И.М.Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится «28» декабря 2006 года в_ часов на

заседании Диссертационного Совета Д.001,009.01 при ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН по адресу: Москва, ул. Погодинская, д, !0Д 5, строение },

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН (119992, Москва, ул. Погодинская , д.10/15, строение 1)

Автореферат разослан У/_ 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук,

профессор

Беляева Наталия Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

В настоящее время одной из глобальных задач является решение проблемы увеличения продовольственных ресурсов, актуальной не только дня развивающихся, но и для развитых стран, включая Россию.

В долгосрочной стратегии по обеспечению продовольственной безопасности Российской Федерации приоритетное место занимает устойчивое развитие сельского хозяйства и других отраслей агропромышленного комплекса, что нашло отражение в «Концепции государственной политики в области здорового питания населения Российской Федерации на период до 2005 г» принятой Постановлением Правительства Российской Федерации от 10 августа 1998 г, № 917.

Центральная роль в покрытии мирового дефицита пиши отводится интенсификации сельскохозяйственного производства путем совершенствования методов селекции и внедрения новых технологий. Для создания высокопродуктивных и сбалансированных агросистем, обеспечивающих значительное повышение урожайности сельскохозяйственных культур и продуктивности животных требуются качественно новые подходы. Одним из перспективных решений этой задачи является использование биотехнологий и поиск новых нетрадиционных источников пищи.

Современная биотехнология позволяет во многих отраслях промышленности заменить традиционные методы получения пищевых продуктов биотехнологическими процессам, такими как выращивание дрожжей и бактерий с целью получения аминокислот, витаминов, ферментов и белка одноклеточных (Тутельян В,А., 2003; Шевелуха B.C., 2003; Ладур Т.А, 2003). Выход на новый уровень эффективности с/х производства путем коммерциализации достижений биотехнологии позволяет улучшить качество продовольствия, обеспечить нужный темп прироста урожайности при минимальном ущербе окружающей среде (Уланова Р.В., 2003; Мелик-Саркисов С.О., 2005).

Общая площадь возделывания биотехнологических с/х культур в мире постоянно увеличивается, что приносит заметные социальные и экономические преимущества для потребителей и общества в целом, обеспечивает более устойчивое развитие окружающей среды и улучшение здоровья граждан (James С., 2005). В настоящее время более 900 линий ГМ растений, относящихся более чем к 50 видам, созданы и доведены до испытаний в полевых условиях (Chripeels M.J., 2002; James С., 2005), при этом более 100 линий ГМ растений допущено к промышленному производству (FDA, USA, 2005). В Российской Федерации 15 линий ГМ культур разрешены для использования в питании.

Значительный материал, накопленный, как отечественными, так и зарубежными исследователями, подтверждает перспективность методов микробиологического синтеза в решении задачи увеличения общих белковых ресурсов за счет производства белка одноклеточных на нетрадиционных субстратах: углеводороды нефти и продукты их переработки, этиловый и метиловый спирты, природный газ и др., путем выращивания на них различных видов дрожжей и бактерий, что способствует созданию кормовой базы для развития традиционного животноводства Щи-рпremití Л Л ■ ffiTJNnii ilTji I' 1 ГГ~ 1984; ЭрнстЛ.К., 1988; Суясов H.A., 2003). I PIAW^a

! имени К.А Тимирязева

i имени !vа "

ЦН6 имени Н.И.Железиова

Задача обогащения рациона человека может быть решена также путем дальнейшего рационального и эффективного освоения разнообразных биологических ресурсов Мирового океана (Майструк П.Н. и др., 1984).

Медицинские аспекты проблемы изыскания и использования новых пищевых ресурсов связаны как с оценкой их пищевой и кормовой ценности, так и с гарантиями безопасности нетрадиционных источников лиши (Покровский В.И., 2002), В связи с этим, наряду с использованием общепринятых химических, токсикологических и других гигиенических исследований, большое внимание уделяется оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или из нетрадиционных источников.

Потенциальная опасность при создании новых видов кормового белка микробиологического происхождения, заключается в возможности накопления в составе биомасс компонентов субстрата, в частности, необычных (бактериальных) жирных кислот и ароматических углеводородов нефти (Алимова Г.А., 1980; Балахонцева В.Н., 1984). Жирные кислоты бактериальных биомасс, полученных на основе микробных продуцентов, отличаются постоянством структуры и не метаболизируют в организме человека. Ароматические углеводороды являются приоритетными загрязнителями, как в списке всемирной организации здравоохранения (WHO, 1998), так и в Российской Федерации (ГН 1.1.725-98). Глобальное загрязнение водных акваторий и суши химическими поллютантами приводит к накоплению в объектах окружающей среды и биосредах, в том числе гидробионтах, техногенных загрязнителей (токсичные элементы, пестициды, ароматические углеводороды) (Осаачая Т.С., 1995; Малышева А.Г., 2003 г.; РакитскиЙ В.Н., 2003, 2004). Систематическое потребление контаминированных продуктов ослабляет защитные возможности организма, снижая антитоксическую функцию печени, почек, легких, кожи, провоцируя образование канцерогенов и кока к церо генов в организме (Онищенко Г.Г., 2003; РакитскиЙ В.Н., 2005).

Создание новых видов рекомбинаитных генов, ранее отсутствовавших в природе, бесконтрольное применение генно-инженерных технологий при создании новой пищи, может привести к выходу на рынок пищевой продукции, представляющей опасность для здоровья человека, что обуславливает необходимость оценки безопасности и разработки методов контроля за данной продукцией, в том числе, и при случайном или преднамеренном выпуске в окружающую среду новых видов генно-инженерно-модифицированных растений. (WHO, 2002; Тутельян ВТ;., 2003; Шевелуха B.C., 2003).

При гигиенической оценке реальных последствий воздействия нетрадиционных источников пищи на здоровье человека принципиально важен поиск и обоснование гигиенически значимых показателей этой оценки. Развитие современных гигиенических проблем не может быть полным без научно-методического и критериального обеспечения медико-биологического мониторинга с учетом установленных приоритетных загрязнителей и маркерных веществ в объектах среды и организме, формирования интегральных оценок, основанных на показателях риска поступления вредных веществ в организм человека в условиях комплексной техногенной нагрузки. В связи с этим, особую актуальность приобретает разработка и совершенствование методических подходов к контролю за новыми технологическими процессами производства и к оценке качества вновь вовлекаемых в сферу использования человеком новых биологических объектов и веществ для минимизации неблагоприятного воздействия на здоровье человека.

Цель исследования

Целью исследования явилась разработка методических подходов к оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или не являющейся традиционным источником пиши.

Задачи исследования:

1.Определить основные гигиенически значимые показатели безопасности пищевой продукции, полученной с использованием новых технологий или не являющейся традиционным источником пиши.

2.Разрзботать метод идентификации и количественного определения ароматических углеводородов в биологических объектах. Изучить характер аккумулирования остаточных нефтяных углеводородов в тканях лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма дрожжи, выращенные на нефтяном субстрате, а также в тканях гидробионтов.

3. Разработать метод идентификации специфических (бактериальных) жирных кислот в биологических объектах. Изучить характер аккумулирования специфических (бактериальных) жирных кислот в тканях лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма бактериальные биомассы,

4. Разработать методические подходы к гигиенической оценке пищевой продукции из ген но-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения. Изучить возможность использования в качестве маркеров генетической модификации регуляторные последовательности, целевые гены и трансформационные события. Изучить возможность использования разработанных методических подходов для определения ГМО растительного происхождения в пищевой продукции, имеющей генно-инженерно-модифицированные аналоги (в т.ч., со сложным ингредиентным составом, подвергнутой глубокой технологической обработке).

Научная новизна работы

Разработан метод количественного определения углеводородов в биологических объектах с помощью хромато-масс-спектрометрин и УФ-сп ектрофотом етри и.

Впервые с использованием разработанного метода изучен групповой, гомологический и индивидуальный состав ароматических углеводородов дрожжей, выращенных на нефтяном субстрате.

Впервые проведен детальный анализ углеводородного состава тканей лабораторных и с/х животных, получавших дрожжи «паприн» в составе корма.

Показано, что использование в качестве кормовой добавки «паприна» приводит к аккумулированию в жировой ткани Н печени животных ароматических углеводородов, характерных для нефтяного субстрата дрожжей.

Установлена идентичность группового и гомологического состава фракции ароматических углеводородов гидробионтов и нефтепродуктов, загрязняющих акватории.

Разработан метод определения состава жирных кислот в микроорганизмах.

Впервые с использованием разработанного метода изучен состав фракции жирных кислот бактериальных биомасс.

Впервые проведен детальный анализ жирнокислотиого состава тканей лабораторных и с/х животных, получавших в составе корма бактериальные биомассы.

Показано, что использование в качестве кормовой добавки бактериатьных биомасс приводит к аккумулированию в жировой ткани и печени животных специфических (бактериальных) жирных кислот.

Стандартизованы и унифицированы методы индикации, идентификации и количественного определения ре комби нантной ДНК в продовольственном сырье и в пищевых продуктах (в т.ч. многокомпонентных и подвергнутых глубокой термической или технологической обработке), основанные на использовании метода подимеразной цепной реакции (ПЦР) и позволяющие выполнять контроль за пищевой продукции, произведенной из сырья растительного происхождения, имеющего ГМ аналоги.

Для мониторинга за ГМО растительного происхождения в продовольственном сырье и пищевой продукции применен метод идентификации рекомОинантной ДНК с использованием праймеров на регуляторные последовательности, маркерные и целевые гены, трансформационные события.

Унифицированы и стандартизованы методы идентификации трансформационных событий, прошедших регистрацию в РФ, в пищевых продуктах, произведенных из ГМО растительного происхождения, позволяющие осуществлять пострегистрационный контроль.

Практическая значимость работы

В практику здравоохранения внедрены высокочувствительные инструментальные методы анализа пищевых продуктов (Авторское свидетельство № 1337764, 06.08.1984 г. Способ количественного определения углеводородов в биологических объектах; Авторское свидетельство №232606, 03.02.1986г. Способ определения состава жирных кислот в микроорганизмах; Методические указания по выделению, идентификации и количественному определению насыщенных и moho-, би- и три-, ряда полицикл и чес к их ароматических углеводородов в пищевых продуктах № 4721-88 МЗ СССР; ГОСТ Р 52173-2003 «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения»; Методические указания МУК 4,2.1902-04 «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции»; Методические указания МУК.4.2.1913-04 «Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания»).

На кафедре гигиены питания и токсикологии Медико-профилактического факультета послевузовского профессионального образования Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова диссертантом проведена подготовка специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека из всех регионов Российской Федерации и административных округов г. Москвы по теме «Генетически модифицированные источники пиши (ГМИ); методы лабораторного контроля».

Основные положения, выносимые на защиту

Разработан метод количественного определения насыщенных, moho-, би-, три-и ряда поли циклических ароматических углеводородов в пищевых продуктам позволяющий определять групповой, гомологический и индивидуальный состав ароматических углеводородов, являющихся приоритетными загрязнителями, как в списке Всемирной организации здравоохранения (WHO, 1998), так и в Российской Федерации (ГН 1.1.725-98). Показана зависимость степени аккумулирования ароматических углеводородов в тканях лабораторных животных от количества дрожжевого белка в составе рациона.

Разработан метод определения состава жирных кислот в микроорганизмах, позволяющий идентифицировать специфические жирные кислоты, характерные для бактериальных биомасс в биоматериале. Показано, что при включении в раиион биомассы «гаприн», в жировой ткани и печени лабораторных животных происходит достоверное накопление изомеров гексадеценовой кислоты (¿10, All) в отличие от контроля.

Использование унифицированных и стандартизованных методов индикации, идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения в продовольственном сырье и в пищевых продуктах сложного ингредиентного состава (в том числе, подвергнутых глубокой термической или технологической обработке), основанных на детекции рекомбинантной ДНК с использованием метода ПЦР, позволяет выполнять контроль за пищевой продукцией, произведенной из ГМО растительного происхождения.

Апробация работы

Материалы и основные положения доложены и обсуждены на Научной конференции «Теоретические и практические аспекты изучения питания человека» (Москва, 1980); «Окружающая среда и здоровье населения» (Таллинн, 1984); на IV Всесоюзной конференции по масс-спектрометрии (Сумы, 1986); на V Всесоюзной конференции по методам получения и анализа химических реактивов (Юрмала, 1987); на Всесоюзной научной конференции «Совершенствование ветсанитарной экспертизы продуктов животноводства и повышение уровня гигиены производства в перерабатывающей промышленности АПК» (Москва, 1988); на I Всесоюзной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 1989); на Всесоюзном симпозиуме «Белковые продукты микробиологического синтеза: анализ качества, медико-биологическая оценка и эффективность применения в сельском хозяйстве» (Москва, 1989); на Симпозиуме «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса» (Москва, 2003); на 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, списка цитируемой литературы. Указатель литературы содержит 103 отечественных и 103 зарубежный источника. Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста, включает 62 таблицы, 43 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования явились: новые виды кормового белка микробиологического происхождения (дрожжи «паприн», род Candida, выращенные на жидкой парафиновой фракции нефти, биомасса «гаприн», штамм продуцента Methylococcus capsulatum ВСБ 874, выращенная на природном газе, бактериальная биомасса «меприн», штамм продуцента Methylobacills-methylophilus ВСБ-792, выращенная на синтетическом метаноле), продукты животноводства и рыбоводства, полученные с использованием новых видов кормового белка, мидии из черноморской акватории, продовольственное сырье и пищевые продукты, произведенные с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги.

Выделение углеводородов и жирных кислот из биоматериала осуществляли путем мягкого щелочного гидролиза с последующей экстракцией и фракционированием. Анализ фракций ароматических углеводородов осуществляли с использованием хроматографических методов исследования: хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), колоночная хроматография (КХ), газо-жидкостная хроматография (ГЖХ), газо-хромато-масс-спектрометрия (ГЖХ-МС), УФ-спектрофотометрия, спектрофлюориметрия, Для анализа смесей жирных кислот использовали ГЖХ и ГЖХ-МС - анализ метиловых эфиров жирных кислот и их производных.

Выделение ДНК осуществляли методом, включающим инкубацию пробы в присутствии детергента (гексадеци лтри м етил-ам м о н и и бромид), экстракцию хлороформом и осаждение ДНК изопропанолом, Для идентификации рекомбинантной ДНК применен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий получить многочисленные копии искомой ДНК в циклическом ферментативном процессе (амплификация). Визуализацию результатов амплификации осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле.

ГЖХ- анализ углеводородов и метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) проводили на хроматографах с пламенно-ионизационным детектором: «Биохром-1» с капиллярной кварцевой кат он кой 30м х 0,25мм с SPB-5 (полибишианопропил силоксан); «Цвет-106» со стеклянной карбонизированной колонкой 50м х 0,25мм с ДЭГС (диэтиленгликольсукцинатом) в качестве жидкой неподвижной фазы.

УФ-спектры растворов ароматических углеводородов получены на двухлучевом сканирующем спектрофотометре «Hitachi-124». Спектры поглощения в спектрально чистом гсксане записывали в области 360-210 нм.

Спектры возбуждения и эмиссии растворов аренов получали на сканирующем сп ектрофлу ори метре «Pcrkin-Elmer MRF-44A»,

ГЖХ-МС- анализ проводили на хромато-масс-спектрометре «Finnigan 3200 F» с автоматической системой обработки данных с капиллярной кварцевой колонкой 47м х 0,3 мм с химически связанной жидкой фазой для разделение углеводородов - SE-52 (диметилфенилсилоксан с 5% фенильных групп), для МЭЖК - SE-30 (ди м ети лпол и с ил океан).

ПЦР анализ осуществляли на амплификаторе «¡Cycler™» фирмы «Bio-Rad» (США) и «АНК-16» ИАнП РАН (Россия), температурный диапазон 4-100 °С,

скорость нагрева/охлаждения активного элемента 3,3/2 °С/сек, температурная однородность ± 0,3 ЬС, нагреваемая крышка.

При проведении скринингового анализа рекомбинантной ДНК для визуализации продуктов амплификации в агарозном геле использовали комплект оборудования для горизонтального электрофореза типа «Mini - Sub Celt GT System» фирмы «Bio-Rad» (США) и гель - документирующая система LabWorks фирмы Ultra-Violet Products Ltd, США.

Метрологическую оценку методов и полученных результатов проводили по ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Значимость расхождения результатов оценивали по критериям Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка методов анализа ароматических углеводородов

Источником контаминзиии ароматическими углеводородами пищевых продуктов может быть загрязнение водных акваторий нефтепродуктами, приводящее к накоплению экзогенных ароматических углеводородов в гидробнонтах, а также остаточные количества этих углеводородов в биомассах дрожжей, выращенных на нефтяных субстратах (Градова H.S., 1971). Это определяет комплекс специфических задач, решаемых при токсихшого-ги гиен ичес кой оценке этик новых кормовых средств и нетрадиционных пищевых продуктов, в частности, необходимость определять содержание и состав остаточных углеводородов в биомассе дрожжей, уровень возможного накопления этих соединений в тканях животных и пищевых продуктах, полученных с использованием биомассы дрожжей.

Преимуществом разработанной схемы анализа ароматических углеводородов, особенно для дрожжей, является возможность извлечения внутриклеточных углеводородов н их концентрирование с помощь КХ и ТСХ.

Нами выполнена серия опытов по сравнению хроматограф« ческой подвижности и спектральных свойств различных углеводородов (алканы, гептадецилбензол, тетралин, нафталин, феиантрен, бенз(а)пирен и др.), как основных маркеров соответствующих фракций нефтяных углеводородов и основных компонентов неомыляемой фракции липидов тканей животных, на окиси алюминия и силикагеле. В опыте на модельной смеси соединений (фенантрен, бенз(а)пирен, бенз(а)антрацен, бенз(д)хризен) установлено, что поли циклические ароматические углеводороды (ПАУ) селективно выделяются из смесей с другими соединениями переэкстракцией из неполярных растворителей такими комплексообразоватедями, как ацетон итри л, днметилсульфоксид, диметилформамид. При этом, при использовании д им етил формам идз, степень извлечения этих ПАУ составляет соответственно 88, 92, 95, 95%. Эффективность введения этой стадии подтверждается существенным уменьшением содержания в экстракте мешающих примесей природных пол и ненасыщенных углеводородов из матрикса продукта.

j На основании полученных данных была выбрана многостадийная схема (рис. 1 ) выделения исследуемых групп углеводородов, позволяющая получить достаточно однородные по составу фракции углеводородов: насыщенные, моно-, бн- и три циклические ароматические углеводороды.

Рис 1. Схема выделения из биоматериала и анализа насыщенных, moho-, би- и три циклических ароматических углеводородов и бею(а)пнрена.

Идентификацию исследуемых групп аренов проводили по характеристическим полосам в их УФ-спектрах: моноциклические арены 267-270 нм, бицикл и чес кие арены 275 — 280 нм, три циклические арены - 255 им и 290 ни. Количественное определение этих групп углеводородов осуществляли методом абсолютной калибровки по внешнему стандарту. Стандартами при построении градуироаочных графиков зависимости оптической плотности растворов аренов от их концентрации явились фракции ароматических углеводородов, выделенные из образца дизельного дистиллята нефти.

Достоверную идентификацию компонентов фракций ароматических углеводородов проводили с помощью ПЖХ-МС (х ром ато граммы по полному ионному току, компьютерная реконструкция ГЖХ-МС хроматограмм по пикам молекулярных (М*) и специфических осколочных ионов). Определена структура компонентов гомологических серий углевшюродов с формулой (С „ Н г„.Д где р = 6^-20.

При определений методом ГЖХ-МС абсолютного количества насыщенных и moho-, би-, три- и ряда пол и циклических ароматических углеводородов в пишевых продуктах использовали внутренний стандарт. В качестве внутренних стандартов для фракций moho-, би- и три циклических аренов использовали соответственно гептадеци л бензол, диметил нафталин и феиантрен. По полным ионным токам, 10

соответствующим внутренним стандартам (ПИТ1МСТ) и каждой группе углеводородов (;. )£ '"к ПИТ | С„ Н ;„.р) с учетом коэффициента ионизации (5) и массы внутреннего стандарта (§ „) рассчитывали массу углеводородов каждой группы.

По разработанной схеме были изучены образцы сала свиней, рационы которых содержали 7,5% (ло массе рациона) дрожжей, выращенных на нефтяном субстрате.

Таблица I. Результаты анализа фракции ароматических углеводородов сала свиней методом ГЖХ'МС и УФ-спектрофотометрии (мг/кг массы образца)_

Определяемые группы Образец I Образец 2

ХМС УФ ХМС УФ

Моноциклические арены | 2,7 ±0,8 2,2 ± 1,0 5,6 ± 1,7 6,2 ± 1,3

Би цикли чес кие арены 0,14 ±0,06 0,16 ±0,06 0,50 ±0,08 0,53 ± 0,06

Три циклические арены 0,04 ± 0,02 0,07 ± 0,03 0,09 ±0,04 0,12 ±0,04

п = 3,Р» 0,95.

Определение суммарного количества ароматических углеводородов в указанных фракциях с помощью ГЖХ-МС и УФ-спектрофотометрических методов показало хорошую сходимость полученных результатов (табл. 1), что свидетельствует о надежности использования экспрессного УФ-слектрофотометрического метода определения следов аренов в биологическом материале. Пределы обнаружения moho-, би- и три циклических аренов дизельных дистиллятов нефти в биоматериале составляют соответственно 3,9; 0,60; 0,10 мг/кг при относительном стандартном отклонении не более 0,20%. Для бенз(а)пирена предел обнаружения - 0,10 мкг/кг с учетом контрольного сигнала «холостого» опыта и его стандартного отклонения при относительном стандартном отклонении не более 0,28%.

Использование высокоселективной капиллярной ГЖХ и УФ-спектрофотометрии, а также ГЖХ-МС, позволило определять следовые количества нефтяных ароматических углеводородов в присутствии природных компонентов липидов.

Изучение содержания ароматических углеводородов в новых видах

кормового белка, выращенного на нефтяном субстрате, и продуктах животноводства и рыбоводства, полученных с использованием дрожжей

«папрнн»

На примере новых видов кормового белка, полученного с использованием микробиологического синтеза: дрожжи, выращенные на дизельной фракции нефти и дрожжи, выращенные на очищенных парафинах нефти «паприн», изучен групповой состав ароматических углеводородов по разработанной схеме.

Анализ показал, что состав остаточных углеводородов дрожжей, выращенных на дизельной фракции нефти, практически совпадает с составом нефтяного субстрата и в значительной степени (около 10% от суммы углеводородов) представлен ароматическими углеводородами, в том числе moho-, би- и трициклическими аренами. Большую часть ароматической фракции остаточных углеводородов биомассы дрожжей, выращенных на очищенных парафинах нефти

м

«паприн», составляют высокомолекулярные алкилбензолы, относительно высока доля нафталинов, и в то же время значительно снижена доля нафтеноароматических соединений (табл. 2).

Таблица 2. Групповой состав ароматических углеводородов, выделенных из биомассы дрожжей, выращенных на дизельной фракции нефти, из биомассы дрожжей «паприн», из дизельной фракции нефти (% от суммы ароматических

Группа углеводородов Обьект исследования

«паприн» Дрожжи, выращенные на дизельной фракции нефти Дизельная фракция нефти

Светлоярский з-д Новопо-лоикий э-д

Алкилбензолы 42,0 58.3 27,0 21,0

Инданы (тетралины) 9.0 5,8 13,0 16,0

Д и нафте нбензо л ы 4.0 0,9 6,5 10,0

Нафталины 19,0 22.5 13,6 13,0

Аценафтены 2,0 6.4 8,1 10,0

Флуорены 4.2 1.8 5,9 9.0

Фенантрены 6.0 1.8 7,7 5,0

Нафтснофен антре н ы 0.1 0.1 1,4 1,5

Бензтиофены 9,0 1.6 10,6 10.4

Дибензтиофены 4,7 0,9 6.2 4.1

Анализ фракции ароматических углеводородов образцов «паприна», произведенного на различных заводах: Киришский БХЗ, Котовский ОПЗ БВК, Башкирский БХЗ, Кременчугский з-д БВК, Новополоцкий з-д БВК, — Светлоярский з-д БВК, Мозырский ЗКД показал, что состав остаточных ароматических углеводородов «паприна» очень вариабелен и зависит, прежде всего, от состава исходного сырья (табл. 3).

Таблица 3. Гомологический состав ароматических углеводородов образцов «паприна» (% от суммы ароматических углеводородов)._

Группа углеводородов Число атомов углерода в боковой цепи молекулы

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Алкилбензолы* 0,511.2 0,5 -10.3 0,0527.8 5,731.9 9,822,5 6,636.2 2,423.8 1,028.4 1,08,9 0,152,9

Ал кил инданы (тетралины)** 29,6* 28,0* 3,9 -7,7 7,810,8 10,519,6 9,519,9 3,520,2 3,412,5 8,8" -

А л ки л нафтал и н ы* 2,0 -4.6 7,0 -17.5 17,361,5 14,4 -29,7 4,820.2 2,014.8 0,814,2 0,36,3 0,2* -

Фенантрены*** ■ - 10,316.0 30,345.0 24,230.7 8,119,7 2,08.5 2,7* 2,4" 1,2"

Бенэтиофены * 28.6 12,1 3,7 - - - - - - -

Дибензтиофены" 33,7 34.6 7.8 1.6 0,1 - - - - -

*п=5 ; **п=2; ***п=3, п 1 =1 - число образцов «паприна».

Влияние кормового белка, полученного С использованием микробиологического синтеза, на углеводородный состав тканей лабораторных и е/х животных, изучено на примере крыс и свиней, получавших в течение 18 месяцев изо калорийные сбалансированные рационы: контрольные группы -традиционный общевиварный, опытные - с включением кормового белка «паприн». Показано, что в жировой ткани и печени опытных животных аккумулируются ароматические углеводороды в количестве от 0,10 мкг/кг (би- и три циклические арены) до 7 >20 мг/кг (алкилбензолы).

ГЖХ-МС анализ узких углеводородных фракций, выделенных из свиного сала показал, что в их состав входят характерные для нефти, отличающиеся наличием большого количества изомеров, ароматические соединения: алкилбензолы, метил-, д и метил-, триметилалкилбензолы, в т, ч, со специфической изопренондной структурой, с числом атомов углерода 12 - 24 и максимумом распределения в области Cíe - С21; нафтеноароматнческие углеводороды, относящиеся к группам нндана и тетралина Сц- С22 и максимумом в области С<4- Си; ал кил нафталины с 11-24 атомами углерода и алкилбенэтиофены (С5Н8 - С23Нл); фенаитрен н его ближайшие гомологи (Си~ С(!).

Хроматогрзммы, приведенные на рис.2, иллюстрируют изменения в составе ароматических и насыщенных углеводородов, выделенных из сала свиней, получавших традиционные корма н дрожжи, выращенные на нефтяном субстрате, с высоким содержанием н-алканов и небольшой примесью изо- И циклоалкаиов.

Рис, 2. Хромато грамма фракций адканов и имклоалкаиов из сала свинеП, получавших: дрожжи «палрин» (А); дрожжи, выращенные на нефтяных дистиллятах (Е); традиционные корма {.В).

Хроматограф «Биохром -1», стеклянный капилляр 30м х 0,23мм, БРВ-З, Т испарителя =300°С, Т детеки^Зт;, Т колонки: 120"С-2мин„ 87мнн до 290"С, газ-носитель-азот 1,4 мл/мин,, сброс 1;Э0

Анализ группового состава ароматических углеводородов сала свиней, получавших в составе корма дрожжи «паприн», показал, что в сале, как в нефтяном дистилляте и дрожжах, выращенных на этом субстрэте, имеет место выраженное преобладание ал кил бензол о в по сравнению с долей бн- и три циклических аренов (табл. 4).

Таблица 4. Групповой состав ароматических углеводородов С„ Н;п.0 от суммы).

Исследуемый образец Р (С» Н?п.„ )

6 8 10 12 14 16 18 10 16

Свиное сало 80,4± 0.4 6,0± 1,3 7,5± 0,9 5,7± 1,7 0,7± 0,5 0,2± 0,0 0,4± 0,2 1,9± _L0_ 0,2± 0,1

п=2, р=0,95

При исследовании тушек прудовой рыбы (карпа), выращенной с использованием кормов, включающих различные Продукты микробиологического синтеза, найдено, что содержание ароматических углеводородов в сумме углеводородов не превышает 10%, из них более 90% приходится на долю моноциклических аренов. Однако, включение в корма рыб достаточно высоких доз «лаприна»: ю% и более (по массе), может привести к накоплению а тканях рыб остаточных углеводородов дрожжей, в концентрации более чем на порядок превышающей природный углеводородный фон. Выходом их этой ситуации является использование в кормах сочетания различных продуктов микробиологического синтеза: углеводородных и гидролизных дрожжей. При этом уровень остаточных нефтяных углеводородов в рыбе соответствует практическому отсутствию в ней следов ароматических углеводородов (1-Змг/кг).

Изучение содержания ароматических углеводородов в тканях гидробвонтов

Проведены исследования углеводородного состава черноморских мидий, собранных в акватории, хронически загрязненной нефтью. Анализ фракции ароматических углеводородов показал, что моноциклические арены представлены преимущественно ал кил бензолами, основными компонентами б к циклических аренов являются нафталин и его гомологи, среди три циклических преобладают гомологи фенантрсна. Полученные данные свидетельствуют о сходстве группового состава фракции ароматических углеводородов из мидий и основного загрязнителя морской средь! — моторного топлива (табл. 1). Содержание ароматических углеводородов в изученных опытных образцах мидий составило 87,б±10,1 мг/кг. При анализе контрольных образцов мидий из зон, ие загрязненных нефтепродуктами, ароматические соединения не были обнаружены. Содержанке углеводородов в контрольных образцах мидий составило 6,6 мг/кг, что соответствовало природному фону. В основном это были н-алханы, .максимальный компонент - изопреноидный ал кап пристан (2,6,10,14 - тетрам ети л пентааекан ).

Полученные результаты исследований подтверждают возможность использования разработанной схемы анализа ароматических углеводородов для оценки уровня нефтяного загрязнения морепродуктов с целью исключения возможности попадания в пищу человека этих токсичных контам ян актов. Широкое географическое распространение и большая доля биомассы в прибрежных экосистемах, высокие уровни концентрирования ими углеводородов делают эти организмы удобными для мониторинга загрязнения объектов окружающей среды углеводородами из техногенных источников нефтяного загрязнения. (Grimer G., 1979; Farrington I.W., 19&0).

Обнаружение ароматических углеводородов в сале свиней, рыбе и морепродуктах подтверждает правильность выбора этих гигиенически значимых показателей для оиеики безопасности новых источников пищевых веществ с целью

индикация и идентификации остаточных углеводородов нефти в пищевых Продуктах, имеющих тенденцию накапливаться в органах и тканях, богатых лкпнлами (жировая ткань, печень). Поэтому^ важно с одной стороны не долу ехать загрязнение сырья для производства продуктов питания, что обеспечивается системой мониторинга за состоянием окружающей среды, а с другой стороны — осуществлять тщательный гигиенический контроль за производством готовой продукции (Рахмании Ю.А., 2003; Габоа Д.Н., 2004).

Предложенная схема анализа позволяет определять групповой, гомологический и индивидуальный состав таких широко распространенных в окружающей среде ксенобиотиков, как ароматические углеводороды, в пищевых продуктах. Многие ароматические углеводороды, в частности бенз(а)пирен, могут обладать канцерогенными свойствами, что обуславливает необходимость контролировать их присутствие в пищевой продукции и окружающей среде и объясняет установленные низкие предельно допустимые концентрации (ПДК) этих соединений в пищевых продуктах, в воде, в воздухе. Так в России гигиенические нормы для бенз(а)пиреиа: в воздухе рабочей зоны - 0,15 мкг/м \ в атмосферном воздухе населенных пунктов 0,1 мкг/100 м в питьевой воде - t нг/л; в почве - 20 мкг/кг; в пищевых продуктах - 1 мкг/кг (ГШ. 1.725-98; ГН2.1.5.1315-03; ГШ Л .7.2 041.06; СанПиН2.3.2.1078-01). Разработанный метод позволяет идентифицировать бенз(а)пирен в сложных смесях природных липмдов на уровне 0,10 мкг/кг.

разработка метода анализа специфических (бактериальных) жирных кислот

Исследования последних лет показали перспективность применения биомасс микробиологического синтеза в качестве кормового белка (Мелкк-Саркпсов С.О., 2005), однако химический состав этих продуктов нужно рассматривать не только с позиции наличия в них полезных факторов питания, но и с позиции возможного присутствия компонентов, способных оказывать неблагоприятное влияние на здоровье человека через пищевые цепи. Отличительной особенностью химического состава бактериальных биомасс является наличие специфических для бактериальных клеток жирных кислот, содержащих в углеродной цепи разветвления, оксигруппу, циклопропаиовое кольцо, а также позиционные изомеры с необычным положением двойной связи. Известно, что некоторые из этих кислот мосуг оказывать отрицательное влияние на организм животных н человека, в частности кислоты с ц и клоп ро Пановым кольцом подавляют репродуктивную функцию крыс (Гальченко В.Ф., 1986),

Ферментная система высших животных и человека обладает недостаточным арсеналом для метаболизма таких веществ (Сорокина Е.Ю., 1987).

Структурные особенности бактериальной клетки, прежде всего, наличие сложных комплексов полисахаридов и белков, кеэкстрагируемых липидов клеточных стенок, обуславливают особые требования к методам выделения специфических жирных кислот. Проведена серия опытов, показавшая, что мягкий щелочной гидролиз биоматериала позволяет в одну стадию получить сумму бактериальных жирных кислот, при этом проведение реакции в токе азота и предварительная очистка реактивов от перекисей предотвращает окисление непредельных соединений.

Ряс. 3 Схема выделения и анализа жирных кислот

Анализ производных жирных кислот методом ГЖХ (рис. 3), позволяет идентифицировать специфические (бактериальные) жирные кислоты при сравнении хроматограмм исходных образцов метиловых эфнров жирных кислот (МЭЖК) и их химических модификаций; гидрированных, бронированных, трим ети ленд ильных производных.

Для расширения возможностей идентификации с применением ГЖХ-МС анализа были исследованы ие только метиловые эфиры, ко их пиррол идиды. Установлены основные направления фрагментации молекул производных кислот под воздействием электронного удара и определены ключевые фрагменты в масс-спектрах метиловых эфиров и пирролидидов специфических (бактериальных) жирных кислот. ГЖХ-МС анализ исходной смеси метиловых эф и ров по специфическим ионам позволяет идентифицировать насыщенные кислоты с прямой и с разветвленной цепью, оксикислоты, непредельные моноеновые и диеновые, циклопропановые кислоты. Исследование гидрированной в мягких условиях (катализатор Рс1/С, комнатная температура) смеси метиловых эфиров жирных кислот, при которых избирательно восстанавливаются двойные связи, а циклоп ропано вое кольцо остается незатронутым, дает возможность дифференцировать непредельные кислоты и кислоты с циклопропаиовым кольцом. Для выявления оксикислот проведена компьютерная реконструкция хроматограмм исходной и гидрированной смесей МЭЖК, а также пирролидидов ЖК. Так как в спектрах МЭ оксикислот практически отсутствуют пики молекулярных ионов, весьма ценную информацию дает рассмотрение масс-спектров пирролидидов этих кислот, обладающих гораздо большей стабильностью молекулярных конов.

Анализ фракций жирных кислот, выделенных из бактериальных биомасс, показал, что ЖК 15:0 и 17:0 с насыщенной цепью представлены триадами ЖК-нормального, изо- и антеизостроения. В группе оксикислот также обнаружены два ненасыщенных соединения: С|в.| (х-окси кислота и 19-цикло пропан а-оксикислота. Дифференцированы моноеновые кислоты С]«:! и Си т, а также циклопропановые кислоты С]? и С|9. В группе гексааеценовых кислот определены два позиционных изомера С^ , Д9 и С^л Д11. Вакценовая кислота Сцл представлена одним изомером с двойной связью у 11 атома углерода.

Таким образом, по фрагментации производных ЖК проведена идентификация ЖК, выделенных из биомассы бактерий, выращенных на метаноле и природном газе.

В сложной смеси фракции жирных кислот, выделенной из биомассы, выращенной на природном газе, «гаприн», с помошью ГЖХ-МС-анализа пирролидидов были идентифицированы 4 позиционных изомера гексадеценовой кислоты (49,44%) и 3 позиционных изомера октадеиеиовой кислоты (15,26%), группа насыщенных оксикислот, характерных для бактерий (2,8%). Кроме того, идентифицированы кислоты с шноюпропановым кольцом - цис-циклопропан 9,10 гексадекановая (Си) и цис-циклопропан 11,12 октадекановая (С|9) кислоты, установлено положение шпею пропан ового кольца, идентифицированы предельные кислоты с разветвленным строением углеродной цепи: изо- и антеизо-изомеры кислот С^ и Си. Основным компонентом смеси бактериальных жирных кислот «гаприна» является пальмитиновая кислота 16:0 (42,98%).

При изучении фракции жирных кислот, выделенной из биомассы, выращенной на синтетическом метаноле, «меприн», идентифицированы жирные кислоты 5-ти основных групп, характерных для бактерий: изо- и антеизокисдоты с нечетным числом атомов углерода (Си и Си), циклопропановые кислоты Сп и С№ среди моноеновых кислот - характерные для бактерий пальмитвакценовая (16:1) и вакценовая (18:1) ЖК с положением двойной связи у 11 атома углерода (56,9%). Широко представлены оксикислоты (10,32%) с числом углеродных атомов 14,16,18,19, причем насыщенные соединения (14:0, 16:0, 18:0) имеют по два позиционных изомера; а- и Р-окс и кислоты. Выявлены также окси производные вакценовой кислоты (а) и И,12-циклопропаноктадекановой кислоты (а). Окси-кислота с 18-тью атомами углерода является в то же время непредельной, о чем свидетельствует изменение времени выхода пика, соответствующего этому соединению, после гидрирования. Основным компонентом смеси бактериальных жирных кислот «гаприна» является пальмитиновая кислота 16:0 (42,98%).

Комбинация методов ГЖХ и ГЖХ-МС позволила определить соотношение компонентов в смеси ЖК изученных бактериальных биомасс (табл. 5),

Был также изучен состав фракции жирных кислот тканей крыс, получавших в составе корма бактериальную биомассу «гаприн». Эксперимент выполнен на крысах-самцах линии Вистар с начальной массой 50-70г, получавших изокалорийные рационы в течение 6 месяцев, при этом опытная группа получала рацион с добавлением биомассы «гаприн» (50 % от квоты белка рациона), в рацион контрольной группы вводили соответствующее количество гидролизата пивных дрожжей.

Таблица 5. Содержание необычных бактериальных жирных кислот «гаприна» и «мепрнна» (% от суммы кислот),__

Кислота Содержание, % к сумме кислот

«гаприн» «меприн»

Окси кислоты 2,44 10,32

Кислоты с циклопропановым кольцом 0,87 5,55

Разветвленные кислоты 0,70 0.79

Изомеры кислот с необычным положением двойной связи 15,24 60,32

Сумма необычных бактериальных жирных кислот 19,25 76,86

Установлено отсутствие в исследованных тканях крыс опытной группы кислот с циклопропановым кольцом и оксигруппой. В то же время в этих тканях наблюдалось увеличение содержания по сравнению с контролем главных компонентов жирных кислот «гаприна» пальмитиновой и гексадеценовой кислот (табл. 6).

Таблица 6. Состав и содержание жирных кислот С161 биомассы «гаприн» и тканей крыс контрольной и опытной групп._

Образец Содержание кислот Состав фракции жирных кислот С^ч,

С|б.| (% от суммы С161 ЖК)

(% от суммы ЖК) Д 7 Д 9 д to Д 11

«гаприн» 49,4 2 68 27 3

Жировая ткань крыс

- контроль 1,6 38 62 не обн. не обн.

- опыт 4,8 10 50 34 6

Печень крыс

- контроль 0,5 30 70 не обн. не обн.

- опыт 3,3 15 42 36 6

Так, в жировой ткани суммарное содержание кислот С к, составляло в опыте 20,5%, а в контроле — 15,8% от суммы ЖК. Кроме того, в жировой ткани и печени крыс опытной группы отмечено изменение по сравнению с контролем состава изомеров положения двойной связи гексадеценовой кислоты; в тканях крыс контрольной группы кислота С|<ц представлена двумя изомерами - Д 7 и Д 9, в опытной группе - 4 изомера - Д 7, Д 9, Д 10, Д 11. Аналогичный состав изомеров имеет жирная кислота С|& [ в «гапрнне», при этом, изомеры с двойной связью в положении Д 10 и А 11 характерны для бактериальных биомасс.

При введении в рацион «гаприна» в количестве 15-20% от квоты белка, характерные для бактериатьной биомассы изомеры А 10 и Д11 гексадеценовой кислоты, окси кислоты и кислоты с циклопропановым кольцом в тканях животных опытной группы не были обнаружены.

Таким образом, предложенный метод анализа жирных кислот позволяет идентифицировать специфические (бактериальные) жирные кислоты, характерные для использованной в составе корма биомассы, в жировой ткани и печени лабораторных и с/х животных. На основании полученных данных при проведении

эксперимента на о/к животных квота замены белка рациона на бактериальную биомассу была снижена до 20%, что позволило избежать аккумулирования бактериальных жирных км слог в пяшевой продукции.

При оценке безопасности пищевой продукции, полученной с использованием бактериальных биомасс необходимо контролировать содержание таких гигиенически значимых показателей безопасности, как специфические (бактериальные) жирные кислоты, необычные для человека, чтобы исключить их попадание в пищевые цепи.

Разработка методических подходов к гигиенической очен к*е пищевой продукции из ген н о-ннженерио-моднфн цн ровянны х организмов (ГМО)

Пишевая продукция, произведенная из ГМО, подлежит оценке на безопасность до выхода на рынок, регистрации и, в большинстве стран мирового сообщества, пострегистраиионному контролю, в том числе в России.

Для осуществления контроля за пищевой продукцией, имеющей геино-инженерно-модифниированные аналоги, были разработаны, апробированы и унифицированы методы идентификации ГМО растительного происхождения, основанные на определении рекомбинантной ДНК. Для определения генетически модифицированных источников пищи в качестве мишени может быть использована вся рекомбинантная ДНК (регуляторные последовательности, смысловой н маркерные гены).

При создании ГМО растительного происхождения наиболее часто используют промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и терминатор NOS, полученный из гена попал и н - синтозы A gro bacterium tmnefaciens - почвенной бактерии (98% мирового производства ГМО), Использование данных регуляториых последовательностей в качестве маркеров генетической модификации дает возможность проведения широких скрининговых исследований с целью выявления пищевой продукции, произведенной из ГМО. Для индикации линий или сортов ГМО растительного происхождения, не прошедших систему регистрации и, следовательно, не разрешенных для использования в пищевой промышленности и реализации населению в России, необходима идентификация конкретных трансформационных событий. Проведение данного анализа предполагает амплификацию последовательности ДНК в области, включающей ДНК встроенной генетической конструкции и генома растения.

Первый этап анализа включает выделение ДНК из пищевых продуктов методом «СТАВ», основанном на стандартном протоколе, включающем инкубацию пробы в присутствии детергента (гексадецилтркметил-аммоний бромид), экстракцию хлороформом и осаждение ДНК изопропанопом (рис, 4).

В качестве стандарта ГМО и негативного контроля использовали материалы Института эталонных материалов и измерений, произведенные совместно с Объединенным научным центром Европейской Комиссии. Амплификацию проводили на амплификаторе My Cycler ™ фирмы «BIO-RAD» (США). Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агароэы при напряженности электрического паля 6 В/см. Визуализацию результатов осуществляли с применением видеосистемы и компьютерной программы Lab Works фирмы Ultra-Violet Products Ltd, США.

Рис. 4. Схема идентификации и анализа рекомбинантной ДНК

В ходе исследований проведено изучение возможности использования различных по структуре прайме ров на промотор 35 S и терминатор NOS. Наибольшая чувствительность, специфичность и воспроизводимость метода была показана при использовании прайм еров, дающих продукты амплификации на уровне 195 п.н. (промотор) и 180 п.н. (терминатор) (рис.5).

Е^ультаты электрофореза

Ш-Мт

5 п.н.

; ■■ .v* ■ "J

)Т ÇV 0

ISO п.н.

I - исследуемая проба;

2- стандартный образец состаай генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения;

3 - маркер молекулярной массы 100 п.н;

4 • стандартный образец состава генетически

модифицированного нсточнн хз пнщн растительного пооискожаенмя.

Рис. 5. Пример представления данных электрофореза по результатам идентификации рекомбинантной ДИК методом полимеразной цепной реакции.

Апробированы методы идентификации всех генно-инженерно-моднфтшрованных организмов растительного происхождения, разрешенных для реализации населению в Российской Федерации.

Осуществлен анализ наличия ГМО растительного происхождения в 2300 образцах продовольственного сырья (соя, кукуруза, рис, сахарная свекла, картофель), пищевых продуктов (колбасные и кондитерские изделия, маточные продукты, продукты для детского питания, крахмалы, лецитины) и пищевых

добавок импортного и отечественного производства. В состав продуктов входили ингредиенты, произведенные из сырья растительного происхождения, имеющего ген но-инженерно-модифицированные аналоги; соя, кукуруза, картофель, рис, папайя, цикорий, томаты, кабачки, лен, сахарная свекла,

Таблица 7. Результаты качественного анализа пищевых продуктов, произведенных из/или с использованием растительного сырья, имеющего генетически модифицированные аналоги._

Наименование продукции Количество образцов ГМО

Не обнаружено Обнаружено

Соевые продукты 1050 825 225

Колбасы 300 210 90

Молочные продукты 50 40 10

Детское питание 470 468 2

Комплексные пищевые добавки 215 185 30

Лецитин соевый 75 65 10

ЕАД к пише 140 127 13

Итого 2300 1920 380

Рекомбинантная ДНК обнаружена в 380 образцах (19% от общего числа проанализированных продуктов), являющихся продуктами переработки соевых бобов или содержащих их в качестве компонентов (табл. 7).

Все образцы пищевой продукции, в которых скрининговыми методами обнаружена рекомбинантная ДНК, были подвергнуты дальнейшему анализу на наличие генетической конструкции. В 98% продукции, содержащей ГМО сою, идентифицирована рекомбинантная ДНК, характерная для генетически модифицированной сои, трансформационное событие 40-3-2, устойчивой к глифосату, фирмы «Монсатно», США., Рекомбинантная ДНК, характерная для генетически модифицированной сои, трансформационное событие А5547-127, устойчивой к глюфосинату аммония, фирмы «БайерКропСаснс», Германия, обнаружена в 2% продуктов. Обе линии сои разрешены для использования в пищевой промышленности в Российской Федерации.

Количественный анализ показал, что в ¡0% образцах пищевой продукции, имеющей декларацию об отсутствии ГМО, содержится рекомбинантная ДНК в количестве от 0,1 до 0,5%.

Разработанная схема исследований позволяет:

- контролировать всю пищевую продукцию, имеющую генно-инженерно-модифицированные аналоги растительного происхождения, представленные на мировом продовольственном рынке на сегодняшний день;

• исключить возможность попадания на продовольственный ранок Российской Федерации ГМО, не прошедших Государственную регистрацию в установленном порядке, безопасность которых не доказана;

- осуществлять контроль за маркировкой пищевой продукции, произведенной из ГМО, которая в Российской Федерации является обязательной в соответствии с ФЗ от 21,12.2004 г №171 «О защите прав потребителей».

выводы

1. Впервые определены гигиенически значимые показатели безопасности и разработаны методы их обнаружения, идентификации и количественного определения в пищевой продукции, полученной с помощью биотехнологии -продуктах микробиологического синтеза и генно-инженерно-модифицированных организмах (ГМО) растительного происхождения,

2. Разработан метод обнаружения, идентификации и количественного определения ароматических углеводородов в дрожжах, выращенных на нефтяном субстрате, основанный на хромато-масс-спектрометрии и УФ-спектрофотометрии (предел обнаружения для moho-, би-, три циклических арснов и Ge нз(а)п ирена, соответственно 3,9; 0,60; 0,1; 0,0001 мг/кг).

Показано, что использование в качестве кормовой добавки дрожжей, выращенных на очищенных парафинах нефти («паприн»), приводит к аккумулированию в тканях лабораторных и с/х животных ароматических углеводородов в количестве от 0,10 мкг/кг (би- и три-, пол и циклические арены) до 7,20 мг/кг (ал кил бензолы).

Количественное определение ароматических углеводородов, в частности бенз(а)пирепа, рекомендуется для осуществления гигиенического контроля за безопасностью пищевой продукции, полученной с использованием в качестве кормовых добавок биомасс, выращенных на нефтяном субстрате.

3. Показано, что ароматические углеводороды в пределах от 77,40 до 97,70 мг/кг обнаруживаются в гидробнонтах (мидии), выращенных в акваториях, загрязненных нефтепродуктами, что служит обоснованием необходимости гигиенического контроля за их содержанием в морепродуктах.

4. Разработан газо-жидкостный и хромато-масс-спектрометрический методы индикации и идентификации специфических жирных кислот (содержащих оке и группу, циклопропановое кольцо, позиционные изомеры с необычным положением двойной связи или разветвлением) в бактериальных биомассах («меприн», «гаприн»).

Показано, что использование бактериальных биомасс в качестве кормовых добавок приводит к аккумулированию в тканях лабораторных животных специфических (бактериазьных) жирных кислоты (изомеры гексадеценовой кислоты Д 10 и Л 11) в количестве до 3% от суммы жирных кислот.

Определение специфических (бактериальных) жирных кислот рекомендуется для использования при гигиеническом контроле за безопасностью пищевой продукции, полученной с использованием бактериальных биомасс.

5. Оптимизированы методы индикации и идентификации ГМО растительного происхождения в продовольственном сырье и пищевых продуктах, в т.ч. многокомпонентных и подвергнутых глубокой термической или технологической обработке, основанные на полимеразной цепной реакции с использованием прайм еров на регул яторные последовательности (промотор и терминатор), смысловой и маркерные гены (чувствительность менее 0,1%), Методы стандартизованы в виде ГОСТ Р 52173-2003 и МУК 4.2,1902-2004 для качественного анализа ГМО в пищевых продуктах.

6, Унифицированы методы количественного определения рекомбинантной ДНК в пищевых продуктах, основанные па полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени (чувствительность 0,01 %) и позволяющие осуществлять контроль за маркировкой пищевой продукции, произведенной из ГМО растительного происхождения (МУК 4,2,1913-2004).

7. С использованием разработанных методов осуществлен анализ наличия ГМО растительного происхождения в 2300 образцах продовольственного сырья (соя, кукуруза, картофель, рис, папайя, цикорий, томаты, кабачки, лен, сахарная свекла) н пищевых продуктов (колбасные изделия, продукты детского питания, кондитерские изделия, крахмалы, лецитины). Наличие ГМО растительного происхождения, зарегистрированных в установленном порядке в РФ, выявлено в 380 образцах, в т.ч. в 10% образцов продукции, декларированной как не содержащей ГМО, обнаружена рекомбинантная ДНК в количестве 0,1 - 0,5%,

Внедрен не результатов в практику:

1. «Способ определения состава жирных кислот в микроорганизмах»- Авторское свидетельство №232606 от 03.02.1986 г. /Ушакова Т.М, Воробьева Л,Ш, Чернышева О.Н., Федотова Н.Ю, Медведев Ф.Л,

2. «Способ количественного определения углеводородов в биологических объектах»,- Авторское свидетельство .Ns 1337764 er 15,09.1987 г,/УшаковаТ,М„ Воробьева Л.Ш., Чернышева О.Н.

3. «Методические указания по выделению, идентификации и количественному определению насыщенных и моно, - би-, три-, ряда полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах» (МУ №4721-88). М.: МЗ СССР, 1988. / Тутельян В.А., Аксюк H.H., Ушакова Т.М., Воробьева Л.Ш„ Чернышева О.Н., Ляпков Б.Г., Медведев Ф.А.

4. «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения». ГОСТ Р 52173-03.- М.: Госстандарт России, 2003/Тутельян В.А.,Сорокина Е.Ю, Чернышева О.Н., Скрябин К.Г., Дорохов Д.Б., Кузнецов Б.Б., Асадова Ю.Е.

5. «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции» (Методические указания, 4,2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Пищевые продукты и пищевые добавки. МУК.4.2.1902-04). М.: Минздрав России, 2004,45с, /Тутельян В,А„ Сорокина Е.Ю., Чернышева О.И., Анисимова О.В., Петухов А.И., Беляев E.H., Брагина И,В., Воронцова Т.В., Потапова Т.Н., Аадеенко Т.Ф., Терехова С.Ю., Зароченисв М.В., Филатов H.H., Пискарева И.И., Сазова И.Я., Сизых Е.В., Суханов Б.П., Скрябин К.Г., Дорохов Д.Б., Кузнецов Б.Б., Асадова Ю.Е., Рогов И.А., Кроха Н.Г., Вашхов А.Ф.

6. «Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания» (Методические указания. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. МУК.4.2.1913-04). М,: Минздрав России, 2004, 31с. / Тутельян В.А., Сорокина Е.Ю,, Чернышева О.II., Левицкая А.Б., Шипулин Г.А., Яцышина С.Б., Петухов А.И., Беляев E.H., Брагина И.В., Воронцова Т.В., Потапова Т.Н., Авдеснко Т.Ф„ Терехова С.Ю., Зарочснцев М.В., Скрябин К.Г., Дорохов Д.Б., Кузнецов Б.Б,

Список работ, опубликованных по теме диссертации

в научных журналах;

1. Ушакова Т.М., Эллер К.И., Воробьева Л.Ш., Федотова НЮ., Чернышева О.Н. Углеводороды некоторых пищевых продуктов животного и растительного происхождения, // Вопросы питания, - 1979.- Кг 5,- С. 61-62,

2. Медведев Ф.Л, Воробьева Л.Ш., Ушакова Т.М., Чернышева О.Н. Хромато-масс-спектромстрическое определение следовых количеств углеводородов в биологических объектах. // Журнал аналитической химии.-1991.- Т.46, вып. 9. - C.I828 -1837,

3. Медведев Ф.А., Чернышева О.Н., Воробьева Л.Ш., Ушакова Т.М. Изучение жирнокислотного состава бактериальных биомасс с помощью хромато-масс-спектрометрии. // Журнал аналитической химии. - 1991.- Т.46, вып. 9. -С. 1862-1869.

4. Воробьева Л.Ш., Зеленцова Е.И., Чернышева О.Н. Определение бенз(а)пирена в кофе и кофейных суррогатах, // Вопросы питания. -1993. -№5.-С. 61-63.

5. Медведев Ф.А„ Воробьева Л.Ш., Чернышева О.Н. Хромато-масс-спектрометрический анализ нефтяных загрязнений воды и гидробионтов, // Журнал аналитической химии.-199б. - Т.51, № II.-С. 1181- 1185.

6. Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н. Современные методы идентификации ГМИ в пищевых продуктах.//Пищевая промышленность. -2003.-№б,- C.2Ö-21.

7. Чернышева О.Н., Сорокина Е.Ю., Аиисимова О.В., Филатов H.H. Идентификация ГМИ в пищевых продуктах: результаты мониторинга. //Пищевая промышленность. - 2003,- №6,- С.22-23.

8. Тутельян В.А„ Филатов H.H., Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н,, Салова НЛ., Сизых Е.В., Анисимова О.В. Мониторинг оборота пищевой продукции из генетически модифицированных источников в Москве,// Вопросы питания. -2003. - Т. 72, № 3.- С.20-23.

9. Чернышева О.Н., Сорокина Е.Ю., Аиисимова О.В. Идентификация трансгенной ДНК в пищевых продуктах: результаты мониторинга. // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2003. - № 5. - С. 100.

в материалах научных конференций:

10. Чернышева О.Н., Ушакова Т.М,, Воробьева Л.Ш., Звягина О.П. Жирнокислотный состав тканей лабораторных животных, в рационах которых использовался «гаприн». // Материалы Всесоюзного симпозиума «Белковые продукты микробиологического синтеза: анализ качества, медико-биологическая оценка и эффективность применения в сельском хозяйстве» -Москва, 12-16декабря 1989.-Москва-С.62-63.

11. Ушакова Т.М., Воробьева Л.Ш., Федотова Н.Ю., Чернышева О.Н, Метод определения алифатических и ароматических углеводородов в продуктах питания. // Материалы научной конференции «Теоретические и практические аспекты изучения питания человека».- Москва,- 1980. — С. 45.

12. Ушакова Т.М., Воробьева Л.Ш., Чернышева О.Н., Медведев Ф.А., Аксюк H.H. Характеристика жирнокислотного состава нетрадиционных кормовых средств и получаемых с их применением продуктов животноводства.//Материалы Всесоюзной научной конференции «Совершенствование ветсан и тарной экспертизы продуктов животноводства и повышение уровня гигиены производства в перерабатывающей промышленности АПК»,- Москва,- 1988. - С.93-94.

13. Ушакова Т.М., Чернышева О.Н., Воробьева Л.Ш. Влияние применения микробного жира, как компонента корма на углеводородный и жирнокислотный состав продуктов животноводстваУ/Материалы Всесоюзной научно-практической конференции «Производство и использование кормового белка, состояние и перспективы. - Томск.-! 989. - С.67-69.

14. Воробьева Л.Ш., Медведев Ф.А., Ушакова Т.М., Чернышева О.Н.н др Разработка унифицированных методов анализа углеводородов нефти н пол и циклических ароматических углеводородов в морских организмах // Морская санитарная гидробиология,/ Под. ред. Миронова О, Г. Севастополь,- 1995, - С. 49-58.

15. Чернышева О.Н., Сорокина Е.Ю., Лнисимова О.В. Количественное определение генетически модифицированных организмов в продуктах переработки кукурузы. // Материалы VII Всероссийского конгресса «Оптимальное питание — здоровье нации», - 26-28 октября 2005, - Москва. -С.279.