Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Совершенствование методов идентификации CAMPYLOBACTER FETUS путем определения молекулярных характеристик ДНК и выделение фагов

всЕСоктй ордзйа шсш 1тъю-:;сапьузл7Ш£:ъ:П шгспптт

• ЭКСПЕРТШНГАЛКЮЯ ВЕТ2РЫ1АРШ1 илени Я.Р. К03АЛЕНК0

ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА JISBEA И 0PJ3HA ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАЖК ШДЕ.ШИ СЕЛЬСКОХОЗЯЗСГГЗ'-неых: НАГА имени В.Л. ЛЗК5НА

На правах рукописи ГАРТ СУДЕЙ РЛЯЕДАН

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДДЕНТИФИКАЩШ . . САМРШЗВАСТЕВ FETUS ПУЛИ ОПРЕДЕЛИЛИ М0ЛЕКУ1ЯРБЩ ХАРАКТЕРИСТИК ДНК И ВЦДЕПЕШВ ФАГОВ

16.СХЗ.ОЗ - ветеринарная микробиология,вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1991

у' уvr A.s

• Рай ora выполнена в лаборатория эпизоотологии, диагностики и профилактики патологии воспроизводства животных и в лаборатории монокулярной биологии и биохимии Всесопзного ордена Ленина научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко.

- дакгор ветеринарных наук, профессор Лучко U.A.

- кандидат биологических наук, стагпнЯ научный сотрудник

- доктор ветеринарных наук.профессор __ Голиков A.B. (ВИЭВ)

- кандидат биологических наук Jfaоешсо А.М (ведущий научный сотрудник института

шкробиолотаи А-.НСССР) "" Московская ветеринарная щпцуинг кивав К.И.Сярябина (UBA)

Запита состоится " ' 1991 г. в И'СО часов

на заседании специализированного Совета К.020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук при Всесоюзной ордена Левина научно-иссладоватальском кн-ституте аконеримвитальной ветеринарии имени Я.Р,Коваленко (109472, Москва, Кувшинки, ВИЭВ).

С диссертацией и окно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан " (о " ¿b^fafö 1Э91 р.

Еаучпаё руководители

Офщиалышэ ошоиааты

Ведущее учреждение

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат ветеринарных наук

f.Г. Терешкоа

I. ОНЦЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛБОТЫ

-| Актуальность теш. Кашилобактерии уяе !.шого лет признаны i':" лак важные этиологические агенты при патологии воспроизводства овец, крупного рогатого скота и некоторые из них вызывают заболевание у ЧЗЛ0В8КЭ. Типовой ВИД рода - Campylobacter fetus - разделяется на два подвида : - с. fetus subspecies venerealia - вызывает бесплодие и аборт у круглого рогатого . скота и - с. fetus subspecies fetus - возбудитель аборта у овец, спорадического аборта у крупного рогатого скота и инфекции у ослабленных лодей ( Smibert , 1984).'

На территории СССР и в других странах, часто выделяются кампилобактерлоподобяыа' микроорганизмы, вмзициэ характеристики нэ ТШЮТШ13 для того ели иного вида кемпалобактерий. В таких случаях Т1удно поставить диагноз, так как идентифицировать возбудителя на удается.

Дифференциация кашилобактерий осложнена и тем, что эти микроорганизмы не расщепляют углевода и являются инертны:.® к общим традиционным биохимическим гестам, принятым для идентификации бактерий. В результате имеется сравнительно мйлое ко- ' личество гестов для идентификации и классификация яампнлобак-терий. Следовательно, классификация кампплобактериЗ на осиов'э только лишь нескольких бяохшлячесхях и культуральных тестов не позволяет точно дифференцировать вида и подвиды бактерий этого рода.

Особые трудности имэются при дифференциации двух подвидов Campylobacter fetus , так как до сегодняшнего для предложен только один лабораторный тест, который применяется для их различия. Это - определение чувствительности микроорганизмов К аминокислоте - ГЛЛЦИНу. с. fetus ssp. venerealis

является чувствительный к глицину, а с. fetus esp. fetua растет б штатальньсс средах в присутствие эго. Однако имеется сообщение о той, что кашилобахтарии иогут развивать толерантность к глицину чарез трансдукцио или мутации ( Cheng, Ogg , 1971). Этот факт осложняет задачу дифференциации яаышыобаета-рий еда болыза.

В добавление к атому.ряд иссяздсгателей (А.Н. Труоищшй, . 19*73; K.ÏÏ. Крвнков, 1982; C.B. Фрадкша, 198Э) наблюдали, что результаты серологетеской дифференциации двух подвидов биофаб-ричнши сыворотками не всегда соответствуют результатам культу-рально-биохимичаскоё иг типизации.

Из вышеуказанного следует, что для болев точной и полной идентификации и типизации с. fetus культуралъно-биогишческие и сарологнчаские характеристики не достаточны: необходимо изыскивать новые подхода. • <

Учитывая вшаизложеннов, иы поставили парад собой задачу выяснить возможность пргианения геносистеыатичвских иссладова- . нжЗ л $агсв о цальо идентификации ж типизации с. fetus .

Даль и задачи исследований. Цедыэ настоящей работн являлось усовершенствование методов идентификации с. fetus путем ощю-делшшя молакулярньш характеристик ЛЕК с. fetus я ввдалевиа фагов. Для достигался накаченной цели да разрвшенхе были ностав-*лены следующие задачи :

1) изучить- культурахьно-баохвмтчасхиа в серологические свойства кашдлобактерай, выделенных от овец и крутого рогатого скота ;

2) отработать катод выдел aima ДНК из изолятов с. fetus и 'определить - - нухлеотидный состав ; •

3) изучить степень подобия нуклеогидных последовательностей ДНК у микроорганизмов исследуемой группы ;

4) определить возможность идентификации с. fetus с помощью молекулярных характеристик ДНК ;

5) выделить (Jam с. fetus.

Научная новизна, Впервые у значительной группы с. fetus, изолированных на территории СССР от здоровых и больных овец и крупного рогатого скота, определен н;уклеотпдный состав и уровень гомолигиу? нуклеотиднш: последовательностей и ДНК. Показано ах значение для идентификации микроорганизмов исследуемой группы наряду с градационными методами. На основании молекулярных характеристик ДЕК установлена высокая степень генетического РОДСТВа бактерий С. fetus subspecies fetus и С. fetus subspecies venerealis

Установлено наличие ударен¡шх фагов у обоях подвидов С, fetus

Практическая ценность работа. Показана цзлесообраэностъ исследования молекулярных характеристик ДЖ дал идентификации изолятов с, fetus . Данные по нуклеотадноыу составу, и опрэ- , делении степени гомологии нуклеотидных последовательностей ЛЕЯ могут быть использованы при дифференциации кагяшлобактериопр-добяых микроорганизмов от с. fetus наряду с традиционными методами идентификация.

По результатам проведенных исследований разработаны : "Методические рекомендации но исследования молекулярных характеристик ДНК с целью идентификации Campylobacter fetus ", одобренные Ученым Советом B5I3B (протокол № 6 от 19 марта19Э1), в которые вошш отработанные на!.®, применительно к микроорганизмам вида с. fetus , методы выделения Доопределения

нуклеотиднзго состава и степени гомологии нуклеотишых последовательностей ДШС.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуас-дены на конференции ыолодах учееныг (Москва, ВИЭВ, 1990), на Международном конгресса по вирусологии (Берлин, ФРГ, 1990), на засадацкв Ученого Совета ВИЭВ (Москва, 1991) и на межлаборагор-ном совещании ВИЭВ (Москва, 1991).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликована I работа и I работа сдана в печать.

Объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах машиношеного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и ыагода, результаты собственных исследований, обоуж- ■ дениэ результатов, вывода, список литературы. Работа иллюстрирована I? таблицами и 7 рисунками. Список литературы содержит 196 источников, в том числе 129 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЙ 2,1. Материалы и метода

Работа выполнена в I988-I99I гг. в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики патологии воспроизводства сельскохозяйственных животных (зав.лаборатории профессор H.A. Лучко) и.в лаборатории ыолекудярной биологии и биохимии (зав. лаборатории академик ВАСШИ Г.<2. Коромыслов) Всесоюзного ордена Ленина научно-исследовательскиго института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко.

В работе бшго использовано 55 штаммов кампилобактеряй, вцдалешах наш от овец и крупного рогатого скота и полученные из других лабораторий, в том числе 3 шташа из Канады ( U.U. Гарсиа).

Для выделения С. fetua бактериологически исследовали 39 проб желчи клинически здоровых быков и коров и 67 проб желчи овец. С этой целью в условиях мясокомбината брали делч-ные пузыря убойных животных и исследовали их в лаборатории не позднее 3-5 часов после взятия.

Для выделения и культивирования кагашлобактерий использовали полужидкий (0,15,^) мясо-печэночяо-ггаптонный агар (ПЗЕА), плотный (2>%) шсо-псченочно-пептоиный агар (ШЛА), бульон Хотткнгэра к бульон Альбими.Во все питательные среды добавляли 10,^ алашопептида-2 или гидролизкна. .

Посла посева гадкую и плотную питательные среды инкубировали в микроаэрофильных условиях при 37°С, в течение 2-5 суток в вакуумном термостате, заполненном газовой смэсыо,состоящей из 85"^ азота, 10,t углекислого газа и 5% кислорода. Посевы на БЖА культивкровали при 37°С в течение 2-5 суток в обычном термостате, в эксикаторах или в вакуушом термостате, заполненном вышеуказанной газовой смесью.

Для изучения морфологических, культуралъных и биохимических свойств кампилобзктеряй бшш применены традиционные та- . тательные среда и бактериологические метода, описанные в литературе (U.A. Триленко, 1961; '.LA. Лучко, 3972; A.B. Голи-. ков, 1978 и др.).

Серологическую типизацию микроорганизмов проводили по реакции агглютинации (РА) с моноспецкфическими каглилобакте-риозныви сыворотками производства Витебской биофабршш.Антигены для серотишзацяя готовили по методике ВГНКП.

Препараты Xffffi штаммов были выцэлены ферментативным методом деградации клеточных стенок с последугэдей экстрактам?! нуклеиновых кислот из лизатов. Для этого за основу бил взят

метод Hnnnur (1961). Концентрацию, чистоту и нативность ДКК устанавливали на спектрофотометре ( Maniatis et al. , 1982).

Нуклеоткдный состав ДНК определяли спектрофотомэтрически по тепловой дэнатуращш, придерживаясь методики Кагпиг , Doty (IS62). Определенна гомологии нуклоотидных последовате- . льностей ДНК проводили с помощью реакции молекулярной ДНК-ДНК гибридизации на нейлоновых фшшграх. 3 качестве репернщ использовали радиоактивномеченыа [^к] dCîï препараты ДЕК двух штаммов с. fetus ssp. venerealia 543 и 1123 и одного иташа с. fetus ssp. fetus 557. Штамм 1123 является вакцинным штаммом ВИЭВ, а штаиш 543 и 557 были получены из Канады. Меченые препараты ДНК радиоактивным изотопом осуществляли согласно протоколу фарш Anarshem (Великобритания) "Nick translation ¡cit. ïor use with any labelled dUTP."

Для выделения фагов с. fetus использовали 35 штаммов С. fetus ssp. vanerealis и С. fetus ssp. fetus . С Ц&1ЬЮ изоляции умеренных_ фагов применяли следующие методы : -перекрестно-культуральныЯ по ?ireha»mer , Border (1968); -проверка фильтратов старых (7-суточннх) культур по Firehaa-mer , Border (1968)-; - выращивание смешанных культур по Bryner et al. (1970) и - воздействием ультрафиолетового излучения на культуры ( Chang , Ogg , 1970).

В добавление к этому были сделаны попытки по ввдалению литического фага из фильтратов фекалий крупного-рогатого скота.

Дюз определения присутствия и активности фага в суспензии и фильтратах, а также приготовления активного фага высокого титра использовали ■. плотные и жидкие питательные среды по методам, описанным И.П.Ревенко (1978) и Eisenstari (1967).

Математическую обработку результатов эксперимента проводили о шалощы) коммерческой программ на персональной кошгьо-торе.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Вндвланиэ каипилобактвриЗ. Морфологические, культуральннэ и Оиохииичэсииа свойства изолятов

В напих исследованиях бнт внцзланн 15 штаммов с. fetus aubsp. fetus из 39 проб желчи крупного рогатого скота (38,555) и 14 штаммов из 67 проб хвлчи овец (20,9,t). Эти данные свидетельствуют о высоком распространении, каышиобакте-рлз у клинеч8ски здоровых яевотннх.

При культивировании штампов кампилобактерий разного ' происхождения наблюдали хорошей рост на ША и более слабый -в бульоне Хоттингера и бульона Альбю/и. На МША в чашках Петри все культуры росли в микроаэрофильвых условиях, однако рост часто бнл скудным. Кая сши показал, что для успешного культивирования кашшлобактерий на вшэуказанннх питательных средах, требуется сравнительно большое количество засевного «атвриала (1:10 - 1:16 по объему).

В опыте по сохранении каотпшобакгерий в лабораторных условиях было устаяоатено, что лизнеспособность гяжроорганизма болев продслзштельна ва ESA в пробирках, закрытых резиновыми пробками (более 270 днэй) в сравнении с ватяо-лащевщв (15 дней). По-видимому, это могно объяснить уменьшением контакта микроорганизмов скпслородш воздуха,которкЗ является для них токсичным. Хранение чистех культур при 25°С ówio эффективнее, чей при 4°С.

При изучении корфолотш исследуекых кнкроорганизыоэ, в

окрашенных мазках наблюдали камяилобактерии, имеющие форму запятой, латинской буквы "S" ж летящей чайка, короткие и дошлые спириллы. В старых культурах наблвдали кокковадныз формы каыпилобактерлЯ.

Были изучены культурадьно биохимические свойства 55 штаммов различного происхождения, выделенные вами и полученные из коллекции культур лаборатории и других учреждений, в sou числе 33 шташЗ , выделенные из »алчи овец и крупного рогатого скотта, II из абортированных плодов овец и II из абортированных , плодов и половых органов крупного рогатого скота.

Все культуры, полученные из желчи животных, выделяли катала зу, росли на ЗКА о 1% глицина л о 10? желчи; при температуре 25°С и 37°С, ио на росли при добавлении 3,5? поваренной соли, а также при температура 42°С и в аэробных условиях. Из 33 штаммов 14 выделяли сероводород. Указанные характеристики свидетельствуют о том, что все эти культуры относятся к подвиду С. fetus osp. fetuB.

Из П культур, выделенных из абортированных плодов овец, 9 кагалазопадожителышх культур (кроме í¿—X и Н-3) также были отнесены к подвиду с. fetue ssp. fetus . Однако катадазона-'гатпвныа культуры M-I и И-3, выделенные из абортированных плодов овец остались не идентифицированными на основе культурадь-но-биохшичеркой характеристики.

' Из II культур, выделанных из абортированных плодов в половых органов крупного рогатого скота, на основе чувствительности культур к глицину и других характеристик, 3 штамма (5, ■ Ц23 и 543) были идентифицированы как С. fetua вар. venereal i я , тогда как 6 шташоя, как С. fetus asp. fetua " .

Однако следует отметить, что через некоторое время при дотталь-ныг пересевах штаммы 5, 1123 и 543 потеряли чувствительность к глицину и росли на ПЖА с добавлением 1% этой аминокислоты.Одна каталазонягативная культура "Дивное" была идентифицирована как с» «putorum ssp. tiubulue . Штама Ш-IO отличался от других шташов способностью расти в аэробных условиях и поэтому он отнесен к аэротолерантным кашилобактериоподобным микроорганизмам.

2.2.2. Серологическая характеристика культур кагяшюбактерий

Из 18 итамков кампилобактерий, получении* из желчи овец и идентифицированных по кульгуральяо-биохкыическиы свойствам как с. fetua es p. fetua , 17 шташов агглютинировались сывороткой с. fetua ssp. fetus (II-го серологического типа) и 1-моноспацифячбокой снвороткой с. fetus esp. venerealis (1-го серологического типа). Из 15 шташов С. fetus esp. fetus(по культурально-биохшичзским свойствам), изолированных из желчи крупного рогатого скота, 12 (80%) агглотшшровалнсь ионоспеюфической сывороткой с. fetua ssp, fetus , 1.(6,7%) штамм агглэткнаровалсл двумя сыворотками, то "есть, сывороткой С. fetus ssp. fetus И сывороткой С. fetus ssp. venerealla и два штамма (13,3.1) не агглютинировались типовыми моноспещ-фяческими сыворотками 1-го, П-го и Ш-го сероиота.

Из 9 птажов с. fetus ssp. fetus (по культуралъио-бпо-хт,отческим свойствам), изолированных из абортированных плодов овец, 7-агглютинировались сывороткой с. fetus вар. fetua . Два культуры (434, 2444) не агглютинировались сывороткаш I, П и Ш серотипа. Биохимически неиденяфщиронапныа культуры 1,1-1 и

.П)

!i-3, выделенные из абортированных плодов, овцы также на вступай в реакцию с моноспецЕфичвсктш сыворотками.

Из П стаимов, внделанных из абортированных плодов я по— . ловых органов крупного рогатого скота, 7 аггаютинаровааись ыаьоспшафгтеской сывороткой 1-го серотипа, однако 4 из них . (43, 1299, России, Казахстан)оказались толерантными к глицину и в результате были идентифицированы как с. rata« ssp.fetus по куяьгураяьяо-биохшяческиы свойствам. Результата серотипи-зации 6 штампов (5, П23, 543, Дивное, 515, 557) совпали с результатами биохимической типизации культур. Аэротолерантный кагяшлобактериоподобнлй микроорганизм КП-Ю не агглютинировался ни ■ одной из трех ионоспацифичесмах енворотох. -

Приведенные данные показали, что результаты серотипиза-цкя на всегда успеинн, так как в кашей работе 4 культуры

»1

с. fetus вор. fetus вз агглютинировались ни одной ыоноспеци-фичаской сывороткой и серотип аца 5 культур не соответствовал результатам иудьтуральяо-биохимичаской характеристики. .

Из полученных фактов схедуат, что необходима развивать к цртаянять другие современные подходы для более точной ндентж-. фшеают и дифференциации различных видов и подвидов кашпао-

>. I

бактерий. Это ваяно для изучения эпизоотического процесса юик шклобактериоза я диагностики, в тоы числе дифференциальной, с тек, чтобы применять эффективные иери борьбы с болезнью.

2.2.3. Схстеиатхка кампидобактерий на основе ыолекулярннх характеристик ДВЕ

2.2.3.1. Препаративное выделение и сравнительные ( • •' характеристики ДНК кшишлобактерий -

Еа первой этапа раб оты, накопление бактериальной кассы проводили на бульона Хоттингера в лнтроанх стеклянных код бах

яря инкубации в термостате-качалке при 37 °С в течэниз 3 суток. Однако опыт показал, что в этих условиях накопление достаточного количества бактериальной массы не происходит из-за слабого роста кашшлобахтерий в бульонных питательных средах.

В последупцац получение бактериально; массы проводили на ШЛА в натровых колбах при культивировании в мияроаэро^иль-ных условиях. В результате культивирования в течение 3 суток получали достаточное количество биомассы (3-10 г), что давало возможность выделить до 1,0-2,8 иг очищенного препарата ДЕК у всех 23 исследуемых изолягол.

Используя федаентативннй катод деградация клеточных стенок с последующей экстракцией нуклеиновых кислот из л^затов, были выделены в очизекы препараты ДНК исследуемых микроорганизмов. Среднее количество ДНК, полученное из I г влажной биомассы, составила 0,3 иг.

Оптические характеристики ДЕК, рассчитанные как соотно-пенио поглощений при заданных дайнах волн ультрафиолетового спектра, в среднем составляли для А 260/ А 230 - 2,0 и для Л 26G/A 280 - 1,9. Усредненная для представленной выборки . препаратов ДЕК величина гиперхроыного эффекта равнялась 25,25. Получанные данные по спектральный характеристикам свидетельствуют о том, что изученные образцы содержат натквяуп ДНК но контаминярованнув примесями белков, полисахаридов, РНК и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к внсокоочищенным препарата« ДНК.

Таким образом, выбранный катод выделения и очистки ДЕК глмпилобактерий позволил получить из качдого англизируемого ятаыма достаточное количество хорооо очедвнеоХ Еызокоцоликзр-hoÄ ДНК, пригодной для определения нуклеотддмого состава и

гомологии нуклеогвдных последовательностей.

2.2.3.2. Нуклеотидный состав ДНК кампилобактерий

Щ еодзркание ДНК 22 псследуекых штаммов кампилобактерий заключалось в интервале 28,1-37,1 хоя.% Щ со средним значе-ниэы 34,6+1,2 v.ai.Z ГЦ. Двадцать из двадцати двух шташов представляли собой более тоскую группировку с X® 35,2+0,Р. Нуклеотидный состав штаммов с, fetus asp. fetus изменялся в пределах 34,0-37,1 ноя.? Щ при 2 = 35,3+0,3; Щ С. fetus взр. venerealls - 32,5-37,1 мол.5» 1Ц,при 1= 35,1+0,6. Сравнение полученных средних по притерло Сгьвдзнта яе дало оснований с высокой вероятностью утверждать достоверность их различия.

У двух шташов : 484 (атипичный штамм) и "Дивное" ( с. oputorum eap.butuiua ) показатели 1Ц' содержания ДНК существенно отличались от остальных исследуемых микроорганизмов и со-ставшщ соответственно 23,1 и 30,0 мол.* Щ.

Содержание Щ ДНК штамма КП-ГО равнялось 60,2 мол.;?, что не позволяет отнести данный микроорганизм к роду Campylo-tacter .

Tai;iM образом, по результата'-! определения нуклеотидного состава ДИК исследуемых кампилобактерий можно заклшить, что по даянох.у показателю не наблюдалось достаточной разницы между прот.ставптелями С. fetus ssp. fetus и С. fetus esp. venereaiis. Следовательно, нуклеотидный состав нельзя считать достаточно надежным критерием при дифференциации этих' микроорганизмов. Но данный тест может быть весьш полезен при вдзнте-фикацаи атипичных и камшшобактериоподобных изолятов, имеющих нечеткие культуральяне, биохимические и серологические показатели.

2.2.3.3. Молекулярная ДНК-ДНК гибридизация

Ддя проведения реакции дЕС-ДКК гибридизации в качестве Р'э-перяых использовали радиоактивномечеяыэ [%]dcrr препараты ДНК штаммов С. fetus' ввр. fetua 557 2 С. fetus язр. venerealie 543 и 1123.

Анализ результатов ДНК-ДНК гибридизации с реперным препаратом ДНК штамма С. fetus subspecies fetus 557 показал плотную генетическую гомогенность исследуемо!! группы микроорганизмов. Уровень гомологии нуклоотидянх последовательностей ДПК -64,3-102,6,^. Высокая степень подобия с ДКК реперного шташа наблюдалась как у представителей с. fetus asp. fetus , так я среда с. fetua esp. yenerealis , причэы у 7 из 14 штатов микроорганизмов и TQro и другого подвида она превышала 841.

Что касается результатов ДНК-ДНК гибридизации с реперным препаратом 543, то в груЪпэ с. fetus ввр. venereaiis наблюдалась в целом высокая степень подобия нуклеогидных последова-г тельяостей «ШК - 54,7-98,5^5, за исюгочешам одного шташа. С представителями с. fetus asp. fetus у данного репера уровень гомологичносги ДЖ составил 38,9-101,Третий репернш» препарат - 1123, принадлежащий как и 543 к группе с. tetua asp. venerealie выявил у её представителей интервал степени охожасти нуклеотЕсдаыг последовательностей 60-100.1. В грушге с. fetus вер. fetua по результатам этой гибридизации был определен уровень подобия нуклеотвдюа последовательностей в пределах 44,6-100,0?.

Охватывая в целом данные трех реакций ДЕК-ДПК гибридизации можно делать вывод, что два подвида с. fetus имоот высокий процент степени схожести нухлеотиданх последоватй,гь-яостей (50-100,1), что указывает на тесные генетические

взаимоотношения. Ногао также сделать вывод, что высокая степень родства не позволяет дифференцировать представителей С. fetuc ssp. fetus и ' С. fetua виЪврво1вв Yeaerealie на основе ЛК-ДЖ гибридизации, по *:ра2неЯ мере, той е§ модификации, которая была выбрана наш.

Basare с тем ДЕ&-ДНК гибридизация позволила нам успешно дифференцировать от общей груша исследуемых микроорганизмов один штакл с. sputorun subspecies butuius (Дивное) л один атипичный штамп (434). Уровень гскологий их ЩК- с ДЩС остальных объектов был очень низок и составил соответственно 25,4% и 2i%. Этот факт указывает на то, что оба микроорганизма не ио-гут пргнадяеяать к виду с. fetus , что, однако, не исклггаает их пршадаагности к роду Canpyiobao-ter

2.2.4. 'Выделение фагов с. fetus

. * s

Доя выделения упаренных фатов бш использованы следующие методы :

- пвракресгно-кульгуральЕьп ;

- фзльтраотя старых культур ;

- выращивание смешанных культур ;

- воздействие ультрафиолетовый (УФ) излучением.

В опытах по выделении умеренных фагов было использованб 35 пггатков каюпиобактерий, вдавленных от овец и крупного рогатого скота.

Пердкрестно-кульгуральниа метод.' При перекрестном куль-tübbpobahiin г.яогеэ комбинации культур показали летичэскую активность. Зоны лизиса наблюдали вокруг капель культур, они былз: зшроние п прозрачные. Прозрачность зон лизиса была равно-!/ерло;! со всех сторон, причем роста колоний в зоне лизиса не

отмечали. В других случаях зоны лязкса были мелкие, прозрсч-ные и располагались внутри кагонг культуры.

Попытки изоляции фагов из зон лизиса били лзудэчлш.я.

'Суспензии материала, собранного из зоны лизгса, в бульоне из показали литичэскун активность при их проварка на галичиэ фага,

Ввдрданиа фага из йкльтратов старых культур. Фильтраты 8 бульонных сэмисуточных культур бклп проверены на наличие фага к 15 птаммам кампилобекгерий. Попытки выделить фаг по данной методике оказалась безрезультатными.

Выращивание смешанных культур с цельв выделения gara. Активность фага бкла обнаружена у многих комбинаций культур донора а хозяина. Количество бляшек, наблюдаемых в перкпчннх посевах варьировало от I до 49. Размер бляиек был небольшим и на превышал I мм в диаметре. Еняшкл были прозрачными, чащз с ровными краями, В некоторых случаях фаги были изолирована из бляшек -и их культивировали в бульонной культура штамма-хозяина- в течение 2-3 циклов для увеличения титра фага. Однако достичь значнт&льного увеличения титра фага не удал ось. Крот того большинство фагов повторно не культивировалось в бульон-нов культуре штамма-хозяина и не образовывало зон лазиса на твердой среде.

Воздействие УФ излучением, В работе использовали 15 кул-ь-тур. Бшш сделаны попытки индуцировать лизогек:ше культуры при различных соотноавниях времени облучения и расстояния от источника УФ лучей до культуры. Фильтраты 5 облучзнкых бульоч-ных культур показали литическов действие при ироззркз на наличие фага. Однако попытки концантраровать фаг не дали поло-аительного результата.

Вндэлэкио акггвного фага из фекалий. Четыре объединениих пробы йокаллп, полуденные от 10-12 голов крупного рогатого скота бита эдоэераяы на наличие gara к 15 штатам камшиобак-тзрлй. В рэз.ульт-чтэ установили, что фильтраты фекалий но оказывали лиггческого ^вИоте.чя на культуры, то есть ив обладают фаговой акглвностью. •

Из приведенных данных слсдуег, что пврекрзстно-кулъгураль-ныЛ метод, кетод выраищвания смешанных культур и УФ-излучение лрнгодны для обнаружения умеренных фагов в лизогенных культурах камгшлобзкгэркй. Однако не. были полностью преодолены трудности накопления фага и получения его активных частиц в высо-koíí тигре.

Как лззесгяо, дая конпегтрагонг фагов, необходимо иметь штая.л быстро разглнсгааадихся индикаторных бактерий чузствитель-klk к фагам, В нашей работе отмечено, что кампклобактерии слабо растут на различных пмтательныг: средах, используемых в настоящее время дая их культивирования. Хотя питательные среды, лспо.чьзозакнке нами являются достаточно хорошжи для ввдеяешш каглииобакгерпй л других бактериологических работ, • оказалось, что они недостаточно стандартные для работы с фагами, Второ2 Ee¡;o^THoí! причтяой нэудачных попыток концентрировать фаги в нашзГ: работа является отсутствие хороших чувствительных инда-iceropuiK пта:т.:ов немпипобаятврпй.

ВЫВОДЫ

1. Пхюводеянцг.и исследованиями подгвергкдена высокая степень гя-тоглобактэрионослтвльства у клинически здоровых убойнш: осец (2СД") и крупного рогятого скота (38,53).

2. Огрзнкчэпг.е контакта культур ка'япшобактерпй с

атмосферным кислородом при их хранении способствует болеэ длительному их сохранении. В ващих экспериментах, культуры в пробирка::, укупоренных резин авали пробками сохранялл дизнеспо-'собность на 1ШД и бульона Хаттингера более 270 суток С срок наблюдения) ; с ватао-карлавыми пробка!^ - 15 суток.

3. Кульгзры С. fetus ssp. venerealia (5, 543, 1123), црояадявшав чувствительность к 1,1 глицина, при нерзоевах на питательных средах а течение 3-12 месяцев утратили это свойство, Таким образом, подтверждена нестабильность данного признака, используемого для дифференциации вышеуказанного подвида от подвида С» fetua ssp. fetus.

4. При изучении антигенных свойств двух подвлдоз С. fetus установлено, что результаты кульгурально-биохимического газирования не всегда совпадают с результатами серологического. Имеются штаммы, которые не агглотиняруготся ни одной из двух моноспецифичэских сквороток (итаммы 3-1, В-2, 484, 2444) или. они реагируют о сывороткой, не соответствующей их культураль-но-<5иахшич80коау типу (птамгш 27 , 43. I2S9, Казахстан,Россия).

5. ферментативный метод деградации клеточных стенок камоидобактарий о последующей экстракцией нуклеиновых кислот из лязатоа, оптимизированный нами, пригоден .зля выделения ДНК из кзолятов с. fetus .

6. Содержание гуанина и цигозина (нуклзотидныЧ состав) ДЕК штаммов с. fetus , выделенных из абортировапних шюдов, половых органов, яелчи овец и крупного рогатого скота на территории СССР, находится в интервале 32,5-37,1 мол.;йЦ,причем у штаммов подвида с. fetus ssp. fetus в пределах - 34,0-37,1 мол.;"оГЦ и у подвида с, fetua вар. venerealls -

- 32,5-37,1 мол..ид.

7. По стопэнл подобия нуклэогидных последовательностей Ш.1, изучаз;.;ыэ птажы микроорганизмов двух подвидов С.fetus приставляет плотную генетическую группу с уровнем гомологии да 5Ü-IÚO,I. '

8. По иуклеот.чдаому составу и степени подобия нуклеотид-ных помздсБательностзй ДЗС не удается установить различия ме.чду изученными прецставитслл;® двух по.двпдов с. fetus. Нукдеотлдш,-" состав и степень подоЗия нуклеотиднщ: пэследова-гельностоС позволяют идентифицировать еновь выделенные изолягы, пркнадлежа'цие к виду с. fetus и дифференцировать их от атпшгчньн каглилобактерпЯ и от кашклобахтарлоподобных микроорганизмов.

9. Культуры с. fetus являются лизогеняыми, бактериальное клетки образовывают умеренный gar и выделяют его в окру-ааюьтуга среду.

1С. Д.ля обнаружения'умэреншг:: фагов у С,- fetus оказались эзйэктиентг.я следуздле методы : перекрестно-культураль-кш';, вырачиваяг'в смешанных культур и облучение культур 70-излученяам.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРЕИС2ЕНИЕ

По результатам проведенной работы разработаны "Методические рекомендация по исследованию молекулярных характеристик ДНК с целью идентификации Campylobacter fetua , ОДОб-PQüHun Ученым Советом В11ЭВ (ig гарта IS3I г., протокол 3 6 ).

ciEicok jnimiiiiBAma paeot

V

.1. Gerg S.H., luohio H.A. and Irenior I.P. Phages of

Campylobacter fetus // Vlllth International Congress of Virology. Berlin. ?.R.O.- 1990.- P. 443.

2. Tapr C.p. CoBapffiaacTBOHaHas usaToaos HseBrK$HKauOT Kawra-JiofiaiccaDzS, EcnojtB3yoMux b <tec$a<5icrcHo;i nponsBoiCTEg / tqa.iokj.hajn.kobi. "CobopaaHCTBoeahiia uaionoB rocyr^apcs-BeHHoro kohtpqm EaTepHHapHux nrenapatoB".- if.- 1991 (b na^aih).

nowmcaHO t.iron 2C.03.9Ir..3aaa»- 546

«opiat 60*90A® - Tupa* 120