Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Содержание гормональных стимуляторов роста в мясе и усовершенствование метода их определения

На правахрукописи

ОСТРОВСКАЯ АННА ВЛАДИМИРОВНА

СОДЕРЖАНИЕ ГОРМОНАЛЬНЫХ СТИМУЛЯТОРОВ РОСТА В МЯСЕ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

16.00.06 — ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН).

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук,

профессор В. Л. Долгов (ГНУ ВНИИВСГЭ)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. В. Светличкин (ГНУ ВНИИВСГЭ) кандидат ветеринарных наук М. Ф. Боровков (ФГУ ВПО МГАВМиБ)

Ведущая организация: Государственное Учреждение Всероссийский

научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ГНУ ВНИиТИБП РЛСХН) Защита состоится " 2004 г в " " часов

на заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при ГНУ Всероссийском научно-исслсдовагельском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское ш., д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Автореферат разослан "_"_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е. С. Майстренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современном промышленном животноводстве и птицеводстве для увеличения производства продукции нередко используются различные гормональные стимуляторы роста (естественные и синтетические стероиды, тиреостатики, бета-агонисты и др.), что может приводить к их избыточному накоплению в мясе и мясопродуктах. Это представляет серьезную опасность для здоровья человека, поскольку данные соединения нарушают обменные процессы и гормональный статус организма, влияют на сердечную деятельность, могут обладать канцерогенным эффектом. (Неклюдов А. Д. и др., 1999; НшеЬу Я. А., 1980; ОГпег Р. ег а1., 1992; Сао К. ег а1., 1988, и др.)

13 связи с этим во многих странах мира ужесточаются требования по контролю за содержанием гормональных препаратов в продуктах животного происхождения, что предусмотрено соответствующими Директивами ЕЭС 89/662/ЕЕС, 90/425/ЕЕС, 96/23/ЕС. В нашей стране Департаментом ветеринарии МСХ РФ издано соответствующее указание по организации Государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатнков в продуктах животного происхождения (№10-7-1/900 от 04.10.99 г.), в котором отражены требования по предупреждению попадания гормонов в продовольственное сырье; требования, критерии и мероприятия, касающиеся их применения в ветеринарной практике, а также лабораторный контроль за содержанием этих веществ в продуктах и кормах. Был утвержден также план мероприятий по усилению контроля качества и безопасности продукции животного происхождения, ведению контроля и учета за ее движением и использованием, в котором определены организации и лаборатории, осуществляющие мониторинг импортного продовольственного сырья на наличие ксенобиотиков, в том числе и гормональных стимуляторов роста (Московская горветлаборатория, ЦНМВЛ МСХ 1

Для определения содержания гормонов используются различные инструментальные методы исследований (радиоиммунные,

хроматографические, спектрометрнческие и др.), которые отличаются трудоемкости, необходимостью иметь дорогостоящую аппаратуру, сложны в постановке и могут использоваться только в лабораторных условиях. С практической ючки зрения наиболее приемлемым является иммуноферментный метод анализа (ИФА), который обладает высокой чувтвительностью, малыми за фатам и времени и средств (Галкин А. В. и др., 1998; Мафёшин Л. 13., 1999; Белоусов А. В., 2002 и др.; Commission Decision 93/257^^ 1993, и др.)

Дальнейшее усовершенствование данною метода позволит расширить облаем, ею применения как для научных целей, так и для проведения мониторинговых исследований продукции животного происхождения, чю является в настоящее время актуальной задачей.

Цель и задачи исследовании. Целью работы являлось изучение содержания юрмональных стимуляторов роста (прогестерона, тестостерона, эстрадиола-HB) в мясе и усовершенствование метода их определения.

В задачи исследовании входило:

1. Изучить содержание юрмональных стимуляторов роста (прогестерона, тестостерона, эстрадиола-17B) в мясе отечественного и импортного происхождения.

2. Определить методические подходы к усовершенствованию иммуноферментного анализа гормонов в мясе.

3. Офабогагь условия очистки и концентрации полученных экстрактов из проб мяса, содержащих гормональные стимуляторы роста.

4. Провести сравнительную оценку усовершенствованного метода определения содержания в мясе прогестерона, тестостерона, и эстрадиола-17B с общепринятым методом.

5. Изучить влияние температурной обработки мяса на содержание в нем гормональных стимуляторов роста.

6. Разработать методические рекомендации по определению гормональных стимуляторов роста (прогестерона, тестостерона, эстрадиола-17Б) в мясе и мясопродуктах с помощью ИФА.

Научная новизна. Изучено содержание гормональных стимуляторов роста (прогестерона, тестостерона, эстрадиола-17B) в мясе отечественного и импортного происхождения. Показано, что в отечественной продукции содержание гормонов не превышало максимально допустимых уровней, в то время как в ряде образцов импортного мяса выявлены превышения МДУ, в некоторых случаях значительные.

Усовершенствована методика определения прогестерона, тестостерона и эстрадиола-17B в мясе с помощью ИФА. Установлено, что применение жидкостно-твердофазной экстракции позволяет увеличить процент выхода гормональных стимуляторов роста из проб мяса и другой продукции животного происхождения в среднем до 45-90% в зависимости от вида гормона, что гораздо выше, чем при использовании общепринятой методики.

Показано, что влияние температурной обработки мяса (варка) снижает уровень содержания в нем гормонов пропорционально длительности температурного воздействия, что позволяет рекомендовать предложенные нами режимы для практического применения.

Практическая ценность работы. На основании результатов исследований разработаны:

- "Методические рекомендации по определению прогестерона в мясе и мясопродуктах методом иммуноферментного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.);

- "Meтодические рекомендации по определению тестостерона в мясе и мясопродуктах методом иммуноферменгного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.);

- "Методические рекомендации по определению эстрадиола- 17B в мясе и мясопродуктах меюдом иммуноферментного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: - 4-ой Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции" (Москва, 2002 г.);

- Международной научной конференции "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных" (ВИЖ, Дубровицы, 2002 г.);

- пятой Международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек."(Москва, 2003 г.);

- Международной научной конференции "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных" (ВИЖ, Дубровицы, 2003 г.);

- II Международной научно-практической конференции "Научно-технический прогресс в животноводстве России — ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной продукции животноводства" (ВИЖ, Дубровицы, 2003 г.);

- заседаниях Ученого совета ВНИИВСГЭ (2001-2003 г.г.);

- межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2004 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных статей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ПО стр. машинописною текста и состоит из введения, обзора литературы,

собственных исследовании, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы включает 136 источников (79 отечественных и 57 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 14 таблицами и 2 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований.

Работа выполнена на основании плана научно-исследовательских работ ВНИИВСГЭ в период, с 2000 но 2003 г.г. в лаборатории ветеринарно-санитарной экспертизы мяса, рыбы и других пищевых продуктов и является частью темы 13.1, задания 05 Программы фундаментальных и прикладных исследований, утвержденной РАСХН.

Материалом для исследований служили различные образцы мяса отечественного и импортного происхождения, поступавшие в лабораторию ветсанэкспертизы института, а также в Испытательную лабораторию пищевой продукции, продовольственного сырья и кормов ВНИИВСГЭ, в том числе при осуществлении мониторинга импортного продовольственного сырья на наличие ксенобиотиков согласно Указанию Департамента ветеринарии МСХ РФ №10-7-1/900 от 04.10.99 г.

Определение в мясе и мясопродуктах гормональных стимуляторов роста (прогестерона, тестостерона, эстрадиола-17B) осуществляли с помощью иммуноферментного анализа согласно "Наставлению по применению набора для количественного определения прогестерона в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа (ИФА-АГ-ПРОГ.)". Утв. ДВ МСХ РФ, №13-5-02/0141 от 31.07.01.; "Наставлению по применению набора реагентов для количественного определения тестостерона в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа (ИФА-АГ-ТЕСТ.)". Утв. ДВ МСХ РФ, №13-5-02/0138 от 31.07.01; "Наставлению по применению набора для количественного определения. эстрадиола-17B в

продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа (ИФЛ-ЛГ-ЭС1.)". Утв. ДВ МСХ РФ, №13-5-02/0146 от 31.07.01.Тест-наборы произведены ООО "Медицина. Аналитика. Ветеринария. "(М.А.В.).

При совершенствовании существующего метода ИФЛ гормонов использовали методические подходы, применяемые при жидкостной, жидкостно-твсрдофазной и твердофазной экстракции, которые изложены в соответствующих методических руководствах и других нормативных документах (Лилли О., 1982; Смит Л., 1982; Сб. нормативных документов ГКСЭП РФ, 1994; ZiefM., 1982, и др.).

Для очистки и концентрации экстрактов применяли концентрирующие патроны Диапак С8 и С16, а также сорбент для хроматографии Диасорб-100-С8. Иммуноферментный анализ проводили на иммуноферментном автоматическом анализаторе "Униплан" производства фирмы "Пикон" (Россия).

Результаты исследований обрабатывали методом вариационной статистики с определением средней арифметической величины, средней ошибки и критерия достоверности.

Результаты исследований.

1. Изучение содержания гормональных стимуляторов роста в мясе отечественною и импортного происхождения.

Нами было исследовано 98 проб мяса разных видов животных (мясо кур, говядина, свинина), из них 46 проб — мясо отечественного происхождения, 52 пробы - импортное мясо, поступившее из различных стран (ФРГ, Польша, Бельгия, Великобритания, Нидерланды, Дания, Австрия, США, Бразилия, Китай).

В результате проведенных исследований установлено, что в мясе отечественного происхождения содержание гормональных стимуляторов роста не превышало максимально допустимых уровней (0,015 мг/кг — для про! естерона и тестостерона, 0,0005 мг/кг - для эстрадиола-17B). Это

свидетельствует о том, что в нашей стране данные гормональные препараты при откорме сельскохозяйственных животных и птицы не применяются и получаемая продукция соответствует по этому показателю ветеринарно-санитарпым требованиям. Тем не менее, полностью исключить применение гормонов в настоящее время нельзя, поскольку достаточно широкое распространение получают различные кормовые добавки, в том числе импортного происхождения, в составе которых могут быть и гормональные стимуляторы роста. Все это свидетельствует о необходимости проведения соответствующих мониторинговых исследований.

Результаты анализа мяса импортного происхождения приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Содержание гормональных стимуляторов роста в импортном мясе

(мг/кг)

№ п/п Вид мяса Страна -производитель Содержание гормонов (мг/кг):

прогестерон тестостерон эстрадиол-17р

1 2 3 4 5 6

1. Говядина ФРГ 0,010 0,015 0,0015

2. Говядина Австрия 0,035 0,008 0,0004

3. Говядина Австрия 0,010 0,012 0,0008

4. Свинина Дания' 0,008 0,007 0,0006

5. Свинина Польша 0,024 0,036 0,0004

6. Свинина Польша 0,080 0,010 0,0005

7. Свинина США 0,015 0,012 0,0047

8. Мясо кур США 0,001 0,018 0,00045

9. Мясо кур Бельгия 0,008 0,010 0,0199

10. Мясо кур Великобритания 0,011 0,007 0,022

11. Мясо кур Китай 0,009 0,010 0,0006

12. Мясо кур Нидерланды 0,015 0,014 0,0111

1 2 • 3 4 5 6

13. Мясо кур мех. обвалки Нидерланды. 0,016 0,005 0,00023

14. Мясо кур Бразилия • 0,001 0,007 0,0075

15. Мясо кур Бразилия 0,009 0,001 0,0044

16. Мясо кур мех. обвалки Бразилия 0,003 0,017 0,0011

Примечание: Более темным цветом выделено содержание гормонов в мясе, превышающее МДУ.

Из представленных в таблице 1 данных видно, что из 46 проб импортного мяса повышенное содержание хотя бы одного из определяемых гормонов отмечено в 16 образцах, что составляет 34,8%. Превышение МДУ прогестерона отмечено в 4 пробах (8,7%), тестостерона - в 3 пробах (6,5%), эстраднола- 17(5 - в 11 пробах (23,9%). Уровень прогестерона в исследуемых пробах мяса превышал максимально допустимый уровень в 1,07 - 5,3 раза, тестостерона - в 1,13- 2,4 раза, эстрадиола- 17Р - в 1,2 - 44 раза.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что проблема поступления в нашу страну импортного мяса с повышенным содержанием гормональных стимуляторов роста существует и никаких ограничений этому, по-сути, нет, поскольку в существующих ныне санитарных правилах и нормах (СанПиН 2.3.2.1078-01) исследование мяса на наличие гормонов не предусмотрено и при сертификации продукции этот показатель не учитывается. В то же время в существовавших до 1997 года "Медико-биологических требованиях и санитарных нормах качества сырья и пищевых продуктов" (МБТ №5061-89) эстрадиол- 170 и тестостерон, наряду с диэтилстильбэстролом, входили в перечень показателей безопасности, подлежащих обязательному определению в мясе убойных животных и птицы, но затем, по непонятным причинам, не были включены в последующие

Санитарные правила и нормы (СанПиН 2.3.2.560-96; СаиПиН 2.3.2.1078-01), что, на наш взгляд, является неправильным.

2. Совершенствование метода определения гормонов (прогестерона, тестостерона и эстраднола- 17В) в мясе.

При совершенствовании иммуноферментного метода определения гормональных стимуляторов роста в мясе использовали методические подходы, применяемые при жидкостной, жидкостно-твердофазной и твердофазной экстракции.

Поскольку гормональные стимуляторы роста являются жирорастворимыми веществами, в качестве экстрагентов использовали такие растворители, как диэтиловый эфир, хлороформ, гексан, ДМСО, спирты, ацетон, а также их сочетания.

На первом этапе работ необходимо было оценить, насколько приемлемым является метод твердофазной экстракции, в основе которой лежит принцип колоночной хроматографии, основанный на специфическом взаимодействии распределенных в матрице компонентов с твердой фазой, для концентрации и очистки проб. Для этого готовили пробы, содержащие гормональные стимуляторы роста в растворителях - гексане, хлороформе и диэтиловом эфире. Полученные пробы пропускали через активированный патрон, а затем элюировали из патрона с использованием соответствующего растворителя.

Результаты опытов приведены в таблицах 2-4.

Из представленных данных видно, что при использовании патронов возрастает процент выхода исследуемых гормонов из проб по сравнению с контролем. 13 отношение прогестерона он увеличивается в среднем в 2,11 раза (табл. 2), тестостерона - в 1,87 раза (табл. 3), эстрадиола- - в 6,37 раза (табл. 4). При этом наиболее приемлемым для использования в качестве растворителя проб, подготовленных для пропускания через патрон, является гексан, лучшим активатором для патрона является поочередное пропускание

через нею воды и дм лиловою эфира, а предпочтительным элюентом показал себя ДМСО.

Проведенные исследования показали, что растворение гормонов в эфире способствовало вымыванию их из патронов при введении независимо опою, чем активировали патрон. При пом процент вымывания гормонов из патрона достигал 85-95 %.

Использование смесей воды и ацетона, воды и гексана, воды, хлороформа и спирта также не способствовало удерживанию гормонов в патроне. В то же время использование в качестве активатора воды и эфира удерживало 100 % введенною юрмона в патроне.

В качестве элюента использовали ДМСО, который обеспечивал дотаточно полное выделение гормонов из патрона.

Использование для концентрации проб патронов Диапак С8 и С16 не имело значительных отличий и показало, что оба типа патронов могут быть в равной степени использованы в анализе.

Определение процента выхода прогестерона из патронов "Диапак С8" и "Диапак С16". _В пробу внесено 50 нг прогестерона._

Кап/п Проба Активация патрона Элюирование Выход

С8, нг С16. нг С8. % С16. %

1. прогестерон в эфире вола 5 мл, ацетон 5 мл 2 мл ДМСО 22,5 20,5 45 41

2. -//--- вода 5 мл, ацетон 5 мл 1,5 %-ый раствор спирта в 2,05 1,35 4,1 2,7

хлороформе, затем ДМСО

3. --//- вода S мл, гексан 5 мл 2 мл ДМСО 8,6 9,7 17,2 19,4

4. -//- вода 5 мл, ацето нитрил 5 мл 2 мл ДМСО 2,01 2,65 4,02 5,3

5. прогестерон в хлороформе вода 5 мл, ацетон 5 мл 2 мл ДМСО 23,7 23,4 47,4 46,8

6. II вода S мл, ацетон 5 мл 1,5 %-ый раствор спирта в 19,8 17,65 39,6 35,3

хлороформе, затем ДМСО

7. -II---- вода 5 мл, гексан 5 мл 2 мл ДМСО 0 0,535 0 1,07

8. -//--- вода S мл, эфир 5 мл 2 мл ДМСО 10,42 11,3 20,84 22,6

9. прогестерон в гексане вода 5 мл, ацетон 5 мл 2 мл ДМСО 0,5 0,54 1 1,08

10. ---1/------ вода 5 мл, ацетон 5 мл 1,5 %-ый раствор спирта в 2,58 3,15 5,16 6,3

хлороформе, затем ДМСО

11. --//--- вода 5 мл, ацетон 5 мл 2 мл диэтилового эфира 19,6 17,6 39,2 35,2

12. ----//--- вода 5 мл, эфир 5 мл 2 мл ДМСО 48,8 47,4 . 97,6 94,8

13. Контроль - проба

приготовлена по • - 22.6 45.2

общепринятой методике

Определение процента выхода тестостерона из патронов "Диапак С8" и "Диапак С16".

В пробу внесено 50 нг тестостерона.

№п/п Проба Активация патрона Элюироаание Выход

С8, иг С1б. нг С8. % С16.%

1. тестостерон в эфире вола 3 мл, ацетон 3 мл 2 мл ДМСО 18 15,5 36 31

2. --//---- вода 3 мл, ацетон 3 мл 1,5 %-ый раствор спирта в 5,05 6,4 10,1 12,8

хлороформе, затем ДМСО

3. ---//__-- вода 3 мл, гексан 3 мл 2 мл ДМСО 5,8 7,25 11,6 14,5

4. ----//---- вода 5 мл, ацетонитрил 5 мл 2 мл ДМСО 3,6 3,45 7,2 6,9

5. тестостерон в хлороформе вода 3 мл, ацетон 3 мл 2 мл ДМСО 27,4 24,6 54,8 49,2

б. ---//------ вода 5 мл, ацетон 5 мл 1,5 %-ый раствор спирта в 30,7 33,35 61,4 66,7

хлороформе, затем ДМСО

7. ----//-------- вода 5 мл, гексан 3 мл 2 мл ДМСО 6,05 4,7 12,1 9,4

8. ----II----- вода 3 мл, эфир 5 мл 2 мл ДМСО 18,95 19,6 37,9 39,2

9. тестостерон в гексане вода 3 мл, ацетон 3 мл 2 мл ДМСО 0 0 0 0

10. ---//---- вода 3 мл, ацетон 3 мл 1,5 %-ый раствор спирта в 5,9 4,7 11,8 9,4

хлороформе, затем ДМСО

11. -// - - вода 3 мл, ацетон 3 мл 2 мл диэтилового эфира 13,8 15,9 27,6 31,8

12. --//------ вода 3 мл, эфир 5 мл 2 мл ДМСО 48,4 49,05 96,8 98,1

13. Контроль - проба

приготовлена по - - 26.1 52.2

общепринятой методике

Определение процента выхода эстрадиола-170 из патронов "Диапак С8" и "Диапак С16".

В пробу внесено 10 нг эстрадиола-170.

Ко Проба Активация патрона Элюирование Выход

п/п С8, нг С16, нг С8. % С16.%

1. эстрадиол-17Р в эфире вода 5 мл, ацетон 5 мл 2 мл ДМСО 1,5 1,8 15 18

2. --//- вода 5 мл, ацетон 5 мл 1,5 %-ый раствор спирта в 3,28 3,11 32,8 31,1

хлороформе, затем ДМСО

3. --ц-- вода 5 мл, гексан 5 мл 2 мл ДМСО 1,46 1,59 14,6 15,9

4. // вода 5 мл, ацетонитрил 5 мл 2 мл ДМСО 1,21 1,5 12,1 15,0

5. эстрадиол-17р в хлороформе вода 5 мл, ацетон 5 мл 2 мл ДМСО 2,29 2,58 22,9 25,8

6. -// - - вода 5 мл, ацетон 5 мл 1,5 %-ый раствор спирта в 1,24 1,1 12,4 11,0

хлороформе, затем ДМСО

7. ---II--- вода 5 мл, гексан 5 мл 2 мл ДМСО 1,65 1,29 16,5 12,9

8. -----//------ вода 5 мл, эфир 5 мл 2 мл ДМСО 4,53 4,19 45,3 41,9

9. эстрадиол-17р в гексане вода 5 мл, ацетон 5 мл 2 мл ДМСО 1,42 1,67 14,2 16,7

10. -----//----- вода 5 мл, ацетон 5 мл 1,5 %-ый раствор спирта в 0,95 0,74 9,5 7,4

хлороформе, затем ДМСО

11. -------//----- вода 5 мл, ацетон 5 мл 2 мл диэтилового эфира 1,6 1,42 16,0 14,2

12. ------//----- вода 5 мл, эфир 5 мл 2 мл ДМСО 9,39 9,71 93,9 97,1

13. Контроль - проба

приготовлена по - - 1.5 15.0

общепринятой методике

Следующим этапом исследований была отработка стадии экстракции гормонов из проб. Для этого определенное количество гормонов (по 50 нг для прогестерона и тестостерона и 10 нг для эстрадиола- вносили в 10 мл воды, затем экстрагировали пробу гексаном, хлороформом или эфиром. Полученный экстракт упаривали досуха, сухой остаток растворяли в 1 мл гексана и проводили концентрирование и очистку экстрактов на патронах.

Результаты экспериментов представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Результаты использования жндкостно-твердофазной экстракции гормонов.

№№ Гормон Жидкостная Очистка Выход

п/п экстракция нг %

1. про! сстерон гексан патроны Дианак С8 28,0±3,0 56

2. прогестерон хлороформ патроны Диапак С8 10,3±0,9 20,6

3. прогестерон диэтиловый эфир патроны Диапак С8 41,4±5,2 82,8

4. прогестерон диэтиловый эфир - 19,3±1,6 38,6

5. тестостерон гексан патроны Диапак С8 21,7±2,4 43,4

6. тестостерон хлороформ патроны Диапак С8 5,0±0,3 10

7. тестостерон диэтиловый эфир патроны Диапак С8 39,1±6,1 78,2

8. тестостерон диэтиловый эфир - 17,0±2,0 34

9. эстраднол-17р гексан патроны Диапак С8 2,98±0,22 29,8

10. эс1 радиол-17(5 хлороформ патроны Диапак С8 5,48±0,1 54,8

11. эстраднол-17р диэтиловый эфир патроны Диапак С8 6,21 ±0,7 62,1

12. зет радиол- 17р диэтиловый эфир - 0,62+0,03 6,2

Проведенные исследования показали, что использование в качестве жидкого экстрагента диэтилового эфира значительно повышает степень выхода искомых веществ - до 82,8 % для прогестерона, 78,2 % для тестостерона и 62,1% для эстраднола-17B. При этом следует отметить, что подготовка проб без очистки на патронах значительно снижала выход гормонов (соответственно до 38,6, 34,0 и 6,2%).

Для улучшения экстракции гормонов из проб нами был использован сорбент Диасорб-100-С8. При проведении экспериментов гормональные стимуляторы роста в количестве по 50 нг для прогестерона и тестостерона и 10 нг для эстрадиола вносили в 4 г сорбента, перемешивали, помещали сорбент в деятельную воронку и промывали растворителями. Затем пробу очищали на патронах и проводили определение гормонов.

Результаты исследований представлены в таблице 6.

Таблица 6.

Результаты использования сорбента Диасорб-100-С8 при определении

гормональных стимуляторов роста,

№№ Гормон Растворитель Выход

I )/■ I нг %

1. прогестерон гексан 31,25 62,5

2. прогестерон ацетон 14,0 28,0

3. прогестерон ДМСО 9,75 19,5

4. прогестерон диэтиловый эфир 41,25 82,5

5. тестостерон гексан 12,05 24,1

6. тестостерон ацетон 0,15 0,3

7. тестостерон ДМСО 10,2 20,4

8. тестостерон диэтиловый эфир 35,35 70,7

9. эстрадиол-17р гексан 1,73 17,3

10. эстрадиол-17р ацетон 0,07 0,7

II. эстрадиол-17р ДМСО 1,21 12,1

12. эстраднол-17р диэтиловый эфир 5,79 57,9

Проведенные эксперименты показали, что введение в процесс экстракции из проб сорбента не дает значительного увеличения процента выхода гормонов. Поэтому для выделения прогестерона, тестостерона и эстрадиола- 17р из проб в дальнейшем использовали жидкостно-твердофазную экстракцию.

Апробацию усовершенствованного нами метода проводили на пробах мяса различных видов животных, а также мяса рыб, сухого молока и сливочного масла, в которые искусственно вносили гормональные

стимуляторы pocта, а затем проводили определение их уровня в исследуемых пробах с использованием разработанных нами методических подходов. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Результат определения процента выхода гормональных стимуляторов роста

из проб продуктов животного происхождения

Иродукг Гормон Внесено, Определено

нг нг %

Говядина прогестерон 50 43,4±3,1 86,8

тестостерон 50 39,1 ±4,5 . 78,2

эстрадиол 10 6,52+1,0 65,2

Мясо прогестерон 50 41,6+3,6 83,2

кур тестостерон 50 37,9+4,1 75,8

эс1радиол 10 6,36±2,9 63,6

Свинина прогестерон 50 47,8±2,6 95,6

нежирная тест остерон 50 39,0±4,0 78,0

эстрадиол 10 5,18±2,7 51,8

Свинина прогестерон - 50 35,4±1,8 70,8

жирная тестостерон 50 30,9±2,6 61,8

эстрадиол 10 4,70±1,9 47,0

Жир прогестерон 50 30,1 ±4,5 60,1

свиной тестостерон 50 28,2+3,6 56,4

эстрадиол 10 4,08±2,8 40,8

Рыба прогестерон 50 45,1+3,4 90,2

речная тестостерон 50 34,7± 1,7 69,4

эстрадиол 10 5,90±4,1 59,0

Сухое прогестерон 50 44,6±5,1 89,2

молоко тестостерон 50 35,8±2,4 71,6

эстрадиол 10 5,82±1,6 58,2

Масло прогестерон 1 50 31,6±2,5 63,2

сливочное тестостерон 50 27,1±1,9 55,2

эстрадиол 10 | 4,28±2,3 42,8

Из представленных в таблице 7 данных видно, что использование жидкостно-твердофазной экстракции позволяет увеличить процент выхода гормональных стимуляторов роста из проб продукции животного происхождения в среднем до 45 - 90% в зависимости от типа гормона и вида

продукта, что гораздо выше, чем при использовании общепринятой методики. Для прогестерона это увеличение составило 60,1 - 95,6%, для тестостерона - 55,2 - 78,2%, для эстрадиола-17В - 40,8 - 65,2%. С увеличением в исследуемой пробе количества жира степень экстракции гормонов несколько снижалась, что соответствует литературным данным и связано с трудностями разделения липидов и жирорастворимых гормонов.

В целом предлагаемая нами схема анализа состоит в следующем:

- жидкостная экстракция гормонов из проб диэтиловым эфиром;

- упаривание экстрактов и растворение сухого остатка в 2 мл гексана;

- очистка на патронах Диапак С8 или С16 (твердофазная экстракция) с последующим элюированием ДМСО;

- количественное определение гормонов методом ИФА с помощью вертикальной спектрофотометрии.

3» Влияние температурной обработки мяса на содержание в нем гормональных стимуляторов роста.

Поскольку повышенный уровень гормональных стимуляторов роста в мясе и мясопродуктах выдвигает определенные ограничения для использования такого сырья на общих основаниях, то нахождение путей его технологической реализации является актуальной задачей.

Нами с целью изучения возможности снижения уровня гормонов в мясе изучено влияние на содержание этих веществ температурной обработки мяса- его замораживания с последующим хранением и варки.

В опытах использовали образцы мяса разных видов животных (мясо птицы, говядину и свинину), в которые искусственно вносили определенное количество гормональных стимуляторов роста, а также мясо с естественным содержанием в нем гормонов.

Установлено, что замораживание мяса до температуры в толще мускулатуры минус 6°С и минус 12°С и последующее хранение в течение 1030 дней не влияет на уровень исследованных нами гормонов (прогестерона,

тестостерона, эстрадиола- 17Р), что не позволяет рекомендовать данные температурные режимы для его обработки.

Не влияет на уровень гормонов в мясе и его многократное (до 10 раз) замораживание и оттаивание.

Мясо подвергали также провариванию в кипящей воде до достижения температуры в толще мускулатуры 100°С с последующей экспозицией 30, 60 и 120 минут. В результате было установлено, что при этом происходит снижение первоначального уровня всех изученных нами гормонов пропорционально длительности температурного воздействия, хотя и в неодинаковой степени. Для прогестерона это снижение составило при длительности варки 30, 60 и 120 минут в среднем, соответственно, 28,6, 50 и 61,5%, для тестостерона - 16,7, 28,6 и 44,5%, для эстрадиола- 17Р - 33,4, 52,4 и 67,8% (рис. 1).

Как видно из приведенных данных, наиболее приемлемой является варка мяса в течение 1 — 2-х часов, что обеспечивает достаточно заметное снижение содержания в нем гормонов.

Исходя из этого, можно рекомендовать использовать мясо с повышенным содержанием в нем гормональных стимуляторов роста после соответствующей термической обработки, в том числе для выработки мясопродуктов, при изготовлении которых предусматривается применение высоких температур.

Рис. 1. Снижение содержания уровня гормонов в мясе после его проварки.

1234 1234 123*

прогестерон тестостерон зстрадиол-17(3

1 - исходное мясо

2 - варка в течение 30 мин.

3 - варка в течение 60 мин

4 - варка в течение 120 мин.

выводы

1. Установлено, что в мясе разных видов животных (мясо пгицы, говядина, свинина) импортною происхождения содержание гормональных стимуляторов роста (протестерона, тестостерона, эстрадиола- может превышав их максимально допустимые уровни, в то время как в мясе отечественною происхождения этого превышения не обнаружено.

2. Из исследованных образцов импортного мяса превышение МДУ прогестерона отмечено в 8,7 % проб, тестостерона — в 6,5 % проб и эстрадиола- 17(1 - в 23,9 % проб; при этом величина превышения составляла для данных гормонов, соответственно, 1,07-5,3, 1,13-2,4 и 1,2-44 раза.

3. Усовершенствована методика определения гормональных стимуляторов роста (прогестерона, тестостерона, эстрадиола- в мясе, которая заключается в экстракции гормонов из проб серным эфиром, очистке эфирных экстрактов на патронах Дианак С8 или С16 и количественном определении содержания гормонов методом иммуноферментного анализа.

4. Показано, что применение жидкостно-твердофазной экстракции позволяет увеличить степень выхода гормонов из проб мяса и других продуктов животного происхождения - до 60,1-95,6 % для прогестерона, до 55,2-78,2% для тестостерона и до 40,8-65,2% для эстрадиола- 17Р, что существенно повышает чувствительность метода и его объективность.

5. Разработанные нами методические подходы обеспечивают высокую степень универсальности анализа при исследовании различных продуктов животного происхождения — мяса, рыбы, молока, жиросодержащих продуктов.

6. Установлено, что варка мяса способствует снижению содержания в нем гормональных стимуляторов роста пропорционально длительности температурного воздействия. Для прогестерона это снижение составило при

длительности варки 30, 60 и 120 минут, соответственно, 28,6, 50 и 61,5%, для тестостерона - 16,7, 28,6 и 44,5%, для эстрадиола- 17р - 33,4, 52,4 и 67,8%.

7. На основании проведенных исследований рекомендуется использовать мясо с повышенным содержанием в нем гормональных стимуляторов роста после соответствующей термической обработки, в том числе для выработки мясопродуктов, при изготовлении которых предусматривается применение высоких температур.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Для использования в научно-исследовательских учреждениях и лабораториях могут быть рекомендованы разработанные нами "Методические рекомендации по определению эстрадиола- 17|} в мясе и мясопродуктах методом иммуноферментного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.), "Методические рекомендации по определению тестостерона в мясе и мясопродуктах методом иммуноферментного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.), "Методические рекомендации по определению прогестерона в мясе и мясопродуктах методом иммуноферментного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Островская А. В. Определение гормональных стимуляторов роста в продуктах животного происхождения // Материалы 4-ой международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции". Москва, 2002, стр.53.

2. Островская Л. В. Контроль уровня гормональных стимуляторов роста в мясе и мясопродуктах // Тезисы докладов Международной научной конференции "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных". Дубровицы, 2002 г., стр. 152-153.

3. Островская Л. В. Долгов В. А., Совершенствование методов определения гормональных стимуляторов роста в мясе и мясопродуктах // Материалы пятой международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек". Москва, 2003, стр. 98-99.

4. Долгов В. Л., Лавина С. А., Арно Т. С, Семенова Е. А., Островская А. В., Кулешова М. Г. Совершенствование методологии оценки ветеринарно-санитарного качества и безопасности продуктов животноводства // Материалы II Международной научно-практической конференции "Научно-технический прогресс в животноводстве России - ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной' продукции животноводства". Дубровицы, 2003, стр.250-251.

5. Долгов В. А., Лавина С. А., Островская А. В, Боровков М. Ф., Макарова И. Е. Пути совершенствования оценки ветеринарно-санитарного качества и безопасности продуктов животноводства // Материалы пятой международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек". Москва, 2003, стр. 248-249.

6. Долгов В. А., Лавина С. А., Арно Т. С, Семенова Е. А., Островская А. В., Кулешова М. Г. Поиск новых подходов в методологии оценки ветеринарно-санитарного качества продуктов животного происхождения // Тезисы докладов Международной научной конференции "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных". Дубровнцы, 2003 г., стр. 104-105.

ВНИИ13СГЭ, 2004 г., г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5 Заказ 8 /-/3 Тираж 80 экз.

1

Актуальность темы. В современном промышленном животноводстве и птицеводстве для увеличения производства продукции нередко используются различные гормональные стимуляторы роста (прогестерон, тестостерон, эстрадиол-17Р и др.), что может приводить к их избыточному накоплению в мясе и мясопродуктах. Это представляет серьезную опасность для здоровья человека, поскольку данные соединения нарушают обменные процессы и гормональный статус организма, влияют на сердечную деятельность, могут обладать канцерогенным эффектом. (Неклюдов А. Д. и др., 1999; Huseby R. А., 1980; Ofner Р. et al., 1992; Cao К. et al., 1988, и др.).

В связи с этим во многих странах мира ужесточаются требования по контролю за содержанием гормональных препаратов в продуктах животного происхождения, что предусмотрено соответствующими Директивами ЕЭС 89/662/ЕЕС, 90/425/ЕЕС, 96/23/ЕС. В нашей стране Департаментом ветеринарии МСХ РФ издано соответствующее Указание (№10-7-1/900 от 04.10.99 г.) по организации Государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продуктах животного происхождения, в котором отражены требования по предупреждению попадания гормонов в продовольственное сырье; требования, критерии и мероприятия, касающиеся их применения в ветеринарной практике, а также лабораторный контроль за содержанием этих веществ в продуктах и кормах. Был утвержден также план мероприятий по усилению контроля качества и безопасности продукции животного происхождения, ведению контроля и учета за ее движением и использованием, в котором определены организации и лаборатории, осуществляющие мониторинг импортного продовольственного сырья на наличие ксенобиотиков, в том числе и гормональных стимуляторов роста (Московская горветлаборатория, ЦНМВЛ МСХ РФ, ВНИИВСГЭ).

Для определения содержания гормонов используются различные инструментальные методы исследований (радиоиммунные, хроматографические, спектрометрические и др.), которые отличаются трудоемкостью, необходимостью иметь дорогостоящую аппаратуру, сложны в постановке и могут использоваться только в лабораторных условиях. С ф практической точки зрения наиболее приемлемым является иммуноферментный метод анализа (ИФА), который обладает высокой чувствительностью, малыми затратами времени и средств (Галкин А. В. и др., 1998; Матрёшин А. В., 1999; Белоусов А. В., 2002 и др.; Commission Decision 93/257/ЕЕС, 1993, и др.).

Дальнейшее усовершенствование данного метода позволит расширить область его применения как для научных целей, так и для проведения мониторинговых исследований продукции животного происхождения, что является в настоящее время актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение содержания гормональных стимуляторов роста (прогестерона, тестостерона, эстрадиола-17Р) в мясе и усовершенствование метода их определения.

В задачи исследований входило:

1. Изучить содержание гормональных стимуляторов роста ^ (прогестерона, тестостерона, эстрадиола-17р) в мясе отечественного и импортного происхождения.

2. Определить методические подходы к усовершенствованию иммуноферментного анализа гормонов в мясе.

3. Отработать условия очистки и концентрации полученных экстрактов ^ из проб мяса, содержащих гормональные стимуляторы роста.

4. Провести сравнительную оценку усовершенствованного метода определения содержания в мясе прогестерона, тестостерона, и эстрадиола-17р с общепринятым методом.

5. Изучить влияние температурной обработки мяса на содержание в нем гормональных стимуляторов роста.

6. Разработать методические рекомендации по определению гормональных стимуляторов роста (прогестерона, тестостерона, эстрадиола-17Р) в мясе и мясопродуктах с помощью ИФА.

Научная новизна. Изучено содержание гормональных стимуляторов роста (прогестерона, тестостерона, эстрадиола-17р) в мясе отечественного и импортного происхождения. Показано, что в отечественной продукции содержание гормонов не превышало максимально допустимых уровней, в то время как в ряде образцов импортного мяса выявлены превышения МДУ, в некоторых случаях значительные.

Усовершенствована методика определения прогестерона, тестостерона и эстрадиола-17(3 в мясе с помощью ИФА. Установлено, что применение жидкостно-твердофазной экстракции позволяет увеличить процент выхода гормональных стимуляторов роста из проб мяса и другой продукции животного происхождения в среднем до 45-90% в зависимости от вида гормона, что гораздо выше, чем при использовании общепринятой методики.

Показано, что влияние температурной обработки мяса (варка) снижает уровень содержания в нем гормонов пропорционально длительности температурного воздействия, что позволяет рекомендовать предложенные нами режимы для практического применения.

Практическая ценность работы. На основании результатов исследований разработаны:

- "Методические рекомендации по определению прогестерона в мясе и мясопродуктах методом иммуноферментного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.);

- "Методические рекомендации по определению тестостерона в мясе и мясопродуктах методом иммуноферментного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.);

Методические рекомендации по определению эстрадиола-17р в мясе и мясопродуктах методом иммуноферментного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: - 4-ой Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции" (Москва, 2002 г.);

- Международной научной конференции "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных" (ВИЖ, Дубровицы, 2002 г.);

- пятой Международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек."(Москва, 2003 г.);

- Международной научной конференции "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных" (ВИЖ, Дубровицы, 2003 г.);

- II Международной научно-практической конференции "Научно-технический прогресс в животноводстве России - ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной продукции животноводства" (ВИЖ, Дубровицы, 2003 г.);

- заседаниях Ученого совета ВНИИВСГЭ (2001-2003 г.г.);

- межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2004 г.).

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в мясе разных видов животных (мясо птицы, говядина, свинина) импортного происхождения содержание гормональных стимуляторов роста (прогестерона, тестостерона, эстрадиола-17р) может превышать их максимально допустимые уровни, в то время как в мясе отечественного происхождения этого превышения не обнаружено.

2. Из исследованных образцов импортного мяса превышение МДУ прогестерона отмечено в 8,7 % проб, тестостерона - в 6,5 % проб и эстрадиола-17р - в 23,9 % проб; при этом величина превышения составляла для данных гормонов, соответственно, 1,07-5,3, 1,13-2,4 и 1,2-44 раза.

3. Усовершенствована методика определения гормональных стимуляторов роста (прогестерона, тестостерона, эстрадиола-17Р) в мясе, которая заключается в экстракции гормонов из проб серным эфиром, очистке эфирных экстрактов на патронах Диапак С8 или С16 и количественном определении содержания гормонов методом иммуноферментного анализа.

4. Показано, что применение жидкостно-твердофазной экстракции позволяет увеличить степень выхода гормонов из проб мяса и других продуктов животного происхождения - до 60,1-95,6 % для прогестерона, до 55,2-78,2% для тестостерона и до 40,8-65,2% для эстрадиола-17р, что существенно повышает чувствительность метода и его объективность.

5. Разработанные нами методические подходы обеспечивают высокую степень универсальности анализа при исследовании различных продуктов животного происхождения - мяса, рыбы, молока, жиросодержащих продуктов.

6. Установлено, что варка мяса способствует снижению содержания в нем гормональных стимуляторов роста пропорционально длительности температурного воздействия. Для прогестерона это снижение составило при длительности варки 30, 60 и 120 минут, соответственно, 28,6, 50 и 61,5%, для тестостерона - 16,7, 28,6 и 44,5%, для эстрадиола-17р - 33,4, 52,4 и 67,8%.

7. На основании проведенных исследований рекомендуется использовать мясо с повышенным содержанием в нем гормональных стимуляторов роста после соответствующей термической обработки, в том числе для выработки мясопродуктов, при изготовлении которых предусматривается применение высоких температур.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Для использования в научно-исследовательских учреждениях и лабораториях могут быть рекомендованы разработанные нами "Методические рекомендации по определению эстрадиола-170 в мясе и мясопродуктах методом иммуноферментного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.), "Методические рекомендации по определению тестостерона в мясе и мясопродуктах методом иммуноферментного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.), "Методические рекомендации по определению прогестерона в мясе и мясопродуктах методом иммуноферментного анализа" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2003 г.) (приложения 1 - 3).