Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биология и экология иерсиний - возбудителя пищевых токсикоинфекций

ГГо 2 1 АЗГ

На правах рукописи

Ленченко Екатерина Михайловна

БИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ ИЕРСИНИЙ -ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ПИЩЕВЫХ ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ

16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Москва 2000

Работа выполнена на кафедре инфекционных и паразитарных болезней Московского государственного университета прикладной биотехнологии (МГУПБ) Министерства образования Российской Федерации

Научный консультант - Заслуженный деятель науки РФ, доктор

ветеринарных наук, профессор А.В.Куликовский

Официальные оппоненты: - доктор ветеринарных наук,

профессор А ,А.Конопаткин (МГУПБ)

- доктор ветеринарных наук, профессор Р.В.Душук (ВГНКИ)

- доктор ветеринарных наук, профессор З.Н.Меныиикова (МГАВМиБ им. К.И.Скрябина)

Ведущая организация: ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (г. Москва)

С'С

Защита состоится " ШО'ЬЯ- 2000 г в часов на заседании диссертационного совета Д063.46.03 в Московском государственном университете прикладной биотехнологии (109316, Москва, Талалихина, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ.

Автореферат разослан

¿Г 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент '

7/

И.Г.Серегин

пмим аимщ О

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Одной из задач ветеринарной службы, имеющей важное социальное значение, является охрана населения от болезней, общих для человека и животных (Закон РФ «О ветеринарии», раздел V, статья 20). Значительную проблему для здоровья человека и животноводства представляют пищевые токсикоинфекции, социальную и экономическую значимость которых трудно переоценить. Так, по данным экспертов ВОЗ каждый год в мире регистрируют свыше 5 миллионов случаев заболеваний людей пищевыми токсикоинфекциями, из них более 9 тысяч с летальным исходом (WHO report, 1998). По данным ЦНИИ эпидемиологии, суммарный экономический ущерб от этих болезней в России за год выражается величиной порядка 13,1 млн. долларов США.

Учитывая повсеместное распространение пищевых токсикоинфек-ций, в рамках ООН была создана международная программа ФАО/ВОЗ по безопасности пищевых продуктов. Особое внимание в программе уделено медико-микробиологическим требованиям к пищевым продуктам в отношении их контаминации бактериями, которые выделяются не только от больных людей и животных, но и чрезвычайно широко распространены в объектах внешней среды (A.B.Куликовский, 1997). К числу таких бактерий относятся Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis (возбудители иерси-ниозов), которые длительное время не привлекали особого внимания исследователей, так как в начале 60-х годов XX столетия были известны лишь единичные случаи заболевания людей иерсиниозами. Начиная с 1967 года, отмечены уже несколько тысяч случаев заболеваний; впоследствии было установлено, что по тяжести течения и частоте встречаемости иер-синиозы не менее значимы, чем сальмонеллезы (Г.В.Ющенко, 1985, Г.П.Сомов, 1986, Н.Ф.Тимченко, 1991).

Следует учитывать, что род Yersinia, согласно определителю зоопа-тогенных бактерий, включает Yersinia pestis (возбудитель чумы, относится к группе особо опасных инфекций) (М.А.Сидоров и др., 1995). Установлено, что уровень гомологии ДНК Y.pestis sub.pestis Р-1300 и Y.pseudotuberculosis 43 - III составлял - 87 % (±5) - 93 % (±3) (C.B.Балахонов, 1988).

Психротрофные свойства иерсиний способствовали резкой активизации циркуляции и закреплению их в антропосфере (Г.П.Сомов, В.И.Покровский, Н.Н.Беседнова, 1990, Н.Ф.Тимченко, 1991, Г.В.Ющенко, 1994). Так, в тех странах, где налажена диагностика, на долю иерсиниозов приходится 4 % всех пищевых токсикоинфекций. В Нидерландах, Бельгии, Германии, Канаде, Австралии иерсиниозы (по уровню заболеваемости населения) занимают третье место после сальмонеллезов и кампилобакте-риоза (WHO report, 1980-1998).

В России, по данным Республиканского информационно-аналитического центра, иерсиниозы приобрели наибольшую эпидемиологическую значимость и находятся на втором месте после сальмонеллезов. В последние годы наблюдается выраженная тенденция к увеличению числа заболеваний иерсиниозами, причем нередко данные являются заниженными, из-за недостаточно полной их регистрации (В .И.Покровский, 1997). Иерсиниозы характеризуются повсеместным и значительным распространением; высокой заболеваемостью детей до 14 лет (болеют дети всех возрастных групп, в том числе и до 1 года); возможностью развития генерализованных и септических форм с летальным исходом; массовостью вспышек пищевого характера. У человека кроме диареи Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica могут вызывать энтерит, псевдоаппендицит, мезентериальный лимфаденит, артриты, менингит, поражение сетчатки; на 2-3-й неделе возможны рецидивы; септицемия, связанная с этими бактериями, характеризуется высоким уровнем смертности. (В.И.Покровский, Г.В.Ющенко, 1983, Г.П.Сомов и др., 1990, Bockemuhl, 1995).

Приведенные данные свидетельствуют о важности проблемы, которая признана Всемирной организацией здравоохранения глобальной (WHO report, 1980, 1998).

За годы, прошедшие с момента описания возбудителей иерсиниозов, достигнуты значительные успехи в изучении их свойств, эпидемиологии, диагностики, прежде всего, благодаря исследованиям Г.В.Ющенко, В.И.Покровского, А.П.Авцына, Г.П.Сомова, Н.Н.Беседновой, Н.Ф.Тимченко, Б.Л.Черкасского, Ю.Е.Полоцкого, В.Ю.Литвина, В.И.Пушкаревой, Б.И.Маракуши, А.А.Жаворонкова, Л.М.Исачковой,

A.Б.Дайтер, Г.Я.Ценевой. Тем не менее, множественность сероваров иер-синий, сложность дифференциальной диагностики обусловливают трудности в профилактике заражения человека. Проблема усложняется тем, что иерсиниозы в ветеринарии еще мало изучены, хотя установлено, что иер-синии циркулируют в объектах ветеринарно-санитарного надзора (Г.В.Ющенко, 1983, А.Ф.Бабкин и др., 1987, Е.А.Кирьянов, И.И.Савчук, 1988, А.В.Куликовский и др., 1988, В.С.Ефремов, 1990, В.А.Гордейко,

B.И.Пушкарева, 1990, С.И.Куцевалов, 1991, Е.П.Каландадзе, 1991, Л.С. Каврук, 1995, К.В.Шумилов, Л.П.Мельниченко, 1996, В.Г.Скрыпник, А.В.Митрофанов, 1997, А.С.Собакин, Л.Ф.Зыкин и др., 1998).

Сельскохозяйственные животные являются основными источниками, а продукты животного происхождения - факторами передачи возбудителей иерсиниозов человеку. В этой связи научно обоснованные профилактические мероприятия в начале «пищевой цепи» (в животноводстве и перерабатывающей промышленности) являются одними из важнейших компонентов в предотвращении контаминации пищевого сырья и продук-

тов животного происхождения иерсиниями, а сама проблема является актуальной для ветеринарной медицины.

Для достижения эффективных практических результатов в данной области необходимы фундаментальные исследования, в частности по биологии и экологии иерсиний. Помимо большого социального значения, эти вопросы связаны с теоретическими проблемами общей биологии, такими как адаптация психротрофных бактерий к паразитированию в теплокровном организме.

Углубление научных исследований по раскрытию механизмов экологической пластичности иерсиний, разработка методов идентификации возбудителей, научное обоснование комплекса мероприятий, направленных на предупреждение заболеваний животных иерсиниозами и получение безопасных продуктов животноводства, с целью профилактики заболеваний человека и определило актуальность проблемы диссертационной работы.

Цель и задачи исследований.

Цель работы: изучить биологию и экологию иерсиний для теоретического обоснования и разработки мероприятий, направленных на предупреждение распространения возбудителей иерсиниозов среди животных, а также через продукты животного происхождения - человеку.

Для достижения поставленной цели были определены" следующие задачи.

1. Изучить морфологические, культурально-биохимические и серологические свойства иерсиний, определить критерии их дифференциации от таксономически близких и сходных видов бактерий и разработать методы обнаружения возбудителей иерсиниозов в сырье животного-происхождения и объектах внешней среды.

2. Изучить широту распространения и сроки выживания иерсиний в объектах ветеринарно-санитарного надзора.

3. Изучить адгезивные и вирулентные свойства культур микроорганизмов, выделенных из различных источников.

4. Провести бактериологические и электронно-микроскопические исследования при экспериментальном моделировании иерсиниоза in vivo.

5. Изучить влияние факторов внешней среды на рост и популяци-онную изменчивость иерсиний.

6. Изучить морфологию иерсиний на клеточном, субклеточном и популяционном уровнях.

7. Изучить внутривидовой и межвидовой антагонизм бактерий, исследовать межпопуляционное взаимодействие иерсиний с инфузориями.

8. Теоретически обосновать комплекс мероприятий, направленных на предупреждение распространения возбудителей иерсиниозов среди животных, а также через продукты животного происхождения - человеку.

Научная новизна. Разработан и осуществлен новый подход в изучении экологии и биологии иерсиний - использование комплекса электронно-микроскопических и морфометрических методов в сочетании с бактериологическими и гистологическими исследованиями - для выявления факторов патогенности (адгезивности, инвазивности, цитотоксично-сти), внутрипопуляционной изменчивости иерсиний in vivo и in vitro, пределов адаптации психротрофных бактерий к изменяющимся условиям среды обитания.

На основании результатов комплексного изучения биологических свойств возбудителей иерсиниозов выявлены критерии их дифференциации по фенотипическим свойствам от таксономически родственных видов бактерий.

Испытаны и подобраны наиболее оптимальные бактериологические методы индикации и идентификации иерсиний, определена частота их распространения на объектах ветеринарно-санитарного надзора.

Изучены вирулентные и адгезивные свойства культур микроорганизмов, выделенных из различных источников.

Установлены сроки выживаемости иерсиний в объектах внешней среды, в зависимости от температурного фактора, их устойчивость к анти-биоткам и дезинфицирующим средствам.

In vitro и in vivo, с использованием микробиологических, светоопти-ческих, электронно-микроскопических, цитохимических, гистологических, морфометрических методов проведено сравнительное изучение морфологии Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.intermedia, Y.frederikseni, Y.kristenseni на клеточном, субклеточном и популяционном уровнях, без нарушения архитектоники колоний, что позволило выявить закономерности существования различных видов иерсиний в колониях, представляющих собой ограниченную часть популяции.

Установлено, что колония иерсиний является многоклеточным сообществом с упорядоченным строением и дифференциацией отдельных клеток в зависимости от среды обитания.

Выявлено, что изученные виды иерсиний в процессе роста в колониях формируют покровы однотипного строения, являющиеся внеклеточным образованием.

Исследованием ультратонких срезов единичных колоний иерсиний в межклеточном пространстве выявлены фибриллярные структуры полиса-харидной природы, Являющиеся элементами покрова.

Показано, что покровы на поверхности колоний и микроколоний выполняют полифункциональную роль: осуществляют межпопуляцион-ное взаимодействие, процессы адгезии и колонизации, выполняют защитную функцию при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды на микробную популяцию.

В сканирующем электронном микроскопе выявлены длинные нитевидные структуры, располагающиеся по краю бактериальных колоний иерсиний. На поверхности и внутри таких структур обнаружены клетки шаровидной формы, участвующие в формировании микроколоний.

Показано, что при воздействии физических и химических факторов наблюдается внутрипопуляционная изменчивость иерсиний, выражающаяся диссоциацией на Б-Я-формы: в Б-формах клетки имеют типичную для вида палочковидную форму; в К.-формах, наряду с типичными для данного вида клетками, с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии обнаружен гетероморфизм популяции иерсиний, по морфологии свойственный Ь-трансформации бактерий.

Изучены межпопуляционные взаимодействия иерсиний с микроорганизмами-продуцентами биологически активных веществ, флокулирую-щими бактериями г.гап^ега (обитателями активного ила) и простейшими. Показано, что при этих взаимодействиях популяция иерсиний переходит в стадию гетероморфизма, характерного для Ь-трансформации.

Выявленный гетероморфизм клеток свидетельствует о пластичности и изменчивости иерсиний, присущей циклу развития бактериальной популяции, объясняет широкое распространение их в природе, обусловливает необходимость использования сред обогащения при выделении чистой культуры иерсиний.

С использованием гистологических, цитохимических, морфометри-ческих и электронно-микроскопических методов, описана топография слизистой оболочки кишечника лабораторных мышей и кур, в норме и при взаимодействии с иерсиниями.

Практическая значимость. На основании результатов изучения биологии и экологии иерсиний теоретически обоснован и предложен комплекс мероприятий, направленных на предупреждение распространения возбудителей иерсиниозов животных, а также через продукты животного происхождения - человеку. Эти мероприятия включают: выявление иерсиний из патологического материала животных, объектов внешней среды и пищевых продуктов животного происхождения; проведение дезинфекционных мероприятий, направленных на уничтожение возбудителей иерсиниозов во внешней среде; осуществление ветеринарно-санитарной экспертизы туш и продуктов убоя при иерсиниозах; соблюдение мер личной профилактики.

По итогам результатов собственных исследований разработаны «Методические указания по выявлению У.еШегосоНйса и У.рзеис1отЬегси1о518 в пищевых продуктах животного происхождения» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 26.01.1998), включающие правила взятия материала для бактериологического исследования, методы выделения и идентификации иерсиний.

Модифицирован метод ускоренного способа количественного учета микроорганизмов, позволяющий изучать не только количественные изменения в бактериальной популяции, но и межклеточные взаимодействия, а также внутрипопуляционную изменчивость в световом, сканирующем и просвечивающем электронном микроскопе. Результаты данного этапа исследований легли в основу «Методических указаний по определению общего микробного числа в пищевых продуктах и объектах внешней среды» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 16.01.1999).

На основании экспериментальных данных по изучению межпопуля-ционных взаимодействий иерсиний с флокулирующими бактериями, грибами, микроводорослями, простейшими и другими представителями микробиоценоза активного ила аэротенков разработаны «Методические рекомендации по определению степени флокуляции микробиоценоза активного ила в аэротенках» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 07.05.1999).

Разработаны «Методические рекомендации по подготовке препаратов для изучения степени адгезии микроорганизмов с клетками животных в световом и сканирующем электронном микроскопе» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 16.01.1999 г.), позволяющие осуществлять объективную оценку адгезивной способности иерсиний и других бактерий с рецепторами животных клеток (эритроцитов, гепатоцитов, энтероцитов и др.).

Разработаны методы подготовки препаратов для световой, сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии, дающие возможность изучать морфологию иерсиний in vivo и in vitro, как при естественном развитии, так и при воздействии различных физических, химических, биологических факторов.

Установлено, что иерсинии чувствительны к гентамицину, канами-цину, левомицетину, мономицину, неомицину, полимиксину, тетрациклину, эритромицину, отварам лекарственных растений (толокнянки обыкновенной, аронии, листьев брусники, крапивы). Микроорганизмы-продуценты биологически активных веществ L.fermentum, L.plantarum, L.helveticum, L.acidofillum, B.polimixa вызывают угнетение роста иерсиний.

Установлено, что флокулирующие бактерии Zoogloea ramigera способны снижать количество бактериальных клеток иерсиний, включая их в полисахаридный. матрикс формирующихся флокул. Это позволяет рекомендовать использование флокулирующих бактерий, для повышения эффективности биологической очистки сточных вод.

По отношению к Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.intermedia, Y.frederikseni, Y.kristenseni установлена бактерицидная активность 1%-го едкого натра, 0,1%-го хлорамина, 0,1%-го формальдегида, 1,0%-го рас-

твора перекиси водорода. На тест-объектах (метлахской, глазурованной, металлической плитках) гибель иерсиний при воздействии дезинфицирующих средств наблюдалась через 10 мин. При воздействии на бактерии температуры 59°С гибель иерсиний наступала через 10 мин; при 60-80°С -через 5 мин. Это позволило отнести иерсинии к малоустойчивой группе (первая группа) в инструкции «Проведение ветеринарной дезинфекции объектов животноводства». М., 1989.

Собственные исследования по биологии, экологии и диагностике возбудителей иерсиниозов легли в основу монографии «Иерсиниоз. Этиология, эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактики» (1998), предназначенной для ветеринарных специалистов.

Материалы диссертации были использованы в цикле лекций для слушателей факультета повышения квалификации (МГУПБ) по темам: «Патофизиология органов пищеварения при диареях»; «Продукты животного происхождения - факторы передачи возбудителей пищевых токсико-инфекций»; «Лабораторная диагностика и профилактика иерсиниоза» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 17.03.1999 г).

Изданы и внедрены в учебный процесс МГУПБ: (кафедра инфекционных и паразитарных болезней; кафедра ветеринарно-санитарной экспертизы) методические указания к практическим занятиям для студентов ветеринарно-санитарного факультета по темам: "Лабораторная диагностика иерсиниоза" (М., МГУПБ, 1997); «Средства и меры личной профилактики при зооантропонозах» (М., МГУПБ, 1997); «Ветеринарно-санитарная оценка и экспертиза продуктов убоя при иерсиниозе» (М., МГУПБ, 1998), учебное пособие «Функциональная морфология органов пищеварения» (М., МГУПБ, 2000).

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в рамках научно-исследовательской работы 4-8-97В «Разработать ве-теринарно-санитарные нормативы и критерии безопасности сырья и продуктов животного происхождения» (номер Государственной регистрации 01990001018).

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы изложены в отчетах НИР, доложены и одобрены на заседаниях кафедры инфекционных и паразитарных болезней и ученого Совета ветеринарно-санитарного факультета МГУПБ (Москва, 1994-1999 гг.); III Всесоюзной конференции по-эпизоотологии (Новосибирск, 1991); Международном симпозиуме: «Пищевые зоонозы - сальмонеллезы, кам-пилобактериоз, иерсиниозы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 1995); Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов:

«Повышение эффективности агропромышленного производства в условиях современных форм хозяйствования» (Воронеж, 1995); Международной конференции: «Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 1995); VIII-ом Международном симпозиуме: «Ветеринарная лабораторная диагностика (Jerusalem, Israel, 1996); Международном симпозиуме: «Биомедицинская оптика» (San Jose, California USA, 1997); Международной научно-практической конференции: «Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (Москва, 1997); Юбилейных чтениях, посвященных 100-летию со дня рождения И.В.Орлова (М., 1999); Международной конференции: «Пища, экология, человек» (М., 1996, 1997, 1999); Юбилейных чтениях, посвященных 100-летию со дня рождения Д.М.Тетерника (М., 1999).

На защиту выносятся следующие положения:

• результаты комплексного изучения биологических свойств возбудителей иерсиниозов, критерии их дифференциации по фенотипическим свойствам от таксономически родственных видов бактерий;

• методы выявления Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis в пищевых продуктах животного происхождения;

• материалы по распространению и выживаемости иерсиний на объектах ветеринарно-санитарного надзора;

• методы подготовки препаратов для световой, сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии, позволяющие изучать морфологию иерсиний in vivo и in vitro как при естественном развитии, так и при воздействии факторов внешней среды.

• материалы по изучению морфологии иерсиний на субклеточном, клеточном и популяционном уровнях in vivo и in vitro;

• материалы по изучению влияния физических и химических факторов на рост, размножение и популяционную изменчивость иерсиний;

• материалы по изучению внутривидового и межвидового антагонизма бактерий и межпопуляционного взаимодействия иерсиний с беспозвоночными животными;

• теоретическое и экспериментальное обоснование мероприятий, направленных на предупреждение распространения возбудителей иерсиниозов среди животных, а также через продукты животного происхождения человеку.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 34 печатных работах, в том числе, монографии «Иерсиниоз. Этиология, эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактики» (М., 1998)..

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, библиографии, приложения. Работа изложена на 374 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, 6 схем, 15 диаграмм, 25 электроннограмм, 50 сканограмм, 24 фотографии и микрофотографии. Библиографический список включает 427 источников, из них 202 иностранных авторов.

2. Материалы и методы

Работа выполнена в период с 1990 по 1999 гг. на кафедре инфекционных и паразитарных болезней МГУПБ и на базе научных лабораторий ВНИиТИБП, ВНИИВСГЭ, ВГНКИ стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

В опытах были использованы паспортизированные штаммы бактерий рода Yersinia: Y.enterocolitica (27 штаммов), Y.pseudotuberculosis (25 штаммов), Y.intermedia (16 штаммов), Y.frederikseni (15 штаммов), Y.kristenseni (17 штаммов) из коллекции Центрального НИИ эпидемиологии, любезно предоставленные Г.В.Ющенко и полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича и Institut für Veterinärmedizin (Berlin), а также культуры иерсиний, выделенные нами от животных, птиц и из объектов внешней среды. При изучении антагонизма бактерий использовали: Salmonella typhimurium, S.enteritidis, Proteus vulgaris, Morganella morgani, Providencia rettgeri, Klebsiella pneumoniae, Campilobacter jejuni, C.fetus sub.fetus, Pseudomonas aeruginosa, Staphilococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus lactis, B. licheniformis, B.brevis, B.polimixa, B.subtilis, B.cereus, L.fermentum, L.helveticum, L.plantarum из музейной коллекции ВНИИВСГЭ и ВГНКИ стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

С целью подбора наиболее эффективных методов индикации и идентификации возбудителей иерсиниозов сравнивали методы: холодово-го обогащения, замораживания и щелочной обработки исследуемого материала (Г.В.Ющенко, В.И. Дунаев, 1981, Г.ПСомови др., 1990, Г.Я.Ценева, 1997).

С целью выделения микроорганизмов рода Yersinia, были проведены бактериологические исследования. Патологический материал и фекалии животных исследовали в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции, вызываемой патогенными энтеробактериями» (1991).

Отбор проб комбикормов и сырья, используемого при его производстве (кроме зерна), проводили по ГОСТ 13496.0-80 "Комбикорма, сырье. Методы отбора проб", зерна - по ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила

п

приемки и методы отбора проб", мясокостной муки - по ГОСТ 25311-82 "Мука кормовая животного происхождения. Методы бактериологического анализа".

Отбор проб смывов с объектов внешней среды осуществляли стерильными ватными или вагно-марлевыми тампонами с площади не менее 100 см2 по общепринятой методике (А.А.Поляков, 1969).

При отборе проб стоков животноводческих объектов смывы делали со стенок и дна навозного желоба у приямка. При наличии гидрологического смыва тампон, не увлажняя, погружали в жидкую навозную массу на 2-3 мин, после чего помещали в пробирку со средой обогащения («Инструкция по лабораторному контролю очистных сооружений на животноводческих комплексах», 1982).

Пробы пищевых продуктов для бактериологических исследований отбирали в количествах, предусмотренных нормативными документами: ГОСТ 26668 - 85 (СТСЭВ 3013-81). "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов"; ГОСТ Р50396 0-92. "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям"; ГОСТ 7269-79. "Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести"; ГОСТ 9792-73. "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб"; САНПИН 2.3.2. 560-96. "Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов".

Идентификацию выделенных культур проводили в соответствии с классификационной системой Bergy s manual... (1984-1989). Видовую идентификацию иерсиний проводили, изучая их ферментативные свойства, используя общепринятые методы (Ф.Герхардт и др., 1984, М.А.Сидоров и др., 1995).

Антагонистические свойства бактерий изучали методами перпендикулярных штриховых посевов и агаровых блочков на плотных питательных средах и путем совместного культивирования в жидких питательных средах (Н.С.Егоров, 1979).

При изучении межпопуляционных взаимодействий иерсиний с фло-кулирующими бактериями использовали штамм 19-а Zoogloea ramigera, выделенный из активного ила аэротенка (А.В .Барков, 1995). Результаты данного этапа исследований легли в основу методических рекомендаций «По определению степени флокуляции микробиоценоза активного ила в аэротенках» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 07.05.1998).

В опытах по изучению межпопуляционных взаимодействий иерсиний и простейших использовали культуры Tetrachimena pyriformis и Paramecium caudatum, любезно предоставленные доктором ветеринарных

наук В.А.Долговым (ВНИИВСГЭ). Влияние инфузорий на численность популяций иерсиний оценивалась по колониеобразующей активности бактериальных клеток (В.И.Пушкарева,1994). Для исследования морфологических аспектов межпопуляционного взаимодействия нами был разработан метод подготовки препаратов для световой и сканирующей электронной микроскопии, основанный на иммобилизации простейших и бактерий на покровных стеклах.

Выживаемость иерсиний на объектах внешней среды изучали согласно общепринятой методике (А.А.Поляков, 1969).

Для гистологических и цитохимических исследований пробы обрабатывали общепринятыми методами (О.В.Волкова и др., 1987).

Морфометрические исследования проводили на компьютерной телевизионной системе «ДИАМОРФ» (НИИФХМ) и программном комплексе «ДИАМОРФО», реализованном на установке IBAS («Opton») (И.Б.Павлова, И.М.Манохина, Т.Г.Путина и др., 1994).

Вирулентность бактерий оценивали общепринятым методом по Риду и Менчу, а также химическим экспресс-методом (Kandollo, Wauters, 1987).

Адгезивные свойства микроорганизмов изучали методом В.И.Брилис и др. (1986) с использованием формалинизированных эритроцитов барана.

Чувствительность к антибиотикам и устойчивость иерсиний к действию дезинфицирующих средств определяли методами диффузии в агар и серийных разведений (С.М.Навашин, И.П.Фомина, 1977, А.В.Куликовский, 1979).

Учитывали влияние факторов внешней среды на рост и популяцион-ную изменчивость иерсиний: температуры, состава питательных сред, повышенных концентраций хлорида натрия, pH среды, интенсивности ультрафиолетового облучения; антибиотиков, пробиотиков, флскулирующих бактерий, инфузорий. Для подсчета количества клеток иерсиний после воздействия вышеперечисленных факторов использовали модифицированный нами метод «Ускоренного способа количественного учета микроорганизмов» (Е.И.Васильева, 1988).

Электронно-микроскопические исследования проводили общепринятыми и разработанными нами методами подготовки препаратов для световой, сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии. Объекты исследовали в световом микроскопе «Биолам-3», электронном микроскопе «Hitachi-800» со сканирующей приставкой «Hitachi-8010» и электронном микроскопе «Jeol 840 A« при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении 1-300 тысяч. Образцы, предназначенные для исследования в сканирующем электронном микроскопе, напыляли золотом на установке «Е-102».

Статистическую обработку материалов проводили методами вариационной статистики (И.П.Ашмарин, Л.А.Воробьев, 1962).

Методологические подходы к выполнению докторской диссертационной работы являются углубленным продолжением исследований кандидатской диссертации «Экология Y. enterocolitica во внешней среде» (М., 1990). При выполнении докторской работы, методические аспекты ее расширились за счет сравнительного анализа морфологии 5 видов микроорганизмов рода Yersinia: Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.intermedia, Y.frederikseni, Y.kristenseni. Данные по изучению морфологии Y.enterocolitica in vitro приведены для сравнения в качестве тест-штамма.

За участие в работе по отдельным направлениям и оказание консультативной помощи приношу благодарность: Засл. деятелю науки РФ, д-ру вет. наук, проф. А.В.Куликовскому, д-ру мед. наук, проф. Г.В.Ющенко, Засл. деятелю науки РФ, д-ру вет. наук, проф. М.А.Сидорову, Член-корр. РАСХН, д-ру вет. наук, проф. А.Н.Панину, д-ру биол. наук И.Б.Павловой, доц. И.А.Логинову, В.Н.Писменской, И.Г.Серегину, канд.вет.наук М.Ю.Штукаревой, А.В.Баркову, Т.Г.Путиной, Д.А.Банниковой. Основная часть исследований выполнена лично автором, участие соисполнителей отражено в списке опубликованных работ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Свойства иерсиний и разработка методов бактериологической диагностики

Культурально-морфологические и биохимические свойства иерсиний. Изучая морфологию иерсиний в мазках, окрашенных по Граму, мы установили, что Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.frederikseni, Y.kristenseni, Y.intermedia представлены грамотрицательными палочками с закругленными концами, нередко овоидной или кокковидной формы. В мазках из бульонных культур Y.enterocolitica, Y.frederikseni, Y.kristenseni, Y.intermedia выявлялись поодиночно, в отличие от Y.pseudotuberculosis, которые, обычно образовывали цепочки. В мазках из агаровых культур Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.frederikseni, Y.kristenseni, Y.intermedia обнаруживались чаще кокковидные формы бактерий, реже овоидные.

На агаре Хоттингера и МПА через 18 ч культивирования при 28°С Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.frederikseni, Y.kristenseni, Y.intermedia формировали круглые колонии, диаметром - 0,5-1,0 мм, с ровными краями, прозрачные, блестящие, мягкой консистенции, с голубоватым оттенком. В полужидком агаре Хоттингера (0,3 %) при посеве уколом Y.pseudotuberculosis вызывали помутнение вокруг укола или только в

отдельных участках агара, тогда как Y.enterocolitica, Y.frederikseni, Y.kristenseni, Y.intermedia росли, образуя более широкие зоны помутнения (особенно в верхних слоях агара), но весь столбик агара оставался прозрачным. Все изученные виды иерсиний на скошенном МПА росли в виде бледно-серого налета с ровными краями; в МПБ давали равномерное помутнение.

При изучении биохимических свойств у Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.frederikseni, Y.kristenseni, Y.intermedia наблюдали положительные реакции в тестах: галактоза, глицерин, глюкоза, инозит, каталаза, мальтоза, маннит, манноза, нитратредуктаза, рибоза, трегалоза, фруктоза, b-галактозидаза, уреаза. Отрицательные реакции наблюдали в тестах: Д-арабиноза, дульцит, инулин, L-ксилоза, лактоза, мелицитоза, желатин, оксидаза, сероводород.

Таким образом, свойства изученных видов микрооганизмов Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.frederikseni, Y.kristenseni, Y.intermedia были типичными и соответствовали видовому описанию (Bergy, 1984, М.А.Сидоров и др., 1995).

Сравнительная оценка методов выделения и идентификации возбудителен иерсиниозов. Задача данного этапа исследований — подбор таких питательных сред, которые могли бы использоваться для выделения и идентификации иерсиний в ветеринарной практике. При этом среды должны были быть просты в приготовлении, недороги, обеспечивать хороший рост иерсиний и не вызывать их диссоциацию. Исходя из этого, мы сравнивали методы холодового обогащения, замораживания и щелочной обработки исследуемого материала.

При использовании метода холодового обогащения через 48 ч концентрация клеток в изучаемых субстратах (молоко, мясо, вода) оставалась на исходном уровне и составляла 39x109 - 45x109 КОЕ. При использовании метода щелочной обработки концентрация клеток в изучаемых суб.. стратах через 48 ч также оставалась на исходном уровне и составляла 38х109 - 41хЮ9КОЕ. При использовании метода замораживания концентрация клеток через 48 ч снижалась, но незначительно и составляла 9x10-12x109.

При изучении характера роста на средах, используемых на практике для выделения энтеробактерий установили, что на среде Эндо отличительным признаком иерсиний, позволяющим дифференцировать их от сальмонелл и эшерихий, являлись размеры колоний.

На среде СБТС колонии иерсиний отличались от колоний сальмонелл и эшерихий. Данная среда позволяла дифференцировать Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика колоний иерсиний, сальмонелл, эшернхий_

Вид бактерий Среда Эндо (25°С, 18 ч) Среда СБТС (25°С, 18 ч)

Y.enterocolitica Колонии-0,1-0,2 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, прозрачные, бесцветные Колонии -2-4 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, непрозрачные, голубые

Y.pseudotuberculosis Колонии - 0,1-0,2 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, прозрачные, бесцветные Колонии -2-4 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, непрозрачные, зеленые

S.typhi-raurium Колонии - 1-4 мм, прозрачные, розоватые Колонии -2-3 мм, круглые, выпуклые, непрозрачные, желтые

E.coli Колонии - 1-4 мм, круглые, выпуклые, влажные, прозрачные, красные или бесцветные Колонии -2-3 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, непрозрачные, желтые

Изученные виды иерсиний на среде Серова при 25°С через 18 ч формировали круглые колонии, с ровными краями, темно-красные, суховатые, диаметром 2,0-5,0 мм. На среде Рессела при 25°С через 18 ч вырастали очень мелкие росинчатые круглые колонии всех изученных видов иерсиний. На среде Плоскирева при 25°С через 48-72 ч Y.enterocolitica формировали мелкие колонии, количество выросших колоний было незначительным. Виды Y.pseudotuberculosis, Y.intermedia, Y.kristenseni, Y.frederikseni на среде Плоскирева не росли.

На висмут-сульфит-агаре при 25°С через 36-48 ч наблюдался слабый рост Y.enterocolitica и Y.intermedia в виде мелких светло-коричневых колоний с ровными краями, диаметром - 1,0-1,5 мм; на месте расположения колоний цвет среды не изменялся. Для сравнения - рост колоний Salmonella typhimurium на ВСА наблюдался через 18-24 ч. Колонии сальмонелл крупные, диаметром 2,0-3,0 мм, пастообразные, интенсивно-черного цвета; по краю колонии выявлялся прозрачный валик, на месте расположения колонии цвет среды изменялся на коричневый. Виды Y.pseudotuberculosis, Y.kristenseni, Y.frederikseni на ВСА не росли.

Средняя арифметическая числа выросших колоний иерсиний при посеве 100 клеток составила для среды Серова 40±1,2; Рессела - 38±1,4; Плоскирева - 12±1,5; ВСА -10±1,4; Эндо - 61±1,2; СБТС - 64±1,2.

Эффективность диагностических сред для иерсиний оценивали в соответствии с «Инструкцией по бактериологическому контролю диагностических сред для чумного микроба» (1980), согласно которой диагностическая среда признается пригодной, если среднее число выросших колоний на чашке Петри при высеве 100 микробных клеток не менее 50; среда должна обеспечивать рост типичных колоний. Если исходить из

этих положений, то оптимальными средами для выделения иерсиний являются Эндо и СБТС.

Сравнительное изучение физиологических свойств иерсиний и достаточно сходных с ними видов бактерий позволило нам отобрать для их дифференциации минимальный набор признаков (см. схему).

На основе сравнительного анализа и подбора наиболее эффективных методов разработаны и используются в ветеринарной практике «Методические указания по выявлению У.етегосоПйса и У.рзеис1о1иЬегси1о81з в пищевых продуктах животного происхождения» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 26.01.1998), включающие правила взятия материала для бактериологического исследования, методы выделения и идентификации иерсиний.

3. 2. Свойства иерсиний, выделенных на объектах ветеринарно-саннтарного надзора

Видовой состав иерсиний. С целью диагностики иерсиниозов, выявления носительства, обсемененности объектов внешней среды и пищевых продуктов иерсиниями мы проводили бактериологические исследования различных объектов ветеринарно-санитарного надзора: свинокомплексов, птицефабрик, конюшен, хладокомбинатов.

Из патологического материала поросят, павших от болезней с невыясненной этиологией, и фецес поросят, больных желудочно-кишечными заболеваниями, в основном, были выделены культуры микроорганизмов, отнесенных к видам У.еШегосо1Шса (54,6 %) и У.рзеис1оШЬегси1о515 (31,8%) (табл. 2).

Таблица 2

Видовой состав иерсиний

Источник выделения и количество культур

Вид иерсиний Поросята Свиньи Лошади Куры Всего

Абс. %. Абс. % Абс. % Абс. /о Абс. %

У.етегосо)И!са 12 5Ц, 6 4 66,7 0 0 ! 20 17 48,6

У.рзеЫоШЬег-Си1051Э 7 31,8 2 33,0 2 100 2 40 13 37,1

У.Оескпкзеш 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

У.кп51сп5еш 2 9,1 0 0 0 0 2 40 4 11,4

УмтегтссПа 1 4,5 0 0 0 0 0 0 I 2,9

Всего 22 100 6 100 2 100 5 100 35 100

Грамотрицательные, факультативно-анаэробные палочки

+ Оксидаза -

- Каталаза +

I Наличие энтеробактернй I

- На МПА (28°С, 24 ч) размеры колоний менее 1 мм +

- Реакция с метиловым красным +

■ Уреаза +

Д-маннит +

+ Сероводород -

+ Реакция Фогес-Проскауэра, 37°С -

+ Фенилаланнндезаминаза -

+ Лизиндекарбокснлаза -

+ Желатин -

- Цитрат Снммонса -

[ Наличие нерсиний |

+ Реакция Фогес-Проскауэра, 22°С -

+ Сахароза ■

+ Сорбоза

+ Сорбит -

+ Целлобиоза -

- Рам поза +

- Мелибиоза +

У.сгПегосоШка | [ У.рзеи(ШиЬегси1о;8!Г

Схема. Основные этапы дифференциации иеренний

Следует отметить, что Y.enterocolitica были выделены из корня языка и тонкого отдела кишечника поросят, тогда как Y.pseudotuberculosis -из мезентериальных лимфоузлов. Наряду с этим, Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis были выделены из фецес клинически здоровых свиноматок, лошадей, кур, а также объектов внешней среды (воды из поилок, комбикормов).

Из патологического материала и фецес животных реже выделяли Y.kristenseni (11, 4 %) и Y.intermedia (2,9 %), в основном, они были выделены из объектов внешней среды (смывов с кормушек, поилок, пола, стен, комбикормов, воды из поилок).

В промышленных холодильниках были взяты пробы сырья и продуктов животного происхождения: в цехе субпродуктов (3°С) - пробы почек, языков свиных, хвостов говяжьих, печени свиней и крупного рогатого скота; в морозильной камере (-18°С) - смывы с поверхностей и внутренней стороны мороженой свинины; в цехе мясных изделий (3°С) - пробы колбасы одесской. На все указанные виды сырья и продукты имелись сертификаты качества.

В сырье и пищевых продуктах животного происхождения (из свиных языков, куриных окорочков, поверхности мороженой свинины, колбасы) были выделены 17 культур иерсиний. Из них 9 культур (52,9 %) были отнесены к виду Y.enterocolitica, 2 (11,8 %) - Y.kristenseni, 2 (11,%%) - Y.ntermedia, 4 (23,5 %) - Y.frederikseni.

В общей сложности мы изучили и определили видовую принадлежность 64 культур иерсиний, выделенных из патологического материала и фецес поросят, свиней, лошадей, кур, сырья и пищевых продуктов животного происхождения, а также объектов внешней среды. Из них 27 культур (42,2 %) были отнесены к виду Y.enterocolitica, 13 (20,3 %) -Y.pseudotuberculosis, 11 (17,2 %) - Y.kristenseni, 8 (12,5 %) - Y.intermedia, 5 (7,8 °/o) - Y.frederikseni.

Таким образом, было установлено, что Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.intermedia, Y.frederikseni, Y.kristenseni циркулируют на объектах ветеринарно-санитарного надзора с включением в эпизоотическую цепь как животных, так и объектов внешней среды.

В структуре заболеваний животных раннего постнатального периода основное место занимают расстройства деятельности желудочно-кишечного тракта (С.С.Гительсон, 1974, М.А.Сидоров, 1980, Г.Ф.Коромыслов, 1981, Е.С.Воронин, 1989, В.Г.Зароза, 1984, В.В.Субботин, 1997), Учитывая, что при определенных обстоятельствах иерсинии могут явиться этиологическим фактором этих болезней при лабораторной экспертизе патологического материала, с целью достоверного диагноза и обоснованного подбора лечебных средств, необходимо принимать во внимание факт обнаружения иерсиний в органах поросят, павших

от болезней с невыясненной этиологией. При этом следует учитывать как возможность первичной этиологической роли иерсиний, так и вероятность смешанной инфекции.

В интенсивном животноводстве все более возрастает значение факторно-инфекционных болезней, отличительным признаком которых является убиквитарность возбудителей, энзоотичность болезней и неспецифическая, или факторная, обусловленность их возникновения (А.А.Конопаткин, А.А.Глушков, 1991).

Результаты наших исследований и анализ данных литературы позволяют заключить, что иерсиниозы можно отнести к группе вышеуказанных болезней; в комплексе противоэпизоотических мероприятий основное внимание должно быть уделено повышению резистентности животных и созданию нормальных зоогигиенических условий содержания, включая ветеринарно-санитарные разрывы между технологическими и возрастными группами животных.

Циркуляция на объектах животноводства патогенных сероваров иерсиний может приводить к контаминации ими продуктов животноводства, которые являются факторами передачи возбудителей человеку. В этой связи возникает необходимость изыскания и разработки ветеринарно-санитарных нормативов и критериев безопасности сырья и продуктов животного происхождения, с целью предупреждения иерсиниозов человека.

Адгезивные и вирулентные свойства иерсиний. Адгезивные свойства культур иерсиний, выделенных нами из различных источников, изучали на эритроцитах барана, учитывая средний показатель адгезии (СПА) (табл. 3).

Таблица 3

Адгезивные свойства иерсиний

Исследовано Средний показатель адгезии (СПА)

Вид иерсиний культур Высокий Средний Низкий

Абс. % Абс. .% Абс. %

Y.enterocolitica 27 20 74,1 5 18,5 2 7,4

Y.pseudotuberculosis 13 10 76,9 3 23,1 0 0

Y.frederikseni 5 1 20,0 3 60,0 1 20,0

Y.intermedia 8 3 37,5 2 25,0 3 37,5

Y.kristenseni 11 6 54,5 1 9,1 4 36,4

Всего 64 40 62,5 14 21,9 10 15,6

Наиболее выраженные адгезивные свойства присущи Y.pseudotuberculosis (высокий показатель адгезии у 76,9% культур), пто-рыми по адгезивной активности были Y.enterocolitica (высокий показатель адгезии у 74,1% культур), третьими - Y.kristenseni (высокий показатель адгезии у 54,5% культур), четвертыми - Y.intermedia (высокий показатель адгезии у 37,5 % культур), пятыми - Y.frederikseni (высокий показатель адгезии у 20,0% культур).

Вирулентность иерсиний при внутрибрюшинном инфицировании белых беспородных лабораторных мышей различалась: ЛД50 для Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica составила 1,5x107 - 2,5x108 микробных клеток; для Y.intermedia, Y.frederikseni, Y. kristenseni ЛД50 -1,5x109 - 2,5x109 микробных клеток.

При определении вирулентности химическим экспресс-методом установили, что эпизоотические штаммы Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis характеризовались ■ отсутствием пиразинамидазной активности (Руг"), в то время как эпизоотические штаммы Y.intermedia, Y.kristenseni Y.frederikseni обладали этим видом ферментативной активности (Руг4), то есть между вирулентностью и пиразинамидазной активностью иерсиний наблюдалась обратная зависимость (табл. 4).

Таблица 4

Вирулентные свойства и пиразинамидазная активность иерсиний

Вид, серовар Источник выделения ЛД50 ' Пнразнп-лмндазная активность

Y.enterocolitica 03 Корень языка поросенка 1,5x10 Руг'

Y.enterocolitica 06.30 Тонкая кишка поросенка 2,5x10 ' Руг"

Y.enterocolitica 08 Комбикорм 1,5x10 8 Руг'

Y.enterocolitica 09 Тонкая кишка поросенка 2,5x10 ' Руг"

Y.enterocolitica 03 Мороженая свинина 1,5x10 7 Руг'

Y.enterocolitica 09 Свиной язык 2,5x10 ' Руг"

Y.pseudotuberculosis I Фекалии лошади 1,5x10 7 Руг"

Y.pseudotuberculosis II Мезентериальный лимфоузел поросенка 1,5x10 7 Руг"

Y.pseudotuberculosis II Фекалии поросенка 2,5x10 7 Руг-

Y.kristenseni Фекалии свиноматки 1,5x10 9 Руг""

Y.kristenseni Фекалии кур 2,5x10 у Руг+

Y.kristenseni Вода из поилок 1,5x109 Руг*

Y.intermedia Фекалии лошади 2,5x10 9 Руг-

Y.frederikseni Комбикорм 2,5x10 9 Руг*

Y.intermedia Вода из поилок 2,5x10 9 Руг*

Химический экспресс-метод позволил дифференцировать вирулентные и авирулентные свойства иерсиний, поэтому его применение является перспективным для быстрой ориентировочной дифференциации вирулентности различных штаммов и видов иерсиний при эпизоотологическом надзоре.

Чувствительность иерсиний к химиотерапевтическим средствам. При изучении антибиотикочувствительности иерсиний, выделенных на объектах ветеринарно-санитарного надзора, было установлено, что У.егПегосоПиса, У.рзеис1ои1Ьегси1оз18, У.ЫегтесЦа, У.1о^епзет, У.&ес1епкзет были чувствительными к гентамицину, канамицину, лево-мицетину, мономицину, неомицину, тетрациклину, эритромицину; устойчивы к карбенциллину, пенициллину. Отвары лекарственных растений (толокнянки обыкновенной, аронии, листьев брусники, крапивы) оказывали бактерицидное действие на иерсинии при культивировании в термостате при 37°С в течение 24 ч.

3. 3. Влияние факторов внешней среды на рост и популяциониую изменчивость иерсиний

Разработка метода определения числа жизнеспособных клеток иерсиний. Задачей данного этапа исследований являлся подбор количественного метода анализа числа жизнеспособных клеток иерсиний. Сравнивали два метода: 1) серийных разведений в физиологическом растворе, с последующим высевом 0,1 мл на поверхность МПА в чашку Петри (Ф.Герхардт, 1981); 2) серийных разведений в агаризованном физиологическом растворе, с последующим высевом 5-6 капель по 0,1 мл на МПА в одну чашку Петри (Е.И.Васильева, 1988).

При определении количества жизнеспособных клеток У.рзеис1оШЬегси1оз18, У.еШегосоМса, УлЩегте&а, У.йгеёепкБеш, У. ктгепзет было установлено, что количество жизнеспособных клеток иерсиний, определенное двумя методами, существенно не отличалось. Вместе с тем метод серийных разведений в агаризованном физиологическом растворе имел ряд преимуществ: позволил сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды и времени проведения анализа (рис. 1, А). С целью расширения сферы использования метода для анализа смешанных популяций бактерий посевы проводили на поверхность дифференциально-диагностической среды СБТС. Это позволило проводить одновременно количественный и качественный учет: установить процентное соотношение голубого цвета колоний иерсиний, не изменяющих цвет среды (гидролизуют мочевину), и желтого цвета колоний сальмонелл и эшерихий, изменяющих цвет среды (не гидролизуют мочевину).

Для исследования морфологии колоний иерсиний использовали мембранные фильтры, размещенные на поверхности МПА в чашке Петри. Выросшие на мембранных фильтрах колонии фиксировали в парах 25 %-го глутарового альдегида 30-40 мин, после чего колонии приобретали темно-коричневый цвет (рис. I, Б). Затем на поверхность колоний наносили несколько капель пропиленоксида, после чего фильтр полностью растворялся, а колонии бактерий оставались заключенными в тонкий слой агара. Это позволяло с помощью микроскопа (или лупы) подсчитать даже очень мелкие (точечные) колонии иерсиний. Преимущество модификации также заключалось в том, что можно было одновременно изучать количественные изменения в бактериальной популяции и внутрипопуляционные процессы с использованием световой, сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии (см. раздел 3.4).

Рис. 1. Метод серийных разведений в агаризованном физиологическом растворе, с последующим высевом: А. На МПА - число КОЕ У.р8еисЫиЬегси1о81з - 17х107. Б. На мембранный фильтр - число КОЕ У.р5еи<ЫиЬегси1о51« - 7х106

Учитывая, что метод серийных разведений в агаризованном физиологическом растворе прост в исполнении, информативен, дает статистически достоверные результаты, мы использовали его при исследовании динамики гибели бактериальных клеток иерсиний. Экспериментальный материал по использованию указанного метода был взят нами за основу при разработке методических указаний по определению общего микробного числа в пищевых продуктах и объектах внешней среды (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 1999).

Влияние физических и химических факторов. Учитывая, что иер-синии - психротрофные бактерии, мы изучали влияние на культуральные свойства иерсиний различных температур: 4, 25, 37, 42°С. У.еШегосоНиса (03; 05.27; 06.30; 08; 09), У.рзеийотЪегси^з (I; II; III), У.бЫепкБет, У.кш1еп5еш, Ул^егтесНа в полужидком 0,3°/о-ном мясо-пептонном агаре при 4 и 25°С были подвижными, при 37 и 42°С - неподвижными.

На скошенном агаре культуры иерсиний при 4 и 25°С росли в виде бледно-серого налета с ровными краями, при 37 и 42°С образовывали массивный сплошной налет с извилистыми краями.

При росте в бульоне иерсинии при 4 и 25°С давали равномерное помутнение; при 37 и 42°С выпадал хлопьевидный осадок.

Иерсинии на МПА при 4 и 25°С формировали Б-формы колоний -круглые, прозрачные, с ровными краями. При 37 и 42°С, наряду с вышеописанными Б-формами, они формировали Я-формы колоний - шероховатые, непрозрачные, с неровными краями.

При изучении влияния хлорида натрия было установлено, что У.еп1егосо1Шса, У.&ес1епкзеш, У.кп81еп5еш, У-лгЛегтесНа росли на МПА и МПБ с содержанием ЫаС1 10-40 г/л, тогда как У.рзеис1ои1Ьегси1оз1з - с содержанием ЫаС1 10-30 г/л. Изученные виды иерсиний на МПА с содержанием хлорида натрия 10-40 г/л, как правило, наряду с Б-формами, формировали Я-формы колоний. В МПБ с содержанием хлорида натрия 10-40 г/л иерсинии образовывали хлопьевидный псадок.

При изучении-влияния различных значений рН было установлено, что У.етегосоНиса, У.рзеис1ошЬегси1оз1з, У.й^епкзеш, У.кпз1епзет, Y.intermedia способны расти на,МПА и МПБ с концентрацией водородных ионов от 6,7 до 7,5..Иерсинии в бульоне (рН 7,0-7,2) вызывали равномерное помутнение среды, тогда как в бульоне (рН 6,6-6,8 и рН 7,3-7,6) образовывали хлопьевидный осадок. Иерсинии на МПА (рН 7,0-7,2) формировали в-формы колоний. При рН 6,6-6,8 и рН 7,3-7,6 они, наряду с Б-формами, формировали Я-формы колоний (60-70%).

Сроки выживания иерсиний на объектах внешней среды. В

опытах использовали У.еШегосоПИса (03; 05.27; 06.30; 08; 09), У.рзе1^отЬегси1о518 (I; II), У.кпз1епзеш, У-А^епквеш, У.ш1егте<На. Было установлено, что иерсинии сохраняли жизнеспособность в воде при 4°С -90 суток, 22°С - 43 суток; в почве при 4°С - 32 суток, 22°С - 22 суток; в навозе при 4°С - 28 суток, 22°С - 12 суток.

На тест-объектах (деревянных, бетонных, железных и кирпичных) иерсинии сохраняли жизнеспособность при 4°С до 30 суток, тогда как при 22°С до 22 суток.

В комбикормах У.еШегосоНйса, У.йЫепкэеш, У.ииегп^1а, У.кпз1еп5еш выживали 75 суток (срок наблюдения), У.р5е1^оШЬегси1оз1з (I, II) - 55 суток. В увлажненных кормах при температуре 23°С иерсинии

не только длительно сохранялись, но и размножались. В частности, в комбикормах исходная концентрация бактерий составляла 1x1О5 микробных клеток, через 24 ч количество бактерий составляло 1,6x105, через 48 ч -6x107, через 72 ч - 6x108 микробных клеток.

При изучении выживаемости иерсиний в мясе и мясопродуктах было установлено, что в говядине и свинине при 4°С иерсинии выживали 35 суток (срок наблюдения); при - 18°С - 75 суток (срок наблюдения). В свином фарше (при 4°С) иерсинии способны были размножаться: исходная концентрация бактерий составляла 1-1,3x105 микробных клеток, через 24 ч количество бактерий составляло 1,7-1,8x106, через 48 ч - 7-9x105, через 72 ч - 7-10х104, через 90 ч -7,1-9х104 микробных клеток.

Таким образом, иерсинии сохраняли жизнеспособность на объектах внешней среды и пищевых продуктах, при благоприятных условиях размножались в них, поэтому контаминация пищевых продуктов может иметь место вдоль всей технологической цепочки: от кормов до готового продукта, и требует осуществления ветеринарно-санитарного контроля за всеми звеньями пищевой цепи.

Влияние биологических факторов. При изучении внутривидового и межвидового антагонизма иерсиний установили, что Y.enterocolitica се-ровар 08 подавляли рост серовара 05.27 и серовара 06.30 (средняя величина зон задержки роста составила 18,1±2,45 мм). Культуры Y.kristenseni, Y.enterocolitica 08, Y.intermedia, Y.frederikseni подавляли рост S.enteritidis, S.typhimurium, K.pneumonia (средняя величина зон задержек роста бактерий составила 19,2±1,94 мм).

Культуры изученных видов иерсиний не препятствовали росту микроорганизмов видов: Proteus vulgaris, Providencia rettgeri, Morganella morgani, Pseudomonas aeruginosa, Staphilococcus aureus, Streptococcus 4. agalactiae, Campylobacter fetus sb. fetus, C.jejuni, E.coli.

Культуры микроорганизмов L.fermentum, L.plantarum, L.helveticum, L.acidofillum, B.polimixa угнетали рост изученных видов иерсиний (средняя величина зон задержек роста составила 20,2+1,75 мм). Причем зоны задержки роста, вызванные лактобактериями, были значительно больше зон, вызванных B.polimixa. B.subtilis, B.cereus не вызывали угнетения роста иерсиний.

При иерсиниозах составной частью профилактических мероприятий является соблюдение ветеринарно-санитарных правил по сбору и использованию животноводческих стоков и навоза для удобрений, так как не исключена возможность обсеменения иерсиниями овощей на полях в зоне природных очагов. Поэтому мы изучили взаимодействие иерсиний с флокулирующими бактериями Z.ramigera, которые, как известно, являются

составной частью микробиоценоза активного ила аэротенков при биологической очистке сточных вод.

Влияние флокулирующих бактерий на численность популяций иер-синий оценивалась по колониеобразующей активности бактериальных клеток иерсиний. Флокулирующие бактерии снижали численность иерси-ний, включая их в структуру формирующихся флокул. В частности, в опыте через 24 ч количество КОЕ иерсиний уменьшилось на один порядок, через 48 и 72 ч — на два порядка, то есть за 48 и 72 ч взаимодействия происходило снижение КОЕ иерсиний с 1х107 до 1х105. Причем большая часть выживших иерсиний формировали R-формы колоний. В контроле количество КОЕ иерсиний в течение 24-72 ч не изменялось, и они формировали характерные S-формы колонии.

Таким образом, флокулирующие бактерии способны включать условно-патогенные и патогенные бактерии (в том числе иерсинии) в структуру формирующихся флокул, поэтому для повышения эффективности очистки сточных вод в биоценозе активного ила аэротенков можно использовать бактерии Z.ramigera.

На основании результатов данного этапа исследований нами были разработаны «Методические рекомендации по определению степени фло-куляции микробиоценоза активного ила в аэротенках», рекомендованные для отбора штаммов с высокой биофлокулирующей активностью.

В естественных биоценозах популяции иерсиний взаимодействуют не только с микроорганизмами, но и с грибами, простейшими, гельминтами и т.д., поэтому одной из задач явилось изучение межпопуляционных взаимодействий иерсиний и простейших (Tetrachimena pyriformis и Paramecium caudatum).

Количественная оценка межпопуляционных взаимодействий выявила, что в опыте исходная концентрация иерсиний 108 микробных клеток снижалась через 5 суток на 3 порядка (105 микробных клеток); через 7 суток - на 4 порядка (104 микробных клеток) и поддерживалась на этом уровне в течение 10 суток (срок эксперимента). Причем большая часть выживших иерсиний формировали R-формы колоний. В контроле исходная концентрация иерсиний 108 микробных клеток снижалась через 5 суток на 2 порядка (106 микробных клеток) и поддерживалась на этом уровне в течение 10 суток (срок эксперимента).

Таким образом, воздействие факторов внешней среды вызывало диссоциацию иерсиний.

3. 4. Электронно-микроскопическое исследование иерсиний in vitro

Изучение морфологии бактериальных клеток, их адгезии и формирования микроколоний на различных объектах внешней среды открывает перспективные возможности для предотвращения этих процессов.

С использованием сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии была изучена морфология и ультраструктура Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.frederikseni, Y.intermedia, Y.kristenseni. У микроорганизмов выращенных на МПБ при 18-25°С обнаруживались перетрихи-альные жгутики (рис. 2, А).

При изучении ультраструктуры установили, что бактериальные клетки иерсиний имели извилистую клеточную стенку, под ней располагалась цитоплазматическая мембрана. Цитоплазма была представлена ос-миофильным гранулярным компонентом; диаметр гранул варьировал в пределах 2,0-2,5 нм. Вдоль продольной оси клетки располагался нук-леоид, выявляемый как осмиофобная зона с диффузно расположенными тонкими осмиофильными нитями ДНК толщиной 2-3 нм.

В бактериальных клетках Y.pseudotuberculosis были выявлены округлые, правильной формы осмиофильные включения, которые по мор-фометрической характеристике сходны с включениями вошотина, обнаруженными у E.coli (А.В.Куликовский, 1979).

Деление иерсиний было типичным для грамотрицательных бактерий, то есть - образованием перетяжки, которая формировалась по центру бактериальной клетки и перешнуровывала клетку на две равноценные дочерние особи.

Таким образом, Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.frederikseni, Y.intermedia, Y.kristenseni имели типичное для грамотрицательных бактерий строение.

Используя разработанный нами метод получения монослойных культур иерсиний с последующей щадящей фиксацией и обезвоживанием, мы изучили морфологию иерсиний без нарушения естественной архитектоники колоний.

При изучении монослойных культур иерсиний, выросших в жидких питательных средах, было выявлено, что микроорганизмы находятся в ассоциации, несколько бактериальных клеток объединялись тонким слоем электронно-плотного вещества (рис. 2, Б).

При исследовании колоний иерсиний, выросших на МПА, установили, что бактериальные клетки в составе колонии находятся в ассоциации и секретируют экзоцеллюлярные вещества (слизь), которые выявляются на поверхности бактерий в виде покрова (рис. 2, В). В центральной части колоний иерсиний покров более развит, чем на периферии; между бактериальными клетками выявлялись анастамозы.

Рнс. 2. У.егиегосоШка (перетрнхиальныежгутикн);х20000 (А); У.р5еи<ШиЬсгси1о5 х8000 (Б); Y.pseudotuberculosis, покров —х12000 (В); У.еШегоЫШса, нитевидн структура; х 10000 (Г); адгезия У.рзе^оШЬегЫоз!: к говядине; х 5600 (Д); адгез! У.р5е1^о(нЬегси1о$15 к эритроцитам; х 6000 (Е)

Исследование ультратонких срезов колоний иерсиний показало, что ассоциативная связь клеток осуществляется через тонкие капсулоподоб-ные фибриллы, являющиеся, по нашему мнению, элементами покрова. Проведенный нами цитохимический анализ (реакция с рутением красным) выявил специфическое окрашивание экзоцеллюлярных образований, указывающее на полисахаридную природу покрова.

Следует отметить, что наличие покровов было выявлено нами как у музейных, так и у эпизоотических штаммов иерсиний. Однако у свежевы-деленных культур иерсиний покровы были выражены в большей степени. По нашему мнению, капсулоподобный покров служит матриксом колонии, играющим определенную роль в межклеточных взаимодействиях бактерий.

С помощью сканирующей электронной микроскопии выявлены длинные тонкие нитевидные структуры, располагающиеся по краю бактериальных колоний. На поверхности или внутри таких структур обнаружены клетки (0,25-0,3 мкм) шаровидной формы, участвующие в формировании микроколоний (рис. 2, Г).

Используя оригинальную методику, с помощью сканирующей электронной микроскопии нам удалось изучать морфологию иерсиний на различных объектах внешней среды (частицах корма, яичной скорлупы, пищевых продуктов). При этом было выявлено, что в первые часы контаминации указанных объектов иерсинии адгезировали к их поверхности (рис. 2, Д). В более поздние сроки эксперимента (14-96 ч) на поверхности опытных образцов было выявлено множество микроколоний, сходных по строению с микроколониями, выросшими на поверхности плотных питательных сред. В отдельных участках выявлялись единичные клетки без покровов, которые имели неправильную уплощенную форму, количество таких клеток было незначительным, мы полагаем, что основная их часть нежизнеспособна. Следовательно, происходит селекция бактерий по признаку максимальной способности к адгезии с последующей колонизацией.

Изучая адгезию иерсиний на эритроцитах в сканирующем электронном микроскопе, мы наблюдали плотный контакт между бактериями и эритроцитами. Как правило, бактериальные клетки были объединены между собой межклеточным матриксом - покровом (рис. 2, Е).

В отличие от капсулы покровы не прочно связаны с клеточной стенкой бактерий, клетки с покровами у энтеропатогенных бактерий, например, сальмонелл более устойчивы к воздействию неблагоприятных факторов, чем клетки без покровов (А.У.КоиПкоузкп е! а1., 1992).

Учитывая вышесказанное, мы провели эксперименты по изучению роли покровов иерсиний при воздействии неблагоприятных факторов. Исследовали две группы клеток: первая - осторожно смытые колонии с поверхности МПА; вторая - после интенсивного их встряхивания. Для этой

цели использовали touch-mixer «Model 4721-00» и центрифугирование при 3000 об/мин - 15 мин. Было обнаружено, что бактерии после интенсивного встряхивания и центрифугирования теряли покровы. Это свидетельствовало о том, что покровы не являются элементом структуры бактериальных клеток, а относятся к продуктам их жизнедеятельности.

Затем нами была изучена устойчивость клеток с покровом и без покрова: при воздействии на них неблагоприятных факторов внешней среды. При воздействии температуры 55°С (экспозиция 30 мин) число КОЕ составило: без покрова - Y.enterocolitica 03 - 19х103, Y.pseudotuberculosis I -18х103, с покровом Y.enterocolitica 03 - ЗбхЮ5, Y.pseudotuberculosis I -38x105. Сравнение концентраций бактерий в суспензии при воздействии 0,05%-го NaOH (15 мин), 0,01%-го хлорамина Б (15 мин) также показало большую устойчивость клеток с покровом.

Результаты экспериментов позволяют заключить, что экзоцеллюляр-ные структуры иерсиний, выявленные на питательных средах, образцах пищевых продуктов, при взаимодействии с эритроцитами морфологически были сходными и представлены покровами. Показано, что экзоцеллюляр-ные структуры иерсиний могут участвовать в адгезии и выполняют защитную функцию при воздействии неблагоприятных факторов на микробную популяцию.

3. 5. Цитоморфометрическое исследование иерсиний на пищевых продуктах

При проведении цитоморфометрического исследования образцов говядины и свинины, экспериментально контаминированных иерсиниями, в соединительнотканных прослойках (эндомизии и перемизии) мяса было обнаружено наличие диффузно расположенной микрофлоры. В образцах вареной колбасы, экспериментально контаминированной иерсиниями, микрофлора обнаруживалась на поверхности со стороны нанесения и под оболочкой; в более поздние сроки эксперимента бактерии располагались в вакуолях.

Методом компьютерной телевизионной морфоденситометрии (КТМДМ) мы выявили четкую разницу микроструктурных характеристик и морфометрических показателей контрольных и опытных образцов мяса и мясопродуктов, что позволило достаточно быстро выявить не только наличие бактерий, но и подсчитать их количество. Метод КТМДМ позволил автоматизировать микроскопию и морфометрию микроструктурных изменений мяса и мясопродуктов.

3.6. Популяционная изменчивость иерсиний

Задачей данного этапа исследований явилось изучение морфологии S-R форм колоний, выросших при воздействии факторов внешней среды. С помощью сканирующего электронного микроскопа было выявлено, что S-формы колоний иерсиний имели круглую форму и ровные края. Палочковидной формы клетки располагались под покровом и плотно прилегали друг к другу (рис. 3, А, Б). На ультратонких срезах иерсинии имели типичное для вида строение.

R-формы колоний иерсиний имели также круглую форму, но неровные, изрезанные края. Несмотря на то, что бактериальные клетки располагались под покровом, целостность его на многих участках нарушалась, поэтому внешний вид колонии имел разрыхленную структуру. Под покровом, наряду с типичными для данного вида бактериальными клетками, были обнаружены клетки с дефектной клеточной стенкой, шаровидные клетки (сферопласты, протопласты, L-формы), игольчатые и гигантские структуры, клетки-ревертанты (рис. 3, В-Д). Это свидетельствовало, что в R-формах колоний с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии обнаружен гетероморфизм популяции иерсиний, по морфологии свойственный L-трансформации бактерий.

Как было выявлено нами, иерсинии вступали во взаимодействие с бактериями и простейшими (см. раздел 3. 3). Для более детального изучения этих процессов была использована сканирующая электронная микроскопия.

При электронно-микроскопическом исследовании микробного антагонизма между штаммом-антагонистом (лактобактериями) и тест-культурой (иерсиниями) в участках визуального угнетения роста микроорганизмов выявлялись гетероморфные клетки и структуры, свойственные L-трансформации бактерий (рис. 3, Е).

Для исследования взаимодействия иерсиний и инфузорий нами был модифицирован метод подготовки препаратов для световой и сканирующей электронной микроскопии, основанный на иммобилизации простейших и бактерий на покровных стеклах.

При изучении взаимодействия иерсиний с Tetrachimena pyriformis и Paramecium caudatum в сканирующем электронном микроскопе была выявлена ассоциация бактериальных клеток и простейших. Как правило, наряду с палочковидными бактериями, выявлялись гетероморфные клетки и структуры, по морфологической характеристике соответствующие клеткам, характерным для L-трансформации бактерий (рис. 3, Ж).

Морфометрические показатели гетероморфных клеток иерсиний приведены в табл. 5.

Рис. 3. Фрагменты в-форм колоний иерсиний; хбООО (А, Б); участ гетероморфного роста К-форм колоний иерсиний; хбООО (В-Д); гетероморфные клет в участке взаимодействия иерсиний и лактобактерий; хбООО (Е); яссоцнац Те^асЫтепа рупГогпш и У.р5сисЫиЬегс1|1о515; х3500 (Ж);

Таблица 5

Морфометрпческие показатели бактериальных клеток и структур иерсиний

Бактериальные гаетка . : в структуры .. ■' -Ли;;? 'V.1 1 Морфометрпческие показатели .,-.

Оптическая плотяоеть • Фактор 'формы

Палочковидной формы клетки 222,06±3,10 15,08±0,20 0,79±0,09

Клетки с дефектной клеточной стенкой 257,07±0,01 20,09±0,06 0,76±0,01

Сферопласты и протопласты 308,77±0,18 16,44±0,1 0,93±0,04

Гигантские структуры 569,71+0,15 8,83+0,7 0,76+0,02

Нитевидные структуры 127,08±0,34 22,82±0,12 0,90+0,16

Ь-формы 28,81±0,19 8,63±0,15 1,18+0,01

Таким образом, при воздействии факторов внешней среды обнаружен гетероморфизм популяции иерсиний, что свидетельствует о пластичности и изменчивости иерсиний, присущей циклу развития бактериальной популяции, объясняет широкое распространение их в природе и обусловливает необходимость использования сред обогащения при выделении чистой культуры иерсиний. Следует отметить, что гетероморфные клетки и структуры иерсиний соответствовали основным этапам L-трансформации, описанным у других видов бактерий (В.Д.Тимаков, Г.Я.Каган, 1973, С.ВЛрозоровский и др., 1981, И.А.Бакулов и др., 1997, И.Б.Павлова, 1999).

Результаты исследований позволяют заключить, что колония иерсиний - многоклеточное сообщество с упорядоченным строением и дифференциацией клеток в зависимости от условий культивирования. Мы полагаем, что способность иерсиний объединяться в колонии за счет синтеза межклеточного матрикса и внутрипопуляционная изменчивость раздвигают границы выживаемости вида, что позволяет этим бактериям заселять различные экологические ниши.

3. 7. Электронно-микроскопическое исследование иерсиний in vivo

Для объективного понимания биологии и экологии иерсиний, особенно учитывая тот факт, что они относятся к энтеропатогенным бактериям, мы провели исследования изменений органов и тканей при экспериментальном иерсиниозе. С целью экспериментального воспроизведения иерсиниоза белых беспородных лабораторных мышей заражали культурами Y.enterocolitica 03 и 09 (интрагастральная инокуляция) в дозе 5х108 микробных клеток. Указанные культуры микроорганизмов были выделены

нами из тонкого отдела кишечника поросят, погибших от болезней с невыясненной этиологией. У всех подопытных мышей через 1-2 суток с момента заражения наблюдали угнетение, отсутствие аппетита, жажду и диарею. Гибель 100% подопытных животных наступала на 2-4 сутки с момента заражения. Из фекалий, содержимого тонкого отдела кишечника, крови и паренхиматозных органов подопытных мышей были выделены культуры У.егиегосоПиса 03 и 09. Патологоанатомические изменения характеризовались развитием острого серозно-фибринозного энтерита. При электронно-микроскопическом исследовании обнаружили, что ворсинки тонкого отдела кишечника контрольных мышей имели объемную конусообразную форму (рис. 4, А).

Рис. 4. Ворсинки тонкого отдела кишечника контрольных мышей; хбОО (А). Ворсинки топкого отдела кишечника опытных мышей; хбОО (Б)

У опытных мышей ворсинки тонкого отдела кишечника были не объемные, а как бы спавшиеся; апикальная поверхность каемчатых энте-роцитов была бугристой, нередко разрыхленной, за счет инвазии бактериальными клетками (рис. 4, Б). На поверхности эпителия ворсинок выявляли наличие палочковидных бактериальных клеток, сходных по морфо-метрическим показателям с иерсиниями, большинство клеток располагались под покровом. Наряду с палочковидными клетками были выявлены гетероморфные клетки (сферопласты, протопласты, игольчатые структуры), свойственные Ь-трансформации бактерий. Наличие Ь-трансформации иерсиний можно рассматривать как один из факторов, обусловливающих длительность персистенции иерсиний в теплокровном организме. Мы полагаем, что ворсинки тонкого отдела кишечника опытных мышей имели уплощенную форму за счет проявления адгезивных, инвазивных и цито-токсических свойств иерсиний.

3-4

Принимая во внимание тот факт, что куры могут быть носителями возбудителей иерсиниозов, а также малошученность вопроса, мы провели экспериментальное заражение иерсиниями кур (порода белый леггорн, возраст 2 года). Кур заражали культурами Y.enterocolitica 03 и 09 (интраназальная и внутримышечная инокуляция), в дозе 5x108 микробных клеток. У подопытных кур в течение 15 суток (срок эксперимента) не наблюдали видимых клинических изменений, на 7, 9, 15 сутки эксперимента проводили диагностический убой птицы. Культуры Y.enterocolitica 03 и 09 были выделены из содержимого тонкого отдела кишечника и фекалий. В сканирующем электронном микроскопе ворсинки тонкого отдела кишечника контрольных кур имели объемную конусообразную форму. На. поверхности эпителия отдельных ворсинок тонкого отдела кишечника опытных кур были выявлены бактериальные клетки, сходные по морфо-метрическим показателям с иерсиниями, большинство бактериальных клеток располагались под покровом.

Результаты экспериментов позволяют заключить, что in vivo бактериальные клетки иерсиний продуцируют в межклеточное пространство эк-зоцеллюлярные вещества, которые выявляются в сканирующем электронном микроскопе в виде покровов и участвуют в адгезии бактериальных клеток к поверхности энтероцитов тонкого отдела кишечника мышей и кур. Важным, по нашему мнению, является тот факт, что покровы, выявленные у бактерий in vivo и in vitro, морфологически были сходными. Из этого следует, что механизм образования экзоцеллюлярных веществ иерсиниями in vitro и in vivo может быть универсальным.

3. 8. Научное обоснование и разработка мероприятий, направленных на профилактику иерсиниозов

Проведенные нами эксперименты и данные анализа литературы показали, что Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis относятся к бактериям с широким диапазоном адаптивных свойств: они способны длительное время сохраняться (при благоприятных условиях размножаться) на различных объектах внешней среды. Наряду с этим данные микроорганизмы способны паразитировать в организме теплокровных, что свидетельствует об их широкой экологической пластичности. Поэтому завершающим этапом наших исследований явилось научное обоснование комплекса противо-эпизоотических мероприятий, направленных на предупреждение распространения возбудителей иерсиниозов среди животных.

Одним из ключевых моментов профилактики инфекционных болезней, включая иерсиниозы, является разработка надежных режимов дезинфекции животноводческих предприятий, поэтому мы провели исследования по установлению бактерицидных концентраций физико-химических дезинфицирующих средств на Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis,

УлШегтесЦа, У.й^епкэет, У.кп51епзеш в сравнении с Е.соН. Установлено, что действие 1%-го едкого натра, 0,1%-го перамина, 0,1%-го алка-мона, 0,1%-го хлорамина, 0,1%-го формальдегида, 1%-го раствора перекиси водорода вызывало гибель иерсиний через 12 мин, эшерихий через 15 мин. Бактерицидная активность 1%-го едкого натра, 0,1 %-го хлорамина, 0,1%-го формальдегида, 1%-го раствора перекиси водорода на тест-объектах (метлахской, глазурованной, металлической плитках) по отношению к иерсиниям и эшерихиям наблюдалась через 10 и 15 мин (соответственно). Облучение ультрафиолетовыми лучами (излучение с длинами волн 320 нм) действовало бактерицидно на иерсинии и эшерихии в течение 3-5 мин (соответственно).

Вышеуказанные эксперименты позволили установить, что в целом, устойчивость иерсиний к дезинфицирующим препаратам ниже, чем у эшерихий, это позволило научно обосновать возможность включения иерсиний в малоустойчивую группу (первая группа) в инструкции «Проведение ветеринарной дезинфекции объектов животноводства» (М., 1989).

Другим важнейшим профилактическим мероприятием при иерси-ниозах является предохранение от обсеменения иерсиниями пищевых продуктов - потенциальных факторов передачи бактерий человеку и разработка ветеринарно-санитарной оценки продуктов убоя животных. В. этой связи были проведены сравнительные исследования устойчивости иерсиний и эшерихий к тепловому воздействию. Было установлено, что при воздействии на бактерии температуры 59°С гибель иерсиний наступала через 10 мин, эшерихий через 15 мин. При нагревании до 60-80°С иерсинии погибали через 5 мин, тогда как эшерихии - через 15 мин; при кипячении (100°С) иерсинии и эшерихии погибали в течение 3-5 с (соответственно).

Для изучения возможности выживания иерсиний в процессе выработки вареной колбасы нами были проведены эксперименты в модельных системах с искусственной контаминацией иерсиниями мясного фарша. В опытах использовали культуры У.еЩегосо1Шса (03, 08, 09), выращенные при 25°С на скошенном мясо-пептонном агаре. Культуры бактерий вносили в мясной фарш в виде суспензии, содержащей У.еп1егосо1Шса в концентрации 107 микробных клеток. При производстве вареной колбасы «Отдельная» из экспериментально контаминированного иерсиниями фарша использовали общепринятые температурные режимы: 85°С, в течение 70 мин; по достижении температуры в центре батона (диаметром 5 см) 70°С. При исследовании проб колбасы на наличие иерсиний ни в одном случае эти бактерии не были выделены, то есть термическое воздействие, предусмотренное технологическим процессом изготовления вареной колбасы, приводило к гибели бактериальных клеток иерсиний. Это позволило нам сделать заключение, что при отсутствии истощения и поражении только отдельных органов или лимфатических узлов туши животных

можно использовать для выработки вареных колбас. На основании результатов исследований нами (совместно с И.Г.Серегиным, М.Ю.Штукаревой) были разработаны методические указания «Ветеринарно-санитарная оценка и экспертиза продуктов убоя при иерсиниозе» (М., 1998).

С целью профилактики контаминации туш в процессе убоя и переработки животных, охлаждения и замораживания мяса особое внимание следует уделять вопросам санитарии и гигиены. В частности, необходимо соблюдать существующие ветеринарно-санитарные правила при убое животных, разделке, нутровке и осмотре туш. Учитывая, что иерсинии являются комменсалами ротовой полости свиней, следует особое внимание уделять дезинфекции ножей и рук персонала после вскрытия лимфатических узлов в области головы и шеи. Быстрое охлаждение и замораживание мяса до минус 18°С исключает размножение в нем иерсиний, поэтому необходимо осуществлять строгий контроль температурно-влажностного режима при холодильном хранении и не допускать размораживания мяса без последующей его быстрой термической обработки.

Средства специфической профилактики при иерсиниозах не разработаны, поэтому основное внимание должно быть уделено повышению общей резистентности животных и созданию нормальных зоогигиениче-ских условий содержания, включая ветеринарно-санитарные разрывы между технологическими и возрастными группами животных.

Основой профилактики иерсиниозов новорожденных животных является соблюдение ветеринарно-санитарных правил отелов (окотов, опоросов) и своевременное скармливание новорожденным животным молозива.

При наличии диареи невыясненной этиологии в животноводческом хозяйстве (особенно у молодняка) следует проводить бактериологические исследования с целью выявления возбудителей иерсиниозов. При обнаружении возбудителей заболевания больных животных изолируют и лечат, в животноводческом помещении проводят дезинфекцию и дератизацию.

Таким образом, меры борьбы с иерсиниозами основаны на проведении комплекса организационно-хозяйственных, ветеринарно-санитарных и зоогигиенических мероприятий, обеспечивающих: повышение резистентности организма животных, а также предотвращение заражения но-. ворожденных возбудителями болезней через объекты внешней среды; создание оптимальных условий содержания и кормления животных; соблюдение ветеринарно-санитарных правил сбора и использования животноводческих стоков и навоза для удобрений; контроль сырья и продукции животного происхождения на иерсиниозы.

Выводы

1. На основе сравнительного анализа и подбора наиболее эффективных бактериологических методов установлена циркуляция иерсиний на объектах ветеринарно-санитарного надзора. Из патологического материала и фекалий поросят, свиней, лошадей, кур; сырья и пищевых продуктов животного происхождения, а также объектов внешней среды выделены 64 культуры микроорганизмов; Y.enterocolitica 27 культур (42,2%), ^pseudotuberculosis - 13 (20,3%), Y.kristenseni - 11 (17,2%), Y.intermedia -8 (12,5%), Y.frederikseni - 5 (7,8%).

2. Установлено, что Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica, Y.intermedia, Y.kristenseni Y.frederikseni, в зависимости от температурного фактора, сохраняют жизнеспособность на тест-объектах 9-30 суток, воде 43-90 суток; почве 22-32 суток; навозе - 12-22 суток; комбикормах - 55-75 суток; говядине и свинине - 35-75 суток.

3. Показано, что для Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica при внут-рибрюшинном инфицировании лабораторных мышей, ЛДз0 . 1,5x107 -2,5x108 микробных клеток (соответственно) и они характеризуются отсутствием пиразинамидазной активности, тогда как для Y.intermedia, Y.frederikseni, Y.kristenseni, обладающих этим видом ферментативной активности, ЛД50 - 1,5x109 - 2,5x109 микробных клеток. Наличие обратной корреляции между вирулентностью и пиразинамидазной активностью позволяет использовать пиразинамидазный тест для дифференциации вирулентных и авирулентных свойств иерсиний.

4. Разработан и осуществлен новый подход в изучении биологии и экологии иерсиний - использование комплекса электронно-микроскопических и морфометрических методов в сочетании с бактериологическими и гистологическими исследованиями - для выявления факторов патогенности, внутрипопуляционной изменчивости иерсиний in vivo и in vitro, пределов адаптации психротрофных бактерий к изменяющимся условиям среды обитания.

5. Установлено, что клетки иерсиний in vitro и in vivo в процессе формирования микроколоний и колоний, продуцируют экзоцеллюлярные вещества - покровы, осуществляющие межпопуляционные взаимодействия, процессы адгезии и колонизации, а так же защиту микробной популяции от воздействия неблагоприятных факторов.

6. Методом электронно-микроскопического и цитохимического исследования единичных колоний установлено, что иерсинии имеют типичную для грамотрицательных бактерий ультраструктуру, клетки находятся в ассоциации за счет межклеточного матрикса полисахаридной природы, являющегося элементом покрова.

7. При воздействии неблагоприятных факторов наблюдается внутрипопуляционная изменчивость иерсиний, выражающаяся дис-

социацией на S-R-формы колоний. В S-формах клетки имеют типичную для вида палочковидную форму. В R-формах, наряду с типичными для данного вида клетками, обнаружен гетероморфизм по морфологии свойственный L-трансформации бактерий.

Выявленный гетероморфизм клеток свидетельствует о пластичности и изменчивости иерсиний, присущей циклу развития бактериальной популяции, что объясняет широкое распространение их в природе и обусловливает необходимость использования сред обогащения при выделении чистой культуры микроорганизмов.

8. С помощью сканирующей электронной микроскопии выявлены длинные тонкие нитевидные структуры, располагающиеся по краю бактериальных колоний иерсиний. На поверхности или внутри таких структур обнаружены клетки (0,25-0,3 мкм) шаровидной формы, участвующие в формировании микроколоний.

9. На основании сравнительного электронно-микроскопического изучения морфологии Y.enterocolitica, ^pseudotuberculosis, Y.intermedia, Y.frederikseni, Y.kristenseni на клеточном, субклеточном и популяционном уровнях установлено, что колония иерсиний является многоклеточным сообществом с упорядоченным строением и дифференциацией отдельных клеток в зависимости от среды обитания.

10. С использованием сканирующей электронной микроскопии на эпителии ворсинок слизистой оболочки тонкого отдела кишечника мышей и кур, экспериментально зараженных иерсиниями, выявлены палочковидные бактерии, располагающиеся под покровом.

11. Разработаны и используются в ветеринарной практике методические указания по выявлению Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis в пищевых продуктах животного. происхождения, включающие: правила взятия материала для бактериологического исследования, методы выделения и идентификации возбудителей по биологическим свойствам.

12. Разработаны:

• метод определения числа бактериальных клеток иерсиний, позволяющий изучать не только количественные изменения в бактериальной популяции, но и межпопуляционные процессы с использованием световой и электронной микроскопии;

• метод определения степени флокуляции микробиоценоза активного ила в аэротенках, позволяющий изучать механизм взаимодействия иерсиний с флокулирующими бактериями, грибами, микроводорослями, простейшими;

• метод подготовки препаратов для изучения степени адгезии иерсиний, позволяющий изучать механизм взаимодействия прокариотической и эукариотической клеток in vitro;

• метод подготовки препаратов для изучения патоморфологии экспериментального иерсиниоза in vivo.

13. Установлено, что иерсинии чувствительны к гентамицину, кана-мицину, левомицетину, мономицину, неомицину, тетрациклину, эритромицину и отварам лекарственных растений - толокнянки обыкновенной, аронии, листьев брусники, крапивы. L.fermentum, L.plantarum, L.helveticum, L.acidofillum, B.polimixa-продуценты биологически активных веществ, угнетают рост иерсиний. Флокулирующие бактерии активного ила очистных сооружений аэротенков снижают численность иерсиний, включая их в полисахаридный матрикс формирующихся флокул.

14. На основании результатов изучения биологии и экологии иерсиний, научно обоснованы и предложены для практики режимы дезинфекции животноводческих помещений и ветеринарно-санитарная экспертиза туш и продуктов убоя, а также общие ветеринарно-санитарные меры, осуществление которых приведет к эффективной профилактике иерсинио-зов у животных и человека.

Практические предложения

На основании полученных результатов были разработаны и утверждены следующие документы:

• Методические указания по выявлению Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis в пищевых продуктах животного происхождения, утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ (М., 1998);

• Методические указания по определению общего микробного числа в пищевых продуктах и объектах внешней среды, утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ (М., 1998);

• Методические рекомендации по подготовке препаратов для изучения степени адгезии микроорганизмов с клетками животных в световом и сканирующем электронном микроскопе, утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ (М., 1999);

• Методические рекомендации по определению степени флокуля-ции микробиоценоза активного ила в аэротенках, утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ (1999).

Материалы исследований нашли применение в учебном процессе Московского государственного университета прикладной биотехнологии в лекциях и методических указаниях для студентов ветеринарно-санитарного факультета и для слушателей ФПК. На основании комплексных исследований разработаны и внедрены следующие документы:

• Методические указания к практическим занятиям для студентов "Лабораторная диагностика иерсиниоза", М.: МГУПБ, 1997;

• Методические указания к практическим занятиям для студентов «Средства и меры личной профилактики при зооантропонозах». М.: МГУПБ, 1997;

• Методические указания к практическим занятиям для студентов «Ветеринарно-санитарная оценка и экспертиза продуктов убоя при иерси-ниозе». М.: МГУПБ, 1998.

• Лекция для слушателей ФПК: «Лабораторная диагностика и профилактика иерсиниоза», утвержденная Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ (М., 1999).

• Учебное пособие. Функциональная морфология органов пищеварения. М.: МГУПБ, 2000.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Куликовский A.B., Павлова И.Б., Джентемирова (Ленченко) Е.М., Айвазян М.А. Изучение поведения иерсиний и грибов Candida в популяции на объектах внешней среды с помощью сканирующей электронной микроскопии // Тезисы докладов III Всесоюзной конференции по эпизоотологии. Новосибирск, 24-26 сентября 1991. С. 371-373.

2. Павлова И.Б., Куликовский A.B., Джентемирова (Ленченко) Е.М., Дроздова Т.Д. Экология бактерий в популяции // Вестник сельскохозяйственной науки. 1990, № 2. С. 75-78.

3. Павлова И.Б., Куликовский A.B., Ботвинко И.В., Джентемирова (Ленченко) Е.М., Дроздова Т.Д. Электронно-микроскопическое исследование развития бактерий в колониях. Морфология колоний бактерий // ЖМЭИ. 1990, №9. С. 15-20.

4. Павлова И.Б., Куликовский A.B., Ботвинко И.В., Джентемирова (Ленченко) Е.М., Дроздова Т.Д. Электронно-микроскопическое исследование развития бактерий в колониях. Гетероморфный рост бактерий в процессе естественного развития популяции // ЖМЭИ. 1990. № 12. С. 1215.

5. Куликовский А.В, Джентемирова (Ленченко) Е.М. Иерсиниоз -актуальная проблема ветеринарной медицины // Ветеринария. 1993. № 1112. С. 28-35.

6. Джентемирова (Ленченко) Е.М., Куликовский A.B., Штукарева М.Ю. Психрофильные патогенные микроорганизмы в мясе - это опасно // Мясная промышленность. 1994. № 6. С. 15-16.

7. Джентемирова (Ленченко) Е.М., Куликовский A.B., Штукарева М.Ю. Иерсиниоз сельскохозяйственных животных // Сельскохозяйственная биология. 1995. № 6. С. 15-25

8. Ленченко Е.М. Популяционная изменчивость иерсиний // Материалы международной научно-практической конференции молодых уче-

ных и специалистов: «Повышение эффективности агропромышленного производства в условиях современных форм хозяйствования». Воронеж. 1995. С. 120-121.

9. Ленченко Е.М. Циркуляция иерсиний на объектах животноводства и продуктах животного происхождения // Материалы международной конференции: «Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК». М., 1995. С. 45.

Ю.Штукарева М.Ю., Ленченко Е.М. Совершенствование системы контроля за мясом и мясопродуктами, с целью предотвращения заболевания населения // Материалы международной конференции: «Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК». М., 1995. С. 110.

11. Куликовский A.B., Ленченко Е.М. Электронно-микроскопическое исследование колоний иерсиний // Материалы международного симпозиума: «Пищевые зоонозы - сальмонеллезы, кампилобак-териоз, иерсиниозы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики». М., 1995. 1-3 марта. С. 81.

12.Ленченко Е.М., Штукарева М.Ю. Сравнительная оценка трех методов выделения иерсиний из пищевых продуктов // Материалы международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек». М., 1995. С. 215.

13.Ленченко Е.М., Куликовский A.B. Сроки выживания иерсиний в объектах внешней среды // Сборник научных трудов ВНИИВСГЭ: «Проблемы ветеринарной санитарии и экологии». М., 1996. С. 100-104.

14.Ленченко Е.М. Сравнительное изучение устойчивости иерсиний и кишечной палочки к воздействию дезинфицирующих средств и температуры // Сборник научных трудов ВНИИВСГЭ: «Проблемы ветеринарной санитарии и экологии». М., 1996. Т. 100. С. 104-108.

15.Ленченко Е.М. Морфофункциональные свойства и популяцион-ная изменчивость иерсиний, поражающих сельскохозяйственных животных, в зависимости от температурного фактора // Сельскохозяйственная биология. 1996. № 6. С. 88-95.

16.Писменская В.Н., Ленченко Е.М., Кузнецова Т.Г. Влияние температуры охлаждения и замораживания мяса на биологические свойства психротрофных микроорганизмов и микроструктуру мышечной ткани // Тезисы докладов: «Теоретические и практические аспекты применения методов инженерной физико-химической механики с целью совершенствования и интенсификации технологических процессов пищевых производств.» М., 1996. С. 26.

17.Putina Т. G., Lenchenco Е.М. L-forms of Yersinia Organism with the Morphodensitometrical Estimation // VIII-th international Symposium of Veterinary Laboratory Diagnosticans. Jerusalem Israil. August 4-8 1996. P. 43.

18. Putina Т. G., Lenchenco E.M. Study of Submicroscropic Forms of Yersinia Organism with the Morphodensitometrical Estimation. International Symposium on Biomedical Optics. San Jose, California USA. 8-14 February 1997. P. 236.

19. Ленченко E.M., Куликовский A.B. Сравнительная оценка биологического и химического методов определения патогенных и вирулентных свойств иерсиний // Сельскохозяйственная биология. 1997. № 2. С. 83-85.

20. Баркоз В.А., Ленченко Е.М. Патогенные и вирулентные свойства иерсиний // Ветеринария. 1997. № б. С. 20-22.

21. Ленченко Е.М., Путина Т.Г. Цитоморфоденситометрия L-трансформации бактерий // Тезисы докладов конференции, посвященной 100-летию открытия вируса ящура: «Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных». 27-31 октября 1997 г. Владимир, 1997. С. 202.

22.Ленченко Е.М., Винник М.Ю., Штукарева М.Ю. Определение бактерицидной активности хитозана методом диффузии в агар // Тезисы докладов 2-й Международной научно-практической конференции: «Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции. М., 1997. С. 58.

23.Писменская В.Н., Ленченко Е.М., Кузнецова Т.Г. Микроструктура мяса и колбасы при микробной порче // Мясная индустрия. 1997. №6. С. 29-30.

24.Павлова И.Б., Ленченко Е.М. Электронно-микроскопическое исследование бактерий на объектах внешней среды // ЖМЭИ. 1998. № 5. С. 13-17.

25.Банникова Д.А., Ленченко Е.М. Методика изучения межпопуля-ционных взаимоотношений Zoogloae ramigera с некоторыми видами бактерий // Сборник научных трудов ВНИИВСГЭ: «Проблемы ветеринарной санитарии и экологии». М., 1998. С. 39-45.

26.Ленченко Е.М., Куликовский A.B., Павлова И.Б. Иерсиниоз. Этиология, эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактики: Монография. М., 1998. 126 с.

27.Ленченко Е.М., Павлова И.Б. Электронно-микроскопическое исследование антагонизма бактерий // Ветеринария. 1998. № 7. С. 22-28.

28.Ленченко Е.М., Штукарева М.Ю. Органолептические и физико-химические показатели мяса кур при экспериментальном иерсиниозе // Материалы 3-й Международной конференции «Пища, экология, человек». М., 1999. С. 161.

29.Ленченко Е.М. Адгезивные свойства иерсиний, выделенных из продуктов убоя животных // Материалы 3-й Международной конференции «Пища, экология, человек». М., 1999. С. 162.

30.Ленченко Е.М. Теоретическое обоснование и разработка мероприятий, направленных на профилактику иерсиниозов // Материалы 3-й

Международной конференции «Пища, экология, человек». М., 1999. С. 163.

31 .Писменская В.Н., Ленченко Е.М. Электронно-микроскопическое исследование продуктов убоя кур // Сборник научных трудов по ветери-нарно-санитарной экспертизе, посвященных 100-летию со дня рождения Д.М.Тетерника. М., 1999. С. 66-67.

32.Ленченко Е.М. Сравнительная оценка питательных сред для выделения возбудителей иерсиниозов из продуктов убоя животных // Сборник научных трудов по ветеринарно-санитарной экспертизе, посвященных 100-летию со дня рождения Д.М.Тетерника. М., 1999. С. 66-67,

33.Косминков Н.Е., Ленченко Е.М., Ванина Н.Н. Микроскопический метод исследования биоценозов желудочно-кишечного тракта // Сборник научных трудов по ветеринарной паразитологии, посвященных 100-летию со дня рождения И.В.Орлова. М., 1999. С. 32-33.

34.Ленченко Е.М. Экспериментальное моделирование межпопуля-ционного взаимодействия простейших и бактерий // Сборник научных трудов по ветеринарной паразитологии, посвященных 100-летию со дня рождения И.В.Орлова. М., 1999. С. 68.