Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Реагенты из моноклональных антител для идентификации инфицированных вирусом лейкоза животных

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

РГ6 О Д На правах рукописи

1 П V.' . УДК: 619:616-006.446:636.22/28

ФАЙЗУЛИН Рафик Зинурович

РЕАГЕНТЫ ИЗ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНФИЦИРОВА1ШЫХ ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА ЖИВОТНЫХ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология.

эпизоотология, микология и иммунология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1996

- г -

Работа выполнена в Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН.

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор В.М.ЧЕКИШЕВ

доктор ветеринарных наук, профессор П.Н.СМИРНОВ

доктор биологических наук, профессор В. А. ПЕТУХОВ

доктор биологических наук, профессор А.И.АУТЕНШЛЮС

Ведущее учреждение - Институт ветеринарной медицины Омского государственного 'аграрного университета.

^¡ита диссертации состоится СШХСЛ 1996 г. в

часов на заседании диссертационного совета Д. 020.23. 01 при Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (633128, Новосибирская область. Новосибирский район, п. Крас-нообск, СО РАСХН ИЭВСиДВ).

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН. Автореферат разослан "ЛМ" 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор ветеринарных наук

А. А. САМОЛОВОВ

Актуальность проблемы. Одним из факторов, определяющих эффективность борьбы с инфекционными болезнями животных, в т.ч. и лейкоза крупного рогатого скота, является наличие высокоспецифичных и чувствительных методов прижизненной диагностики.

Используемый в настоящее 'время в ветеринарной практике серологический метод диагностики (РИД) - прост в постановке и оценке результата, но обладает недостаточной для полного выявления всех инфицированных животных чувствительностью (K.L.Jacobson et al.,1985; В.Г.Арутюнян, 1992; А.В.Киселев, 1992). Более эффективный тест на основе иммуноферментного анализа позволил бы в сжатые сроки проводить оздоровление, особенно на завершающих стадиях, и надежно контролировать благополучие стад.

К достоинствам метода относятся высокая специфичность и превосходящая РИД чувствительность, (D.R.Monke et al., 1992; D. Be-1er and H.Siakkou, 1994), быстрота получения информации и возможность автоматизации постановки реакции (F.Brlcout, 1987; Ia-cobello С. et al., 1988). В ИФА можно определять антивирусные антитела не только в индивидуальных, но и в сборных пробах сыворотки крови и молока (R.M.Jacobs et al., 1991). В настоящее время метод широко применяется в зарубежной практике и позволил практически завершить оздоровления ферм на территории Западной Европы (I.Schwartz and D.Levy, 1994).

Высокочувствительный иммуноферментный анализ (ИФА) для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в настоящее время в нашей стране не используется из-за отсутствия высокоочищенных и специфичных реагентов, в частности, детектирующих конъюгатов из антивидовых антител, а также из-за неотработанности соответствующих тест-систем. Наиболее специфичные реагенты для иммуноанали-за готовят на основе моноклональных антител (МКА).

Цель работы. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных (ВЛКРС) и оценка ее чувствительности и специфичности в сравнении с РИД. Для реализации указанной цели были определены следующие задачи:

1. Получить клоны гибридом, синтезирующие МКА к специфическим фрагментам иммуноглобулинов основных классов крупного рогатого скота (IgGl, IgG2, IgA, slgA, L-цепи), и выбрать из их числа клоны, наиболее перспективные для изготовления высококачест-

венных иммунопероксидазных конъюгатов и использования в иммуноа-нализе.

2. Получить клоны гибридом, синтезирующие МКА к р24 антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота, которые можно было бы использовать в конкурентном или сэндвич- вариантах ИФА, или для аффинной очистки р24 антигена.

3. Разработать набор реагентов для выявления инфицированных вирусом лейкоза животных в ИФА, наиболее приемлемый для практического применения.

4. Оценить, специфичность и чувствительность разработанной' тест-системы в сравнении с РИД.

Научная новизна. Впервые в стране получены панели гибридом, устойчиво синтезирующие моноклональные антитела к фрагментам иммуноглобулинов крупного рогатого скота: да, да1, да2, Ь-цепи, в^А и к р24 антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота. Предложен вариант скрининга гибридом, синтезирующих антивидовые моноклональные антитела, .при помощи меченного видового да. Определена кинетика связывания окисленной перйодатом перок-сидазы из корней хрена (НЕРО) с антителами. Определена кинетика связывания иммунореагентов с поверхностью планшета и с другими иммунореагентами на всех стадиях разработанного сэндвич-варианта иммуноферментного анализа. Показана на практике возможность аффинной очистки моноклональных антител с высоким сродством к антигену при помощи гомологичного антигена (да северного оленя). Показана роль балластных антител в возникновении неспецифических реакций в иммуновферментном анализе.

Практическая значимость работы. Получены клоны гибридом к основным классам иммуноглобулинов крупного рогатого скота и к р24 антигену ВЛКРС. Клоны устойчиво синтезируют моноклональные антитела, которые можно использовать в иммунодиагностике для дифференциации иммунного ответа по подклассам иммуноглобулинов или для их количественного определения по Манчини (С.МапсШ е1 а1., 1965) и в ИФА. Усовершенствована методика изготовления иммунопероксидазных конъюгатов.

Разработана тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии МСХиП РФ "Временные наставления по применению тест-системы иммуноферментной для выявления

антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота" и Технические условия на изготовление реагентов указанной выше тест-системы.

Разработан сэндвич- вариант ИФА для определения антител к р24 антигену в пробах сыворотки крови и молока, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью.

На защиту выносятся условия приготовления реагентов иммуно-ферментной тест-системы для определения антител к р24 антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота и условия проведения им-муноферментной реакции.

■ Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ИЭВСиДВ в 1991 - 1995 гг.; на всесоюзной научно-теоретической конференции "Использование достижений биотехнологии в животноводстве и ветеринарии" (1991г); научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения проф. Щепилова Н. С. (1993 г.); научно-практической конференции "Проблемы адаптации сельскохозяйственных животных в Сибири" (1995 г.); конференции молодых ученых, посвященной 26-летию СО РАСХН (1995г.); на межлабораторном совещании сотрудников ИЭВСиДВ (1996 г.).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 4 научных работах в сборниках научных трудов ИЭВСиДВ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 11 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы, состоящей из 178 источников, из которых 48 отечественных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Диссертационная работа была выполнена в лаборатории биотехнологии ИЭВСиДВ СО РАСХН с 1990 по 1996 гг. (руководитель лаборатории - доктор ветеринарных наук, профессор В.М.Чекишев).

Выделение и очистку иммуноглобулинов крупного рогатого скота проводили из сборных материалов по методикам: IgM - Р.В.Боровик (1977) и В. П. Мерзлов с соавт. (1981), IgGl и IgG2 - Й.Брок (1987), slgA - В.М.Чекишев с соавт. (1985). Гомогенность полученных препаратов IgM, IgGl, IgG2 и slgA контролировали в имму-

ноэлектрофорезе (Г.Фримель, 1987) и в SDS-электрофорезе в 7.5%-ном полиакриламидном геле (U.К.Laemmli, 1970). Содержащую ВЛКРС культуральную жидкость получали из лаборатории по изучению лейкозов животных ИЭВСиДВ СО РАСХН (проф. П.Н.Смирнов). Вирус очищали ультрацентрифугированием по методу K.Takahashi и J.Kono (1985). Титр вирусных антигенов контролировали в РИД с положительной преципитирующей сывороткой (П.Н.Смирнов и др., 1989; А.Т.Левашев и др. 1992). Концентрацию вирусных белков определяли по Лоури (O.H.Lowry et al., 1951). Выход вируса был около 10 мг с литра культуральной жидкости.

Иммунизацию мышей проводили по схеме Tsai-Hsai Hong с соавт. (1989) в полном адъюванте Фрейнда (W.J.Herbert,1973).

Миеломные и гибридомные клетки культивировали в среде RPMI-1640 (НПО "Вектор") с добавлением сыворотки плодов крупного рогатого скота до 10-20%, L-глутамина - 2 мМ, 2-меркаптоэтанола и 2-аминоэтанола - по 0.001% каждого и рабочего разведения антибиотика в С02-инкубаторе (Hospitechnlk, Германия) с содержанием 5.5% С02 или в герметично закрытых флаконах при 37 С.

Слияние клеток" проводили по методике G.Galfre и C.Milstein (1981). Специфическую продукцию антител выявляли в непрямом варианте ИФА на полистироловых планшетах ПО "Красноярский химкомбинат Енисей". Клоны, специфичные к IgG, выявляли пероксидазным коньюгатом антител крупного рогатого скота.

Клетки из лунок с положительным сигналом клонировали на фидерный слой перитонеальных макрофагов методом лимитирующих разведений (Дж.Келер, 1983). Асцитные опухоли получали в мышах линии Balb/c .(G.Galfre and C.Milstein, 1981). Специфическую активность выявляли в реакции иммунодиффузии по Оухтерлони (1959) и контролировали в ИФА. МКА очищали высаливанием полунасыщенным раствором сульфата аммония-и последующей гель-фильтрации.

Оптимизацию методики конъюгирования и подбора условий выполнения ИФА проводили путем варьирования одного из параметров процесса (концентрации реагентов, рН, ионная сила растворов, время реакции) в параллельном исполнений, и таким путем определяли влияние параметра на процесс и его оптимальное численное значение.

Иммунопероксидазные конъюгаты получали по оптимизированной метддике. Хранили конъюгат в виде суспензии в полунасыщенном

растворе сульфата аммония при +4 С или под 20%-ным раствором глицерина (10 мМ трис-HCl pH 7.4, 150 мМ NaCl) при -16 С (Angel Montoya and Jose V.Castell, 1987).

Рабочим титром конъюгата считали наибольшее его разведение, при котором регистрировали не менее 90% от максимального сигнала с разведением сыворотки крупного рогатого скота 1:1000 в прямом выявлении. Чувствительностью конъюгата считали наименьшее количество IgG с которым конъюгат в рабочем титре давал окрашивание более 0.5 o.e. в течение 10 минут реакции.

Аффинные колонки готовили по методу О.К.Баранова с соавт. (1987). МКА элюировали скачком pH.

Для отработки ИФА использовали заведомо положительные и отрицательные сыворотки крупного рогатого скота, любезно предоставленные проф. П.Н.Смирновым. Отрицательные сыворотки были взяты от животных из оздоровленного хозяйства. Положительные сыворотки давали четкую линию преципитации в РИД.

Тест-систему, реализующую непрямой вариант ИФА с антигеном, приготовленным из очищенного ультрацентрифугированием вируса, сравнили в межведомственном испытании в ВГНКИ ветеринарных препаратов (В.М.Чекишев и др., 1993) на полевом и экспериментальном материале с аналогичным набором фирмы "Бельдико" (Бельгия).

Специфичность и чувствительность сэндвич-варианта ИФА в сравнении с РИД оценили на полевом материале, предоставленном лабораторией по изучению лейкозов животных ИЭВСиДВ (проф. П.Н.Смирнов).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение гибридом к иммуноглобулинам крупного рогатого скота

Работа по получению клонов к иммуноглобулину М была выполнена ранее Ездаковой И.Ю. (И.Ю.Ездакова, 1994) в лаборатории иммунологии ВИЭВ РАСХН.

В ходе выполнения первой задачи нами были получены панели гибридом, устойчиво и в высоких титрах синтезирующие монокло-нальные антитела, специфичные к L-цепям и Fc-фрагментам IgGl, IgG2, IgG, IgA, slgA крупного рогатого скота. После изучения их

свойств из множества клонов был выбран 7Ds2 клон, как наилучший для выявления специфических антител крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе. Для выбранного клона были подобраны условия очистки и приготовления иммунопероксидазного конъюгата, обеспечивающие наибольшую чувствительность и специфичность имму-ноферментного анализа. Остальные МКА можно использовать для изучения синтеза специфичных антител по подклассам иммуноглобулинов при различных инфекциях или для количественного определения иммуноглобулинов по Манчини и в ИФА. МКА к аллотипическим вариантам иммуноглобулинов можно использовать в селекции для маркирования генов иммуноглобулинов.

Совершенствование метода конъюгирования моноклональных антител с пероксидазой из корней хрена

Определившись с выбором клона, мы решили улучшить качество получаемого конъюгата. При этом преследовались следующие цели: воспроизводимость конъюгата (его стандартизация), достижение максимально возможной чувствительности ИФА. устранение фоновых реакций (реакция с заведомо отрицательными сыворотками) и простота приготовления конъюгата.

За исходную была взята методика P.Tijssen and E.Kurstak (1984). Нас не удовлетворяла слабая воспроизводимость методики и низкая активность конъюгата. После приготовления конъюгата и осаждения его сульфатом аммония большая часть пероксидазы оставалась в супернатанте, что свидетельствовало о низкой эффективности ее связывания с антителами. Причиной было слабое окисление пероксидазы. вызванное, по-видимому, низким качеством реактивов. Так, рН свежеприготовленного раствора различных партий ИаНС03 варьировал от 8.0 до 10.0.

Исследования показали, что 50 мМ раствор NaI04 в дистиллированной воде полностью окисляет пероксидазу в концентрации 10 мг/мл без инактивации в течение 10 минут при комнатной температуре, и при рН 9.3 и 0.06 М Na+ она количественно связывается с антителами в концентрации 10 мг/мл (молярное соотношение антител и пероксидазы 1:1) в течение 10 минут. Большая длительность реакции приводит к образованию крупномолекулярных агрегатов. Более кислая рН обеспечивает более высокую скорость реакции, и по-ви-

димому, применима для более разбавленных растворов белков.

Первоначально, методика была отработана для антител клона 7Бз2, но оказалась эффективна в отношении других МКА, антител кролика, крупного рогатого скота, лошади, других белков.

Так как качество перйодата натрия может варьировать от партии к партии, длительность окисления и рабочую концентрацию для каждой партии следует подбирать эмпирически.

Оптимизация субстратной смеси

Невоспроизводимость иммуноферментной реакции на стадии окрашивания заставила нас провести оптимизацию субстратной смеси. В использовавшейся прописи (0.К.Баранов и др., 1987) субстратная смесь готовилась перед употреблением из нескольких миллиграмм ортофенилендиамина и микролитров 30%-ного пергидроля. Причиной плохой воспроизводимости реакции могла стать невозможность точного измерения столь небольших количеств реагентов. Также мы хотели полностью использовать ферментативную активность конъюгата.

Исследования показали, что окрашивание максимально при рН субстратной смеси 5. 0±0.2 и концентрации Н202 - 4 мМ (от 2 мМ до 8 мМ). Достаточная концентрация ортофенилендиамина в субстратной смеси -0.4 мг/мл. Эмпирически, мы установили, что ортофенилен-диамин хорошо растворяется в 40%-ном этаноле, при добавлении уксусной кислоты до 6% не кристаллизуется при температуре -16' С и, в этих условиях, способен храниться в течение 2 месяцев (вместо 2-3 часов в готовой субстратной смеси при традиционном способе приготовления) без значительного окисления в виде 100-кратного концентрата. Также вполне удовлетворительной оказалась сохранность перекиси водорода в рабочей концентрации 4 мМ в используемом буфере. Готовый буфер сохраняется в холодильнике в течении полугода. Таким путем мы добились стандартизации условий реакции и упрощения подготовки субстратной смеси, сократив затраты времени и исключив возможные ошибки.

Аффинная очистка монокпональных антител клона 7Из2

Используя колонку с ковалентно закрепленным антигеном можно в одну стадию очистить специфические антитела как от сопутствую-

щих примесных белков, так и от балластных антител.

Качество реагентов определяет возможности использования им-муноферментных тест-систем (С.Altaner et al., 1982; В.М.Чекишев,' 1992). Поликлональные антитела получают в лучшем случае из гипериммунной антисыворотки, в которой доля специфических антител не превышает 30% но, как правило, значительно ниже (S.Cohen and R.Porter, 1964). Основную массу антисыворотки составляют балластные антитела к посторонним антигенам. Переход к аффинно-очи-щенным антителам повышает качество выявления, и такие тест-системы могут конкурировать с использующими МКА (D.V.Zaane et al., 1984). Недостаток аффинно-очищенных поликлональных антител в низкой аффинности. Высокоаффинные, самые ценные для иммуноанали-за антитела, затруднительно десорбировать без инактивации с им-муносорбента.

Для моноклональных антител, полученных из асцитов или наработанных в культуре клеток, существует та же проблема балластных антител. Их доля, даже в сравнении с гипериммунными антисыворотками, очень незначительна, но они, тем не менее, могут стать причиной неспецифических реакций конъюгата.

При попытке аффинной очистки МКА клона 7Ds2 на колонке BrCN-сефарозы с ковалентно закрепленным IgG крупного рогатого скота моноклональные антитела связывались с иммуносорбентом. При попытке элюировать МКА скачком pH, только очень небольшое количество белка было элшровано при pH 2.0. Мы опасались, что более кислые значения буфера элюции будут инактивировать антитела. Изготовление конъюгата даже из частично инактивированных антител нежелательно. Поэтому мы предположили, что аффинно очистить МКА 7Ds2 можно на колонках с IgG других видов животных, прочность связи с которыми у антител 7Ds2 ниже. Удовлетворительный результат был получен при использовании BrCN-сефарозы с IgG северного оленя. МКА 7Ds2 количественно снимались с колонки буфером с pH 3. 0.

Иммунопероксидазный конъюгат из аффинно очищенных МКА 7Ds2, как мы и ожидали, в ИФА характеризовался значительно меньшими фоновыми и неспецифическими реакциями. Так. при использовании "аффинного конъюгата" вообще отсутствовала реакция в контроле конъюгата, и наблюдались очень редкие и слабые реакции с отрицательными сыворотками в небольших разведениях.

Получение МКА к р24 антигену ВЛКРС

МКА к р24 антигену планировалось использовать для дифференциации между инфицированными и вакцинированными рекомбинантным гликопротеидным антигеном животными. Эффективная вакцина могла бы создавать защитный иммунитет на время оздоровления стада, препятствующий горизонтальной передаче вируса, и, в сочетании с ИФА, быть действенным инструментом оздоровления от энзоотического лейкоза. Поэтому, перед нами ставилась задача разработки полевого теста для быстрого и эффективного обнаружения антител против р24 антигена в пробах крови и молока.

Был получен один гибридомный клон, названный нами LA, который достаточно эффективно и специфически связывал р24 антиген из неочищенных препаратов вируса при сорбции на планшет. Попытки аффинной очистки р24 антигена были безуспешны из-за очень прочного связывания антигена моноклональными антителами. Антиген количественно и прочно связывался с МКА, но отщеплялся с низким выходом при очень жестких условиях, инактивировавших аффинную колонку и антиген.

Антитела клона LA легко осаждаются в буфере с низкой ионной силой при рН 5.5 (0.01 М Ыа-ацетатный буфер). Феномен, по-видимому, вызван агрегацией моноклональных антител вблизи их изоэ-лектрической точки. Данное свойство было использовано для очистки антител клона LA.

Разработка непрямого варианта ИФА

Поскольку в литературе была показана более высокая эффективность выявления инфицированных животных по антителам к оболочеч-ному белку (J.M.Miller et al., 1981; Р.А.Кукайн и др., 1982), нами был разработан вариант непрямо'го ИФА, использующего антиген из очищенного ультрацентрифугированием вируса. В ходе межведомственных испытаний в ВГНКИ ветеринарных препаратов (В. М.Чекишев и др., 1993) разработанную нами диагностическую тест-систему сравнивали с аналогичным набором фирмы "Бельдико" (Бельгия), где было продемонстрировано некоторое преимущество набора ИЭВСиДВ.

Из 73 парных проб сыворотки крови и молока в ИФА с использованием gp51 антигена положительно реагировали 29. Молоко одной

коровы показало в ИФА отрицательный результат при положительной сыворотке. В РИД при 2-кратном исследовании -выявлено 28 положительно реагирующих проб (все они были положительны в ИФА), причем. в 9 случаях реакции были слабо положительными и проявлялись лишь через 72 часа.

Производить указанную тест-систему для практического применения не позволили высокая стоимость и сложность процесса очистки вируса в препаративных количествах и недостаточный срок годности сенсибилизированных планшет.

Для преодоления этих препятствий нами был отработан непрямой сэндвич-вариант иммуноферментной реакции на полистироловых планшетах с использованием моноклональных антител к р24 антигену ВЛКРС и неочищенного антигена.

Разработка сэндвич-варианта ИФА

Нами были также испытаны другие варианты ИФА: конкурентный с использованием очищенного р24 антигена и меченных пероксидазой антител ЬА, непрямой вариант с очищенным р24 антигеном, непрямой вариант с рекомбинантным р24 антигеном (любезно предоставлен Е.С.Белоусовым, лаборатория эволюционной иммуногенетики ИЦиГ СО РАН). Конкурентный вариант характеризовался низкой чувствительностью и в большинстве положительных сывороток не выявлял специфических антител. Вариант с рекомбинантным р24 антигеном давал очень сильную неспецифическую реакцию с отрицательными сыворотками, подавить которую мы не смогли. Сэндвич-вариант ИФА по чувствительности реакции был сопоставим с непрямым вариантом, использующим очищенный р24 антигена, но не требовал трудоемкой и длительной процедуры очистки антигена, которая могла стать причиной невоспроизводимости реакции.

Дальнейшая работа проводилась в трех направлениях: увеличение чувствительности реакции, устранение неспецифических реакций от заведомо отрицательных проб, упрощение методики постановки реакции. Критерием выбора была прежде всего воспроизводимость результатов реакции.

Устранение неспецифических реакций

Наибольшую сложность в ходе отработки выбранного варианта ИФА представляли неспецифические реакции от заведомо отрицательных проб. В большинстве случаев неспецифическая реакция была вызвана реакцией отрицательной сыворотки на поверхность планшета и лишь в редких случаях реакцией на МКА ЬА. Отдельные пробы давали неспецифическую реакцию в разведении 1:100 по интенсивности сравнимую с положительной реакцией контрольной сыворотки.

Мы для их устранения опробовали широкий круг реагентов. Некоторый положительный эффект имел неионный детергент неонол АФ0-8991, аналог тритона Х-100, в концентрации 0.1%.

Из ряда испытанных блокаторов: казеин, яичный альбумин, бычий сывороточный альбумин, сывороточный альбумин человека, свиная сыворотка, сыворотка лошади и др. . - были более эффективны сыворотки лошади и свиньи в концентрациях 10%. Некоторые партии казеина и сывороточного альбумина, видимо, недостаточно очищенные, усиливали реакцию в контроле конъюгата. Неплохие результаты были получены при блокировании планшет переваренной пепсином сывороткой крупного рогатого скота (в разведении 1:3) из благополучного по лейкозу хозяйства. Сыворотка требовала тщательного подбора.

Наилучшие результаты были получены при использовании в качестве блокатора обезжиренного молока из благополучного хозяйства (ОПХ "Элитное"), в которое вносили 0.1% тритона Х-100 и под-титровывали рН до 8.6.

Поскольку путем внесения блокатора нам не удалось полностью устранить неспецифические реакции, мы изменили схему постановки реакции введением контрольных лунок для каждой пробы. Количество исследуемых проб на планшете сократилось в два раза, но неспецифические реакции стали легко дифференцируемы от специфических.

Таким путем проблема неспецифических реакций была снята. Реакция исследуемой пробы интерпретируется как положительная при превышении оптической плотности в лунке с антигеном над контрольной лункой более, чем в 2 раза, и как сомнительная при соотношении от 1.5 до 2.0. При получении сомнительного результата проба исследуется повторно, и при повторном сомнительном результате считается слабоположительной. Во всех остальных случаях ре-

акция считается отрицательной. При визуальной оценке для положительной классификации результата реакции необходимо четкое превышение окрашивания в лунке с антигеном над контрольной лункой.

Упрощение методики постановки реакции

Необходимость делать разведения исследуемых сывороток 1:100 утомительно и снижает производительность анализа. Значительное снижение интенсивности неспевдфических реакций, которого мы смогли добиться, и устранение такой проблемы вообще позволили нам исследовать сыворотку в разведении 1:10.

Попытки совмещения стадий не были результативны. Существенным упрощением была замена отмывочного буфера с детергентом на дистиллированную воду.

Определение кинетики связывания иммунореактантов позволило нам обоснованно выбрать наиболее оптимальные длительности стадий (по 15 минут) и, тем самым, еще уменьшить неспецифические реакции. Применительно к разрабатываемому варианту ИФА, традиционно используемые длительности стадий от 30 минут до 1 часа, как показали наши исследования, не только избыточны, но и приводят к усилению неспецифических реакций.

Увеличение чувствительности реакции

Критерием чувствительности было наибольшее, интерпретируемое как положительная реакции, разведение положительной контрольной сыворотки в отрицательной.

Разработка и применение высокосолевого щелочного буфера (3 М NaCl, рН 12.0) при сенсибилизации планшет моноклональными антителами увеличило интенсивность положительной реакции в 2-2.5 раза в сравнении со стандартными условиями сорбции и увеличило чувствительность реакции приблизительно в 4 раза. Оптимальная длительность сорбции МКА - 8 минут при комнатной температуре (традиционная методика сенсибилизации планшет требует 30 минут при 37 с и в течение ночи при 4 С).

Высокосолевой щелочной буфер был испытан на других иммуноре-актантах: МКА 7Ds2, МКА к IgG и IgM лошади, очищенные иммуноглобулины крупного рогатого скота и лошади, очищенный р24, рекомби-

нантный р24, ОПС антиген бруцелл - и показал свою высокую эффективность, значительно превосходящую стандартные условия.

Оценка чувствительности и специфичности ИФА в сравнении с РИД

Окончательный вариант ИФА имеет длительность 90-100 минут от начала подготовки планшета до читки результатов реакции. Для оценки чувствительности и специфичности реакции мы провели исследование полевого материала (1184 пробы сыворотки крови, из них 217 - положительные в РИД) в сравнении с РИД. РИД выполнялась сотрудниками лаборатории по изучению лейкозов животных ИЭВСиДВ.

При исследовании проб сыворотки крови крупного рогатого скота из ОПХ "Элитное", благополучного по лейкозу, мы не получили положительных реакций в ИФА, что подтверждает высокую специфичность разработанного теста.

По результатом исследований материала из неблагополучных хозяйств ИФА дополнительно к РИД выявил 11.4 % инфицированных животных. и невыявил 1.9% проб, реагировавших в РИД. При повторной перестановке в РИД проб с различающимся результатом 80% проб из числа "РИД+.ИФА-" дали отрицательный результат и 100% проб из числа "РИД-.ИФА+" показали положительную или слабоположительную реакцию.

При интерпретации результатов РИД требуется высокая квалификация и большой опыт работы для дифференциации слабоположительных результатов реакции от возможных неспецифических. В этом. ИФА имеет преимущество за счет более качественного различия положительного и отрицательного результата реакции, который легко интерпретируется даже визуально.

Небольшое число проб, положительных в РИД и отрицательных в ИФА мы объясняем тем. что эти реакции определяют противовирусные антитела к разным антигенам. РИД выявляет gp51 антитела. Разработанный нами ИФА - антитела против р24. Соответственно, уровень антител у разных животных к разньм вирусным антигенам может существенно отличаться.

Таким образом разработанный нами сэндвич-вариант ИФА имеет высокую специфичность и чувствительность, прост в постановке реакции и пригоден для исследования проб сыворотки крови.

выводы

1. Получены гибридомы следующей специфичности: 4 клона к 4 клона к 4 клона к 1^2. 4 клона к Ь-цепям, 1 клон к 1 клон к б1яА, 1 клон к р24 антигену ВЛКРС. Клоны устойчиво

синтезируют моноклональные антитела, которые можно использовать в иммунодиагностике и для количественного определения антигенов.

2. Иммунопероксидазный конъюгат из антител к Н-цепям крупного рогатого скота клона 70э2 превосходит коньюгаты других клонов по чувствительности и специфичности при выявлении антивидовых антител в непрямом и сэндвич-вариантах иммуноферментного анализа.

3. Наиболее простой и быстрый способ количественной очистки антител клона 70б2 - аффинная хроматография на колонке ВгСИ -сефарозы с ковалентно прикрепленным северного оленя. Использование гомологичного антигена позволяет легко десорбировать антитела с высоким сродством к антигену. Аффинная очистка антител клона перед конъюгированием с пероксидазсй существенно снижает неспецифические реакции в ИФА.

4. Оптимизированная схема перйодатного метода конъюгирования позволяет быстро и воспроизводимо готовить иммунопероксидазные коньюгаты с 100% связыванием фермента без инактивации и агрегации. На приготовление конъюгата из очищенных антител требуется не более 2-х часов. Методика дала превосходные результаты с широким кругом антител и с прочими белками.

5. Использование высокосолевого щелочного буфера с рН 12. О и ЗМ НаС1 при сенсибилизации планшет антигеном позволяет увеличить интенсивность специфической реакции в 2 - 2. 5 раза и чувствительности реакции в 4 раза.

6. Очищенные антитела клона ЬА в сэндвич-варианте ИФА позволяют использовать антиген без какой-либо очистки и обеспечивают чувствительность реакции, не уступающую непрямому варианту ИФА. Оптимизированная схема ИФА более проста в постановке, позволяет добиться более высокой чувствительности, специфичности анализа и производительности труда. Постановка реакции на одном планшете требует 90-100 минут времени от начала подготовки планшета до читки результатов реакции.

7. При исследовании сыворотки крови и молока из благополуч-

ных по лейкозу крупного рогатого скота хозяйств (оздоровленные хозяйства Удмуртии и ОПХ "Элитное") в ИФА с набором" разработанных нами реагентов не регистрировались положительные результаты реакции, что подтверждает высокую специфичность тест-системы.

8. Контроль благополучия ферм по лейкозу крупного рогатого скота можно осуществлять при исследовании групповой пробы молока. При инфицированности стада от 3% и выше результаты ИФА с групповой пробой молока регистрируются, как положительные.

9. При исследовании материалов из неблагополучных по лейкозу хозяйств в ИФА дополнительно реагировали 11.4% проб сыворотки крови по отношению к числу РИД положительных. В тоже время, наличие небольшого числа проб (1.9%), положительно реагирующих в РИД и отрицательных в ИФА, объясняется тем, что в ИФА определяются антитела к р24 антигену, а в РИД к gp51 антигену, уровень которых в сыворотках инфицированных животных может значительно отличаться.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Временные наставления по применению тест-системы иммуно-ферментной для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Утверждены ГУВ МСХ РФ 02.06.93 г.

2. Технические условия на изготовление реагентов тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Утверждены ГУВ МСХ РФ 01.07.93 т.

Список печатных работ по теме диссертации

1. Файзулин Р.З., Чекишев В.М. Универсальные реагенты для диагностики инфекционных болезней животных в иммуноферментной анализе // Диагностика инфекционных болезней животных: Сб.науч. тр. _/ РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск. 1993. -С,55-63.

2. Чекишев В.М. Файзулин Р.З., Файзрахманов Ш. Р., Смирнов П.Н., Храмцов В.В., Левашёв А.Т. Эффективность иммуноферментного анализа с пробами молока и сыворотки крови при диагностике лейкоза крупного рогатого скота // Диагностика инфекционных болезней животных: Сб.науч.тр. / РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ,- Ново-

сибирск, 1993,- С. 137-143.

3. Чекишев В.М. Храмцов В.В., Файзулин Р.3., Попова Н. В. Возможность использования тест-системы ИФА для диагностики инфекции ВЛКРС // Проблемы адаптации сельскохозяйственных животных в Сибири / Под ред. проф. П.Н.Смирнова.- Новосибирск, 1995.-С. 39-40.

4. Файзулин Р.3. Получение моноклональных антител к р24-ан-тигену вируса лейкоза крупного рогатого скота и их использование для выявления инфицированных животных // Материалы конференции молодых ученых, посвященной 26-летию СО РАСХН.- Новосибирск. 1996.- С. 37-39.