Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Разработка ускоренных методов обнаружения антибиотиков из группы тетрациклина и изучение сроков их сохранения в меде

всесоюзная ордена ленина и ордена трудового красного знамени ДКАДВШЯ сельскохозяйственных наук имени В.н.ленвнд

!ессш31ый ордена друяеу народов научно-исследовательский институт езтеринарной санитарии

на правах рукопаоа

сшоненкова Галина Яковлевна разработка ускоренных нетодов обнаружения

антибиотиков из группы тетрациклина и изучение

сроков их сохранения в неде

16.00.06. - ввторвварная саынхарня, вэтерннарыо-сааатараал экспертиза, п гнтена пороработкд продуктов зявогаоводства

Автореферат диссертации иа совоканио ученой отепенн каыдпдага ветернкараых наук

Москва - 1990

Работа выполнена го Всесоюзном научно-исследовательской институте ветеринарной санитарии

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук,■профессор

А.У.Смирнов

Научный консультант - кандидат химических наук

Н.С.Мороз (Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков)

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

А.В.Аганин (Саратовский аооветергшарный институт)

кандидат ветеринараых ваук Л.Д.Демидова (В1ШИВС)

Ведущее научное учрэадевие - Белорусский ШШЭВ

Защита диссертации ооотовтсн 25 октября 1990 года в чао, на заседании специализированного совета Д 120.45.0 при Всесоюзном научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии (123022, Москва, Звенигородское иоссе,5).

С диссертацией ыоано ознакомиться в библиотеке ВНИИВС. Автореферат разослав года.

Ученый секретарь специализированного совета« кандидат биологических наук

Л.П.Пиыенова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность токи. Развитое пчолозодства паеот бодьаоо зпачонпо в народной хозяйстве, так шик пчожи агравт актявнуп роль опылителей сельскохозяйственных культур. Кроив того, пчеловодство дает ценнсЗвнй продукт - нед, а такдо воск, прополис, пчелиный яд, паточное молочко и пергу, ваведвие вирокое применение в медицине,. ветеринарии я промывленности. Для того, чтобы полезные хозяйственные свойства пчел проявлялись наиболее полно, необходимо сохранять ах в здоровом в деятельной состоянии, различные хе заболевания пчел приводят в резкому снвяениэ продуктивности а габода пчелиных семей.

С цольи профилактика а леченая инфекционных болезней на пасеках пряиенш» различные лечебные препараты, в частности используется аптвбзотпка, соторыо скарцлйвавт пчелам с сахарнкя свропон а гаекяся оведонпп, что часть аптсбзотиков порзпосптся пчолавз в мед ( Д.Савов,1962;- О.УаёагЬ' ,1963; /

*1969; З.Ц.Аеояпн, Г.А.Еакаряп,1970; Т.А.Долгунова, Ы.П.Бутко, А.Н.Сынрнов,1970;. Л.ПгГоранова, 1976; ,

И^ЫнютЫ ,1982 ).

Учитывая вредное воздействие, которое оказывают на органнзи человека остаточные колвчеотва антибиотиков в продуктах питания, в 1983 году было принято "Указание Главного управления ветеринарии Иинистерства сельского хозяйства СССР" об обязательном исследования ыэда, реализуемого в пределах страны н отправляемого на экспорт, на наличие антибиотиков.

В связи сатин, необходимо имагь па вооруаения доступные методы контроля за их остаточными количествами в меде.

В настоящее время определение остаточных количеств антибиотиков в меде в ветеринарных лабораториях страны осуществляется

микробиологическим методом диффузии в авар, проведены которого затруднено из-за присутствия естественных антибактериальных веществ натурального меда, которые, чк и антибиотики, оказывают * мнгибируюаде действие на тест-культуры, применяемме в процессе проведения исследования. Кроне того, микробиологический метод трудоемкий и длительный - на его проведение затрачивается около 18-20 часов. ■

Исходя из вывеиаложенного, возникает необходимость в создании достаточно чувствительных ускоренных методов определения остаточных количеств антибиотиков о целью осуществления их контроля ■ меде.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка ускоренных методов обнаружения остаточных количеств наиболее часто применяемых в пчеловодстве антибиотиков в меде и изучение сроков сохранения этих антибиотиков в нем. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Определить чувствительность возбудителей европейского и американского гнильцов пчел к наиболее перспективным антибиотикам в сравнении с традиционными антибиотиками, применяемыми в пчеловодстве;

£

2. Изучить влияние природных антибактериальных веществ меда на чувствительность микробиологического метода определения остаточных количеств антибиотиков в меде;

3. Разработать ускоренные методы определения в меде остаточных количеств наиболее эффективных для лечения'гнильцовых болезней пчел антибиотиков;

4. Изучить накопление остаточных количеств антибиотиков в меде с целью изыскания оптимальных способов их применения для лечения пчел;

5. Определить степень загрязнения товарного иода аптибноти-шшп после проведения лечения пчел и изучить влияние этих антибиотиков па органолептичаскне показатели и физико-химические свойства иеда;

6. Изучить сроки сохранения антибиотиков в меде и воздействие высокой температуры на их разрушение.

Научная новизна. В результате исследований по определению чувствительности возбудителей американского и европейского гнильцов пчел Зое. {otvae, Meikccoccus p¿nbf>t fac. (¡tvec, Steept apig.

и Bat. oipheus ц антибиотикам, предлоаен для применения п ветеринарии полисинтетический антибиотик из группы тетрациклина-докснцншшна гидрохлорид, оказаваийсч наиболее эффективным для лечения гнильцовых болезней пчел.

изучено влияние естественных ннгнбируаадх веществ меда на проведение микробиологического метода днффузпи в агар, применяемого в настояцее время для определения остаточных количеств антибиотиков б-меде. '

Разработан экопресс-иетод. определения остаточных количестз антибиотиков из группы тетрациклина (тетрациклин, окситетрацик-лан, метацишшн и. доксициклин) в меде с применением тонкослойной хроматографии.

Практическая ценность. Определена чувствительность возбудителей американского и европейского гнильцов пчел к полуоинтети-ческоыу антибиотику доксицикляну а разработаны рекомендации по его применении л пчеловодстве.

Разработала и прздлозена для практического применения методика экспрессного определения остаточных количеств антибиотиков > i

из группы тетрациклина (тетрациклин, оасатетрацикшга, изтавдклин п доксициклин) в меде неЕодом тонкослойной хроматографии.

Результаты эксперииенюв по изучению накопления остаточных количеств антибиотиков в кеде позвгчили предложи» оптимальные режимы по их применению, исключающее загрязнение кеда.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на семинаре "Организация производственно-ветеринарного, лабораторного контроля и ветсанэкспертизы на мясоперерабатывающих предприятиях, убойных пунктах и рынках" (Москва,Косино,1990).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликована одна статья, в которой изложены основные положения выполненной работы. Подана ааявка на авторское свидетельство по методу определения тетрациклинов в меде.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописи и состоит иа введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы, включающей 209 источшзпов, в том числе 95 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 4 таблицами, 16 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в'течение 1986-1990 гг. в лаборатории ветеринарной санитарии в пчеловодстве ВНИИВС, лаборатории аналитической химии Всесоюзного научно-исследоБатедьокого инотитута антибиотиков (ВНША). лаборатории апологических проблем в ветеринарии Киргизского НИВИ (гЛрунае) и пасеках Иссшс-Кульского облпчелопро*-ма Киргизской ССР.

В опытах было испольаовано 120 пчелосемей, исследовано 260, проб меда.

Изучение чувствительности возбудителей европейского и американского гнильцов пчел к антибиотикам проводилось методом диффузии в агар с использованием бумажных дисков (Методическое письмо.

Определенно антабаотакочувствительностп иакроорганиэиов диско-дпффувпоншш ц0годом, 1984).

Испытание терапевтической эффективности доксициклина в сравнении с трздпцаонншш антибиотиками - тетрациклином, окситетра-цашшпоа, иетацнкланом в канаиицинок проводили на пасеках: Нссык-Нульокого обяпчелопроаа Киргизской ССР. Выделение возбудителей гиилщовых болезной из пахыатериала, собранного на обследуемых пасеках проводила согласно "Методическим указаниям по лабораторной даагносхоке гнильцовых.болезней пчел, парагнильца, септицииии а сальмонелле*« пчел" (1986). С отой целью с четырех пасек из пчелнных семей с характерными признакаии поражения расплода было взято 10 образцов сотов размерам 10x15 си о больншш п погнбпяни лечиннааа.

При разработке ускоренных методов определения антибиотиков в иоде проводила сравнительное испытание иетодов, применяемых в нсдоа стране а за рзбевои, с ташшн, как микробиологический метод определения остаточных количеств антибиотиков (Методические указания по нсследовааио меда, 1985), метод тонкослойное хроматографа и для обнаружения аптабнотиков (Государственная Фармакопея СССР; метод /У.б^а., ИЯпония), метод спектрофотометрл-гевкого определения антибиотиков (Государственная Фармакопея ЗССР). Исследования проводили с иэдои, в который искусственно мисвлм антибиотики в различных концентрациях. Были отобраны наиболее подходяще для решения поставленной задачи методы. Разра-1отву ускоренных методов вела в направлении повышения чувствитель-юстп метода в 'сокращения времени на проведеппе исследований. &ло исследовано ПО проб не да.

Нотификацию методоз тонкослойной хроматографии и спектрофотометра« проводили на основе вышеуказанных фармакопейных методов

для антибиотиков. Извлечение' антибиотиков из меда разрабатывала на основе имеющихся литературных да? их. Было исследовано 29 проб меда с искусственный внесением антибиотиков.

С целью изучения пригодности разработанного метода определения остаточных количеств тетрациклинов в меде с использованием тонкослойной хроматографии, а также определения степени загрязнения и сроков сохранения антибиотиков в кеде из обследованных пасек исследовали 96 проб меда. Из этих проб в 39 (41$) были обнаружены антибиотики в разных концентрациях.

Определение ингибирующих свойств меда проводили по методу а.В.Аганина (1985), исследовано 25 проб меда.

Определение физико-химических свойств меда проводили оогдас-но "Методическим указаниям ло исследованию меда" (1987).

При разработке метода тонкослойной хроматографии были использованы готовые пластины для тонкослойной хроматографии на стеклянной и полиэтилентерефталатной подложках с закрепленный слоем силиаагеля для многоразового использования отечественного производства .

Результаты экспериментальных исследований обработаны статистически при помощи константного метода математической обработки по Н.В.Садовскому (1975). •

результаты исследований

Испытание терапевтической эффективности доксициклина при лечении гнильцовых болезней пчел

В результате проведенных нами ранее опытов по определению , чувствительности возбудителей европейского гнильца к антибиотикам, было установлено, что ¿V? v'tiro они показали наибольшую чувствительность к тетрациклиновым антибиотикам, а особенно к доксициклину. В связи с этим мы поставили перед собой задачу

испытать этот антибиотик при леоении гнильцовых болезней пчел. Для этого пчелосемьям, больным европейским гнильцом, скармливала с сахарным сиропом тетрациклин, окситетрациклнн, кананиции по 0,4 г (согласно инструкции) и доксициклин в дозах 0,25, 0,5 и 0,75 гг на I литр сиропа из расчета 100-150 мл на улочку. Три первых антибиотика чаче применяются при лечении гнильцов пчел, поэтому мы использовали их в исследованиях для сравнения о докси-циклиноы. На основании проведенных исследований было установлено, что наиболее эффективными для лечения европейского гнильца пчел оказались доксициклин, после его двукратного скармливания с сиропом в дозе 0,5 г на I литр и окситетрациклин, после четырехкратного скармливания сиропа, содержащего 0,4 г препарата на I литр. Интервалы между скармливанием лечебного сиропа - для док-сицнклнна 7, а для окситетрациклина - б дней.

Испытание микробиологического метода определения остаточных количеств антибиотиков в меде

Так как цельо пашнх исследований была разработка ускоренных методов обнаружения антибиотиков в меде, мы испытали в разработке экспресс-методов мнкробиблогичеокий метод как основной, путем его модификаций.

В. процессе воспроизведения классического микробиологического метода определения антибиотиков в меде мы столкнулись с рядом трудностей, причиной которых, по назему мнению стали природные ингибирувщие вещества, присутствующие в любом натуральном меде. Так, при использовании данного метода (метод диффузии в агар), саше большие зоны задержки роста тест-культур получены при исследовании меда, взятого из ульев, пчелам которых скармливала доксициклин из расчета 0,5 г на I литр сиропа двукратно в весенний период. При пересчете величины этих зон в количественном

сзотвовении при поиоад таблиц В.С.Дмитриевой в C.U.Семенова ato соответствует 10? ед. антибиотика (величина зоны внгибнцнв была в среднем 28,5 мм) на I г меда, что ^возможно, так как мы всего окармливали I млн. единиц доксициклиьа на весь улей при средней оиле пчелосемей 16 рамок. Поэтому мы сделали вывод, что происходят в 8ЮМ случав суммарное антибактериальное действие на применяемые тест-культуры как антибиотика, так и естественных ингиби-

*

рувдих веществ меда. Предпринятое, согласно методу, прогревание меда о Целью уст раненая его природных нигибирующих свойств но дало ожидаемого результата: до и после прогревания в точение 10 минут при 60 °С всех растворов меда зоны гадерякк роста тест-культур оставались почти без изменений. Кроме того нами были обнаруленк 80нм внгвбвции как в меде, в который добавляли антибиотики, так и в меде, в который не вноскли никакие антибиотики. Все атк полученные результаты требовали дальнеЯиего рааьяспения.

Изучение влиянвя внгибируоцих вецеств мода на чувствительность микробиологического метода С атой цельв использовали мед, полученных из контрольных ульев, пчелам которых не скармливались никакие антибиотики. Брали по 3 образца от каждого исследуемого меда. Первый прогревали в в&яяой бане при температуре 80 °С в течение 15 и 30 минут и

при температуре 100 °С в течение 15 и 30 минут. После этого не

со

растворяли мед буфером, а наносили непосредственно в вырезанные в агаре с тест-культурой лунки. Второй образец меда растворяли соответствующим для кагдой тест-культуры буфером в соотноиении 1:1 и 1:5, пробы каждого разведения наносили в лунки вначале без прогревания, затем после прогревания в течение 15 и 30 минут при 80 и 100 °С. В третий образец в отдельности добавляли антибиотики - тетрациклин, окситетрациклин, метациклин и доксицирлив в

■ > : ■.'•: и

козцсптрэдап I tsar/ us. Образца иада в этой случае разводили цат-рзййа-соягзокзолнз буфорсз в соозвопоаяп 1:1 н.1:5, пробы наносила з луссп без продгартельного арогрзвапип и с прогроваияеи в то-icnno 15 п ГО.гаиуэ при 100 °С.

ггсслэг.огапал.Салп папразлоии на азысааиао поэиопности г.-глипя прпро.тшх гглг::бпруп":1х гэцзегз «ода, для чого пгсгрз-ата npcín v.^.-x я, глз плдао пз таблица I, это но

лздо noncm^í-t'noro г^зульггга - прогрзганло з.точоыяо 15 и 30

пр ггглэрзгурэ СО п ICO °С попгп по язмоаяоз бактораоста-гг^зг^П c^rrr; ппгпСлеороз кэда, по срзйае.1 иоро, по отаопешта s n тосг-кульгураи.

СС5ГЭ, ^С-И ПОСГОЛЮ Сало сцон.чть чузсззптольпость пра-г:гг.г.С"зго essq&i» з Сила добплоии аатзбаотпкз пз группы d пзэдеягргцаз i од./кп» Розудьтахи этах опытов з г-Сллад 2, пз когороЯ гпдпо, пго oiccascspamaasaa пол-~сзх*э П22гтгг.згсл Ь г:здо паалэ арэгрэзззаа ого пр:з ?ешюратуре ICO э 15 L'^y?,' ссгалышэ аиг::бпо?иаа саазала своо •

олг-рггеегь з загпеп'оотч os врэаонз воздействия гксоках теапора-гур.

Ра.зрпЕогт уо:эрз titiíix fio то л оз озрздолешш елггбяезпл-оз з ыедо ' Пагод уопкоолоВкой ггочагогрдФаа.

Па оскосаиин прегэдепеш: асслодовааай по кыыга^йа гшвробио-логзчссвого иэтода т едэлалз гцвод, чго независим от прогревания прпродпно пцгнбаруззно огоЗстга-кода продолзазт оказывать влияние' ка працеппеаыо в иикробдодогачесаоп ыетодо определения антабаотн-ков тест-цшсроорганизгш. В сипаа с виавазлояенгаш перед нани была поставлена задача разработки метода, иозавпсииого от антибактериальных веществ цеда. С этой цельп кы испытали возноаность принене-

Результаты изучения влияния степени разбавлешш меда и различных режимов прогревания на тест-шшроорганиэыы.

Таблица I.

т-;-:-■ --- ::':

*, Средний диаиетр зон задерзкн роста гест-шшроорганизиов, мм

' Без ! с ' предварительный прогреваннен ' прогревания •-1-—--—-—

. * ! 15 шшут 1 30 иисуг 1 15 минут ! 30 минут

1 1 80 °С ! 80 °С ! 100 % ! 100 °С I—---;-—4,-;-1-----4--4—-:-■ .

Степень ! без ! 1:11 1:5 !бев !Ш !Т:5 !бэв !Т:1 11:5 !боа !Т:1 11:5 !без !I:I !I:5 Я

разведи I Др ! ! I igf! 1 да «

Н1Я I НИН ! 1 !ввн ! 1 !шш 1 1 less ! ! !няя ! !

, Тест-,:-V культуры: ■ ■

iao.suiütis,

Uib 20,7 15,2 15,3 18,3 16,8 16,2 17,9 Г5,2 15,7 Т7,8 Т4,9 15,3 Г7,5 Т5,0 14,8

bdc.subtftfs -

JA ' 21,3 15,0 15,3 19,7 16,0 16,3 18,8 15,8 16,3 18,5 15,5 16,8 18,1 15,3 16,2

Bae.Mt/cvdei, ^ ^ ^ ^ 16f3, I7>0 ^,715,0 T6.3 14,0 14,3 15,5 14,2 14,7

&>e.nt/caeks, I9j2 I3^8 13>7 I7f8 I6|2 I6f5 I3f9 1б<1 I3f2 I3f0. I5f6 М|2-1*,0

За&шця 2.

Результат изучения влаяипя рззлзчох рззаиоз прогрзвшшя па аатабавтераальнув активность аитабаотааоз, исдуоот^гано гзасеанах а иод, I ют/ид

Мед с добавлением антибиотиков:

Рехни

ярогревааия

!

2 Хетраоикаиа ! I

'ва-. ' Т5

I

! !

■"! -. ■■■ • ! I ■

! ! I

.иа ¡Овсатэтрсццкааа { Цатападдпа | Доксацавлап

1 ■-.'.■ ■ ■■, I ■■ . 1 ,■'.:■' ■ ,

'рева- 'без 1 прогрзга- 'без.-' прогрева- 'без 'прогревание

18 у1ру| нао 1зрог-4 шш 1прзг-1

г ре- « ........"■■■ |Р<3- I ;РЗ- I

! зп "ва-- тс ! хп ва- ' « ! тп 'ва- тс ! ™

Г .' .' I ! ! I I I !

!без ' прогрева- -без 1 !прог-1 ние 1щюг ,ре- --:-г рева-. '

ы

Средний диаиехр зон задержки роста тест-вулмуры (иа) х

26,6 24,2 22,5 .23,7 15,3 15,З2* 21,8 19,5 18,5 2*,3 23,8 23,1

) - использовалась спори культура бас. ¿иИ/Аз , аташ! Ло

хх) - асследуешй иод. без добавления антабнотпков цкол зону ивгабаоаа, равной 15,6 ш.

вин исхода тонкослоОеой хроаатографав для лпродоаозпс в подо scs-ращзюшиов - тетрацншшна* оксктетрацвкдпва, иетецпкшпа в доссв-цнклевс. Нага было разработано два способа свстракцав 8£шс c3sköu-® отпков аз иода. В первой случае проби и еда расторгай £> сизоя б^уЗ-ра иак-Ндьвейна в этсладетата, со второй - г 0,01 ы ооссесЗ ccsoi'c в ацотоио. При вспользовапйк псргэго способа с-сгр^'дгз срс^ззо нанесения ого па пластики очень гдаюлои, sob && его eojiüü pacsrop,

tt

СЛ12& на xpouaiorpsaniax часто ргспслсашсп, прз tz. caczczcx c^rf.u-чявается около 30 & болоо шшуг. Б раэулыгато пр^сдс^ил: сзс^с^;-юавпй наиболее оптенолыши в проспи овазояся rsopoll слозсб, гев сак па ого проведение затрачивается иоиьсо вревевз, сзсользусгсп простые в доступные реактивы. Получений oBcspass uaso Csosp носить tia пластины пз-за присутствия в вой летучего eocsoaesta-ацетоиа. Степень окстракцин антибиотиков в сгпк двуг czocoßar одинакова.

Для проведения товеосло2^о2 хроматограф tea tx:

приионоии властшш, технология про^аьодства cavopus faifaöoic^c вветвтутои высоковолокувпраих соодцневиа ¿П СССР (г.Есисвгрсд) са стеклянной и полвэтнловторефтаяатвой воддозше, Езг02сйсввае;г20 в ЭССР (ТУ 15/16 ЭССР 7-88) в в г.Красиодаро (Т2 26*11-17-89). НшМ биле разработали оптвиальвио условия 'прэводошш toatocfioEuoll хроиатографнн акстракгов гстрацйкгвиов яз иода. Продлоссввиа ваш ветод с примененной втих пласта позволяет в течйше ь5-60 шшу? определить в ыедо остаточные количества тетрациклина, овситетра-адишна, иегацвклина в доксивдишыа на уровне 0,005-0,02 иг каждого антибиотика в I г меда.

Сущность втого метода заклсчаотся в следующей: Е 5 г меда в колбе с притертой пробкой прибавляли сначала I ил 0,01 в соляной кислоты в после тщательного перемеаивания до-

бавляли 4 нл ацетона. Все еде раз перемевдвали платолеи, верхний прозрачный раствор сливали и использовали для нанесения на пластины.

На линию отарта приготовленных пластин наносили в точки следующие пробы на расстоянии I см друг от друга и на 1,5 си от крап пластины:

- 5, 10 и 20 шел экстракта 38 нода;

- 5'икл раствора стандарта докепциклина (0,1 ыкг антибиотика);

- 5 шел раствора стандартов всех четырех тетрациклинов (0,1 нкг каадого антибиотика).

Пластину о нанесепишш пробами высупивали на воздухе в течение 1-2 мипу?, поносам г камеру со смесью растворителей этнлаце-тат-ацетон-вода (20:19:5) а хроиатогрзфаровалн восходящий способом (около 20 шшут).

Когда $1)0н2 растворптодсй подцпиалеп 'на 7-8 си от линии старта, пластпау гишаацш па дал зри, сутшлн на воздухе 10 шшут, нотой в оушгаьЕои вкефу 5 иннут (прз 100 °С). После охлапдешш пластину помещала на 3-5 шшут в камеру с' пароля аммиака и затем просматривала в свете лучей УФ-лаыпы при длине волны 366 ну. На хроматограы-ме была впдпь 4 светящиеся зоны антибиотиков, полученные при храда-тографвровашга раствора стандартов всех тетращшшяов: метациклин

0 I* по довсишююну а °»*7± О*05« *в8РаЦШшш с^по доксадикШЕу равному О.Тб^.ОЭ; довонвдюгаа о^по д(Жсицшшшу в 1»°±Р«05 и окситетрацнвлнм сЛ^ й0 д0Ксюдоимну в 1»М±0,05. При этом сравннг вали интенсивность свечения зон пятен веществ, полученных при хро-матографировании раствора меда, нанесенного в разных количествах (от 5 до 20 мил), с интенсивностью свечения зон пятен веществ, полученных при хроиатографировании раствора стандартов тетрациклинов. Схема полученной хроиатограммы отражена на рисунке I.

Рирл Схема полученной хроматограмыы тетрациклинов в меде

0,Д,Т,М - зоны свечения тетрацикдинов -окситетрациклина, доксициклина, тетрациклина и метациклина;

1,2,3...- точки нанесения раствора меда на хроматограмму (5, 10 и 20 мкл);

4 - раствор стандарта доксициклина

для определения всех тетрацикдинов (5 мкл);

5 - раствор стандартов всех тетра-

цикдинов (5 мкл)

Метод спектрофотометрии. Кроме метода тонкослойной хроматографии нами был применен для обнаружения тетрациклинов в меде метод спектрофотометрического анализа. С целью предварительного удаления многочисленных гс^поневтов меда и проведения экстракции антибиоти-

ков, наци был испытан ряд органических п нинеральных кислот, щелочей» Однако праиепеиве различных растворителей, а такзе степеней разведения но дало положительных результатов, позволяющих судить о наличия конкретного количества содержащегося в иеде антибиотика. Трудность заключалась в невозможности осаждения коылонентов неда, ыаксииуц поглощения которых был значительно вине фона тетрацишш-нов. Так, при использовании в качестве растворителей снеси I н уксусной и I н серной кислот обнаружили только первый характерный иаксииуы доксициклина в области 190-300 ни, а при растворении ыеда ацетоном был обнаружен второй максимум поглощения этого антибиотика в области 320-390 на.

Изучение сроков сохранения антибиотиков в иеде

Прииененпеи разработанного наип метода тонкослойной хроматографии были изучены сроки сохранения тетрациклинов в неде после скаршшвания этих антибиотиков пчелам с сахарник спропоц. Было определено, что тетрациклин и'доксициклпн дольие всех сохраняются в иеде - свыпе года, в процентной соотнопонни они разругаются за первые полгода на 75% от исходного количества, обнаруженного в начале опытов после последнего скармливания. Окситетрациклин и и'ета-циклин сохраняюзся в меде соответственно два я пять месяцев.

При исследовании проб неда на остаточные количества антибиотиков обнаружили, что процесс их накопления в меде находятся в прямой зависимости от сроков скармливания пчелам лечебного сиропа и от величины выбранной дозы антибиотика. При использовании антибиотиков двукратно с интервалом в 7 дней в дозе 0,5 г на I литр сахарного сиропа их остаточные количества во всех пробах не обнаружили. При увеличении кратности скармливания антибиотиков в этих же дозах ны обнаруживали их остаточное количество - около 0,01 иг на I г

меда. Накопление антибиотиков происходит такие при окаршгаваиии пчелам антибиотиков в летний период во время недосбора или аа две неделя до его начала. Цы обнаруживали в такой иеде 0,02 иг антибиотика на I г кеда. Поэтому, с целью исключения загрязвеиня меда оот&точншш количествами медикаментов, необходимо проводить скары-ливание сиропа с антибиотиками не позднее чем аа 30-45 дне! до начала интенсивного медосбора. Хелательио в пчело|одстве применять антибиотики, обладающие терапевтической эффективностью при применении их не более, чем двукратно. Таким антибиотиком, например, является предложенный нами для применения при гнильцовых болезнях пчел доксициклин. Увеличение кратности скармливания пчелам антибиотиков более чем двукратно способствует накоплению их в меде, что недопустимо.

ЭКОНШИЧЕСШ ЭФФЕКТИВНОСТЬ Расчет экономической эффективности применения доксициклииа в пчеловодстве определяли на основании сравнения основных технаио-акономвческих показателей, полученных при применении нового антибиотика и традиционного, в соответствии с "Методикой определения экономической эффективности использования в ветеринарии результатов,... "(198 7). Применение довсицивлииа позволило получить экономический эффект в размере 99,55 рублей иа одну пчелосемью.

Внедрение метода тонкослойной хроматограф*«^« определения

остаточных количеств антибиотиков в мел« бтдпт иметь бодьвое соцм-

■ i

алькое значение.

выводи

I. Разработан ускоренный метод определения остаточных количеств антибиотиков из группы тетрациклина (тетрациклин, окситетра-цнклиь, ыетациклин и доксициклин) в меде методом тонкослойной хро-иатографии. •

Прякопопне многоразовых готовых пластин с закрепленным слоем сшшкагеля на стеклянной а полизтилентерефталатной подлояках, выпускаемые отечественной пронывленяостьо, значительно упростило метод тонкослойиоЛ хроматографии антибиотиков а сократило время на процесс его проведения.

2. Разработанный метод тонкослойной хроматографии позволяет одновременно идентифицировать четыре антибиотика из группы тетрациклина и оценить остаточное количество каждого антибиотика в меде в «отчестве 0,005-0,02 мг на I г меда, ила 0,0005-0,002%% в течение 55-60 минут.

3. Проведено исследование по изучение влияния ингибирупщих веществ меда на чувствительность микробиологического метода определения остаточных количеств антибиотиков в меде. Вами установлена прямая зависимость величины зоны аадерзки роста применяемых в микробиологическом методе тест-культур от присутствия в меде естественных пнгибаруюотх веществ.

4. Показано, что применение предварительного прогревания проб мода о целью раэрувения естественных ннгибирующих веществ при температуре 60 °С в течение Ю минут, а также при 80 и 100 °С в тече-вио 15 а 30 минут, не оказало значительного влияния на величины зон загабицмв до а после прогревания.

5. На основании результатов испытания чувствительности возбудителей американского в европейского гнильцов пчел был предложен для применения в пчеловодстве полусинтетическяй антибиотик из группы тетрациклина - доксициклин. Этот антибиотик оказался наиболее эффективным при лечении гнильцовых болезней пчел в дозе

Э,5 г на I литр сиропа из расчета 100-150 мл на улочку.

Применение докенцикляна с лечебной целью при американском и европейском гнильцах позволяет вдвое сократить кратность

скармливания лечебной дозы препаратов, что способствует значительному снижению вероятности загрязнения меда антибиотиками.

6. Установлено, что антибиотики начинают обнаруживаться в меде только после применения доз, превышающих терапевтические -более 0,4-0,5 г препарата на I л сиропа; при увеличении кратности скармливания лечебного сиропа (более 4-х раз) в тех же дозах, а также когда лечение проводится во время главного медосбора. Остаточные количества антибиотиков в меде при этом составляли 0,02 -0,01 мг иа I г меда.

7. Полученные результаты при изучении степени накопления м сроков сохранения антибиотиков в меде позволили предложить оптимальные режимы их применения для лечения европейского я американского гнильцов пчел, исключающие загрязнение меда антибиотиками.

ПРШОШИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании проведенных исследований разработаны:

I. Методические рекомендации по определению остаточных количеств антибиотиков тетрациклинового ряда в меде методом тонкослойной хроматография, утвержденные 28 марта 1990 года Главным управлением ветеринарии Государственной Комиссии Совета Министров СЭёР по продовольствию и закупкам.'

2« Временные рекомендации по применению доксициклика гидро-

А «2

хлорида для лечения гнильцовых болезней пчел, утвержденные 30 марта 1*90 года на ветеринарной секции Научно-технического совета Гоокомсельхоза Киргизской ССР (протокол fei).

3. Получена приоритетная справка № 4813056 от 12 апреля 1990 года на предполагаемое изобретение "Способ определения тет-рациклннов в меде методой тонкослойной хроматографии".

По тело диссертации опубликована статья: • '

Симовенкова Г.Я. "Антибиотики в кеде", "Пчеловодство", 1990, J6 5, с. 44-45. .