Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Совершенствование ветеринарно-санитарного контроля безопасности и качества производства мясных консервов

СЮ34792 Ю

На правах рукописи

<7-

Горобчук Елена Алексеевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОГО КОНТРОЛЯ БЕЗОПАСНОСТИ И КАЧЕСТВА ПРОИЗВОДСТВА МЯСНЫХ КОНСЕРВОВ

16.00.06-Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза 16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

-8 0ЯГЖ

АВТОРЕФЕРАТ"

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва 2009

003479218

Работа выполнена на кафедре «Товароведение и безопасность сырья и продуктов биотехнологии» в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (ГОУ ВПО МГУПБ).

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится «2Ъ> ОА" 2009 г. в (6 "¿-'^часов на заседании

диссертационного совета Д 212.149.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316 Москва, ул. Талалихина 33.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии», а также на веб-сайте http://www.msaab.ru

Автореферат разослан «. -/V» сшыЩЛгт г.

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Родин В.И. (ГОУ ВПО МГУПБ) доктор биологических наук, Ярков С.П. (ФГУП «Гос НИИ БП»)

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Смирнова И.Р. (ГОУ ВПО МГУПБ); доктор ветеринарных наук, профессор Белоусов В.И. (ФГУ «ЦНМВЛ»)

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, профессор

Серегин И.Г.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Развитие современной мясной промышленности связано с производством продуктов не только кратковременного, но и длительного срока годности, при котором осуществляется наиболее эффективное использование мясного сырья. К такому виду продукции относятся стерилизованные мясные консервы, основное преимущество которых заключается в возможности продолжительного хранения без потерь питательных и вкусовых качеств.

Начиная с 2005 г., в России наметился устойчивый рост производства мясных консервов. Этому способствовало увеличение импорта говядины и свинины, изменение видового ассортимента мясных консервов, а также повышение их спроса на отечественном рынке. В этой связи своевременное обеспечение контроля их качества и безопасности является важнейшей задачей по охране здоровья потребителя.

Основными критериями безопасности и качества выпускаемой консервной продукции являются микробиологические показатели, по которым контролируют ветеринарно-санитарное состояние перерабатываемого сырья, производственных помещений, оборудования и других объектов, а также соблюдение установленных технологических процессов (Ю.Г. Костенко, 2006; М.А. Шикина, 2006; Е.^сЬатг, 1992).

Однако применяемые методы контроля требуют значительных затрат времени и материалов, что побуждает проведение научно-исследовательских работ по изысканию новых и совершенствованию действующих методов с целью сокращения времени исследования и получения достоверных результатов (М.А. Мамаев, 1999; Л.Б. Сметанина и др., 2005; В.В. Светличкин, 2005).

Для этого представляются перспективными методы ДНК- и иммунодиагностики (А.Я. Самуйленко, 2003; А.Ф. Валихов, И.Н. Комарова, 2004; И.Б. Бычкова, 2006), которые требуют усовершенствования с целью возможности их применения для ускоренного а!щлиза мясного и растительного сырья, термообработанной продукции, а также идентификации микроорганизмов и выявления их токсинов (С.П. Ярков и др., 2007; К.

БЬагша е1 а1., 2005).

При этом особое внимание должно быть уделено разработке экспрессных и ускоренных методов исследования объектов ветеринарного надзора, так как в практических условиях ветеринарные лаборатории выполняют значительный объем работ, связанных с бактериологическим контролем перерабатываемого пищевого сырья и санитарного состояния производства.

Цель исследований: совершенствование контроля безопасности и качества сырья и готовых консервов на основе ускоренных, чувствительных и специфичных методов.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

- оценить ветеринарно-санитарное состояние объектов консервного цеха, перерабатываемого мясного и растительного сырья, а также изучить качество и безопасность мясных консервов;

- усовершенствовать идентификацию Е. coli, S. typhimurium, Staph, aureus из мясного и растительного сырья при производстве мясных консервов на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией;

- разработать методику идентификации S, typhimurium из объектов ветеринарного контроля в консервном производстве с помощью индикаторных иммунохроматографических тест-систем с учетом их специфичности, чувствительности и продолжительности анализа;

- разработать методические подходы к выявлению ботулинического токсина в мясных консервах с помощью индикаторных иммунохроматографических элементов.

Научная новизна. Разработаны методические подходы для оценки качества и безопасности сырья, готовой продукции, а также ветеринарно-санитарного состояния объектов консервного производства на основе ускоренных методов ДНК- и иммунодиагностики. Разработаны и испытаны методики для выявления S. typhimurium и ботулинического токсина с помощью индикаторных иммунохроматографических элементов (ИИХЭ), включающие модифицированные этапы пробоподготовки с использованием дифференциального центрифугирования. Определена чувствительность, специфичность разработанных методов. Усовершенствована методика одновременной индикации Е. coli, S. typhimurium, Staph, aureus на основе амплификации с неспецифическими праймерами и последующей ДНК-гибридизацией со специфическими ДНК-зондами. Установлена корреляция результатов исследований, полученных с использованием общепринятых и предлагаемых методик, что доказывает возможность их комплексного или раздельного применения для обеспечения ветеринарно-санитарного контроля качества консервного производства.

Практическая значимость работы. На основании результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по индикации сальмонелл группы В в сырье растительного и животного происхождения, мясных консервах и объектах внешней среды на основе индикаторных иммунохроматографических элементов» (п.п. 5.1, 6.2.1, 6.2.2, 6.3) (утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 11.12.2008 г.). Материалы исследований включены в проект Национального стандарта Российской Федерации «Растительная продукция и корма, зерно. Экспресс-метод обнаружения специфичных белков». Научные разработки используются в учебном процессе по курсу «Ветеринарная санитария» и «Товароведение», а также на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на 4-й Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (М.: МГ'УПБ, 2002); 5-й Международной

конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» (М.: МГУПБ, 2004).; VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М.: МГУПБ, 2007); Международной научно-практической конференции преподавателей, молодых ученых и аспирантов аграрных вузов РФ «Актуальные проблемы современного аграрного производства» (М.: РУДН, 2008); VII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М.: МГУПБ, 2008); а также на расширенном заседании кафедры «Товароведение и безопасность сырья и продуктов биотехнологии» (2008 г.).

Публикации. Результаты исследований отражены в 10 научных работах, в том числе 3 статьях - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

За проект «Разработка экспресс-методов определения микробных контаминации в продукции, технологическом оборудовании мясоперерабатывающих предприятий на основе иммунохроматографии» в 2007 году был получен грант ассоциации «Университетский комплекс прикладной биотехнологии».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Ветеринарно-санитарная оценка мясного и растительного сырья, готовой продукции и объектов консервного производства.

2. Совершенствование идентификации Е. coli, S. typhimurium, Staph, aureus из мясного и растительного сырья для производства консервов на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией.

3. Разработка методики идентификации S. typhimurium с помощью индикаторных иммунохроматографических тест-систем.

4. Методические подходы к определению ботулинического токсина в мясных консервах с помощью индикаторных иммунохроматографических элементов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, предложений для практики, списка использованной литературы и приложений. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 13 рисунками. Список литературы включает 140 источников отечественных и зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в течение 2001-2009 гг. на кафедре «Товароведение и безопасность сырья и продуктов биотехнологии» ветеринарно-санитарного факультета ГОУ ВПО МГУПБ.

Материалами и объектами исследований служили образцы мясного сырья (свинина и говядина охлажденная и замороженная в полутушах, замороженная

в блоках); образцы растительного сырья (сушеная морковь, сушеный лук); специи (перец черный молотый, перец белый горошком, лавровый лист); консервы перед стерилизацией; готовые мясные стерилизованные консервы; смывы с ограждающих конструкций, технологического оборудования, инструментов и внутрицехового транспорта; вода водопроводная питьевая.

Отбор проб и проведение скрининга мяса, растительного сырья и специй проводили согласно официально утвержденным и общепринятым методам по ГОСТ 10444.15-94 «Продукты пищевые. Методы определения КМАФАнМ»; ГОСТ 21237-75 «Мясо. Методы бактериологического анализа»; ГОСТ Р 5144799 «Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб»; ГОСТ Р 50474-93 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)»; ГОСТ Р 50480-93 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella»; ГОСТ 29185-91 «Продукты пищевые. Методы выявления сульфитредуцирующих клостридий»; ГОСТ Р 51921-02 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения L. monocytogenes».

Проверка мясных консервов перед стерилизацией включала определение количества МАФАнМ; выявление спор мезофильных клостридий и термофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (ГОСТ 10444.3-85 и ГОСТ 10444.5-85). Определение герметичности консервных банок, предназначенных для микробиологического анализа, проводили по ГОСТ 8756.18-70. Термостатирование консервов без изменения внешнего вида банок перед посевами осуществляли согласно ГОСТ 26669-85. При этом в готовых консервах определяли: количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КОЕ/г) по ГОСТ 10444.15-94, наличие роста жизнеспособных мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (ГОСТ 30425-97), наличие роста жизнеспособных мезофильных анаэробных микроорганизмов (ГОСТ 30425-97), плесени и дрожжи, КОЕ в 1 г по ГОСТ 10444.12-88, сульфитредуцирующие клостридии в 0,1 г по ГОСТ 29185-91.

В мясных консервах определяли массовую долю влаги, белка, жира и золы. Массовую долю влаги исследовали методом высушивания навески до постоянной массы, массовую долю жира - методом Сокслета, массовую долю белка - методом Кьельдаля, массовую долю золы - методом озоления навески в муфельной печи.

Анализ качества воды проводили согласно ГОСТ 18963 «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа», ГОСТ Р 51593-2000 «Вода питьевая. Отбор проб», СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

В работе использовали методы иммунохроматографии для определения S. typhimurium и ботулинического токсина; методы амплификации с последующей ДНК-гибридизацией для индикации S. typhimurium, Е. coli, Staph, aureus; а также метод иммунодиффузии для определения видовой

принадлежности мясного сырья. Отдельные методические подходы при выполнении исследований приведены в соответствующих разделах.

Количественные показатели результатов исследований подвергали вариационно-статистическому анализу с использованием программного обеспечения PC Microsoft Excel 2003. Достоверность различий устанавливали по методу Стьюдента-Фишера (Плохинский Ш.А., 1970).

2.2. Результаты исследований 2.2.1. Ветеринарно-санитарная оценка производства мясных консервов

Ветерннарно-саннтарная оценка объектов консервного цеха

Качество получаемой консервированной продукции во многом зависит от ветеринарно-санитарного состояния предприятия (цеха).

С целью установления общей микробной загрязненности объектов консервного цеха, выявления бактерий группы кишечных палочек, сальмонелл и сульфитредуцирующих клостридий отбирали и исследовали смывы в соответствии с инструкциями «По санитарной обработке технологического оборудования и производственных помещений на предприятиях мясной промышленности» (2003) и «Порядок санитарно-микробиологического контроля при производстве мяса и мясных продуктов» (1995). Всего бактериологическому контролю было подвергнуто 224 смыва, в т.ч. 112 -отобранных до проведения дезинфекции и 112 смывов, взятых после санитарной обработки объектов. Исследованиями установлено, что в течение рабочей недели (до проведения дезинфекции) на поверхностях объектов цеха накапливается достаточно большое количество микроорганизмов, в т.ч. и бактерии группы кишечных палочек. Так, общая бактериальная обсемененность пола составила (4,74 ± 0,23)-105 КОЕ/см2, нижних частей стен -(3,25±0,17)-105 КОЕ/см2. Такая же высокая обсемененность отмечена на поверхностях напольных тележек (3,50tfc0,16)-105 КОЕ/см2. В их числе в 10-20% случаев выявлены бактерии группы кишечных палочек и в 7-10 % -сульфитредуцирующие клостридии. В то же время отмечена относительно низкая бактериальная загрязненность волчка, куттера, закаточной машины и инструментов. Это объясняется тем, что в конце каждой рабочей смены в цехе проводится мойка оборудования с применением горячей воды (60 - 70 °С) или химических моющих средств. Кроме этого, мусаты и ножи в течение смены 2-3 раза подвергают очистке и дезинфекции методом погружения в 1,5%-й раствор РИК-Д при экспозиции 30 мин. И, тем не менее, полученные данные свидетельствуют о необходимости контроля за технологией проведения санитарной обработки объектов цеха, так как режим дезинфекции позволяет уничтожать на поверхностях все неспоровые микроорганизмы, находящиеся на объектах консервного цеха. Этот вывод подтверждают данные бактериологических исследований смывов с объектов консервного цеха после проведения дезинфекции 2%-м раствором РИК-Д при экспозиции 3 ч. (табл. 1).

Таблица I - Санитарно-микробиологическая оценка смывов с объектов консервного цеха до и после санитарнойобработкн

Объект исследования Кол-во исследованных смывов КМАФАнМ,КОЕ/см 2 Кол-вовыявленных смывов отч ислаисследованных

БГКП Сальмонеллы Сульфит-релу цирующие клостридии

До и после мойки и дезинфекции

до после ДО после до после ДО после до после

Напольная тележка 10 10 (3,50±0,16)105 (2,2±0,10)102 2 - - - 1 -

Волчок 10 10 (1,34±0,06)105 (1,6±0,07) 102 - - - - - -

Кутгер 12 12 (1,52±0,07)105 (1,6*0,08)-10 2 - - - - - -

Мешалка 10 10 (1,10±0,05)105 (1,9±0,1)102 - - - - - -

Лентатранспортера 10 10 (1,89±0,09)105 (2,0±0,10)102 1 - - - - -

Закаточная машинка 10 10 (1,20 ±0,05)-105 (1,7±0,07)102 - - - - - -

Ножи 12 12 (0,65 ±0,03)-10 5 (0,83±0,04)102 - - - - - -

Мусаты 12 12 (0,57 ± 0,02) • 105 (0,62±0,03)-102 - - - - - -

Пол 14 14 (4,74 ±0,23)- 105 (2,74*0,13)-102 2 - - - 1 -

Стены (нижняя часть) 12 12 (3,25±0,17)105 (2,25±0,12)-102 2 - - - 1 -

Примечание: - (минус) - микроорганизмы не обнаружены;

БГКП - бактерии группы кишечных палочек;

КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно -анаэробныхмикроорганизмов

Например, общая бактериальная обсемененность пола не превышала (2,74±0,13)-10 , стен - (2,25±0,12)-103, напольных тележек - (2,2±0,10> 1О2 КОЕ/см2. Отмечена низкая обсемененность технологического оборудования -от (1,6±0,07) 102 до (2,0±0,10)-102 КОЕ/см2 и инструментов - от (0,62±0,03)-102 до (0,83±0,04)-102 КОЕ/см2. При этом не были выявлены бактерии группы кишечных палочек, сальмонеллы и сульфитредуцирующие клостридии

Таким образом, результаты выполненных исследований позволяют заключить, что микробная загрязненность объектов консервного цеха к концу рабочей недели достаточно высока и необходима их механическая очистка, мойка и дезинфекция, что позволит содержать цех на требуемом ветеринарно-санитарном уровне.

В консервном производстве важное значение придают санитарному состоянию используемой питьевой воды, так как её качество непосредственно влияет на безопасность вырабатываемой продукции. Для этого нами было подвергнуто бактериологическому контролю 137 проб воды.

Результаты исследований показали, что вода, поступающая непосредственно в консервный цех в весенний и осенний сезоны года не отвечает установленным санитарно-гигиеническим требованиям, так как в ней в 7,1-12,5 % случаев обнаружены бактерии группы кишечных палочек, хотя количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов находилось в пределах нормы (от 44,3±2,1 до 47,5±2,5 КОЕ/см3). Полученные данные свидетельствуют об имевшем место неэффективном обеззараживании водопроводной воды на стадии водоподготовки или о бактериальной обсемененности внутренней поверхности водопроводной системы на момент отбора проб. В то же время, в летний и зимний сезоны года в воде, поступающей на завод, патогенные микроорганизмы не были выявлены, а общее микробное число не превышало 41,1 ±2,5 КОЕ/см3. Аналогичные данные получены нами при бактериологическом исследовании воды, отобранной из чана для охлаждения консервов после стерилизации.

Заслуживают внимания результаты исследования проб воды, взятых из чана для определения герметичности консервных банок до стерилизации. В данном случае, исследованная вода была практически стерильной. Видимо это объясняется тем, что температура воды в чане постоянно поддерживается на уровне 85-87 °С.

Контроль безопасности сырья для производства мясных консервов

Пищевое сырье, используемое для изготовления мясных консервов, может быть обсеменено различной микрофлорой, характерной для мяса и ингредиентов растительного происхождения.

Интенсивность микробного загрязнения мяса и его видовая принадлежность зависят от многих факторов, в частности, от несоблюдения ветеринарно-санитарных правил убоя животных, разделки, транспортировки и

хранения продуктов убоя, нарушения требований, предъявляемых к технологическим процессам, санитарии и гигиены производства и др.

Нами были проведены бактериологические исследования 67 проб говядины и 71 пробы свинины, предназначенных для производства мясных консервов. Пробы отбирали от охлажденного, замороженного в полутушах и замороженного в блоках мясного сырья.

Результаты микробиологического исследования мяса представлены в табл. 2.

Таблица 2 - Результаты микробиологического контроля мясного сырья

Материал исследования Кол-во исследованных проб КМАФАнМ, КОЕ/г Кол-во выявленных проб от числа исследованных

БГКП Сальмонеллы Сульфитредуцирующие клостридии L.monocytogenes

Норма', не более Результат

Свинина охлажденная в полутушах) 29 1-Ю3 (0,84±0,04)103 - - - -

Свинина замороженная в блоках 21 5-105 (2,21±0,25)105 1 - - -

Свинина замороженная в полутушах 21 МО4 (0,98±0,06)104 - - - -

Говядина охлажденная в полутушах 21 1-Ю3 (0,92±0,04)-103 - - - -

Говядина замороженная в блоках 28 5105 (2,84±0,11)105 1 - 1 -

Говядина замороженная в полутушах ¡8 1-Ю4 (0,89*0,07)104 - - - -

Примечание: - (минус) - микроорганизмы не обнаружены; БГКП - бактерии группы кишечных палочек; КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультатнвно-анаэробных микроорганизмов *- по СанПиН 2.3.2.1078-01

Из табл. 2 следует, что в пробах охлажденной свинины количество МАФАнМ (КОЕ/r) составляло (0,84±0,04>103, замороженной в полутушах -(0,98±0,06)-104, замороженной в блоках - (2,21 ±0,25)-105. Несмотря на то, что общая бактериальная обсемененность свинины замороженной в блоках не превышала установленной нормы, в одном случае из 21 были выявлены бактерии группы кишечных палочек (БГКП).

Аналогичные данные получены по бактериальной обсемененности говядины. В охлажденной говядине количество МАФАнМ (КОЕ/r) не превышало (0,92±0,04)-103, замороженной в полутушах - (0,89±0,07)Т04, замороженной в блоках - (2,84±0,11)-105. В числе последних выявлены БГКП и сульфитредуцирующие клостридии.

Результаты исследований показывают, что общая бактериальная обсемененность говядины и свинины находится на пределе допустимой нормы. Это связано с обсеменением мяса микроорганизмами в процессе транспортировки, хранения, обвалки и контакта с воздухом производственных помещений. Несмотря на это, при дальнейшем бактериологическом контроле в свинине и говядине сальмонеллы и листерии не выявлены.

Наряду с микробиологическим контролем нами были выполнены исследования по определению видовой принадлежности мясного сырья, хотя этот показатель не является показателем безопасности мяса в соответствии с действующими СанПиН 2.3.2.1078-01. Однако фальсификация мяса одного вида другим не допускается. Существует ряд методов идентификации мяса, основанных на морфологических показателях, но при поступлении блочного мяса идентификация по указанным показателям затруднена. В данном случае применяются гистологические, иммунологические методы и методы на основе ДНК-диагностики.

Для идентификации блочного мяса на основе метода иммунодиффузии использовали тест-системы серии ORBIT, PRIME, SOFT (США). Интерпретацию результатов проводили по линии'преципитации между диском .с исследуемой пробой и диском, пропитанным соответствующими антителами к белкам определенного вида мяса. Метод иммунодиффузии четко позволял идентифицировать видовую принадлежность мясного сырья, поступающего для производства консервов.

В ряде случаев, в зависимости от избранной рецептуры, в мясные консервы добавляют определенное количество ингредиентов растительного происхождения, таких как лук и морковь в сушеном виде, а также специи -перец и лавровый лист. Перед закладкой в консервы они подвергаются входному бактериологическому контролю с учетом возможной контаминации овощей и специй патогенными микроорганизмами (в т.ч. анаэробами) в период сбора и обработки (очистки, нарезки, сушки).

Бактериологическому контролю подвергли 36 проб сушеной моркови, 33 -сушеного лука, 30 - перца черного молотого, 30 - перца белого (горошек) и 33 -лаврового листа.

В результате исследований установлено, что общая бактериальная обсемененность ингредиентов растительного происхождения находится в пределах допустимых норм. Обсемененность моркови не превышала (5,2±0,3)-104, лука - (1,7±0,08> 103, перца черного молотого - (9,0±0,5)-104, перца белого (горошек) - (6,1 ±0,33)-105, лаврового листа - (4,8±0,2)-10s КОЕ/г. При этом из сушеной моркови, в одном случае из 36, выявлены сульфитредуцирующие клостридии. Из всех проб исследованных ингредиентов не выделены термофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы и бактерии группы кишечных палочек.

В соответствии с действующими нормативными документами («Инструкция о порядке санитарно-технического контроля консервов на производственных предприятиях, оптовых базах, в розничной торговле и на предприятиях общественного питания», 1993) бактериологическому контролю подлежат консервы перед стерилизацией. В этой связи нами были проведены микробиологические исследования 58 банок свиных и говяжьих консервов до поступления на термическую обработку. Исследованиями было установлено, что общее количество микроорганизмов в порционированной говядине составляло (1,74±0,08>105 КОЕ/г, свинине - (1,90±0,09>105 КОЕ/г„ т.е. в пределах допустимой нормы (норма - не более 2,0-105 КОЕ/г). При этом в мясе не были обнаружены споры мезофильных клостридий и термофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, сальмонеллы и листерии, но в 3,3-3,6 % случаев были выявлены бактерии группы кишечных палочек.

Исследование качественных показателей мясных консервов

Стерилизованные консервы подвергали исследованию по микробиологическим и химическим показателям качества.

Микробиологический анализ готовой продукции проводили на соответствие требованиям промышленной стерильности. В результате исследования консервов установлена их полная стерильность.

При химическом анализе определяли массовую долю влаги, жира, белка и золы методами, общепринятыми в лабораторной практике. Предварительно консервы проверяли на наличие физического брака (банки с вибрирующими концами, банки-хлопуши, деформированные банки, ложный бомбаж, подтеки банок и др.) и на герметичность. После вскрытия консервов «Говядина тушеная» и «Свинина тушеная» регистрировали органолептические показатели. Установлено, что цвет мяса от желтого до светло-коричневого, вкус свойственный тушеной говядине и свинине с пряностями без постороннего запаха и привкуса, мясо кусочками, не переваренное, сочное, без грубой соединительной ткани, хрящей, сухожилий.

Результаты химических исследований 50 банок консервов показали, что их стерилизация при температуре 115 °С в течение 70 мин не приводит к значительному снижению питательных веществ. В говяжьих мясных консервах

содержание протеина составило 17,3±0,52 %, жира - 17,8±0,71 % при влаге -63,1 ±2,8 %.

Аналогичные данные получены при исследовании консервов из свинины. Отмечено высокое содержание белка 14,5±0,55 % и жира 31,6±1,5 %, что свойственно исходному сырью - свинине.

2.2.2. Совершенствование идентификации Е. coli, S. typhimurium, Staph, aureus в мясном и растительном сырье на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией

Методы определения микробных контаминации мясного и растительного сырья для производства консервов относительно продолжительны и трудоемки. Поэтому дальнейшим этапом наших исследований явилось совершенствование контроля микробного обсеменения сырья с помощью методов на основе ДНК и иммунодиагностики.

Для идентификации Е. coli, S. typhimurium, Staph, aureus в мясном и растительном сырье, используемом при производстве мясных консервов, нами усовершенствована методика на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией. Для этого исследуемые образцы сырья гомогенизировали, микроорганизмы элюировали, подращивали их на жидких питательных средах и после этого осаждали центрифугированием при 8ООО g. Осадок элюировали в буфере для лизиса, содержащем лизоцим и протеиназу К. ДНК осаждали этанолом. Осадок элюировали в буфере для амплификации, а ликвоты амплифицировали с неспецифическими нуклеотидными праймерами, мечеными биотином. Полученные ампликоны гибридизовали с иммобилизованными на нитроцеллюлозных фильтрах специфичными ДНК-зондами. ДНК-зонды получали в реакции амплификации с использованием праймеров: Staphylococcus aureus: Sa442-1 (5'-ААТ СТТ TGT CGG TAC ACG ATA TTC TTC ACG-3'), позиция с 5 по 34; Sa 442-2 (5'-CGT GAG ATT TGA GAT AAT АСА ACA-3'), позиция с 83 по 112; Stn гена основного токсина Salmonella typhimurium; fim А структурного гена Escherichia coli. После проведения гибридизации добавляли конъюгат стрептавидинфосфатазу, субстрат и краситель. Результаты определяли по окрашиванию точек с гибридными молекулами.

Предложенная нами усовершенствованная методика выявления ДНК микроорганизмов отличается от общепринятой методики и позволяет проводить одновременную индикацию Е. coli, S. typhimurium, Staph, aureus на основе амплификации с неспецифическими праймерами и последующей ДНК-гибридизацией со специфическими ДНК-зондами.

С целью установления достоверности полученных результатов исследований одна часть мясного сырья была искусственно контаминирована смесью суточных агаровых культур: Е. coli + S. typhimurium + Staph, aureus; E. coli + Staph, aureus по (10,0±1,0) тыс.м.к./г каждого вида микроорганизмов, а другая - обработана стерильной дистиллированной водой и служила контролем.

Полученные результаты исследований по идентификации тест-микроорганизмов методом на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией были подтверждены бактериологическими анализами (табл. 3).

Таблица 3 - Контроль микробных контаминации мясного сырья бактериологическим и методом ДНК-диагностнки

Объект исследования Результаты идентификации

ДНК-диагностика Бактериологический метод

Е. coli S. typhimurium Staph, aureus Е. coli S. typhimurium Staph, aureus

Говядина (Е. coli + S. typhimurium + Staph, aureus) + + + + + +

Говядина(контроль) - - - - - -

Говядина (Е. coli + Staph, aureus) + - + + - +

Говядина(контроль) - - - - - -

Свинина (Е. coli + S. typhimurium + Staph, aureus) + + + + + +

Свинина (контроль) - - - - - -

Примечание: + (плюс) - микроорганизмы выявлены;

- (минус)- микроорганизмы не выявлены

Таблица 4 - Контроль микробных контаминации мясного н растительного сырья методом ДНК-диагностики

Объект исследования Результаты идентификации

Е. coli S. typhimurium Staph, aureus

Мясное сырье - - -

Растительное сырье - - -

Специи - - -

ДНК Е. coli (положительный контроль) + - -

ДНК S. typhimurium (положительный контроль) - + -

ДНК Staph, aureus (положительный контроль) - - +

ДНК Вас. subtil is (отрицательный контроль) - - -

Примечание: + (плюс) - наличие реакции гибридизации;

- (минус) - отсутствие реакции гибридизации

Используя данную методику, нами проведен анализ микробной контаминации свинины и говядины (замороженной, охлажденной в блоках и

полутушах), растительного сырья (сушеная морковь и сушеный лук), а также специй (перец черный молотый, перец белый горошком, лавровый лист).

Как видно из данных, представленных в табл. 4, в исследуемых пробах сырья для производства мясных консервов с помощью предложенной нами методики Е. coli, S. typhimurium, Staph, aureus обнаружены не были. При этом положительные контроли, проявляющиеся во всех анализах, указывали на специфичность тест-системы (в качестве положительных контролей использовали очищенные ДНК Е. coli, S. typhimurium, Staph, aureus).

Таким образом, модифицированная методика позволяет с высокой специфичностью выявлять микроорганизмы различных видов и проводить анализ в течение 17-18 ч при обогащении микроорганизмов.

2.2.3. Разработка методики идентификации S. typhimurium и ботулинического токсина с помощью индикаторных иммунохроматографическихтест-систем в консервном производстве

Разработка методики идентификации S. typhimurium в сырье и смывах с

помощью индикаторных иммунохроматографических тест-систем

Другим методом экспрессного анализа микробных контаминации мясного сырья, готовой продукции и контроля санитарного состояния объектов консервного производства является использование иммунохроматографических тест-систем.

В качестве индикаторных тест-систем использовали опытные образцы индикаторных иммунохроматографических элементов производства ГНЦ ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения» (рис. 1).

Рнс.1 Схема построения ИИХЗ:

I - подложка для нанесения исследуемого образца; 2 - подложка, содержащая конъюгаг коллоидного золота н антител; 3 — полимерная подложка, обеспечивающая механическую прочность сборки; 4 - нитроцеллюлозная мембрана; 5 - подложка для впитывания образца; б - антитела аналитической зоны; 7 - антитела контрольной зоны.

Образец наносили на мембрану фильтра, где он реагировал с частицами коллоидного золота, покрытыми антителами. Затем смешанный комплекс поступал на иммунохроматографическую мембрану, которая имеет «аналитическую» и «контрольную зону». Аналитическая зона захватывала бактерии с определенными отдельными антигенами, позволяя окрашенным частицам коллоидного золота концентрироваться и образовывать видимую линию (полоску). Положительный образец, содержащий бактерии со специфичными антигенами, давал видимую полоску в аналитической и контрольной зонах. Негативный образец не давал видимой линии в аналитической зоне. В контрольной зоне окрашенная полоска наблюдалась всегда, что свидетельствовало о пригодности индикаторного элемента. Помимо визуальной оценки результатов иммунохроматографического теста использовали отечественный видеоцифровой анализатор «Рефлеком», позволяющий оценивать интенсивность окрашивания линий иммунохроматограммы.

Для определения чувствительности индикаторных

иммунохроматографических элементов были проведены модельные эксперименты на примере музейной культуры 5.1урЫтипит.

Исследования показали, что тест на наличие антигена Б. 1урЫтипит является одноэтапным иммунохроматографическим тестом, который позволяет выявить 1,0-105 м.к./мл и более микроорганизмов. Чувствительность индикации микроорганизмов с помощью иммунохроматографических гест-систем можно повысить путем предварительного обогащения культур.

С целью выявления специфичности иммунохроматографической тест-системы нами были проведены исследования бактериальных культур, в которой Б. (урЫгтшпит дифференцировали от других видов микроорганизмов.

Таблица 5 - Результаты индикации S. typhimurium с помощью иммунохроматографических тест-систем на S. typhimurium

Исследуемые бактерии Результаты окрашивания тест-зоны иммунохроматографического элемента на S. typhimurium

Е. coli -

S. typhimurium +

Staph, aureus -

S. dublin -

L. monocytogenes -

Y. enterocolitica -

E. coli + Staph, aureus (1:1) -

S. typhimurium + E. coli + Y. enterocolitica (1:1:1) +

Примечание: + (плюс) - наличие окрашивания;

- (минус) - отсутствие окрашивания 16

Исследованиями установлено, что индикаторная

иммунохроматографическая тест-система четко дифференцирует S. typhimurium от Е. coli, Y. enterocolitica, L. monocytogenes, Staph, aureus, а также от сальмонелл других серовариантов (табл. 5).

Полученные данные позволили применить метод для контроля мясного сырья и санитарного состояния цехов мясокомбинатов на наличие S. typhimurium. Для этого нами была разработана и испытана методика подготовки проб и смывов к проведению исследований. Мясное сырье гомогенизировали и элюировали микроорганизмы буферным раствором, затем подготовленные пробы сырья и смывы подвергали очистке от крупных частиц и концентрировали микроорганизмы с помощью дифференциального центрифугирования в интервалах 200-15000 g. Для повышения чувствительности метода можно проводить предварительное обогащение микроорганизмов в жидкой питательной среде.

С целью установления достоверности выявления S. typhimurium из мясного сырья предварительно опыты проводили в лабораторных условиях. Для этого часть проб мяса (говядина) искусственно обсеменяли суточной агаровой культурой сальмонелл из расчета 10,0-12,0 тыс. м.к./г. Другую часть мясного сырья не обсеменяли, и она служила контролем.

Таблица 6 - Результаты контроля мясного сырья на обнаружение S. typhimurium

Объект исследования Количество исследованных проб Методы контроля

Иммунохромато-графический Бактериологический

С применением обогащения тест-культур

Говядина (опыт) 20 - +

Говядина(контроль) 10 - -

- С применением обогащения тест-культур

Говядина (опыт) 19 + +

Говядина(контроль) 10 - -

Без применения обогащения тест-культур""

Говядина (опыт) 18 + +

Говядина(контроль) 10 - -

Примечание: + (плюс) сальмонеллы выявлены;

- (минус) сальмонеллы не обнаружены; * - обогащение с начальной концентрацией 3,12-104 м.к./г; ** - обогащение с начальной концентрацией 6,25-Ю4м.к./г; *** - без обогащения с начальной концентрацией 1,25-105 м.к./г.

Подготовку отобранных проб к анализу проводили в соответствии с разработанной методикой с применением и без применения обогащения тест-культур, Параллельно мясное сырье исследовали бактериологическим методом. Результаты испытаний представлены в табл. 6.

Исследованиями установлено, что из .87 проб, мясного сырья, подвергнутых анализу иммунохроматографическим методом, дали положительные результаты пробы, в которых концентрация сальмонелл превышала 6,25Т О4 м.к./г. .

Таким образом, иммунохроматографический метод может бьпь использован при проведении скрининговых исследований мясного сырья на наличие сальмонелл, так как время проведения анализа (без обогащения материала) с учетом пробоподготовки составляет не более 60 мин.

Разработка методики выявления ботулннического токсина в мясных консервах с помощью индикаторных иммунохроматографическнх тест-систем

С целью определения чувствительности и возможности применения индикаторных иммунохроматографическнх элементов для выявления ботулннического токсина готовили разведения препарата ботулннического анатоксина тип А (производство ФГУП НПО «Микроген»), которые наносили на индикаторный иммунохроматографический элемент.

2 £

% о

О. _г

* Л

О Е

«а о

ё ё

108 64 20-

30 ми

15 мин

0,1 1 10

концентрация ботулннического анатоксина типа А, мкг/мл

Рис. 2 Зависимость окрашивания аналитической зоны индикаторного элемента, измеренная прибором «Рефлеком», от концентрации ботулннического анатоксина типа Л, при обнаружении иммунохроматографическим методом в модельных растворах. Время протекания реакции 15 и 30 мин

Регистрацию результатов проводили спустя 15 и 30 мин после начала анализа с помощью прибора «Рефлеком».

Как показали исследования, чувствительность индикации составляет 300 нг анатоксина/мл, а оптимальное время анализа лежит в диапазоне 25-30 мин. Следует отметить, что в препарате анатоксина присутствовали балластные белки, а его иммунохимическая реактивность ниже, чем у нативного токсина.

Для более корректной оценки чувствительности индикаторных элементов в ФГУП «ГосНИИБП» были проведены исследования по изучению чувствительности индикаторных элементов для выявления ботулинического токсина, полученного из культуральной жидкости Clostridium botulinum. Чувствительность индикаторных элементов, подтвержденная биологическими пробами, составляет 3,0 нг/мл.

С целью установления достоверности выявления ботулинического токсина из мясных консервов нами была разработана и испытана методика подготовки проб к проведению исследований. Отобранные образцы консервов гомогенизировали и элюировали буферным раствором, подвергали очистке от крупных частиц при низкоскоростном центрифугировании с целью сохранения максимального количества токсина в образце. Затем супернатант наносили на подложку индикаторного элемента.

Разработанный иммунохроматографический метод испытали на 32 образцах мясных консервов. В качестве положительного контроля использовали ботулинический анатоксин, а в отрицательном контроле -буферный раствор.

Результаты исследований показали, что иммунная реакция «антиген-антитело» происходила там, где в качестве антигена использовался ботулинический анатоксин. В то же время в исследованиях с использованием буферного раствора подобная реакция не была отмечена.

Результаты испытания нммунохроматографнческого метода для выявления S. typhimurium и ботулинического токсина в консервном

производстве

Для подтверждения экспериментальных исследований, выполненных в лабораторных условиях, нами были проведены производственные испытания иммунохроматографического метода непосредственно в условиях консервного цеха мясоперерабатывающего завода.

В процессе выполнения работы по обнаружению S. typhimurium были исследованы 40 проб говядины и свинины, 69 смывов с поверхностей ограждающих конструкций и технологического оборудования, а также 63 пробы мясных консервов для выявления ботулинического токсина. В результате выполненных исследований ни в одном случае не были обнаружены S. typhimurium (результаты были подтверждены бактериологическим методом) и ботулинический токсин.

При этом необходимо отметить следующие преимущества иммунохроматографического метода: компактность аналитической системы, возможность визуальной оценки результатов анализа, экспрессность (воспроизведение метода в течение 1 ч), высокая специфичность (действует избирательно, реагируя только на определенный антиген).

2.2.4. Экономическая эффективность внедрения иммунохроматографического метода для контроля консервного производства

Экономическую эффективность рассчитывали методом приведенных затрат, производимых при исследовании одной пробы мяса и одной пробы мясных консервов в производственных лабораториях с помощью индикаторных иммунохроматографических элементов по сравнению с классическими методами.

Согласно установленному прейскуранту на 01.04.2009 цена индикаторного иммунохроматографического элемента для выявления Б. (урЫтигшт и ботулиническош токсина типа А составляет 120 руб. за каждый. Стоимость исследования одной пробы биологического материала (мясо, овощные и мясные консервы и т.п.) на исключение сальмонелл в среднем составляет 376 руб., а ботулинического токсина - 630 руб.

Затраты на проведение исследования мяса иммунохроматографическим методом составляют 276, 4 руб., а консервов - 278,2 руб.

Таким образом, предполагаемый экономический эффект от внедрения иммунохроматографического метода исследования 1000 проб мяса на выявление сальмонелл составит: 99,6 тыс.руб., а ботулинического токсина в мясных консервах - 351,8 тыс.руб. Высокая коммерческая стоимость исследования биологических материалов на выявление ботулинического токсина связана с постановкой биопробы на лабораторных животных.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован контроль качества и безопасности мясного сырья и вырабатываемых из него консервов на основе ускоренных методов иммунохроматографии и амплификации с последующей ДНК-гибридизацией. Показана высокая специфичность, экспрессность методов и корреляция результатов исследований с общепринятыми бактериологическими методами.

2. Общая бактериальная обсемененность поверхностей ограждающих конструкций и оборудования консервного цеха к концу рабочей недели находилась в пределах от(1,10±0,05)'Ю5 до (4,74±0,23> 105 КОЕ/см2. После проведения влажной дезинфекции 2%-м раствором РИК-Д этот показатель снижается от (1,6±0,07)-102 до (2,74±0,13)• 102 КОЕ/см2.

3. Установлена зависимость бактериальной обсемененности водопроводной питьевой воды, поступающей в консервный цех. В весенний и осенний периоды года на момент отбора проб в 7,1-12,5 % случаев выявлены бактерии группы кишечных палочек, хотя количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов находилось в пределах нормы (от 44,3±2,1 до 47,5±2,5 КОЕ/см3). В летний и зимний сезоны года в воде патогенные микроорганизмы не обнаружены.

4. Общая бактериальная обсемененность мясного сырья, используемого для производства консервов находится в пределах допустимой нормы. Однако в мясе, поступающем в блоках, выявлены бактерии группы кишечных палочек в 3,6-4,7 % случаев.

5. Усовершенствована методика на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, позволяющая с высокой специфичностью проводить одновременную индикацию Е. coli, S. typhimurium и Staph, aureus в мясном и растительном сырье, а также сокращающая, по сравнению с общепринятым бактериологическим методом, время анализа в 2,3 раза.

6. Разработаны методики выявления S. typhimurium и ботулинического токсина с помощью индикаторных иммунохроматографических элементов, чувствительность которых составляет 1,0-105 м.к./г и 3 нг/мл соответственно.

7. Установлена возможность практического применения индикаторных иммунохроматографических элементов для проведения исследований, в т.ч. и скрининговых, по выявлению сальмонелл в мясном, растительном сырье и объектах консервного производства, а также ботулинического токсина в готовой продукции в течение 1-2 ч.

8. Предполагаемый экономический эффект за счет применения индикаторных иммунохроматографических элементов при выявлении сальмонелл и ботулинического токсина составит 99,6 и 351,8 тыс. руб. соответственно на 1000 исследований.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

По материалам исследований разработаны «Методические рекомендации по индикации сальмонелл группы В в сырье растительного и животного происхождения, мясных консервах и объектах внешней среды на основе иммунохроматографических индикаторных элементов» (п.п. 5.1, 6.2.1, 6.2.2, 6.3) (утв. Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 11.12.2008 г.).

Методические рекомендации могут быть использованы в производственных лабораториях и лабораториях при продовольственных рынках, базах и других объектах ветеринарного надзора для ветеринарно-санитарной экспертизы сырья и продуктов растительного происхождения.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Полякова Е.А. Санитарно-микробиологические показатели мясных консервов / Е.А. Полякова, Т.Н. Сорокина // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции: материалы 4-й Международной научно-практической конференции. -М: МГУПБ, 2002. - С. 150-152.

2. Полякова Е.А. Контроль безопасности и качества мясных консервов при сертификации / Е.А. Полякова, Т.Н. Сорокина // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции: материалы 4-й Международной научно-практической конференции. -М.: МГУПБ, 2002. - С. 152-153.

3. Горобчук Е.А. Совершенствование методов оценки безопасности и качества при производстве мясных консервов / Е.А. Горобчук // Живые системы и биологическая безопасность населения: материалы 6-й Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2007. - С. 307.

4. Горобчук Е.А. Идентификация видового состава мясного сырья методом иммунодиффузии при производстве стерилизованных мясных консервов / Е.А. Горобчук // Актуальные проблемы современного аграрного производства: материалы Международной научно-практической конференции преподавателей, молодых ученых и аспирантов аграрных вузов РФ. - М.: РУДН, 2008. - С.66-68.

5. Горобчук Е.А. Ускоренные методы контроля консервов / Е.А. Горобчук,

B.И. Родин, В.В. Светличкин, В.П. Яремчук // Мясные технологии. - 2008. -№8.-С. 34-36.

6. Горобчук Е.А. Определение критериев безопасности и качества при производстве мясных консервов / Е.А. Горобчук // Вестник российского университета дружбы народов. - 2008. - №1. - С. 5-11.

7. Горобчук Е.А. Экспресс-методы определения качества при производстве мясных стерилизованных консервов / Е.А. Горобчук // Вестник Кыргызского аграрного университета. - Бишкек, 2008. - № 3. - Т. 11. -

C.131-134.

8. Горобчук Е.А. Идентификация мясного сырья при производстве стерилизованных мясных консервов / Е.А. Горобчук // Живые системы и биологическая безопасность населения: материалы 7-й Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2008. -С. 234.

9. Горобчук Е.А. Совершенствование контроля безопасности и качества при производстве мясных консервов на основе ДНК- и иммунодиагностики / Е.А. Горобчук// Ветеринария и кормление. -2009.-№3. -С.28-29.

10. Горобчук Е.А. Ветеринарно-санитарный контроль мясного сырья и консервов с применением усовершенствованных методов / Е.А. Горобчук // Достижения науки и техники АПК. - 2009. - №5. - С.62-64.

Подписано в печать 15.09.2009. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 09/21

МГУПБ. 109316, Москва, ул. Талалихина, 33.

ООО «Полисувенир». 109316, Москва, ул. Талалихина, 33.

Тел. 677-03-86

Актуальность темы. Развитие современной мясной промышленности связано с производством продуктов не только кратковременного, но и длительного срока годности, при котором осуществляется наиболее эффективное использование мясного сырья. К такому виду продукции относятся стерилизованные мясные консервы, основное преимущество которых заключается в возможности длительного хранения без потерь питательных и вкусовых качеств. Наряду с этим, главной составной частью безопасности и качества выпускаемой консервной продукции служат показатели ветеринарно-санитарного состояния перерабатываемого сырья, производственных помещений, оборудования и соблюдение установленных требований к технологическим процессам. При этом методы оценки качества продукции консервного производства требуют значительных затрат времени и материалов, что и побуждает к проведению научно-исследовательских работ по изысканию новых и совершенствованию действующих методов с целью сокращения времени исследования и получения качественных и достоверных результатов.

На сегодняшний день перспективными представляются методы ДНК- и иммунодиагностики (А.Я. Самуйленко, 2003; И.Г. Гламаздин, 2003; А.Ф. Валихов, И.Н. Комарова, 2004; В.В. Светличкин, 2005; С.П. Ярков и др., 2007; R. Higuchi et al., 1992; С.С. Huang, Т.М. Pan, 2005), позволяющие проводить анализ термообработанной продукции, идентифицировать возбудителей и определять их токсины, но вместе с тем, требующих их усовершенствования.

Особого внимания требуют микробиологические методы исследования объектов ветеринарного надзора. Это связано с тем, что в практических условиях ветеринарные лаборатории выполняют значительный объем работ, связанных с бактериологическим контролем санитарного состояния производства (Л.Б. Сметанина и др., 2004; Ю.Г. Костенко, 2006; М.А. Шикина, 2006).

Важным элементом закона «О техническом регулировании» является тезис о не введении в заблуждение потребителей, поэтому на стадиях приемки мясного сырья необходимо проводить его идентификацию, чтобы мясные консервы, их компонентный состав соответствовал требованиям технических регламентов, национальных и отраслевых стандартов (В .Г. Версан, 2003; А.Я. Калинин, 2003). г

В связи с изложенным, совершенствование контроля показателей безопасности и качества производства мясных консервов на основе ускоренных, чувствительных и специфичных методов является актуальной задачей.

Научная новизна Разработаны методические подходы для оценки > качества и безопасности сырья, готовой продукции, а также ветеринарно-санитарного состояния объектов консервного производства на основе ускоренных методов ДНК- и иммунодиагностики. Разработаны и испытаны методики для выявления S. typhimurium и ботулинического токсина с помощью индикаторных иммунохроматографических элементов (ИИХЭ), включающие модифицированные этапы пробоподготовки с использованием дифференциального центрифугирования. Определена чувствительность, специфичность разработанных методов. Усовершенствована методика одновременной индикации Е. coli, S. typhimurium, Staph, aureus на основе амплификации с неспецифическими праймерами и последующей ДНК-гибридизацией со специфическими ДНК-зондами. Установлена корреляция результатов исследований, полученных с использованием общепринятых и предлагаемых методик, что доказывает возможность их комплексного или раздельного применения для обеспечения ветеринарно-санитарного контроля качества консервного производства.

Практическая ценность

На основании результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по индикации сальмонелл группы В в сырье растительного и животного происхождения, мясных консервах и объектах внешней среды на основе индикаторных иммунохроматографических элементов» (п.п. 5.1, 6.2.1, 6.2.2, 6.3) (утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 11.12.2008 г.). Материалы исследований включены в проект Национального стандарта Российской Федерации «Растительная продукция и корма, зерно. Экспресс-метод обнаружения специфичных белков». Научные разработки используются в учебном процессе по курсу «Ветеринарная санитария» и «Товароведение», а также на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

4-й Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (М.: МГУПБ, 2002);

- 5-й Международной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» (М.: МГУПБ, 2004);

- VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М.: МГУПБ, 2007 г.);

Международной научно-практической конференции преподавателей, молодых ученых и аспирантов аграрных вузов РФ «Актуальные проблемы современного аграрного производства» (М.: РУДН, 2008 г.);

7 - VII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М.: МГУПБ, 2008 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Ветеринарно-санитарная оценка мясного и растительного сырья, готовой продукции и объектов консервного производства.

2. Совершенствование идентификации Е. coli, S. typhimurium, Staph, aureus из мясного и растительного сырья для t производства консервов на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией.

3. Разработка методики идентификации S. typhimurium с помощью индикаторных иммунохроматографических тест-систем.

4. Методические подходы к определению ботулинического токсина в мясных консервах с помощью индикаторных иммунохроматографических элементов.

Публикации. Результаты исследований отражены в 10- научных работах, в том числе 3 статьях - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

За проект «Разработка экспресс-методов определения микробных контаминаций в продукции, технологическом оборудовании мясоперерабатывающих предприятий на основе иммунохроматографии» в 2007 году был получен грант ассоциации «Университетский комплекс прикладной биотехнологии».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений.

выводы

1. Усовершенствован контроль качества и безопасности мясного сырья и вырабатываемых из него консервов на основе ускоренных методов иммунохроматографии и амплификации' с последующей ДНК-гибридизацией. Показана высокая специфичность, экспрессность методов и корреляция результатов исследований с общепринятыми бактериологическими методами.

2. Общая бактериальная обсемененность поверхностей ограждающих конструкций и оборудования консервного цеха к концу рабочей недели находилась в пределах от (1,10±0,05)-105 до (4,74±0,23)-10? КОЕ/см . После проведения влажной дезинфекции 2%-м< раствором РИК-Д этот показатель снижается от (1,6±0,07)-102 до (2,74±0,13>102 КОЕ/см2.

3. Установлена зависимость бактериальной обсемененности водопроводной питьевой воды, поступающей в. консервный цех. В весенний и осенний периоды года на момент отбора проб в 7,1-12,5 % случаев выявлены бактерии группы кишечных палочек, хотя количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов находилось в пределах нормы (от 44,3±2,1 до 47,5±2,5 КОЕ/см3). В летний.и зимний сезоны года в воде патогенные микроорганизмы не обнаружены.

4. Общая бактериальная обсемененность мясного сырья, используемого для производства консервов находится в пределах допустимой нормы. Однако в мясе, поступающем в блоках, выявлены бактерии группы кишечных палочек в 3,6-4,7 % случаев.

5. Усовершенствована методика на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, позволяющая с высокой специфичностью проводить одновременную индикацию Е. coli, S. typhimurium и Staph, aureus в мясном и растительном сырье, а также сокращающая, по сравнению с общепринятым бактериологическим методом, время анализа в 2,3 раза.

6. Разработаны методики выявления S. typhimurium и ботулинического токсина с помощью индикаторных иммунохроматографических элементов, чувствительность которых составляет 1,0-105 м.к./г и 3 нг/мл соответственно.

7. Установлена возможность практического применения индикаторных иммунохроматографических элементов для проведения исследований, в т.ч. и скрининговых, по выявлению сальмонелл в мясном, растительном сырье и объектах консервного производства, а также ботулинического токсина в готовой продукции в течение 1-2 ч.

8. Предполагаемый экономический эффект за счет применения индикаторных иммунохроматографических элементов при выявлении сальмонелл и ботулинического токсина составит 99,6 и 351,8 тыс. руб. соответственно на 1000 исследований.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Методические рекомендации «Индикация сальмонелл группы В в сырье растительного и животного происхождения, мясных консервах и объектах внешней среды на основе индикаторных иммунохроматографических элементов», (утверждены Отделом ветеринарной медицины Россельхозакадемии, 11 декабря 2008 года).

Методические рекомендации могут быть использованы в производственных лабораториях и лабораториях при продовольственных рынках, базах и других объектах ветеринарного надзора для ветеринарно-санитарной экспертизы сырья и продуктов растительного происхождения.

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время важное значение приобретает своевременная ветеринарно-санитарная экспертиза сырья и продуктов животного происхождения. Это связано с защитой животных и человека от опасных зоонозных заболеваний, возбудители которых могут контаминировать мясо, яйца, субпродукты и продукты их переработки.

Следует обратить особое внимание на тот факт, что более 60% сырья животного происхождения импортируется в нашу страну из Европы, Азии, Америки и других стран, не всегда благополучных по инфекционным и инвазионным заболеваниям. В этой связи специальные ветеринарные и медицинские службы проводят мониторинг эпизоотического состояния отдельных регионов и стран, а также осуществляют контроль безопасности и качества- завозимой продукции непосредственно на местах закупок или таможенных терминалах. Тем не менее, имеют место случаи регистрации импорта некачественной продукции в ветеринарно-санитарном отношении.

С целью снижения- зависимости от стран-экспортеров животноводческой продукции, а также получения качественного и безопасного мясного сырья многие мясоперерабатывающие предприятия входят в состав крупных объединений, так называемых* холдингов, имеющих свои животноводческие хозяйства по выращиванию и откорму крупного рогатого скота, свиней, овец и птицы. Такая организация агропромышленного комплекса позволяет в определенной' мере восполнить дефицит пищевого сырья животного происхождения и получить существенный экономический и социальный эффект. В то же время дальнейшее развитие отечественного животноводства, особенно свиноводства и птицеводства открывает возможность в ближайшие годы получать продукцию более качественную по сравнению с импортной.

Для изготовления консервов направляют сырье не только, благополучное в ветеринарно-санитарном отношении, но и мясо, полученное от убоя больных животных (туберкулез, бруцеллез, рожа и др.). В этой связи можно предположить, что объекты консервного цеха (ограждающие конструкции, оборудование, инструменты и дрО обсеменены различной микрофлорой, в т.ч. патогенной. С целью проверки этого предположения нами было проведено достаточно большое количество микробиологических исследований объектов консервного цеха, а также используемой* водопроводной питьевой воды, мясного сырья и готовой продукции. При этом было исследовано 224 смыва с поверхностей ограждающих конструкций, технологического оборудования и инструментов. Исследованиями установлена высокая; бактериальная обсемененность пола (4,74±0,23) 105 КОЕ/см2, нижних частей стен (3,25±0,17)-105 КОЕ/см2, транспортера (1,89±0,09)-105 КОЕ/см2 и

5 2 напольных тележек (3,50±0,16)-10 КОЕ/см . В их числе выявлены бактерии группы кишечных палочек; в; 10-20 % и сульфитредуцирующие клостридии в 7-10 % случаев; В то же время обсемененность технологического оборудования: ниже примерно в два раза, что можно объяснить их санитарной обработкой в конце каждой рабочей смены.

При ветеринарно-санитарной оценке цеха важное значение имеет микробиологическая безопасность мясного- сырья. Результаты выполненных нами исследований показали, что свинина и говядина, направляемые для изготовления консервов, имеют общую бактериальную обсемененность, не превышающую допустимую^ норму. Так в пробах свинины и говядины замороженной в полутушах количество КОЕ/г не превышало (0,98±0,06)-104, замороженной в блоках - (2,84±0,11)-105 и охлажденной - (0,92±0,04)-103. Следует отметить, что эти данные, свидетельствуют о невысокой, общей микробной загрязненности мясного сырья. Однако необходимо иметь в виду, что во время его размораживания, временного хранения, транспортировки и обвалки может

91 происходить резкое размножение остаточных микроорганизмов, так как мясное сырье является для них оптимальной питательной средой. Особенно необходимо обращать внимание на исключение сальмонелл и токсигенных анаэробов.

Помимо микробиологического контроля мясного сырья важное значение имеет определение его видовой принадлежности. Фальсификацию некоторых видов мяса органолептически определить I сложно (например, мясо в блоках), а в ряде случаев, невозможно. Особенно это относится к случаям, когда мясо измельчено, смешано со специями, консервантами, что приводит к изменению цвета, запаха и консистенции. В таких случаях применяются гистологические, иммунологические методы и методы на основе ДНК-диагностики.

Анализ методов определения видовой принадлежности мяса показал, что перспективным является иммунологический метод. Испытание метода иммунодиффузии с применением тест-системы серии ORBIT, PRIME, SOFT показало полную его специфичность - четкую идентификацию свинины от мяса других видов животных.

При производстве мясных консервов в обязательном порядке в качестве специй применяют перец молотый, горошком и лавровый лист. В ряде случаев в качестве добавки используют растительные ингредиенты, такие как репчатый лук и морковь. Учитывая, что они также могут быть обсеменены различной патогенной микрофлорой, нами проведен их бактериологический контроль на исключение бактерий группы кишечных палочек, мезофильных анаэробов, термофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Полученные результаты анализа подтверждают вывод о ■ необходимости входного бактериологического контроля выше перечисленных ингредиентов.

Например, общая бактериальная обсемененность моркови не превышала (в

КОЕ/г) (5,2±0,3>104, лука - (1,7±0,08>103. При этом из сушеной моркови, в одном случае из 36, выявлены сульфитредуцирующие микроорганизмы. Из

92 растительных добавок не были выделены бактерии группы кишечных палочек, термофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы.

Таким образом, результаты исследований мясного сырья- и добавляемых в консервы ингредиентов свидетельствуют об их соответствии требованиям нормативных документов по микробиологическим характеристикам.

При ветеринарно-санитарной оценке консервного производства, учитывают не только микробную загрязненность объектов цеха и используемого сырья, но и конечного продукта, т.е. консервов. По данным некоторых исследователей, несмотря на- жесткий режим стерилизации, в ряде случаев' в консервах выявляют различные микроорганизмы. По нашим данным исследованные 50 банок консервов* показали их полную стерильность. Однако качество * консервов- оценивается не только по микробиологическим показателям, но и химическим. При, подборе режимов стерилизации учитывают не только тепловой режим, но-и его влияние на денатурацию белка мяса. Чем выше температура стерилизации и ее продолжительность, тем ниже содержание белка в консервированном продукте. Выполненными химическими, исследованиями" консервов «Говядина тушеная» и «Свинина тушеная» установлено, что в первых содержание белка составляет 17,3±0,52 %, а во вторых - 14,5±0,55 % при содержании жира 17,8±0,71 % и 31,6±1,5 % соответственно. Исследования показали, что консервы отличаются высоким содержанием протеина* при-минимальном содержании жира.

Одним из важнейших условий санитарного^ благополучия консервного производства является его обеспечение качественной питьевой водой, используемой'в,технологических процессах. Вода должна соответствовать ГОСТ 18963-73 «Вода питьевая. Методы санитарнобактериологического анализа». При наличии в воде микроорганизмов в количествах, превышающих показатели ГОСТа неизбежно обсеменение

93 поверхностей технологического оборудования, инструментов, консервной тары и, в конечном итоге, сырья и готовой продукции.

Выполненные нами микробиологические исследования показали, что вода, поступающая в консервный цех, в весенний и осенний сезоны года не отвечает установленным санитарно-гигиеническим требованиям, так как в ней обнаруживаются бактерии группы кишечных палочек. Полученные данные свидетельствуют об имевшем место неудовлетворительной дезинфекции воды на стадии водоподготовки или бактериальной обсемененности внутренней поверхности водопроводной системы на момент отбора проб. Поэтому в пробах воды, отобранной из чана для охлаждения консервов, выявлены эти же микроорганизмы. В то же время в пробах воды, взятой из чана для проверки герметичности консервов, патогенные микроорганизмы обнаружены не были. Это связано с высокой температурой воды, поддерживаемой постоянно на уровне 85-87 °С.

Вторая и основная часть нашей работы была посвящена усовершенствованию некоторых методов ветеринарно-санитарного контроля мясного сырья и объектов консервного производства.

Микробиологические методы исследования объектов ветеринарного надзора также требуют усовершенствования с целью ускорения анализов и повышения уровня достоверности получаемых результатов. Это объясняется тем, что в практических условиях ветеринарные лаборатории выполняют значительный объем работ, связанных с бактериологическим контролем санитарного состояния производства. Например, в консервном производстве необходимо осуществлять входной контроль мясного сырья и выходной — готовой продукции, периодически проводить исследования смывов с поверхностей производственных помещений, технологического оборудования, инструментов, транспортных средств, тары и воздуха помещений. Применяемые для этого микробиологические методы хотя и достоверны, но их воспроизведение требует значительных затрат времени и материалов. В этой связи в нашей стране и за рубежом постоянно

94 методов контроля с целью снижения времени исследования и получения специфичных и достоверных результатов. Учитывая это, нами была усовершенствована методика выделения и идентификации Е. coli, S. typhimurium и Staph, aureus на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией. В методику были включены последовательно проводимая гомогенизация пробы, элюирование и подращивание культур, центрифугирование, элюирование полученного осадка в буфере с лизоцимом и протеиназой К. ДНК осаждали этанолом. В дальнейшем осуществляли амплификацию ликвота с неспецифическими нуклеотидными праймерами, меченными биотином и гибридизацию ампликонов со специфическими ДНК-зондами на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах. Испытание усовершенствованного метода в такой модификации показало высокую специфичность выявления вышеприведенных микроорганизмов из мясного сырья, специй и растительных добавок. Методика позволяет получить результаты- анализа через 17-18 ч.

Выделение некоторых микроорганизмов возможно не только на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, но с применением индикаторных иммунохроматографических элементов

ИИХЭ). Этот метод относительно новый в лабораторной практике и в основном применяется для определения некоторых веществ в биологических материалах. Основное достоинство метода — специфичность и быстрота получения результата исследования. Поэтому в литературе встречается определение иммунохроматографического анализа, как метод сухой иммунохимии, стрип-тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, экспресс-тест или экспресс-анализ. Исходя из этого, в последние годы проводятся исследования по модификации иммунохроматографического метода для экспрессной индикации некоторых возбудителей особо опасных заболеваний, как сап, сибирская

95 язва, туляремия, чума и др. на примере чистых культур (Волох О.Х. и др., 2005; Ярков С.П. и др., 2003, 2007 и др.).

Нами так же были проведены эксперименты по установлению возможности применения иммунохроматографического метода для индикации сальмонелл из мясного и растительного сырья, а также объектов консервного цеха и выявления. ботулинического токсина" из мясных консервах. При выполнении данной работы необходимо было разработать методы отбора проб, последовательность их обработки^ для дальнейшего исследования, а также выполнить другие действия с учетом-чувствительности и специфичности исследуемых материалов. Для получения достоверного результата часть тест-материалов была искусственно обсеменена S. typhimurium, а другая (не обсемененная)-служила контролем. В результате иммунохроматографического анализа было четко выявлено наличие сальмонеллезного антигена в говядине. В то же время при испытании иммунохроматографического метода в тест-материалах не был выявлен ботулинический токсин, что особенно важно для мясных консервов.

На заключительной стадии, работы были проведены широкие производственные испытания усовершенствованного иммунохроматографического метода. Результаты исследований подтвердили результаты анализа, полученные в лабораторных опытах.

Таким образом, результаты выполненных исследований позволяют заключить, что разработанные усовершенствованные методы позволяют получать результаты исследований с высокой специфичностью, многократным ускорением процесса исследований даже в полевых условиях при наименьших затратах труда и материалов. Мясное сырье (говядина и свинина) для производства консервов благополучно в ветеринарно-санитарном отношении, но в 3,6-4,7 % случаев были обнаружены БГКП. Вода, используемая в консервном производстве, требует постоянного санитарно-микробиологического контроля в соответствии с действующими нормативными документами