Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка средств и методов лабораторной диагностики пограничной болезни овец
- Ученая степень
- кандидата ветеринарных наук
- ВАК РФ
- 16.00.03
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Разработка средств и методов лабораторной диагностики пограничной болезни овец
На правах рукописи УДК 619:616-085.371:578.824.11
РГБ ОД 2 8 МДР т
ЛУГОВЦЕВ Владимир Юрьевич
РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПОГРАНИЧНОЙ БОЛЕЗНИ ОВЕЦ
16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
Покров 2000 г.
Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ВНИИВВиМ РАСХН).
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
Член-корреспондент РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор |ВИШНЯКОВ Иван Федорович | (ВНИИВВиМ, г. Покров).
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: ЛАГУТКИН Николай Алексеевич - доктор ветеринарных наук, профессор (ВНИИВВиМ, г. Покров);
ЧИЧКАНОВ Владимир Павлович - кандидат биологических наук (ФГУП ПЗБ, п. Вольгинский).
ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:
Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (ВНИИЗЖ, п. Юрьевец).
Защита состоится " 21 " апреля 2000 г. в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д-120.61.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, г. Покров, Владимирская область, ВНИИВВиМ.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.
Автореферат разослан " 20 " марта 2000 г.
Ученый секретарь диссертационного
совета, кандидат биологических наук В.Я. САВУКОВА
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Пограничная болезнь овец (ПБО, Border disease, Syndrom "X", "Hairy shakers", "Fuzzy lambs") - вирусная конгенитальная болезнь овец, возникающая при заражении суягных овцематок, характеризующаяся абортами, рождением мертвых и слаборазвитых ягнят с ненормальным шерстным покровом, тремором мускулатуры тела и замедленным развитием. Исход болезни зависит от стадии суягности, на которой произошло заражение овцематки и плода, и может проявляться смертью плода с его последующей резорбцией, мумификацией или абортом, мертворождением или смертью приплода в первые дни жизни. В ряде случаев наблюдается рождение молодняка с типичными клиническими признаками, или персистентно инфицированных ягнят (Boden Е. et al., 1991; Brennand D.M. et al., 1986). Описаны отдельные вспышки ПБО, сопровождавшиеся значительным процентом (до 50%) гибели взрослых овец (Barlow R.M. et al. 1960; Campen H.V. et al., 1998; Chappuis G. et al., 1989).
В настоящее время болезнь регистрируется во всех странах с развитым овцеводством, где наносит значительный экономический ущерб (Boden Е. et al., 1991; Bonniwell M.A. et. al., 1987; Brizzi A. et al., 1996; Campen H.V. et al., 1998).
Возбудителем болезни является вирус, имеющий близкое антигенное и генетическое родство с вирусами классической чумы свиней (КЧС) и вирусной диареи КРС (ВДКРС) (Acland Н.М. et al., 1972; Becher P. et al., 1994, 1995, 1996; Brugere-Picoux J. et al., 1984). По данным MKTB вирусы ПБО, ВДКРС и КЧС представляют род Pestivirus, семейства Flaviviridae (Murthy F.A. et al., 1995). В настоящее время доказано, что синдром ПБО может быть вызван инфицированием суягных овцематок не только "истинным" вирусом ПБО, но также и вирусом ВДКРС (French E L. et а]., 1974; Snowdon W.A. et al., 1975; Barlow R.M. et al., 1980; Patón D.J. et al., 1994; Sullivan D.G. et al., 1995). Кроме того, доказана возможность перекрестного заражения овец, КРС, коз и свиней вирусами ПБО, ВДКРС и КЧС (Barlow R.M. et al., 1975,1980; Shimizu M. et al., 1989; Loken T. et al., 1991; Patón D.J. et al., 1994,1997).
Способность представителей рода Pestivirus преодолевать межвидовой барьер и вызывать инфекционный процесс у всех парнокопытных, культивироваться на клеточных культурах различного происхождения и давать перекрестные реакции при серологическом тестировании, обусловливают определенные трудности в постановке соответствующего диагноза при пестивирусных инфекциях животных. Это особенно важно при дифференциации возбудителя ПБО от других пестивирусов, что связано с различным характером проводимых мероприятий, необходимыми для ликвидации очага инфекции.
Таким образом, ПБО, как отдельная нозологическая единица представляет собой важную проблему в ветеринарии. Это обусловлено непосредственными экономическими потерями при вспышке болезни, трудностью дифференциации вируса ПБО из-за близкого генетического и антигенного родства с другими пестивирусами, опасностью распространения нецитопатогенных пестивирусов-контаминантов среди вое-
приимчивого поголовья животных при использовании в биологической промышленности, в частности в производстве вакцин, биоматериалов овечьего происхождения.
В современных социально-экономических условиях с расширением международных торгово-экономических отношений возрастает опасность заноса инфекции из различных регионов мира и неконтролируемого ее распространения в России и странах СНГ. До сих пор в России исследования в области ПБО не проводились, однако, указанные выше причины определяют необходимость разработки средств и методов лабораторной диагностики и изучения эпизоотической ситуации по данной болезни в России. Не менее актуально создание средств специфической профилактики ПБО. Перечисленные проблемы обусловили выбор цели настоящей работы.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является разработка средств и методов лабораторной диагностики ПБО.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1) изучить способность вируса ПБО к репродукции в первичных и перевиваемых культурах клеток, условия, позволяющие получать наибольшее накопление вируса;
2) изучить формы течения инфекции, обусловленной вирусом ПБО, у овец;
3) разработать способ получения сывороток, специфичных вирусу ПБО, и пригодных для использования в диагностических целях;
4) разработать лабораторные методы диагностики ПБО;
5) разработать схему лабораторной диагностики ПБО.
6) провести исследования полевых сывороток крови овец и коз с целью определения распространенности пестивирусных инфекций в популяциях мелких жвачных в отдельных регионах России.
Научная новизна
Научная новизна проведенных исследований состоит в том, что:
- установлено, что наиболее чувствительными к вирусу ПБО являются первичные культуры клеток, ТЯ и ПЯ;
- показано, что заражение вирусом ПБО овец романовской породы вызывает инаппарантную форму болезни, при которой наиболее вероятным путем распространения вируса является вертикальный;
- разработан метод выделения вируса ПБО в культуре клеток ТЯ с его последующей идентификацией в РИФ;
- для серологического типирования вируса ПБО отработана перекрестная РН; с целью детекции антител к ПБО разработаны два варианта РН; для обнаружения РНК вируса ПБО и дифференциации его от других пестивирусов разработана ПЦР.
оактическая значимость
Для диагностики ПБО предложены тесты: реакция иммунофлюоресценции, ре-:ция нейтрализации и полимеразная цепная реакция.
Разработаны "Методические указания по лабораторной диагностике ПБО" , ут-ржденные директором ВНИИВВиМ.
Разработанные средства и методы лабораторной диагностики ПБО внедрены в 1учно-исследовательскую и диагностическую работу во ВНИИВВиМ.
сновные положения, выдвигаемые на защиту:
1) Результаты исследований по определению оптимальных условий культивирования вируса ПБО в культурах клеток.
2) Результаты изучения форм течения инфекции, обусловленной вирусом ПБО, у овец романовской породы в пост- и пренатальном периодах и формы проявления данной инфекции у свиней.
3) Результаты разработки методов и схемы лабораторной диагностики ПБО с использованием иммунофлюоресценции для идентификации вирусного антигена, перекрестной реакции нейтрализации для дифференциации вируса ПБО от других пестивирусов, полимеразной цепной реакции для обнаружения и дифференциации РНК вируса ПБО и реакции нейтрализации - для выявления специфических антител.
пробация результатов работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях в ИЭВ (г. Москва, 1998), ВНИИВВиМ (г. Покров, 1998) и на заседаниях Ученого Со-:та ВНИИВВиМ (г. Покров, 1997-1999). Результаты основных научных исследова-ш подтверждены комиссионными испытаниями.
убликация результатов исследований
По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.
бъем и структура диссертации
Диссертация изложена на 148 листах машинописного текста и включает еле-тощие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты соб-венных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список [тературы (254 источника, в том числе 14 отечественных). Работа иллюстрирована ' таблицами, 22 рисунками и дополнена приложением.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы Вирусы
Вирус ПВО: Moredun - референс штамм, получен на уровне второго пассажа в культуре клеток SK с активностью 3,0 ККИД5о/см3 в Центральной ветеринарной лаборатории (Weybridge, Великобритания); BDV-Irish - штамм вируса ПБО, получен на уровне четвертого пассажа в первичной культуре клеток тестикул ягненка (ТЯ), с активностью 3,2 ККИД50/СМ3 в Центральной ветеринарной исследовательской лаборатории (Abbotstown, Ирландия); BD-112 - полевой изолят, получен на уровне второго пассажа в первичной культуре клеток ТЯ, с активностью 3,2 ККИД50/см3 в ID-DLO (Lelystad, Нидерланды); R-2727 - полевой изолят, получен на уровне второго пассажа в первичной культуре клеток ТЯ, с активностью 3,5 ККИД50/СМ3 в Федеральном исследовательском центре вирусных болезней животных (Tubingen, Германия).
Вирус ВДКРС: Oregon C24V - референс штамм, получен в ВГНКИ на уровне пятого пассажа в первичной культуре клеток почки плода КРС с активностью 4,0 ККЩЫсм3.
Вирус КЧС: Ши-Мынь - вирулентный штамм вируса КЧС, получен на уровне 48 пассажа в перевиваемой культуре клеток РК-15 с активностью 5,5 ККИД50/СМ3 в лаборатории Музея штаммов микроорганизмов ВНИИВВиМ; ЛК-ВНИИВВиМ - вакцинный штамм, получен на уровне 20 пассажа в первичной культуре клеток ТЯ с активностью ККИДзо/см3 в лаборатории Музея штаммов микроорганизмов ВНИИВВиМ; 238-Н - низковирулентный полевой изолят, получен на уровне пятого пассажа в перевиваемой культуре клеток РК-15 с активностью 4,5 ККИД50/см3 в лаборатории Диагностики ВНИИВВиМ.
Животные
В экспериментах были использованы овцы романовской породы различных половозрастных групп, свиньи 2-5 месячного возраста крупной белой породы, полученные из хозяйств Владимирской области, благополучных по инфекционным болезням и из Сектора подготовки экспериментальных животных ВНИИВВиМ.
Культуры клеток
Для изучения вируса in vitro были использованы культуры клеток ТЯ, ПЯ, ПО, ПЭАК, ПС, MDBK, SK-6, полученные в лаборатории Культур клеток с музеем клеточных штаммов ВНИИВВиМ, КСТ, ВТ, ЕВТг , полученные в лаборатории Культур клеток и тканей ВИЭВ (г. Москва) и FLK, полученная в лаборатории Культур клеток НИИ вирусологии им. И.И.Ивановского (г. Москва). Для их культивирования использовались питательные среды Игла (MEM), ДМЕМ, с добавлением сывороток крови плода КРС, КРС, овцы, лошади, проверенных на отсутствие антител к пестивирусам и вирусоносительство.
выворотки
Сыворотки свиней, специфичные вирусу КЧС, специфические ФИТЦ-онъюгаты к вирусу КЧС и сыворотки, специфичные другим гетерологичным виру-ам, были получены в лаборатории Диагностики ВНИИВВиМ.
Ретроспективные исследования проводили с использованием полевых сыворо-ок в количестве 526 проб от овец (из хозяйств Владимирской, Орловской, Ульянов-кой областей, Кабардино-Балкарской Республики, Республики Бурятия, Республики 'ыва, Республики Саха-Якутия) и 184 проб от коз (из хозяйств Владимирской облас-и).
{'ультивирование и титрование вирусов
Для культивирования вирусов ПБО и ВДКРС были использованы 2-3 суточные ервичные (ТЯ или ПЯ) и перевиваемые (ПС) культуры клеток, приготовленные из каней органов парнокопытных животных, выращенные в матрасах РУ. После куль-ивирования инфицированную культуру клеток хранили при температуре минус 70 °С о использования.
Титрование вирусов ПБО и ВДКРС проводили в культуре клеток ТЯ и ПС, со-тветственно. Учет результатов проводили с помощью реакции иммунофлюоресцен-ии (РИФ) (Кэтти Д., 1991) или по проявлению характерного ЦПД (для вируса 1ДКРС). Титр вируса рассчитывали по методу Рида-Менча.
Толучение специфических сывороток
Специфичные сыворотки к вирусу ПБО получали на овцах, путем двукратной ммунизации в дозе 2x105 ККИД50 с интервалом 2 мес. Для бустер-инъекции исполь-овали смесь равных объемов вируссодержащей суспензии и полного адьюванта >рейнда, которую вводили внутримышечно и подкожно в несколько точек. Полипес-ивирусные сыворотки получали на свиньях, путем последовательной иммунизации ирусами ПБО и КЧС.
)ценка функциональной активности лейкоцитов
В экспериментах использовали лейкоциты крови, инфицированные пестивиру-ами in vitro или in vivo. Определение прокоагулянтной активности (ПКА) лейкоци-ов и постановку реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) проводили со-пасно описанным ранее методикам (Ющенко Ю.А., 1997).
)бнаружение и титрование специфических антител
С целью выяштения специфических вируснейтрализующих антител применяли еакцию нейтрализации (РН) в культуре клеток, выращенной на покровных стеклах в робирках или в 96-ти луночных микропанелях, с использованием вируса ПБО или 1ДКРС. Учет результатов проводили в РИФ или по проявлению цитопатогенного ействия (для вируса ВДКРС).
Определение антигенного родства
Для определения антигенного родства между пестивирусами была использована перекрестная РН, проводимая с постоянной дозой сыворотки или вируса. Сыворотки разводили с шагом 1 log2, вируса - 1 IoglO.
Исследование полевых сывороток крови овец и коз
Исследование проб полевых сывороток крови овец и коз проводили с помощью разработанного микроварианта РН. В качестве тест-вируса использовали цитопато-генный штамм ВДКРС Oregon C24V. Учет реакции проводили по проявлению ЦПД вируса. Позитивными считались сыворотки, с титром антител 1:8 и выше.
Постановка ПЦР
Обработку информации по первичной структуре проводили с использованием пакетов прикладных программ DNASIS/PROSIS версия 3.00 и PC Gene, версия 5.15 1988 (Intelligenetics, Швейцария). Подбор праймеров и расчет вероятных схем их спаривания осуществляли с использованием программы Oligos, на основе анализа опубликованных последовательностей генома пестивирусов (Becher Р. et al., 1998; Moel-rose L. et al., 1993; Moormann R.J. et al., 1990; Ruggli N. et al., 1996).
Выделение РНК пестивирусов проводили по описанной ранее методике (Chomezynski P. and Sacchi, 1987). Синтез кДНК и клонирование проводили с помощью набора "Universal RiboClone® cDNA Synthesis System" (Promega, США) с использованием "рассеянной затравки" и специфических олигонуклеотидов длиной 1920 оснований. Амплификацию кДНК проводили в подобранной реакционной смеси по отработанным программам. Продукты ПЦР анализировали с использованием ферментов Ava-I, Pst-I. Учет результатов проводили по размеру ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле.
Электронная микроскопия вируса ПБО
Очищенный вируссодержащий материал исследовали под электронным микроскопом (JEOL, JEM 100, Япония) методом негативного контрастирования с использованием 2%-ного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК).
Методы статистической обработки данных
Статистическую обработку данных проводили согласно рекомендациям Лакина Г.Ф. (1990) с использованием пакета прикладных программ "Statgraphics. Version 2.1".
Результаты исследований
Подбор клеточной системы для культивирования вируса ПБО
С целью подбора оптимальной пермиссивной клеточной системы для культивирования вируса ПБО нами были использованы первичные и перевиваемые культуры клеток различного происхождения: овцы (ТЯ, ПЯ, ПО, SCP, FLK), козы (ТК, ГК, ПЭАК), КРС (КСТ, MDBK, ВТ, ЕВТг), сайги (ПС), свиньи (SK-6, РК-15).
Инфицированные культуры клеток культивировали в течение 4-7 суток. При необходимости проводили до 5 последовательных слепых пассажей. Репликацию вируса в клетках определяли по обнаружению вирусного антигена в РИФ. В качестве модели был использован референс штамм вируса ПБО Moredun.
Полученные результаты показали, что наиболее высокой чувствительностью к вирусу ПБО обладают культуры клеток ТЯ и ПЯ, в которых он накапливался в титре 4,3+0,15 lg ККИД5()/см3 в течение 96-120часов. Уровень накопления вируса в первичных и вторичных культурах (субкультурах) клеток ТЯ сохранялся независимо от числа пассажей вируса. При этом, установлено, что титр инфекционности внутриклеточного и внеклеточного вируса находился на одном уровне. Необходимыми условиями для максимального накопления вируса является использование для культивирования культуры клеток ростовой среды Игла (MEM) с добавлением 0,5% ГЛА и 8% сыворотки крови овцы в режиме инкубирования при 37 °С. Накопление вируса ПБО в других культурах клеток было значительно ниже или не наблюдалось вовсе (табл.1).
Таблица 1.
Титр вируса ПБО (штамм Moredun) в различных культурах клеток_п-3
Культура Номер пассажа в культуре клеток
клеток 1 2 3 4 5 10
ТЯ 4,3+0,10 4,5+0,12 4,3±0,20 4,2+0,15 4,15+0,19 4,25±0,15
ПЯ 4,0±0,22 4,3510,15 4,4±0,15 4,3±0,17 4,1±0,12 4,35±0,12
MDBK 2,2+0,14 2,0+0,15 1,3+0,15 - - -
ПС 1,0±0,20 0,85±0,17 - - - -
ВТ 2,1+0,19 0,75+0,12 - - - -
EBTR 1,0±0,12 - - - - -
SK-6 2,0+0,15 1,2+0,12 - - - -
Примечание: "-" - вирус не выявлен.
Исследование культур клеток на наличие или отсутствие пестивирусов-контаминантов проводили с использованием РИФ с применением поликлональных антител, распознающих антигены всех пестивирусов. Из шестнадцати исследованных клеточных культур, шесть - ПО, ПЭАК, МБВК, КСТ, БЬК, БСР - оказались конта-минированными пестивирусами.
Накопленный в культуре клеток ТЯ вирус ПБО хранили при температуре минус 70 °С или в лиофилизированном состоянии в течение года (срок наблюдения) без потери им инфекционной активности.
Концентрирование, очистка и электронная микроскопия вируса ПБО
- Для изучения морфологии вируса ПБО методом электронной микроскопии был получен концентрированный вируссодержащий материал. Для этого использовали методику, предложенную Нихз1ап ^ а1. (1994) в нашей модификации, которая обеспечивала концентрирование первичного объема вируссодержащего материала в 1000 раз и получение степени очистки, достаточной для использования препаратов вируса для электронной микроскопии (табл. 2).
Таблица 2.
Результаты концентрирования вируса ПБО из культурального материала
Этап
Начальный объем, см3
Конечный объем, см3
Титр вируса, % ККИДо/см3.
1. Приготовление лизата инфицированных клеток
200,0
200,0
4,0
2. Преципитация вируса ПЭГ-6000
200,0
20,0
4,8
3. Первичное концентрирование и очистка
20,0
2,0
4. Вторичное концентрирование
2,0
0,2
Примечание: "н.и." - не исследовали.
При исследовании методом негативного контрастирования с использованием ФВК, наблюдали отдельно расположенные вирусоподобные частицы размером 40-50 нм, с электронноплотной внутренней структурой и слабозаметной внешней оболочкой. Описанные признаки характерны для представителей рода Ре51тгиБ, семейства Р1аутп<1ае.
Изучение инфекции, вызванной вирусом ПБО, у овец и свиней
Воспроизведение болезни на овцах
Результаты экспериментального заражения овец романовской породы показали, что вирус ПБО (штаммы Могес1ип и ВОУЛшЬ) вызывает у овец в постнатальный период инфекцию, протекающую инаппарантно. При этом у животных обнаруживали лейкопению, с пиком проявления на 6-9 сутки после заражения и возвратом к норме на 12-14 сутки. Незначительную гипертермию наблюдали в первые сутки после заражения. Вирус был выделен из проб лейкоцитов периферической крови на 3-9 сутки после заражения. Специфические вируснейтрализующие антитела обнаруживали у овец через 2-3 недели после инфицирования, с максимальным накоплением на 55-65 сутки в титрах 1:256-1:512. Антитела выявляли в крови в течение 1 года (срок наблюдения).
Заражение суягных овцематок в последнюю треть беременности сопровождалось внутриутробным инфицированием плодов с последующим иммунным ответом, сопровождавшимся элиминацией вируса. Поэтому, вирус не был выделен из органов и крови ягнят, однако в пробах крови, отобранных у ягнят до получения ими первой порции молозива были обнаружены нейтрализующие антитела в титрах 1:32-1:128. Результаты
Экспериментальное инфицирование свиней
При инфицировании свиней пестивирусами жвачных (штамм BD-112 вируса ПБО и штамм Oregon C24V вируса ВДКРС, которые вводили внутримышечно или интраназально) так же как и у овец наблюдалась инаппарантная форма болезни. Через 3-4 недели после заражения у всех животных обнаруживали сывороточные вирус-нейтрализующие антитела к вирусам, которыми производили инфицирование, хотя у свиней, зараженных вирусом ВДКРС интраназально, антитела не выявляли. Инфицирование свиней пестивирусами жвачных способствовало образованию протективного иммунитета против вирулентного штамма вируса КЧС (Ши-Мынь) независимо от наличия или отсутствия в сыворотке крови детектируемого уровня специфических антител. Уровень накопления антител, выявленных в РН, после заражения свиней указанными пестивирусами показан в таблице 3.
Таблица 3.
Результаты экспериментального заражения свиней пестивирусами п = 3
№ п/п Первое введение вируса Штамм Клиника Титр антител против вируса X U 5 ч - О и п О с? Клиника Титр антител против вируса
ПБО ВДКРС КЧС ПБО ВДКРС КЧС
1 ПБО* BD-112 - 1:64 1 32 - Вирус КЧС, штамм Ши-Мынь - 1:1024 1:512 512
2 ПБО BD-112 - 1:16 1 16 - - 1:128 1:256 256
3 ПБО BD-U2 - 1:32 1 16 - - 1:256 1:256 256
4 ВДКРС* Oregon - - 1 32 - 1:32 1:256 128
5 ВДКРС Oregon - - - - - 1:16 1:128 256
6 ВДКРС Oregon - - - - 1:16 1:64 32
7 ВДКРС * Oregon - - 1:16 - - 1:64 1:256 256
8 ВДКРС Oregon - - - - - 1:16 1:128 256
Примечание: "*" - инфицирование производилось внутримышечно.
Сравнение прокоагулянтной активности лейкоцитов периферической крови, инфицированных разными пестивирусами
Известно, что при многих вирусных инфекциях, сопровождающихся геморрагическим синдромом, наблюдается усиление прокоагулянтной активности лейкоцитов. Такие данные показаны в отношении КЧС, протекающей в острой форме. В связи z этим, представлялось целесообразным определить изменяется ли индукция прокоа-гулянтов лейкоцитами, полученными от животных разных видов и инфицированных in vitro или in vivo различными пестивирусами, с целью оценки перспективности данного критерия для дифференциации пестивирусов, и, в частности, для дифференциации вируса ПБО от вирусов ВДКРС и КЧС.
Для решения поставленной задачи первоначально оценивали уровень ПКА в лейкоцитах овец, инфицированных in vitro вирусом ПБО (штамм Moredun). Изменение ПКА оценивали по времени полурекальцификации (коагуляции) плазмы в присутствии лизатов исследуемых лейкоцитов. Время полурекальцификации плазмы в присутствии лизата лейкоцитов овцы, инфицированных вирусом ПБО, сокращалось на 15,5 или 25,7% по сравнению с контролем в зависимости от концентрации белка
лейкоцитарного лизата в реакционной смеси (100 и 200 мкг/см3). Аналогичные результаты были получены при инфицировании тем или иным пестивирусом (ПБО , ВДКРС или КЧС) лейкоцитов, полученных от овец, КРС или свиней (табл. 4).
Таблица 4.
Снижение времени полурекальцификации плазмы крови в присутствии лизатов
лейкоцитов, инфицированных in vitro различными пестивирусами
Вирус Лейкоциты
Овцы Свиньи КРС
ПБО 25,7% 28,0 % н.и.
ВДКРС 25,0 % н.и.1 22,0 %
КЧС 25,0 % 14,0% 16,0 %
Примечание: "н.и." - не исследовали.
Результаты экспериментов показали, что все изученные пестивирусы (ПБО, ВДКРС и КЧС), способны индуцировать in vitro повышенный уровень ПКА лейкоцитов всех трех оцененных видов животных.
Параллельно была предпринята попытка выявить различия в уровне ПКА лейкоцитов животных, инфицированных пестивирусами in vivo. ПКА лейкоцитов крови инфицированных овец повышалась на 7-8 сутки после инфицирования, а затем, на 1214 сутки, значительно снижалась. В другом опыте определяли динамику изменения ПКА лейкоцитов крови подсвинков, иммунизированных вакцинным штаммом JIK-K вируса КЧС. Отмечено повышение уровня ПКА на 5-17 сутки после инфицирования.
Таким образом, установлено повышение ПКА лейкоцитов, инфицированных как in vitro, так и in vivo, независимо от вида животного и использованного типа пес-тивируса, поэтому, данный тест не пригоден для дифференциации пестивирусов.
Оценка развития гиперчувствительности замедленного типа при ПБО
При КЧС, сопровождающейся характерной клинической картиной, одним из механизмов патогенеза является гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). Поэтому, для сравнения особенностей патогенеза пестивирусных инфекций, в частности ПБО и КЧС, была использована методика определения ГЗТ у овец, инфицированных вирусом ПБО. Данные исследования проводили с использованием реакции торможения миграции лейкоцитов (PTMJI). В данном эксперименте изменение миграции лейкоцитов не превышало 15-18% от исходного значения, что, согласно использованной методике, свидетельствует об отсутствии достоверного изменения данного показателя.
Эти данные свидетельствуют о том, что эфферентная стадия (фаза проявления) ГЗТ не развивается при инаппарантной форме ПБО. Аналогичная картина наблюдается при инфицировании свиней вакцинным штаммом вируса КЧС (Ющенко Ю.А., 1997). Таким образом, данный тест не может быть рекомендован для дифференциации вирусов ПБО и КЧС, обусловливающих инаппарантное течение инфекции.
Разработка методов лабораторной диагностики ПБО
Получение сывороток, специфичных вирусу ПБО
Специфическую антисыворотку против вируса ПБО получали иммунизацией овец и свиней. В качестве антигена использовали инфекционный культуральный ви-руссодержащий материал, осветленный низкоскоростным центрифугированием. С целью снижения иммунного ответа на клеточный (культуральный) белок, овец иммунизировали вирусом, выращенным в культуре клеток ТЯ, приготовленной из тканей органов этих же животных.
Наиболее активные сыворотки были получены на овцах по схеме:
1) иммунизация овец живым вирусом парэнтерально (внутривенно, внутримышечно и интраназально);
2) бустеринъекция вируса с полным адьювантом Фрейнда (1:1), через 2-4 недели после первичного введения антигена, вводимая внутрикожно, подкожно и внутримышечно в несколько точек;
3) отбор крови для получения сыворотки через 3-4 недели после последней иммунизации.
Максимальный титр вируснейтрализующих антител при вторичном иммунном ответе возрастал до 1:512-1:1024 через три-четыре недели после последней иммунизации.
Полипестивирусные сыворотки были получены на свиньях, которых иммунизировали первый раз штаммами BD-112 (вирус ПБО) или Oregon C24V (вирус ВДКРС), второй - вирулентным штаммом Ши-Мынь, вируса КЧС. Это позволило получить сыворотки, с титром антител в РН 1:256-1:1024 против вирусов ПБО и ВДКРС и 1:256-1:512 против вируса КЧС. Иммуноглобулины, выделенные из данных сывороток, были использованы для приготовления ФИТЦ-конъюгатов, выявляющих в культуре клеток антигены всех пестивирусов (в разведении 1:16-1:32).
Отработка реакции прямой иммунофлюоресценции для идентификации вируса ПБО
Для обнаружения антигена вируса ПБО в культуре клеток была разработана методика постановки РИФ. Для этого использовались полипестивирусные ФИТЦ-конъюгаты и тест-препараты, приготовленные из инфицированной вирусом ПБО, фиксированной на покровных стеклах, культуры клеток ТЯ.
Полученные данные позволили определить следующий режим подготовки препаратов для постановки РИФ. Культуру клеток, выращенную на покровных стеклах в пробирках, после инфицирования вирусом ПБО инкубировали в течение 2-3 суток при 37 °С. Затем культуру клеток на стеклах фиксировали в 100%-ном ацетоне на холоду в течение 20 минут и высушивали на воздухе. Зафиксированные таким образом препараты инкубировали с раствором ФИТЦ-конъюгата иммуноглобулинов в течение 45 минут при 37 °С, во влажной камере. Затем стекла с культурой отмывали от несвя-завшегося конъюгата путем инкубации в ЗФР в течение 10 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации стекла с фиксированной и окрашенной культурой клеток извлекали и помещали на предметные стекла в каплю глицерина.
Учет результатов проводили люминесцентной микроскопией. В положительных случаях в поле зрения микроскопа наблюдалось специфическое ярко-зеленое диффузное свечение цитоплазмы клеток. Клетки, содержащие вирусный антиген, как правило, формировали небольшие бляшки или фокусы по 5-20 клеток. В остальных клетках монослоя, а также в контрольном материале характерного свечения не наблюдали.
Специфичность РИФ определяли путем обработки данным ФИТЦ-конъюгатом (или специфическими глобулинами - в непрямом варианте РИФ) клеток, инфицированных гомологичным (вирус ПБО) и гетерологичным вирусом (вирусом ВДКРС, КЧС, катаральной лихорадки овец, лихорадки долины Рифт, болезни Акабане, болезни Ауески, чумы мелких жвачных).
Полученные результаты свидетельствуют о чувствительности и специфичности РИФ, позволяющей идентифицировать антиген вируса ПБО в культуре клеток. Однако данный метод не позволяет проводить дифференциацию пестивирусов. Этот факт обусловил необходимость отработки реакции перекрестной нейтрализации, и методов идентификации генома вируса ПБО с помощью ПЦР, описанные ниже.
Выделение в культуре клеток вируса ПБО из патматериала
С целью отработки методики выделения вируса ПБО в культуре клеток ТЯ были использованы пробы стабилизированной гепарином крови, полученные от экспериментально инфицированных овец, и органы (селезенка, почки, легкие, головной мозг, лимфоузлы) ягнят, рожденных овцематками, которые были заражены вирусом ПБО в последнюю треть суягности.
Лейкоциты выделяли из 20 см3 крови. Отмытые клетки собирали в 1 см3 ЗФР и хранили при температуре минус 70 °С, до использования. Органный материал хранили при температуре минус 50 °С. Суспензию исследуемого материала готовили ех tempore по общепринятой методике.
Результаты опытов позволили отработать схему выделения вируса. После проведения двух последовательных пассажей исследуемого материала в культуре клеток ТЯ или (ПЯ) наличие или отсутствие вирусного антигена в культуре клеток определяли в РИФ.
Установлено, что при инаппарантной форме болезни оптимальным исследуемым материатом для вирусовыделения является суспензия лейкоцитов периферической крови, лизированных методом замораживания-оттаивания.
Типирование пестивирусов в перекрестной РН
Для типирования пестивирусов по антигенным свойствам была отработана перекрестная РН с использованием референс штаммов вирусов ПБО (Moredun), ВДКРС (Oregon C24V) и КЧС (Ши-Мынь) и антисывороток к ним. Результаты представлены в таблице 5.
Показано, что пестивирусы жвачных имеют близкое антигенное родство между собой и отдаленное - с вирусом КЧС: сыворотки к некоторым из штаммов вируса ПБО в низких разведениях (1:8-1:32) обладали нейтрализующей активностью в отношении некоторых штаммов вируса КЧС. Результаты
Результаты перекрестной нейтрализации пестнвирусов.
о 2»
Сыворотка для РН
Вирусный штамм и культура клеток для РН
Вирус, штамм
Виц
животного
ПБО
Moredun
ТЯ
BDV-Irish ТЯ
BD-112
ТЯ
ВДКРС
Oregon C24V ПС
КЧС
Ши-Мынь PK-15
Ж РК-15
716 РК-15
ПБО
Moredun
Овца
1024
256
64
BDV-Irish
256
1024
256
16
BD-112
512
256
512
256
16
BD-112
Свинья
128
128
256
32
16
R-2727
Овца
64
64
128
16
32
R-2727
Свинья
64
64
128
64
ВДКРС
Oregon C24V
Свинья
64
4-515
КРС
64
32
1024
ХЧС
Щи-Мынь
Свинья
512
256
512
Ж-ВНИИВВиМ
Свинья
256
512
512
Ж-ВНИИВВиМ
Овца
64
128
128
238-Н
Свинья
512
16
32
716
Свинья
256
512
512
Пимечание: "*" - в таблице приведены значения обратные величине титра антител .
8
ii.ii.
8
8
Сложнее судить о степени антигенного родства штаммов вируса ПБО и ВДКРС. Сыворотка против референс штамма вируса ПБО Moredun нейтрализует все использованные штаммы вируса ПБО в сравнительно высоких разведениях, за исключением штамма BDV-Irish (1:8). При этом, референс штамм вируса ВДКРС Oregon C24V нейтрализуется сыворотками ко всем штаммам вируса ПБО в разведениях от 1:16 до 1: 256. В то же время специфическая сыворотка против вируса ВДКРС не обладает нейтрализующей активностью в отношении штаммов вируса ПБО.
Таким образом, все исследованные сыворотки, специфичные разным штаммам вируса ПБО, за исключением штамма BDV-Irish, сходны по профилю нейтрализации как между собой, так и в отношении референс штамма вируса ВДКРС (Oregon C24V).
Коэффициент антигенного родства (R), был определен по методике Archetti and Horsfal (1950).
Данный показатель для вируса ВДКРС (референс штамм Oregon C24V) равен нулю как в отношении штаммов вируса ПБО, так и в отношении штаммов вируса КЧС. То есть, вирус ВДКРС отличен в антигенном отношении от двух других представителей рода Pestivirus.
Полученные данные позволили сделать следующее заключение:
- штаммы вируса ПБО использованные в эксперименте, проявляют между собой слабое антигенное родство: R референс штамма Moredun со штаммами BD-112 и BDV-Irish составляет 25 и 4,4%, соответственно;
- R вирусов ПБО и ВДКРС равен нулю. В данном случае наблюдается одностороннее антигенное родство - сыворотки, специфичные штаммам вируса ПБО, нейтрализуют в сравнительно высоких разведениях (до 1:256) вирус ВДКРС, но обратной зависимости не наблюдается;
- родство между штаммами вирусов ПБО и КЧС обнаружено только в отношении штамма BD-112 (вирус ПБО) и вакцинного штамма JIK-ВНИИВВиМ (вирус КЧС), R = 3,1%.
Таким образом, на уровне референс штаммов расчет коэффициента антигенного родства позволяет дифференцировать пестивирусы на три основных типа.
Результаты определения индекса нейтрализации для штаммов вирусов ПБО (Moredun, BDV-Irish) и ВДКРС (Oregon C24V) показаны в таблице 6.
Таблица 6.
Индексы нейтрализации вирусов ПБО и ВДКРС в присутствии соответствующих
антисывороток.
Тестируемый штамм вируса Используемая сыворотка, специфичная штамму:
Moredun BDV-Irish Oregon C24V
Moredun 3,5 1,0 0,25
BDV-Irish 0 3,0 0
Oregon C24V 2,25 2,6 4,0
Данные, представленные в таблицах 5 и 6, показывают наличие антигенной гетерогенности между штаммами ПБО и ВДКРС, хотя и проявляющейся в односторон-
1ем порядке.
Анализ вышеуказанных подходов типирования пестивирусов, показал, что (аиболее приемлемым методом является анализ профилей нейтрализации штаммов изолятов) в присутствии эталонных антисывороток. Результаты, полученные при >асчете коэффициента антигенного родства (Я) или определении индекса нейтрализа-цш, имели менее однозначный результат, хотя принципиально совпадали с первым. Зднако решающим фактором, определяющим результат типирования пестивирусов квачных, остается именно анализ профиля нейтрализации, характерной чертой кото-юй является проявление одностороннего антигенного родства между штаммами ПБО I ВДКРС, лишь на основе которого и возможно провести дифференциацию исследо-1анных вирусов.
Таким образом, перекрестная РН с использованием эталонных штаммов пести-шрусов и специфических антисывороток к ним, позволяет проводить дифференциа-шю пестивирусов, однако, необходимо отметить, что данные заключения получены 1ри использовании ограниченного числа штаммов как вируса ПБО, так и вируса ЗДКРС.
)бнаружение и дифференциация вируса ПБО с помощью ПЦР
Для обнаружения и типирования пестивирусов широкое распространение приобрели методики на основе использования ПЦР, обладающие высокой чувствитель-юстью и специфичностью. Поэтому, нами была предпринята попытка разработки ме-ода дифференциации вируса ПБО от вирусов ВДКРС и КЧС на основе использова-шя ПЦР.
Для обнаружения РНК вируса ПБО был отработан метод ПЦР, с использовани-м пары праймеров (Р1 и РЗ), комплементарных участку нуклеотидной последова-ельности 5'-нетранслируемой области (5'-иТЯ) генома всех трех пестивирусов и ам-!лифицирующих продукт размером 284 пар оснований (п.о.).
Для дифференциации ПЦР-продуктов, специфичных вирусу ПБО, были разра-¡отаны два протокола гнездовой ПЦР с использованием праймеров, специфичных фодуктам первичной (внешней) ПЦР.
Для дифференциации по первому протоколу используется гнездовая ПЦР, с па-юй праймеров Р2 и РЗ, продукты которой анализируются рестрикционным методом, использованием эндонуклеаз Ауа-1 и РбЫ. Продукт ПЦР, соответствующий участку енома вируса ПБО данными ферментами не разрезается, тогда как соответствующие еному вирусов ВДКРС и КЧС разрезаются одним из них (табл. 7).
Таблица 7.
(ифференциация пестивирусов с помощью рестрикционного анализа продуктов
нездовой ПЦР (праймеры Р2+РЗ).
Вирус Праймеры РбМ Ауа-1 Размер продукта, п о.
ВДКРС (ОгеЕоп С24У) Р2 + РЗ + - 133 и 99
КЧС (Ши-Мынь) Р2 + РЗ - + 163 и 68
ПБО (Могеаип) Р2 + РЗ - - 231
«+»-РНК разрезается, «-»- РНК не разрезается рестриктазой
Во втором варианте в гнездовой ПЦР используются две пары праймеров, которые не амплифицируют участок генома вируса ПБО, но одна из которых специфична участку генома вируса ВДКРС (В1 и В2), а вторая - КЧС (К1 и К2).
Описанная методика позволяет обнаруживать и дифференцировать РНК вируса ПБО в разведениях превышающих пороговое значение титра инфекционности, определяемого в серологических реакциях, на 1,0 lg ККИД50/см3. Таким образом, в результате подбора праймеров, режима и условий проведения ПЦР была разработана методика, пригодная для идентификации вируса ПБО.
Разработка РН для выявления антител против вируса ПБО
Необходимым подходом при постановке диагноза на инфекционные болезни является выявление специфических антител и определение уровня сероконверсии. Одним из методов для детекции специфических антител является реакция нейтрализации.
Для ретроспективной диагностики ПБО было отработано два варианта РН, с постоянной дозой вируса: в пробирках и на микропанелях (микровариант). При постановке РН в пробирках использовали первичную культуру клеток ТЯ и вирус ПБО, в дозе 100 ККИД50. Учет реакции проводили в РИФ. За титр антител в сыворотке крови принимали наибольшее ее разведение, обеспечивающее нейтрализацию вируса в 50% случаев.
Установлена пропорциональная зависимость титра антител в исследуемых сыворотках от дозы вируса. Увеличение рабочей дозы вируса на один порядок (1 lg ККИД50) приводит к снижению титра антител на два порядка (2 log2).
Использование нецитопатогенных штаммов вируса ПБО при постановке РН определяет необходимость применения РИФ, что усложняет постановку РН, снижает производительность и быстроту проведения экспертизы, увеличивает расходы, связанные с использованием необходимых для РИФ компонентов. Кроме того, постановка РН с вирусом ПБО связана с применением первичной культуры клеток ТЯ, что также является ограничивающим фактором. Одним из путей решения этих проблем является использование в качестве тест-вируса вируса ВДКРС, обладающего цитопа-тогенностью. Учитывая близкое антигенное родство между пестивирусами жвачных (ПБО и ВДКРС) нами был отработан микровариант РН с использованием цитопато-генного штамма ВДКРС Oregon C24V и перевиваемой культуры клеток ПС, выращенной в 96-ти луночной микропанели. В данном случае учет реакции проводили по наличию или отсутствию ЦПД. За титр антител в сыворотке крови принимали наибольшее разведение сыворотки, обеспечивающее нейтрализацию вируса в 50% использованных тест-лунок.
Оба варианта РН обладают высокой чувствительностью и специфичностью, одинаковы по продолжительности (2-3 суток), однако реакция с применением вируса ВДКРС более экономична, менее трудоемка и позволяет выявлять специфические антитела в сыворотках, содержащих антитела как против вируса ВДКРС, так и против штаммов вируса ПБО. В связи с этим, в дальнейшем, для ретроспективной оценки полевых сывороток в качестве рутинного метода применялся микровариант РН.
Схема лабораторной диагностики ПБО
Результаты собственных исследований и анализ данных литературы позволили разработать схему лабораторной диагностики ПБО, включающую выявление и идентификацию возбудителя и специфических антител (рис. 1).
Рис. 1. Схема лабораторной диагностики ПБО.
Вирусологические исследования включают: выделение вируса и обнаружение вирусной РНК.
Первым этапом лабораторных исследований является выделение вируса из патологического материала в первичной культуре клеток ТЯ. Идентификацию вируса в культуре клеток проводят с использованием РИФ. Параллельно проводят исследование на обнаружение РНК вируса с помощью ПЦР, с использованием общих для всех пестивирусов праймеров.
При необходимости определяют тип выделенного изолята в перекрестной РН по профилю нейтрализации и в гнездовой ПЦР.
В соответствии со схемой лабораторной диагностики ПБО диагноз считается положительным в случае выделения и идентификации вируса ПБО из проб лейкоцитов периферической крови (или паренхиматозных органов от павших или вынужденно убитых овец), и обнаружения специфических антител в пробах сывороток крови в разведении 1:8 и выше, полученных от овец в отарах, в которых отмечались случаи нарушения воспроизводства или клинические признаки ПБО.
Таким образом, разработанные нами средства и методы лабораторной диагностики позволяют обеспечить постановку диагноза на ПБО и дифференциацию возбудителя по серологическим характеристикам или результатам анализа генома вируса.
Серологические исследования (РН) позволяют проводить ретроспективную диагностику по наличию специфических антител.
В соответствии со схемой лабораторной диагностики ПБО диагноз считается
положительным в случае:
- выделения и идентификации вируса ПБО из проб лейкоцитов периферической крови или патматериала от павших, вынужденно убитых или подозреваемых на заболевание овец; обнаружения и идентификации РНК вируса ПБО,
- обнаружения специфических антител в пробах сывороток крови в разведении 1:8 и выше, полученных от овец в отарах, в которых отмечались случаи нарушения воспроизводства или клинические признаки ПБО.
Таким образом, разработанные нами средства и методы лабораторной диагностики позволяют обеспечить постановку диагноза на ПБО и дифференциацию возбудителя по серологическим характеристикам или результатам анализа генома вируса.
Ретроспективная оценка полевых сывороток iq>oeu овец и коз
Для получения предварительных данных о распространении пестивирусных инфекций среди мелких жвачных в регионах России была проведена оценка полевых сывороток овец и коз, которую проводили с помощью микроварианта РН с использованием цитопатогенного штамма Oregon C24V вируса ВДКРС и перевиваемой культуры клеток ПС. Всего было исследовано 526 проб сывороток крови от овец и 184 пробы от коз. Положительными считались пробы сывороток крови, имеющие титр вируснейтрализующих антител 1:8 и выше (табл. 8).
Таблица 8.
Результаты определения вируснейтрализующих антител к пестивирусам у овец и коз
Вид Регион Количество проб Положительные Выявление, %
животного
Овцы Владимирская обл. 48 19 39,5
Орловская обл. 132 72 54,5
Ульяновская обл. 253 0 0
Респ. Бурятия 14 4 28,5
Кабардино-Балкарская Респ. 46 0 0
Респ. Тыва 35 1 2,8
Всего овец 526 96 18,2
Козы Владимирская обл. 184 0 0
Итого 710 96 13,5
Из таблицы 8 видно, что пробы сывороток крови коз не содержали специфических вируснейтрализующих антител против пестивирусов жвачных, однако от 2,8 до 54,5% проб сывороток крови овец имели такие антитела в титрах от 1:8 до 1:128.
Таким образом, титры антител исследованных полевых сывороток указывают на распространение пестивирусов среди овец в отдельных обследованных регионах России.
ЫВОДЫ
Изучены некоторые параметры репродукции вируса ПБО в первичных и перевиваемых культурах клеток. Наиболее высокой чувствительностью обладают первичные культуры клеток ТЯ и ПЯ, в которых он накапливается в титре 4,3+0,15 lg ККИД50/смЗ в течение 96-120 часов.
Изучена инфекционность вируса ПБО на овцах романовской породы. Установлена трансплацентарная передача вируса, сопровождающаяся образованием специфических вируснейтрализуюших антител в организме плода, при инфицировании овцематки на поздней стадии суягности.
Показано, что уровень ГПСА лейкоцитов периферической крови, инфицированных пестивирусами in vitro или in vivo, не может служить объективным критерием дифференциации пестивирусов.
Разработаны схемы иммунизации, обеспечивающие получение на овцах специфических сывороток к вирусу ПБО с активностью в реакции нейтрализации 1:512-1:1024, и полипестивирусных сывороток на свиньях, которые могут быть использованы в диагностических тестах для типирования вируса ПБО в реакции нейтрализации и обнаружения специфического вирусного антигена в культуре клеток в реакции иммунофлюоресценции.
Разработана методика обнаружения и идентификации РНК вируса ПБО на основе полимеразной цепной реакции.
Разработана схема лабораторной диагностики ПБО, включающая отработанные методики выделения вируса в культуре клеток и его идентификации в реакции иммунофлюоресценции; перекрестной реакции нейтрализации - для серологического типирования вируса ПБО; полимеразной цепной реакции - для обнаружения и дифференциации РНК вируса ПБО и реакции нейтрализации - для выявления специфических антител.
При исследовании полевых сывороток крови овец, полученных из разных регионов России, в 18,2% случаев выявлены специфические антитела к пестивирусам жвачных в титре от 1:8 до 1:128, что свидетельствует о возможной циркуляции пестивирусов в популяциях овец. В исследованных пробах сывороток крови коз специфических антител не обнаружено.
РАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
На основе разработанных средств, методов и схемы лабораторной диагностики БО предложены "Методические указания по лабораторной диагностике погранич-ой болезни овец", утвержденные директором ВНИИВВиМ, внедренные в научно-сследовательскую и диагностическую работу в институте и рекомендуемые для ши-окого использования в практике диагностических исследований.
рактические предложения
-г
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ
ДИССЕРТАЦИИ
1. Луговцев В.Ю., Вишняков И.Ф. Пограничная болезнь овец // Вестник Россельхозакаде-мии,- 1998.-№№1-3.
2. Куриннов В.В., Вишняков И.Ф., Луговцев В.Ю. Экспериментальное заражение животных пестивирусами // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: Матер. Междунар. науч.-практич. конфер., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ. - Покров. - 1998 - С. 34-36.
3. Луговцев В.Ю., Вишняков И.Ф., Селянинов Ю.О., Куриннов В.В. Филогенетический анализ и дифференциация пестивирусов // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: Матер. Междунар. науч.-практич, конфер., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ. - Покров. - 1998 - С. 36-38.
4. Сенечкина Е.К., Селянинов Ю.О., Цыбанов С.Ж., Луговцев В.Ю., Куриннов В.В. Дифференциация пестивирусов методом ПЦР // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: Матер. Междунар. науч.-практич. конфер., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ. - Покров. - 1998 - С. 38-40.
5. Афанасьева И.Г., Селянинов Ю.О., Цыбанов С.Ж., Куриннов В.В., Луговцев В.Ю. Определение чувствительности и специфичности метода дот-гибридизации для выявления вируса КЧС // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: Матер. Междунар. науч.-практич. конфер., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ. - Покров. - 1998 - С. 54-55.
6. Луговцев В.Ю., Вишняков И.Ф., Куриннов В.В., Юрков С.Г., Неверовская Н.С. Определение пермиссивных клеточных культур для вируса пограничной болезни овец // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: Матер. Междунар. науч.-практич. конфер., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ. - Покров. - 1998 - С. 116-117.
7. Луговцев В.Ю., Вишняков И.Ф., Куриннов В.В. Метод концентрирования и очистки вируса пограничной болезни овец // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особс опасными и экзотическими болезнями животных: Матер. Междунар. науч.-практич. конфер., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ - Покров. - 1998 - С. 118-120.
Отпечатана в типографии ОКДМнМ ВНИИВВиМ, г. Покров, 2000 г. Тираж-70 экз.
Оглавление диссертации Луговцев, Владимир Юрьевич :: 2000 :: Покров
1 Содержание
2 Список сокращений
3 Введение
3.1. Актуальность темы
3.2. Цели и задачи исследования
3.3. Научная новизна
3.4. Практическая значимость
3.5. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту
3.6. Апробация работы
3.7. Публикации
4 Обзор литературы
4.1. Характеристика по^ганичной болезни овец
4.1.1. Историческая справка и экономическая значимость болезни
4.1.2. Эпизоотология ПБО
4.1.3. Патогенез ПБО
4.1.4. Клиническое проявление ПБО
4.1.5. Патологоанатомическая картина при ПБО
4.1.6. Иммунитет при ПБО
4.1.7. Профилактика и меры борьбы при ПБО
4.2. Характеристика возбудителя ПБО
4.2.1 .Таксономическое положение вируса ПБО
4.2.2. Физико-химические свойства вируса ПБО
4.2.3. Генетическая структура вируса ПБО
4.2.4. Молекулярная биология вируса ПБО
4.2.5. Антигенное и генетическое родство вируса ПБО с другими пестивирусами
4.3. Диагностика ПБО
4.3.1. Вирусологические методы исследования
4.3.1.1. Выделение вируса ПБО в культуре клеток
4.3.1.2. Методы обнаружения антигена вируса ПБО иммуноферментным анализом
4.3.1.3. Обнаружение и идентификация вирусной РНК
4.3.2. Методы выявления специфических антител
4.3.2.1. Реакция нейтрализации
4.3.2.2. Методы на основе иммуноферментного анализа 31 4.3.3. Дифференциальная диагностика
Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка средств и методов лабораторной диагностики пограничной болезни овец"
7 Выводы
1. Изучены некоторые параметры репродукции вируса ПБО в первичных и перевиваемых культурах клеток. Наиболее высокой чувствительностью обладают первичные культуры клеток ТЯ и ПЯ, в которых он накапливается в титре 4,3±0,15 lg ККИД50/см3 в течение 96-120 часов.
2. Изучена инфекционность вируса ПБО на овцах романовской породы. Установлена трансплацентарная передача вируса, сопровождающаяся образованием специфических вируснейтрализующих антител в организме плода, при инфицировании овцематки на поздней стадии суягности.
3. Показано, что уровнь ПКА лейкоцитов периферической крови, инфицированных пестивирусами in vitro или in vivo, не может служить объективным критерием дифференциации пестивирусов.
4. Разработаны схемы иммунизации, обеспечивающие получение на овцах специфических сывороток к вирусу ПБО с активностью в реакции нейтрализации 1:512-1:1024, и полипестивирусных сывороток на свиньях, которые могут быть использованы в диагностических тестах для типирования вируса ПБО в реакции нейтрализации и обнаружения специфического вирусного антигена в культуре клеток в реакции иммунофлюоресценции.
5. Разработана методика обнаружения и идентификации РНК вируса ПБО на основе полимеразной цепной реакции.
6. Разработана схема лабораторной диагностики ПБО, включающая отработанные методики выделения вируса в культуре клеток и его идентификации в реакции иммунофлюоресценции; перекрестной реакции нейтрализации -для серологического типирования вируса ПБО; полимеразной цепной реакции -для обнаружения и дифференциации РНК вируса ПБО и реакции нейтрализации - для выявления специфических антител.
7. При исследовании полевых сывороток крови овец, полученных из разных регионов России, в 18,2% случаев выявлены специфические антитела к пестивирусам жвачных в титре от 1:8 до 1:128, что свидетельствует о возможной циркуляции пестивирусов в популяциях овец. В исследованных пробах сывороток крови коз антител не обнаружено.
Практические предложения 132
8 Практические предложения
На основе разработанных средств, методов и схемы лабораторной диагностики ПБО предложены "Методические указания по лабораторной диагностике пограничной болезни овец", утвержденные директором ВНИИВВиМ, внедренные в научно-исследовательскую и диагностическую работу в институте и рекомендуемые для широкого использования в практике диагностических исследований.
Благодарности
Отдельные этапы комплексных исследований выполнены совместно с кандидатом ветеринарных наук В.В. Куринновым; доктором биологических наук С.Ж. Цыбановым; кандидатом биологических наук Ю.О. Селяниновым; кандидатом биологических наук Е.К. Сенечкиной; кандидатом биологических наук Н.Г. Шубиной; кандидатом биологических наук Б.В. Новиковым; кандидатом биологических наук JI.B. Шевченко; кандидатом биологических наук Н.С. Неверовской; кандидатом биологических наук С.И. Сидоровым; научным сотрудником Л.И. Анисимовой, младшим научным сотрудником Н.Г. Афанасьевой, за что автор выражает им глубокую признательность.
Искреннюю благодарность автор приносит коллективу лаборатории Диагностики за оказанную помощь при выполнении данной работы.
Автор благодарен профессору H.A. Лагуткину, доктору биологических наук H.A. Власову, кандидату биологических наук С.Г. Юркову (ВНИИВВиМ), доктору ветеринарных наук С. А. Жидкову (ВИЭВ) за ценные консультации.
Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2000 года, Луговцев, Владимир Юрьевич
1. Антитела. Методы. Под ред. Д.Кэтти. М.: Мир. - 1991. - С. 273.
2. Жидков С.А. Вирусная диарея болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота (характеристика возбудителя, диагностика и специфическая профилактика): Дис. . докт. вет. наук. - Москва, 1994. -299 с.
3. Кудрявцев A.A., Кудрявцева J1.A., Привольнее Т.И. Гематология животных и рыб.-М.: Колос, 1969.
4. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, - 1990. - С. 352.
5. Лярски 3. Диагностика вирусных болезней животных М.: Колос. -1980. - 400 с.
6. Мникова Л.А., Гоголев М.М., Жидков С.А. Диагностика вирусной диареи крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа // Доклады Россель-хозакадемии. 1998. - № 3. - С. 25-27.
7. Сергеев О.В. Пестивирусы (обзор) // Вопросы вирусологии 1997. -№ 1. С. 5-10.
8. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология. М.: Колос. - 1984.-С. 316.
9. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и др. Вирусные болезни животных. М.: ВНИТИБП. 1998. - С. 111-135.
10. Форни Л. Флюоресцирующие антитела и их применение при анализе антигенов лимфоидных клеток // В кн.: Методы исследований в иммунологии. Под ред. Лефковитиса И. М.: Мир. - 1984. - С. 164-180.
11. Цыбанов С.Ж., Куриннов В.В., Вишняков И.Ф., Семенихин А.Л. Современные достижения в изучении пестивирусов (Описание вируса и заболеваий вызываемых ими) // Ветеринария, 1995, - № 3. - С. 14-18.
12. Ющенко Ю.А. Биохимические и иммунологические механизмы патогенеза классической чумы свиней: Дис. . канд. биол. наук. Покров, 1997. - 155 с.
13. Ющенко Ю.А., Колонцов A.A.,Шубина Н.Г. Прокоагулянтная активность в свиных лейкоцитах, инфицированных вирусом классической чумы свиней // Вопросы вирусологии. 1998.-т. 43, № 3. - С. 138-141.
14. Abraham A., Orgad U., Rappoport Е., Marcus S. First report of Border disease in Israel and isolation ofthe virus // Isr. J. Vet. Med., 1991, v. 46, № 4, p. 138-141.
15. Acland H.M., Gard G.P., Plant J.W. Infection of sheep with mucosal disease virus // Aust. Vet. J., 1972, v. 48., p. 70.
16. Akkina R.K., Raisch K.P. Intracellular virus-induced polypeptides of pestivirus border disease virus // Virus Res., 1990, v. 16, № 1, p. 95-106.
17. Alenius S., Lindqvist A., Cafaro E. Ett utbrott av border disease in Sverige // Svensk
18. Veterinartidning, 1986, v. 38, p. 163-167.
19. Anderson C.A., Higgins R.J., Smith M.E., Osburn B.I. Border disease. Virus-induced dicrease in thyroid hormon levels with assosiated hypomielination // Lab. Invest., 1987, v. 57, №2, p. 168-175.
20. Baradel J. M., Barrat J., Blancou J. Results of a serological survey of wild mammals in France // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz, 1988, v. 7, № 4, p. 873-883.
21. Barlow R.M. Experiments in Border disease. IV. Pathological changes in ewes // J. Comp. Pathol., 1972, v. 82, p. 151-157.
22. Barlow R.M., Dickinson A.G. On the pathology and histochemistry of the central nervous system in Border disease of sheep // Res. Vet. Sci., 1965, v. 6, p. 230-237.
23. Barlow R.M., Gardiner A.C. Experiments in Border disease I. Transmission, pathology and some serological aspects of the experimental disease // J. Comp. Pathol., 1969, v. 79, p. 397-405.
24. Barlow R.M., Gardiner A.C., Nettleton P.F. The pathology of a spontaneous and experimental mucosal disease-like syndrome in sheep recovered from clinical border disease //J. Comp. Pathol., 1983, v. 93, p. 451-461.
25. Barlow R.M., Patterson D.S.P. Border Disease of Sheep: a virus-induced teratogenic disorder//Adv. Vet. Med., 1982, v. 36, p. 1-90.
26. Barlow R.M., Purves D., Butler E.J. Swayback in South-East Scotland II. Clinical, patological and biocemical aspects // J. Comp. Pathol., 1960, v. 70, p. 411-428.
27. Barlow R.M., Rennie .T.C., Gardiner A.C. Infection of pregnant sheep with the NADL strain of bovine virus diarrhoea virus and their subsequent challenge with Border disease IIB pool // J. Comp. Pathol., 1980, v. 90, p. 67-72. x
28. Barlow R.M., Rennie J.S., Keir W.A., Gardiner A.C., Vantsis J.T. Experiments in Border disease. VII. The disease in goats // J. Comp. Pathol., 1975, v. 85, p. 291-297.
29. Barlow R.M., Storey I.J., Gardiner A.C., Slater J.S. Experiments in Border disease.II. Some aspects of the disease in the foetus // J. Comp. Pathol., 1970, v. 80, p. 635.
30. Barlow R.M., Vantsis J.T., Gardiner A.C., Rennie J.S., Herring J.A., Scott F.M.M. Mechanism of natural transmission of Border disease // J. Comp. Pathol., 1980, v. 90, p. 57-65.
31. Barr M. Hypomyelinogenesis congenita in lambs // Vet. Rec., 1964, v. 76, p. 815-817.
32. Becher P., Konig M., Paton D.J., Thiel H.-J. Further characterization of border disease virus isolates: evidence for the presence of more than three species within the genuspestivirus // Virol., 1995, v. 209, № 1, p. 200-206.
33. Becher P., Meyer G., Shannon A.D., Thiel H.-J. Cytopatogenisity of Border disease virus is correlated with integration of cellular seqences into the viral genom // J. Virol., 1996, v. 70, № 5, p. 2992-2998.
34. Becher P., Orlich M., Thiel H.-J. Complit genomic sequence of Border disease virus, a pestivirus from sheep // J. Virol., 1998, v. 72, № 6, p. 5165-5173.
35. Becher P., Shannon A.D., Tautz N, Thiel H.J. Molecular characterization of border disease virus, a pestivirus from sheep // Virol., 1994, v. 198, № 2, p. 542-551.
36. Beer M., Wolf G., Pichler J. Cytotoxic T-lymphocyte responses in cattle infected with bovine viral diarrhea virus //Vet. Microbiol., 1997, v. 58, № 1, p. 9-22.
37. Behrens S.-E., Grassmann C.W., Thiel H.J., Meyers G., Tautz N. Characterisation of an autonomous subgenomic Pestivirus RNA replication // J. Virol., 1998, v. 72, № 3, p. 2364-2372.
38. Berry E.S., Lewis T.L., Ridpath J.F., Evermann J.F., Rupnow B.A., Qi F. Genomic comparison of ruminant pestiviruses // Proceed. Second Symp. on Pestiviruses. 1-3 Oct., 1992., Annecy, France, p. 53-59.
39. Boden E. Sheep and goat practice //1991,265 pp. PB: Bailliere Tindall Ltd.; London.
40. Bolin S., Moennig V., Gourley N.E.K., Ridpath J. Monoclonal antibodies with neutralizing activity segregate isolates of bovine viral diarrea virus into groups // Arch. Virol., 1988, v. 99,"№ 1-2, p. 117-123.
41. Bolin S.R., Ridpath J.F. Glycoprotein E2 of bovine viral diarrhea virus expressed in insect cells provides calves limited protection from systemic infection and disease // Arch. Virol., 1996,141, 1463-1477.
42. Bonniwell M.A., Nettleton P.F., Gardiner A.C. Border disease without nervous signs or fleece changes // Vet. Rec., 1987, v. 120, p. 246-249.
43. Brennand D.M., Danson M.J., Hough D.W. A comparison of ELISA screening methods for the production of monoclonal antibodies against solubile protein antigens //J. Immunol. Meth., 1986, v. 93, p. 9-14.
44. Brizzi A. Pestivirus infections of ruminants (Pestivirosi dei ruminanti) // Praxis-Veterinaria-Milano. 1996, v. 17, № 2, p. 20-22.
45. Brock K., Deng R. Nucleotide sequence analysis of the complete genome of noncytopathic bovine viral diarrhea virus strain SD-1 // Proceed. Second Symp. Pes-tivi., ESVV, 1 -3 Oct., 1992., Annecy, France, p. 47-51.
46. Brockman S.J., Wood L., Edwards S., Harkness J.W. Selection of an appropriatepestivirus strain for border disease serodiagnosis // Vet. Rec., 1988, v. 122, № 24, p. 586-587.
47. Brownlie J., Clarke M.C., Howard C.J. Experimental production of fatal mucosal disease in cattle // Vet. Rec., 1984, v. 114, p. 535.
48. Brugere-Piceux J. Border disease in France // Vet. Rec., 1987, v. 120, № 15, p. 374.
49. Brugere-Picoux J., Maes H., Moussa A. Identification de la "border disease" ou "maladie de la frontiere" chez le mouton en France // Bull. Acad. Vet. Fr., 1984, v. 57, p. 555-562.
50. Brugger M., Jungi T.W., Zurbriggen A., Vandevelde M. Canine distemper virus increases procoagulant activity of macrophages // Virology, 1992, v. 190, № 2, p. 616623.
51. Brun A., Lacoste F., Reynaud G., Kato F., Saint-Marc B., Edwards S. Evaluation of the potency of an inactivated vaccine against border disease pestivirus infection in sheep // Proceed. Second Symp. Pestivir., 1-3 October 1992. 1993, p. 257-259.
52. Campbell B., Vogel P.J. Immunofluorescent detection of myelin antibodies in serum of multiple sclerosis patients // Fedn. Proceed. Fedn. Am. Socs. Exp. Biol., 1968, v. 27, p. 609.
53. Campen H.V., Huzurbazar S., Edwards J., Cavender J.L. Distribution of antibody titers to bovine viral diarrhea virus in infected, exposed, and uninfected beef cattle // J. Vet. Diagn. Invest., 1998, v. 10, p. 183-186.
54. Canal C.W., Strasser M., Hertig C., Masuda A., Peterhans E. Detection of antibodies to bovine viral diarrhoea virus (BVDV) and characterizatetion of genomes of BVDV from Brazil // Vet. Microbiol., 1998, v. 63, p. 85-97.
55. Carlsson U. Border Disease in sheep caused by transmission of virus from cattle persistently infected with bovine virus diarrhoeae virus // Vet. Rec., 1991, v. 128, p. 145-147.
56. Carlsson U., Belak K. Border disease virus transmitted to sheep and cattle by a persistently infected ewe: epidemiology and control // Acta-Vet. Scand., 1994, v. 35, № 1, p. 79-98.
57. Carter H.B., Terlecki S., Shaw I.G. Experimental Border disease of sheep: effect of infection on primary follicle differentiation in the scin of Dorset Horn lambs // Br. Vet. J., 1972, v. 128, p. 421-427.
58. Cay B., Chappuis G., Coulibaly C. Comparative analysis of monoclonal antibodies against pestiviruses: report of an international workshop // Vet. Microbiol., 1989, v.20, p. 123-129.
59. Chomezynski P., Sacchi Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate phenol - chloroform extraction // Anal. Biochem., 1987, v. 162, p. 156159.
60. Chu H.-J., Zee Y.C. Morphology of bovine viral diarrhea virus // Am. J. Vet. Res., 1984, v. 45, №5, p. 845-850.
61. Chu H.-J., Zee Y.C., Ardans A.A., Dai K. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to bovine viral diarrhea virus in bovine sera // Vet. Microbiol., 1985, v. 10, №4, p. 325-333.
62. Cole G.A., Gilden D.H., Monjan A.A., Natanson N. Lymphocytic choriomeninditis: pathogenesis of acute central nervous system disease // Fed. Proceed., 1971, v. 30, p. 1831.
63. Collet M.S. The dilemma of Pestivirus nomenclature // Proceed. ESVV 3d Symp. on Pestivirus Infection. Lelistad., The Netherland, 19-20 Sept., 1996, p. 17.
64. Collet M.S., Larson R., Gold K., Strick D., Anderson D., Purchio A.F. Molecular cloning and nucleotid sequence of the pestivirus bovine viral diarroea virus // Virology., 1988, v. 165, p. 191-199.
65. Collet M.S., Moennig V., Horzinek M.C. Recent advances in pestivirus research // J. Gen. Virol., 1989, v. 70, p. 253-266.
66. Collet M.S., Wiskerchen M.A., Welniak E. Bovine viral diarrhea virus genomic organisation // Arch. Virol., 1991, v. 3, p. 19-27.
67. Corapi W.V. Donis R.O., Dubovi E.J. Monoclonal antibody analysis of cytopathic and noncytopathic viruses from fatal bovine viral diarrhea virus infection // J. Virol. 1988, v. 62, p. 2823-2827.
68. Corapi W.V., Donis R.O., Dubovi E.J. Characterisation of a panel of monoclonal antibodies and their use in the study of the antigenic diversity of bovine viral diarrhea virus //Am. J. Vet. Res. 1990, v. 51, p. 1388-1394.
69. Cravero G.C., Fatzer R., Fankhauser R. Border-Krankheit (hypomyelinogenesis congenita) bei lammern in der Schweiz // Schweizer Arch. Tierheilk., 1975, v. 117, p. 119-121.
70. Dekker A., Wensvoort G., Terpstra C. Six antigenic groups with in the genus pestivirus as identified by cross neutralisation assay // Vet. Microbiol., 1995, v. 47, p. 317-327.
71. Deng R., Brock K.V. Molecular cloning and nucleotid sequence of a pestivirus genom noncytopathic bovine viral diarrhoea virus strain SD-1 // Virology, 1992, v. 191, p. 867-879.
72. Donis R. Molecular biology of bovine viral diarrhea virus and its interactions with thehost // Vet. Clinics of North America. 1995, v. 11, p. 393-421.
73. Donis R.O., Dubovi E.J. Characterization of bovine viral diarrhea -mucosal disease virus-specific proteins in bovine cells // J. Gen. Virol., 1987, v. 68, p. 1597-1605.
74. Dubovi E.J. Genetic diversity and BVD virus // Comp. Immunol. Microbiol. Inf. Dis. 1992, v. 15, p. 155-162.
75. Duffel S.F., Harkness J.W. Bovine virus diarrhoea-mucosal disease infection in cattle //Vet. Rec., 1985, v. 117, p. 240.
76. Edwards E. The diagnosis of bovine virus diarrhoea-mucosal disease in cattle // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 1990, v. 9, № 1, p. 115-130.
77. Edwards S., Moennig V., Wensvoort G. The development of an international reference panel of monoclonal antibodies for the differentiation of hog cholera virus from other pestiviruses // Vet. Microbiol., 1993, v. 29, p. 101-108.
78. Edwards S., Paton D. Antigenic differences among pestiviruses // Vet. Clinics of North America. 1995, v. 11, p. 563-578.
79. Edwards S., Sands J.J., Harkness J.W. The application of monoclonal antibody panels to characterise pestivirus isolates from ruminants in Great Britain // Arch.Virol., 1988, v. 102, p. 197-206.
80. Elahi S.M., Harpin S., Cornaglia E., Talbot B., Elazhary Y. Antigenic variations among bovine viral diarrhea virus (BVDV) strains and the role of different cell fixation methods in immunoassays // Can. J. Vet. Res., 1997, v. 61, p. 34-38.
81. Entrican G., Dand A., Nettleton P.F. A double monoclonal-antibodies ELISA for detecting pestivirus antigen in the blood in viraemic cattle and sheep // Vet. Microbiol., 1995, v. 43, Iss. 1, p. 65-74.
82. Entrican G., Flack A., Hopkins J. Detection of border disease virus in sheep efferent lymphocytes by immunocytochemical and in situ hybridisation techniques // Symp. Rumin. Pestivir. Inf., Hannover, 1991, p. 175.
83. Fenton A., Entrican G., Herring J.A., Nettleton P.F. An ELISA for detecting pestivirus antigen in the blood of the sheep persistently infected with Border Disease Virus // J. Virol. Meth., 1990, v. 27, p. 253-260.
84. Fenton A., Nettleton P.F., Entrican G. et al. Identification of cattle infected with bovine virus diarrhoea virus using a monoclonal antibody capture ELISA //Arch. Virol., 1991, v. 3, p. 169-174.
85. French E.L., Hore D.E., Snowdon W.A., Parsonson I.M., Uren E. Infection of pregnant ewes with mucosal disease virus of ovine origin // Aust. Vet. J., 1974, v. 50,p. 45-54.
86. Gardiner A.C., Barlow R.M. Experiments in Border disease. III. Some epidemiological considerations with reference to the experimental disease // J. Comp. Pathol., 1972, v. 82, p. 29-35.
87. Gardiner A.C., Barlow R.M. Vertical transmission of Border disease infection // J. Comp. Pathol., 1981, v. 91, p. 467-470.
88. Gardiner A.C., Barlow R.M., Rennie J.C., Keir W.A. Experiments in Border disease. V. Preliminary investigations on the nature of the agent // J. Comp. Pathol., 1972, v. 82, p. 159-161.
89. Gardiner A.C., Nettleton P.F., Barlow R.M. Virology and immunology of spontaneous and exsperimental mucosal-like syndrome in sheep recovered from clinical border disease // J. Comp. Pathol., 1983, v. 93, p. 463-469.
90. Gardiner A.C., Zakarian B., Barlow R.M. Periarteritis in experimental Border disease in sheep. II. Immunopatological observation // J. Comp. Pathol. 1980, v. 90, p. 469474.
91. Gilbert S.A., Burton K.M., Prins S.E., Deregt D. Typing of bovine viral diarrhea virus from blood of persistentinfected cattle by multiplex PCR //J. Clin. Microbiol., 1999, v. 37, №6, p. 2020-2023.
92. Goddeeris B.M., Baldwin C.L., Ole-Moy-Yoi O. Improved methods for purification and depletion of monocytes from bovine periferal blood mononuclear cells // J. Immunol. Meth., 1986, v. 89, p. 165-173.'
93. Grooms D.L., Brock K.V., Ward L.A. Detection of bovine viral diarrhea virus in the ovaries of cattle acutely infected with bovine viral diarrhea virus // J. Vet. Diagn. Invest., 1998, v. 10, p. 125-129.
94. Gutekunst D.E. Malmquist W.A. Complement-fixing and neutralising antibody response to bovine viral diarrhea and hog holera antigen // Can. J. Comp. Med., 1964, v. 28, p. 19-23.
95. Hamilton A.F., Timoney P.J. Bovine virus diarrhoea/mucosal disease virus and Border disease //Rec. Vet. Sci., 1973, v. 15, p. 265-267.
96. Hamilton A.F., Timoney P.J. BVD virus "Border disease" // Vet. Rec., 1972, v. 91, p. 468.
97. Harasawa R. Phylogenetic analysis of pestivirus based on the 5'-untranslated region // Acta Virologica. 1996, v. 40, № 1, p. 49-54.
98. Harasawa R., Giangaspero M. A novel method for pestivirus genotyping based on palindromic nucleotide substitutions in the 5'-untranslated region // J. Virol. Meth., 1998, v. 70, №2, p. 225-230.
99. Harkness J.W., King A.A., Terlecki S., Sands J.J. Border Disease of sheep : isolation of the virus in tissue culture and experimental reproduction of the disease // Vet. Rec., 1977, v. 100, p. 71-72.
100. Hooft van IddekingeB., J. van Wamel., van GennipH. and Moormann R. Application of polymerase chain reaction to the detection of bovine viral diarrhea virus infection in cattle.// Vet. Microbiol., 1992, v. 30, p. 21-34.
101. Hovard C.J., Clarke M.C., Brownlie J. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies to bovine viral diarrhoea virus (BVDV) in cattle sera // Vet. Microbiol., 1985, v. 10, № 4, p. 359-369.
102. Hughes L.E., Kershaw G.F., Shaw I.G. B or Border disease. An undiscribed disease in sheep//Vet. Rec., 1959, v. 71, p. 313-317.
103. Hulst M. M., Himes G., Newbigin E. et al. Glycoprotein E2 of classical swine fever virus: expression in insec cells and identification as ribonuelease // Virology, 1994, v. 200, p. 558-565.
104. Hulst M.M., Moormann R.J.M. Ingibition of pestivirus infection in cell culture by envelope proteins Erns and E2 of classical swine fever virus: Erns and E2 interact with different receptors // J. Gen. Virol., 1997, v. 78, № 11, p. 2779-2787.
105. Hulst M.M., Panoto F.E., Hoekman A., van Gennip H.G.P., Moormann R.J.M. Inactivation of the RNase activity of glicoprotein Erns of classical swine fever virus resalts in a cytopathogenic virus // J. Virol., 1998, v. 72, № 1, p. 151-157.
106. Hussian A.A., Woldehiwet Z. Effects of experimental infection with border disease virus on lymphocyte subpopulations in the peripheral blood of lambs // Res. Vet. ScL, 1994, v. 56, №2, p. 201-207.
107. Hussian A.A., Woldehiwet Z. Lymphocyte responses to viral antigens and phytogemagglutinin in persistently viraemic sheep and lambs experimentally infected with Border Disease Virus // Vet. Microbiol., 1994, v. 39, № 1-2, p. 89-95.
108. Hussian A.A., Woldehiwet Z. Replication of border disease virus in ovine lymphocytes and monocytes in vitro // Res. Vet. Sci., 1994, v. 56, № 2, p. 193-200.
109. Hyera J.M.K., Liess B., Frey H.R. A direct neutralising peroxidase-1 inked antibody assay for detection and titration of antibodies to bovine viral diarrhea virus // J. Vet. Med. B., 1987, v. 34, p. 227-239.
110. Jackson T.A., Osburn B.I., Crenshaw G.L. Experimental reproduction of hairy fleece and horea in California lambs // Vet. Ree., 1972, v. 91, p. 223-224.
111. Jeffrey M., Roeder P.L. Variable nature of Border Disease on a single farm: clinical and pathological description of affected sheep // Res. in Vet. Sei., 1987, v. 43, p. 2227.
112. Kelling C.L., Kennedy J.E., Stin L.C., Rump K.K., Paul P.S., Partridge J.E. Genetic comparison of ovine and bovine pestiviruses // Am. J. Vet. Res., 1990, v. 51, № 12, p. 2019-2024.
113. Korn G., Lorentz R.J. Zur korrelation des auftrens von schweinepestvirus und chymotrypsin in vivo und in vitro sowie zur serologishen Spezifität dises chymotrypsin // Tierarztl. Umschau., 1979, v. 34, p. 587-598.
114. Kummerer B.M., Stoll D., Meyers G. Bovine viral diarrhea virus strain Oregon: a novel mechanism for processing of NS2-3 based on point mutation // J. Virol., 1998, v. 72, №5, p. 4127-4138.
115. Kwang J., Bolin S., Littledike E.T. Bovine virus diarrhea serologic diagnostic reagents prepared from bacterially expressed recombinant proteins // J. Vet. Diagn. Invest, 1995, v. 7, p. 143-145.
116. Laude H., Gelfi J. Properties of Border Disease Virus as studied in sheep cell line // Arch. Virol., 1979, v. 62, p. 341-346.
117. Lees V.W., Loewen K.G., Deregt D., Knudsen R. Border disease virus isolated from twin lambs// Can. Vet. J., 1991, v. 32, № 8, p. 501.
118. Liess B., Blindow H., Orban S. Aborte, Totgeburten, Kummern, Lammerstreben in zwei Schafherden Nordwest-Deutschlands-Border disease in der Bundesrepublik // Dt. tierarztl. Wschr., 1982, v. 89, p. 6-11.
119. Loken T. Border disease in sheep // Veterinary Clinics of North America, Food Animal Practice. 1995, v. 11, № 3, p. 579-595.
120. Loken T. Experimental transmission of pestivirus from goats to sheep, calves and pigs // Proceedings of the XVII Nordic Vet. Congress, Reykjavik, Norway, 1994, p. 120.
121. Loken T. Experimentally indused Border disease in goats // J. Comp. Path., 1987, v. 97, p. 85-89.
122. Loken T. Pestivirus infection in goats // Etudes-et-Syntheses-de-l'IEMVT. 1993, No.42, p. 331-332.
123. Loken T., Barlow R.M. Border disease in Norway // Acta Vet. Scand., 1981, v. 22, № l,p. 137-139.
124. Loken T., Bjerkas I. Experimental pestivirus infection on pregnant goats // J. Comp. Pathol., 1991, v. 105, №2, p. 123-140.
125. Loken T., Bjerkas I., Hyllseth B. Border disease in goats in Norway // Res. Vet. Sei., 1982, v. 33, p. 130-131.
126. Loken T., Krogsrud I., Bjerkas I. Outbreaks of border disease in goats induced by a pestivirus-contaminated orf vaccine, with virus transmission to sheep and cattle // J. Camp. Pathol., 1991, v. 104, p.-195.
127. Lowry O.H., Rosenbough N.J., Farr A.L. Protein measurment with the Folin phenol reagent//Biol. Chem., 1951, v. 193, p. 265-275.
128. Mackintosh S.G., Shannon A.D., Edwards S. Monoclonal antibody analysis of pestivirus isolates from sheep in Australia and New Zealand // Proceed. Second Symp. Pestivir., ESVV, Annecy, 1-3 Oct., 1992, p. 83-84.
129. Manktelow B.W., Porter W.L., Lewis K.H.C. Hairy shaker disease of lambs // N. Zeal. Vet. J., 1969, v. 17, p. 245-248.
130. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. OIE. 1996, p. 678-685.
131. Matthaeus W. Differences in reaction bihaviour of structural polypeptides of bovine viral diarrhoea virus with antisrea against BVDV and hog cholera virus (HCV) // Zentralblatt fur Veterinärmedizin (B). 1981, v. 28, p. 126-132.
132. McGoldrick A., Bensaude E., Ibata G., Sharp G., Paton D.J. Closed one-tube reverse transcription nested polymerase chain reaction for the detection of pestiviral RNA with fluorescent probes //J. Virol. Meth., 1999, v. 79, p. 85-95.
133. Meehan J.T., Lehmkuhl H.D., Cutlip R.C., Bolin S.R. Acute pulmonary lesions in sheep experimentally infected with bovine viral diarrhoea virus // J. Comp. Pathol., 1998, v. 119, p. 277-292.
134. Mendez E., Ruggli N., Collett M.S., Rice C.M. Infectious bovine viral diarrea virus (strain NADL) RNA from Stable cDNA clones: a cellular insert determines NS3 production and viral cytopathogenicity // J. Virol., 1998, v. 72, № 6, p. 4737-4745.
135. Mengeling W.L., Gutekunst W.A., Fernelius D.E. Demonstration of an antigenic relationship between hog cholera and bovine viral diarrhea viruses by immunofluorescence // Can. J. Comp. Med.,1963, v. 27, p. 162-164.
136. Meyers G., Rumenapf T., Thiel H.-J. Molecular cloning and nucleotid sequence of thegenomic of hog cholera virus // Virology, 1989, v. 171, p. 555-567.
137. Meyers G., Thiel H.-J. Cytopathogenicity of classical swine fever virus caused by defective interfering particals // J. Virol, 1995, v. 69, p. 3683-3689.
138. Meyers G., Thiel H.J. Molecular characterization of pestiviruses // Adv. Vims Res., 1995, v. 47, p. 53-118.
139. Miekka S.I., Busby T.F., Reid B. New methods for inactivation of lipid-enveloped and non-enveloped viruses // Haemophilia, 1998, v. 4, p. 402-408.
140. Mignon B., Dubuisson J., Baranowski E. A monoclonal ELISA for bovine viral diarrhoea pestivirus antigen detection in persistently infected cattle // J. Virol. Meth., 1991, v. 35, p. 177-188.
141. Moennig V., Leder L., Greiser-Wilke I. Ein neuer enzymimmuntestzum nachweis von antikorprern gegen das virus der bovinenvirusdiarrho // Tierarztl. Prx., 1991, v. 19, p. 35-38. *
142. Moormann R.J., Warmerdan P.A.M., Meer B. Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera virus strain Brescia and mapping of the genomic region encoding envelope protein El // Virology, 1990, v. 177, p. 84 -98.
143. Murthy F.A., Fauquet C.M., Bishop D.H.L. et. al. Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses // Arch. Virol., 1995, Suppl. 10.
144. Nettleton P.F. Border disease // In Practice, 1988, v. 10, p. 76-78.
145. Nettleton P.F. Patogenesis and epidemiology of Border Disease // Ann. Rech. Vet., 1987, v. 18, p. 147-155.
146. Nettleton P.F. Pestivirus infection in ruminant other than cattle // Rev. Sci. et Tech. De OIE, 1990, v. 9, № 1, p. 131-150.
147. Nettleton P.F., Entrican G. Ruminant pestiviruses // Br. Vet. J., 1995, v. 151, № 6, p. 615-642.
148. Nettleton P.F., Entrican G. The diagnosis of ruminant pestivirus infections // Proceed. Second Symp. Rumin. Pestivir., ESVV, Annecy, France, 1-3 Oct. 1992, p. 185-191.
149. Nettleton P.F., Gilray J.A., Russo P., Dlissi E. Border disease of sheep and goats // Vet. Res., 1998, v. 29, p. 327-340.
150. Niskanen R. Relationship between the levels of antibodies to bovine virus diarrhoea virus in bulk tank milk and prevalence of cows exposed to the virus // Vet. Rec., 1993, v. 133, p. 341-344.
151. Niskanen R., Alenius S., Larson В. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to bovine virus diarrhoea virus in milk // J. Vet. Med. В., 1989, v. 36, p. 113-118.
152. Orr M.B., Barlow R.M. Experiments in Border disease. X. The postnatal skin lesion in sheep and goats //J. Сотр. Pathol., 1978, v. 88, p. 295-302.
153. Orr M.B., Barlow R.M., Ryder M.L. Histological and histochemical studies of fetal skin follicles in Border diseases of sheep // Res. Vet. Sci., 1977, v. 22, p. 56-61.
154. Orr MR., Roe A.R. A mucosal disease-like condition in lambs with hair}/ shaker disease//N. Vet. J., 1993, v. 41, p. 152.
155. Osburn B.I., Castro A.E. (éd.), Heuschele W.P. Border disease // Veterinary diagnostic virology: a practitioners guide. 1992, p.200-202. PB: Mosby Year Book Inc.; St Louis; USA,
156. Osburn B.I., Clarke G.L., Stewart W.C., Sawyer M. Border disease-like syndrome in lambs : antibodies to hog cholera and bovine viral diarroea viruses // J. Am. Vet. Med.лее 1 qti <tr \гг,1п «пм., i^/j, v. lujj jk lkj, j. 1 1u/ .
157. Paton D.J, Gunn M., Sands J. Establishment of serial persistent infections with bovine viral diarrhoea virus in cattle and sheep and changes in epitope expression related to host species .//Arch. Virol, 1997, v. 142, p. 929-938.
158. ЙЛ Potnn П T Poc+ivii-lio Hi4jwci-H7 // T Гптп Pcfbrvl 1 ÛÛ4 ^r 110 «
159. X yj \J A 14X1/11 LV . . i VJli V 11 UJ Vil V VI JltJ II *J . V/lllj^. JL UlllV/1. ? i. S S V. Ji ± jJ. 1 A* J \J .
160. U I I W UJ I 1 I i. .1 . UU11UJ »' . j—^ttvuiuv; »J. LfVl uvl U1L;VU4JV f 11UJ. UVllllUtlVll U^ HlV/llUViUllWlantibodies // Arch. Virol, 1994, v. 135, № 3-4, p. 241-252.
161. Paton D.J., SandsJ.J., Roehe P.M. BVD monoclonal antibodies: relationship between viral protein specificity and viral strain specificity // Arch. Virol 1991, Suppl 3, p. 471. QA
162. Phisick.-Sheard P.W., Hopkins J.B., O'Connor R.D. A border disease-like syndrome in southern Ontario sheep flock // Can. Vet. J., 1980, v. 21, p. 53-60.
163. Plant J.W., Akland H.M., Gard G.P. Walker K.H. Clinical variation of border diseasein sheep according to the sourse of the inoculum // Vet. Rec., 1983, v. 16, p. 58-60.
164. Plant J.W., Gard G.P., Acland H.M. Transmission of a mucosal disease virus infection between sheep //Aust. Vet. J., 1977, v. 60, p. 574-577.
165. Plant J.W., Gard J.P., Acland H.M. A mucosal disease virus infection of the pregnant ewe as a cause of a border disease-like condition // Austral. Vet. J., 1976, v. 52, p. 247-249.
166. Plant J.W., Littlejohns I.R., Gardiner A.C. Immunological relationship between Border disease, mucosal disease, and swine fever // Vet. Rec., 1973, v. 92, p. 455.
167. Plant J.W., Walker K.N., Acland H.M., Gard G.P. Patology of the ovine foetus caused by an ovine pestivirus // Aust. Vet J. 1983, v. 60, p. 137-140.
168. Potts B.J., Johnson K.P., Osbom B.L Border disease : tissue culture studies of the vims in the sheep // Am. J. Vet. Res., 1982, v. 43, № 8, p. 1460-1463.
169. Potts B.J., Osbom B.L, Johnson K.P. Border disease : experimental reproduction in sheep, using a virus replicated in tissue calture // Am. J. Vet. Res., 1982, v. 43, № 8, p.1 ACA 1 AC!ltut-itu / .
170. Pringle C.R. Virus Taxonomy. Proceeding of the 26th Meeting of the Executive Committee of the ICTV, Strasbourg, France,May 10-11, 1997 // Arh. Virol., 1997, v.1 AO No 8 r, 107.1 11
171. JL I j ^ KJ j LJ . Lj—ll J. .
172. Oi F., Ridpath J.F., Berry E.S. Insertion of a bovine SMT3B gene in NS4B and duplication in NS3 bovine viral diarrhea virus genome correlate with the eytopathogenicitv of the virus // Virus res., 1998, v. 57, p, 1-9.
173. Qvist P., Aasted B., Bloch B. Flow cytometric detection of bovine viral diarrhea virus in peripheral blood leucocytes of persistently infected cattle // Can. J. Vet. Res., 1990,1. V <A ^ /1AQ.479
174. Ovist P., Houe H., Aasted B. Comparison of flow cytometry and virus isolation in cell culture for identification of cattle persistently infected with bovine viral diarrhea virus // T Clin Mirrnbinl 1QQ1 v ?Q n f>f>()-f,f, 1
175. Raid B.D. The stervvays process: a new approach to inactivating viruses using gammaradiation/7 Biologicals, 1998, v. 26, p. 125-130.
176. Ridpath J.F., Bolin S.R. Comparison of the complete genomic sequence of border disease virus, BD-31, to other pestiviruses // Virus Res., 1997, v. 50, p. 237-243.
177. Ridpath J.F., Bolin S.R. The genomic sequence of bovine viral diarrhea virus (BVDV) from the type 2 genotipe: detection of a large genomic insertion in a noncytopathic
178. Q\7TYlf IflflC ^ Tn „ Ifl AC.tWL/V // vuvjujgj., 1>7j, v.z.1^., p. j7-tu.
179. Roeder P.L. Studies of Border disease virus infection in sheep II Thesis. London, University of London, 1984.
180. Roeder P.L., Drew T.W. Persistence in tissues of Border disease virus antigen demonstrable by immunofluorescence // Res. Vet. Sci., 1980, v. 29, p. 394.
181. Roehe P.M., Edwards S. Comparison of pestivirus multiplication in cells of different species // Res. Vet. Sci., 1994, v. 57, № 2, p. 210-214.205 Roehe
182. P.M., Woodward M.J., Edwards S. Characterisation of p20 gene sequences
183. Ruggli N., Tratschin J.-D., Mittelholzer C. Nucleotide sequence of classical swine fever strain Alfort/185 and transcription of infectious RNA from stably cloned full-length cDNA //J. Virol., 1996, v. 70, p. 3478-3487.
184. Rumenapf Т., Meyers G., Stark R. Hog cholera virus- characterisation of specific antiserum and identification of cDNA clones // Virology, 1989, v. 171, p. 18-27.
185. Russo P., Delor V., Giauffret A. Border disease in France // Ann. Rech. Vet., 1987, v. 18, p. 103-105.
186. Sandvik T. Laboratory diagnostic investigation for bovine virus diarrhoea virus infectious in cattle // Vet. Rec., 1999, v. 64, p. 123-134.
187. Sandvik Т., Paton D.J., Lowings P.J. Detection and identification of ruminant and porcine pestiviruses by nested amplification of 5' untranslated cDNA regions // J. Virol. Meth., 1997, v. 64, № 1, p. 43-56.
188. Sawyer M. Border disease of sheep: The disease in the newborn, adolescent and adult //Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Disease., 1992, v. 15, p. 171-177.
189. Sawyer M.M., Osburn B.I., Edwards S. Long term effects of persistent pestivirus infection on thyroid secretions in border disease sheep // Proceed. Second Symp. on Pestivir., 1-3 Oct. 1992. 1993, p. 127-130.
190. Shannon A.D., Richards S.G., Kirkland P.D. An antigen-capture ELISA detects pestivirus antigens in blood and tissues of immunotolerant carrier cattle // J. Virol. Meth., 1991, v. 34, p. 11-12.
191. Shimizu M., Kumagai T. Experimental infection on pregnant goats with swine fever virus //Vet. Microbiol., 1989, v. 20, p. 207-214.
192. Smith G.H., Collins J.K., Carman J., Minocha H.C. Detection of cytopathic and noncytopathic bovine viral diarrhea vims in cell culture with an immunoperoxidase test//J. Virol. Meth., 1988, v. 19,№ 3-4, p. 319-324.
193. Snowdon W.A., Parsonson I.M., Broun M.L. The reaction of pregnant ewes to inoculation with mucosal disease virus of bovine origin // J. Сотр. Pathol., 1975, v. 85, p. 241-251.
194. Spais A.G., Papadopolus O., Vantsis J.T. An extensive outbreak of Border disease in Greece // Proceed. 20th World Vet. Congress, Thessaloniki, Greece, 1975, p. 622.
195. Sullivan D. G., Accina R. K. A nested PCR assay to differentiate pestiviruses // Vet. Res., 1995, v. 38, №2-3, p. 231-239.
196. Sweasey D., Patterson D.S.P. Border disease : A sequential study of surviving lambs and an assassment of its effect on profitabilty // Vet. Rec., 1979, v. 19, № 104, p. 447450.
197. Tautz N., Meyers G., Dubovi E.J. Cytopathogenicity of pestivruse correlates with a 27-nucleotide insertion //J.Virol., 1996, v. 70, p. 7851-7858.
198. Terlecki S., Richardson C., Done J.T. Pathogenicity for the sheep foetus of bovine virus diarrhoea-mucosal disease virus of bovine orgin // Br. Vet. J., 1980, v. 136, p. 602-611.
199. Terlecki S., Roeder P.L. Border disease. Effect of virus administered intracerebrally tonewborn lambs // J. Comp. Pathol., 1983, v. 136, p. 243.
200. Terpstra C. Border disease : virus persistence, antibody response and transmiision stadies//Res. Vet. Sci., 1981, v. 30, p. 185-191.
201. Terpstra C. Detection of BD-antigen in tissue of affected sheep and cell cultures by immunofluorescence //Res. Vet. Sci., 1978, v. 25, p. 350-355.
202. Terpstra C. Diagnosis of Border Disease by direct immunofluorescence // Vet. Sci. Comm., 1977, v. l,p. 75-77.
203. Terpstra C., Wensvoort G. The protective value of vaccine-induced neutralizing antibody titres in swine fever//Vet. Microbiol., 1988, 16, 123-128.
204. Thiel H.-J. Introduction to the molecular biology of Pestiviruses // Proceed. 3d Symp. Pestivir. Infection, ESVV, Lelistad, 19-20 Sept., 1996, p. 18-19.
205. Thur B., Hilbe M., Strasser M. et al. Immunohistochemical diagnosis of pestivirus infection associated with bovine and ovine abortion and perinatal daeth // Am. J. Vet. Res., 1997, v. 58, 12, p. 1371-1375.
206. Tijssen P. Practice and theory of anzyme immunoassay. Elsevier. Amsterdam. 1985.
207. Vantsis J.T., Barlow R.M., Fraser J., Rennies J.S., Mould D.L. Experiments in Border disease. VIII. Propagation and properties of cytopathic virus // J. Comp. Pathol., 1976, v. 86, p. 111-120.
208. Vantsis J.T., Barlow R.M., Gardiner A.C., Linklater K.A. The effects of challenge with homologous and heterologous strains of Border disease virus on ewes with previous experience of the disease // J. Comp. Pathol., 1980, v. 90, p. 39-45.
209. Vantsis J.T., Linklater K.A., Rennie J.S., Barlow R.M. Experimental challenge and infection of ewes following a field outbreak of border disease // J. Comp. Pathol., 1979, v. 89, p. 331-339.
210. Vantsis J.T., Rennie J.C., Gardiner P.W., Wells P.W., Barlow R.M., Martin W.B. Immunisation against Border disease // J. Comp. Pathol., 1980, v. 90, p. 349-354.
211. Vilcek S., Belak S. Genetic identification of pestivirus strain Frijters as a border disease virus from pigs //J. Virol. Meth., 1996, v. 60, p. 103-108.
212. Vilcek S., Nettleton P.F., Paton D.J., Belak S. Molecular characterization of ovine pestiviruses // J. Gen. Virol., 1997, v. 78, № 4, p. 725-735.
213. Vilcek S., Nettleton P.F., Paton D.J., Belak S., Wensvoort G. Molecular characterization of ovine pestiviruses // Proceed. Third ESVV symp. Pestivir. Inf., Lelystad, The Netherlands, 19-20 September 1996. 1997, p. 104-107.
214. Walz P.H., Baker J.C., Mullaney T.P., Vaneene J.B., Maes R.K. Comparison of type I and type II bovine viral diarrhea virus infection in swine // Can. J. Vet. Res., 1999, v. 63, p. 119-123.
215. Warrener P., Collet M.S. Pestivirus NS3 (p80) protein possesses RNA helicase activity
216. J.Virol., 1995, v. 69, p. 1720-1726.
217. Weiland E., Stark R., Haas B., Rumenapf T., Meyers G., Thiel H.-J. Pestivirus glycoprotein wich induced neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer // J. Virol., 1990, v. 64, № 8, p. 3563-3569.
218. Wensvoort G., Terpstra C. Bovine viral diarrhoea virus infections in piglets born to sows vaccinated against swine fever with contaminated vaccine // Res. Vet. Sci., 1988, v. 45, p. 143-148.
219. Wensvoort G., Terpstra C., Kluyver E.P. Characterisation of porcine and same ruminant pestiviruses by cross-neutralisation // Vet. Microbiol., 1989, v. 20, p. 291306.
220. Westbury H.A., Naphtine D.V., Straube E. Border disease. Persistent infection with the virus // Vet. Rec., 1979, v. 104, p. 406-409.
221. Wilsmore A.J., Roeder P. Border disease in Syria // Trop. Anim. Hlth. Prod., 1984, v. 16, p. 225-226.
222. Wirz B., Tratschin J.-D., Muller H.K. Detection of hog cholera virus and differentiation from other pestiviruses by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol., 1993, v. 31, №5, p. 1148-1154.
223. Wiskerchen M.A., Collet M.S. Pestivirus gene expression: protein p80 of bovin viral diarrhea virus is a proteinase involved in polyprotein processing // Virology, 1991, v. 184, p. 341-350.
224. Woldehiwet Z., Hussian A.A. Distribution of border disease virus antigen in lymphocyte subpopulation in the periferal blood of experimentally infected lambs // Vet.Immunol. Immunopathol., 1994, v. 43, № 4, p. 389-400.
225. Woldehiwet Z., Hussian A.A. Distribution of border disease virus antigen in lymphocyte subpopulation in the periferal blood of persistently infected sheep // J. Vet. Microbiol., 1992, v. 37, № 1, p. 5.
226. Woldehiwet Z., Hussin A.A. Cytotoxic T cell responses in lambs experimentally infected with Border disease virus // Vet. Immunol. Immunopath., 1994, v. 41, № 3-4, p. 201-209.
227. Woldehiwet Z., Hussin A.A. Distribution of border diseases virus antigen in lymphocyte subpopulations in the peripheral blood of experimentally infected lambs // Vet. Immunol. Immunopath., 1994, v. 43, № 4, p. 389-400.
228. Woldehiwet Z., Nettleton P.F. Progeny of sheep persistently infected with Border disease virus //Arch. Virol., Suppl., 1991, v. 3, p. 267-271.
229. Xue W., Blecha F., Minocha H.C. Antigenic variation in bovine viral diarrhea viruses detected by monoclonal antibodies // J. Clin. Microbiol., 1990, v. 28, № 8, p. 16881693.
230. Zaghawa A. Prevalence of antibodies to bovine viral diarrhoea virus and/or border disease virus in domestic ruminants // J. Vet. Med. B., 1998, v. 45, p. 345-351.
231. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК1. ВНИИВВиМг с"*1Ж•г --—- —:1. УТВЕРЖДАЮ тор ВНИИВВиМ1. Вишняков 1999 г
232. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ1. ПОГРАНИЧНОЙ БОЛЕЗНИ ОВЕЦг. Покров 1999
233. УТВЕРЖДАЮ И. д^црещдраЗНИИВВиМ1. АКТ1. V ъ „ \ ; * к /1. С V, V,.' • л. .-V- /1. V V,, .•' -V /межлабораторных комиссионных испытаний средств и методов лабораторной диагностики пограничной болезни овец (ГТБО).
234. Испытания проведены в соответствии с утвержденной программой на базе лаборатории Диагностики и вивария (12 корпус).
235. ВДКРС и КЧС (протокол № 3);4. методика анализа генома вируса ИБО, основанная на обратно