Разработка ПЦР тест-системы для идентификации энтерогеморрагических E.COLI и дифференциации E.COLI О157:H7

Брюсова, Мария Борисовна

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка ПЦР тест-системы для идентификации энтерогеморрагических E.COLI и дифференциации E.COLI О157:H7

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Брюсова, Мария Борисовна Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Разработка ПЦР тест-системы для идентификации энтерогеморрагических E.COLI и дифференциации E.COLI О157:H7

На правах рукописи

БРЮСОВА Мария Борисовна

РАЗРАБОТКА ПДР ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭНТЕРОГЕМОРРАГИЧЕСКИХ Е.СОЫ Й ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ

Е.СОЫ 0157:Н7

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00345ези4

Москва - 2008

003459304

Работа выполнена в лаборатории генодиагностики инфекционных болезней животных отдела биотехнологии Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») Россельхознадзора Министерства сельского хозяйства Российской Федерации

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Доктор биологических наук, профессор Обухов И. Л.

Доктор ветеринарных наук,

Скляров О.Д. (ФГУ «ВГНКИ»)

Доктор ветеринарных наук, профессор

Белоусов В. И. (ФГУ Центральная научно методическая ветеринарная лаборатори Россельхознадзора МСХ РФ)

Государственное научное учреждени "Всероссийский научно-исследовательски

институт ветеринарной санитарии, гигиены экологии Россельхозакадемии"

Защита диссертации состоится «у 2» февраля 2009 г. в / часов на заседании диссертационного совета Д 220.011.01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»)

Адрес: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ВГНКИ. Автореферат разослан декабря 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент, Заслуженный ветеринарный врач РФ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы

Впервые энтерогеморрагические кишечные палочки (ЭГКП) идентифицированы в 1982 г., когда штаммы Е coli ранее неизвестного серотипа 0157:Н7, оказались причиной двух крупных вспышек гемморагического колита у детей в США (Schlundt 2001; Clarke et al., 2002).

Основным резервуаром ЭГКП является крупный и мелкий рогатый скот (Beutin L et al., 1993). Однако такие домашние животные, как свиньи, лошади, олени, птицы, собаки и кошки так же могут быть носителями ЭГКП (Johnson R.P. et al. 1996). Выделяя бактерии с фекалиями во внешнюю среду, животные служат основным источником контаминации различных объектов ЭГКП. При проведениии мониторинга ЭГКП среди сельскохозяйственных животных в Европе, обнаружено, что в Германии около 20,8% животных и 2,6% исследованных проб мяса крупного рогатого скота (крс) были заражены Е. coli 0157:Н7. При исследовании образцов мяса в Финляндии, данный показатель составил 1,4%, а в Бельгии -1,26% (Chapman P.A. et al., 2000). При проведении мониторинга ЭГКП серовара 0157:Н7 в хозяйствах Рязанской, Воронежской, Тульской и Орловской областей обнаружено, что носительство среди крс составляет 2,6%, среди свиней 0,9% и птиц - 0,8% (Степаншин Ю.Г. и соавт., 2006).

Вспышки инфекции у человека возникают при употреблении пищевых продуктов животного происхождения, контаминированных эшерихиями в процессе убоя, переработки, упаковки, хранения и приготовления пищи, а также фруктов и овощей, обсеменение которых происходит в результате контакта с фекалиями домашних и диких животных на какой-либо стадии их выращивания или обработки. По данным Центра Всемирной Организации Здравоохранения Животных (МЭБ), каждый год на территории США в среднем регистрируется до 72 000 случаев заболеваний людей, вызванных ЭГКП, из них около 60 летальных. В Великобритании в период 1995-2000 гг. зарегистрировано 18 вспышек геморрагического колита (ПС) у людей, заболеваемость за это время возросла с 6 до 411 случаев на 100 тыс. населения,

а число смертельных исходов составило 2,5% (Paiba G.A. et al., 2006 ).

Наиболее распространенным и значимым для здравоохранения серологическим вариантом ЭГКП является серовар 0157:Н7, тем не менее, при спорадических случаях и эпизоотиях часто выявляются и другие серогруппы эшерихий: 026, 091, ОЮЗ, 0104, Olli, 0113, 0117, 0118, 0121, 0128, 0145 (Johnson R.P. et al. 1996, Karmali M.A. et al., 2004), идентификация которых имеет немаловажное значение.

Сложность определения энтерогеморрагических эшерихий обусловлена тем, что среди множества непатогенных близкородственных представителей необходимо выявлять единичные серогруппы, которые приобретают измененные свойства в результате генетических мутаций, и не имеют фенотипических свойств, прочно коррелирующих с патогенностыо.

Разработка новых высокочувствительных и специфичных экспресс методов для идентификации энтерогеморрагических Е. coli является актуальной задачей, В последние годы широкое распространение во многих странах получил метод выявления факторов патогенности ЭГКП с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Большинство молекулярно-генетических методик, разработанных для идентификации ЭГКП, направлены на прямое выявление генов, кодирующих веротоксины (Cebula et al., 1995; Deng and Frataraico, 1996; Fratamico et al., 1995; Gannon et al., 1997; Nagano et al., 1998; Patón and Patón, 1998; Ziebell K.A. et al. 2002; Wang G. et all., 2002). Метод ПЦР отличается высокой чувствительностью, специфичностью и универсальностью и позволяет выявлять ЭГКП не только в биологическом материале, но и в объектах внешней среды.

1.2. Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы являлась разработка тест-системы для идентификации энтерогеморрагических Е. coli и дифференциации Е. coli 0157:Н7 методом ПЦР.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Сконструировать олигонуклеотидные праймеры для идентификации энтерогеморрагических Е. coli и дифференциации серологического варианта

0157:Н7, разработать оптимальные параметры ПЦР и оценить эффективность различных способов выделения ДНК из патологического материала;

2. Провести оценку аналитических и диагностических характеристик разработанной тест-системы;

3. Сравнить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы с традиционным методом;

4. Провести комиссионные испытания ПЦР-тест-системы для идентификации E.coli 0157:Н7 и дифференциации веротоксинов энтерогеморрагических E.coli методом ПЦР.

1.3. Научная новизна

Впервые сконструированы оригинальные праймеры для амплификации ДНК энтерогеморрагических Е. coli и дифференциации E.coli 0157:Н7 в формате электрофоретической детекции.

Разработан положительный контрольный образец (ПКО) ДНК VT1, VT2, Н7, являющийся генно-инженерной конструкцией, несущей вставки фрагментов генов stxl, stx2 и fliCm Е. coli 0157:Н7. ПКО позволяет контролировать работу амплификационной смеси и является маркером длины ПЦР-продуктов.

Впервые в России разработана ПЦР тест-система для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli, обладающая 100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 100 мк/мл.

1.4. Практическая значимость работы

Впервые в России разработана и внедрена в ветеринарную практику тест-система «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР. Использование метода ПЦР в диагностических лабораториях позволит в течение одного рабочего дня проводить анализ биологического материала, продукции животного происхождения, объектов внешней среды на наличие ЭГКП, а также дифференцировать серологический вариант 0157:Н7, тогда как

идентификация ЭГКП бактериологическим методом занимает от 6 до 7 суток и требует применения дополнительного исследования для определения веротоксинов.

С 2006 года на базе ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора аттестовано производство и налажен серийный выпуск тест-системы «КОЛИ-ДИФ» (Аттестат № 1167 от 01.02.06). Рекламаций на тест-систему в течение трех лет не поступало.

1.5. Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (2004-2007 гг.), а также на научных и практических конференциях:

- Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов», посвященной 75-летию ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2006 г.);

- 6-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2007» (Москва, 2007 г.);

- Научно-проблемных методических комиссиях ФГУ «ВГНКИ» (2004-2007 гг.).

1.6. Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 научные статьи, одна из которых -в рецензируемом журнале «Ветеринария», рекомендуемом ВАК.

1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1. Выбор праймеров для идентификации энтерогеморрагических Е. coli и дифференциации Е. coli 0157:Н7, оптимизация условий выделения и амплификации ДНК;

2. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы;

3. Апробация и регистрация ПЦР-тест-системы для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации шигаподобных токсинов энтерогеморрагических Е. coli методом полимеразной цепной реакции.

1.8. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на /ОУ страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003»), и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения. Диссертация иллюстрирована 11 рисунками и 12 таблицами. Приложение к диссертации содержит разработанную нормативную документацию, подтверждающую результаты исследований, их научно-практическую ценность. Список литературы включает 162 источника, в том числе 127 иностранных.

Приносим искреннюю благодарность за помощь в проведении исследований сотрудникам ФГУ «ВГНКИ»: д.в.н. Тугаринову O.A., д.в.н Пирожкову М.К., Стрельченко С.А., ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора: к.м.н. Подколзину А.Т.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Поиск нуклеотидных последовательностей проводили по базам данных GeneBank - Национального института здоровья США, EMBL - Европейской молекулярно-биологической лаборатории, DDBJ - Национального института генетики Японии и PDB - базы данных белковых последовательностей при помощи поисковой системы Entrez Национального центра биотехнологической информации США.

Анализ выбранных нуклеотидных последовательностей на вариабельность и поиск консервативных участков, необходимых для выбора праймеров проводили с помощью системы ClustalW MuJti Sequnce Alignment. Специфичность выбранных праймеров теоретически изучали с помощью компьютерных программы FASTA (Pearson W.G. 2000) и BLAST on-line (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).

Выбранные праймеры были синтезированы ЗАО "Синтол" (г.Москва) фосфоамитидным методом на синтезаторе ASM-102 (г. Новосибирск).

Для оценки аналитической чувствительности, и специфичности разработанной тест-системы использовали штаммы из коллекции ФГУ «ВГНКИ», любезно предоставленные лабораторией качества и стандартизации лекарственных средств против бактерийных болезней животных, - 40 штаммов Е. coli, из них 12 серологического варианта 0157:Н7 и 0157:Н". (табл. 1), а так же культуры других патогенных энтеробактерий: Salmonella enteritidis, Enterobacter faecalis, Streptococcus faecalis, Citrobacter. freundidi, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Yersinya enterocolitica, Campylobacter jejuni subsp. jejuni.

Культивирование бактерий проводили на полужидком МПА. Концентрацию микробных клеток определяли по оптическому стандарту мутности. Выделение ДНК из различных образцов проводили методом аффинной сорбции на силикагеле с предшествующим лизированием пробы в гуанидинтиоцианате (Boom R. et al., 1990), а так же методом протеиназной обработки и осаждения этанолом с предварительной фенольной экстракцией (Manialis Т. et al., 1982).

В качестве внутреннего контроля качества выделения ДНК использовали BKO-CMV. ПЦР проводили на амплификаторе ТЕРЦИК ("ДНК-технология"), по следующей программе: 95 °С - 2 мин, 1 цикл; 95 °С - 10 с, (57-65) °С - 10 с, 72 °С - 10 с, 40 циклов; 10 °С - хранение. ПЦР проводили в реакционном буфере объемом 25 мкл следующего состава: каждого праймера по (5-15) пмоль, каждого дНТФ по 0,2 мМ, 0,5 ед Taq-полимеразы, трис-НС1 68 мМ, сульфата аммония 17 мМ, сульфата магния от 1 до:3 мМ, твин-20 0,01 %, бычьего сывороточного альбумина 0,1 мг/мл. В качестве матрицы (ДНК-пробы) брали 10 мкл препарата ДНК. Оптимальную концентрацию сульфата магния, концентрацию и температуру отжига праймеров подбирали в ходе работы.

Полученные ПНР-продукты визуализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Таблица 1

Перечень штаммов Е. coli, использованных в работе

№ п/п Номера штаммов E.coli Серовар Тип веротоксина № П/II Номера штаммов jE.coli Серовар Тип вероток сина

1 35150 0157.Н7 VT1, VT2 21 F41 0101:F41 -

2 43888 0157:117 VT1, VT2 22 2005 0141:K99 -

3 43889 0157:Н7 VT2 23 ТП85 0115:K88 -

4 43890 0157:117 VT1 24 430 08:К8 -

5 43894 0157:Н7 VT1, VT2 25 723 0138:К81 -

6 43895 0157:Н7 VT1, VT2 26 1308 026:К60 -

7 51675 0157:Н7 VT1, VT2 27 733 OU9.K69 :Н4 -

8 51658 0157:Н7 VT1, VT2 28 115/2 0115 -

9 51659 0157:Н7 VT1, VT2 29 39/2 055 -

10 161 0157:Н7 VT2 30 660 041 -

и 904 0157.Н7 VT1, VT2 31 1092 0147:К89 :К88 -

12 1271 0157:Н" VT1.VT2 32 857 08б:К61: Н32 -

13 1463 0117.К62.Н 4 33 1407 ОЮ1.-К99 -

14 1370 02 0 - 34 б/и 0145 -

15 1111 0149:К91: К88 - 35 б/н 0125 -

16 1084 0139:К82 - 36 727 0141:К87 :К88 -

17 899 015:К14:Н 30 - 37 E.coli 0138:К81 :К88ас -

18 1330 09:K30 - 38 E.coli 0157:К88 -

19 1230 08:К43 - 39 E.coli 09:К35:К 99 (КЗО) -

20 987 09:К103:98 7Р - 40 E.coli 09:К35:К 99-F41 (КЗ) -

* - не образуют веротоксины

Секвенирование фрагментов амплификации выполняли методом "cycle sequence" на амплификаторе GeneAmp® PCR System 2400 (Perkin-EImer, США) с набором «АВ1 PRISM Big Dye™» Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction, включающим ДНК-полимеразу AmpliTaq-FS (Taq-FS, Applied Biosystems, США), согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного

автоматического секвенатора «ABI PRISM™ 3100 Genetic Analyzer» («Applied Biosystems», США).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка тест-системы проводилась в несколько этапов: выбор генов-

мишеней для идентификации ЭГКП и выбор генов-мишеней для дифференциации Е. coli 0157:Н7, выбор олигонуклеотидных праймеров, оптимизация условий мультиплексной ПЦР для выявления ЭГКП и оптимизация условий ПЦР для дополнительной дифференциации серотипа 0157:Н7, подбор оптимального метода выделения ДНК, разработка контрольных образцов тест-системы, изучение аналитических характеристик и стабильности препарата.

3.1. Выбор олигонуклеотидных праймеров

Основным фактором патогенности ЭГКП является способность образовывать шигаподобные вероцитотоксины. В настоящее время изучено и идентифицированы две их разновидности: веротоксин-1 и веротоксин-2 (VT1, VT2). Гены stxl и stx2, кодирующие выработку этих веротоксинов, находятся в хромосоме, в районе профага. Штаммы ЭГКП могут экспрессировать либо один из этих токсинов, либо оба (Nataro J. P., 1998; Karmali M.A., 2004). Таким образом в качестве мишеней для специфических праймеров были выбраны фрагменты последовательностей генов stxl и stx2, кодирующие А субъединицы этих токсинов.

В результате анализа баз данных пуклеотидных последовательностей были выбраны две пары специфических праймеров - «VT1» и «VT2» для дифференциальной амплификации ДНК гена stxl и гена stx2, соответственно. В одной реакционной смеси праймеры амплифицируют фрагмент ДНК stxl длиной 730 п.н. и (или) ДНК stx2 длиной 310 п.н. Разница длин амплифицируемых продуктов (730 и 310 п.н.) позволяет уверенно дифференцировать их элекрофорезом в агарозном геле. Теоретический анализ комплиментарности праймеров генам stxl и stx2, проведенный при помощи

компьютерных программ, показал максимальную их гомологию с выбранными ДНК-мишенями.

Среди группы ЭГКП наиболее распространенным и значимым для здравоохранения серологическим вариантом является серовар 0157:Н7. В качестве гена-мишени для дифференциации Е. coli серологического варианта 0157:Н7 был выбран ген fliC, кодирующий жгутиковый H антиген. У E.coli официально зарегистрировано 53 типа H антигенов, Н1-Н12, Н14-Н21, Н23-Н49, Н51-Н56. Н-антигены служат важным дифференциально-диагностическим признаком для идентификации E.coli. Жгутиковые антигены эшерихий характеризуются серологической обособленностью и не проявляют антигенных взаимосвязей с Н-антигенами других бактерий семейства Enîerobacteriaceae (F.Orskov, I.Orskov, 1984; Ewing W.H., 1986). Аминокислотная последовательность терминальных участков этого антигена очень консервативна, тогда как центральная часть достаточно вариабельна, что дает возможность их серологического гипирования.

Однако, из литературных данных известно, что последовательности гена Н7 Е. coli серовара 0157 и серовара 055, который филогенетически считается неверотоксигенным предком 0157, имеют отличия от гена Н7 других сероваров Е. coli (Reid S.D. et al., 1998; Wang L. et al., 2000; Ratiner Y.A. et al., 2002). В результате анализа баз данных нуклеотидных последовательностей были выбраны специфические праймеры - «Н7» для дифференциальной амплификации ДНК гена fliCm Е. coli 0157:Н7.

Структура каждого праймера удовлетворяет общепринятым правилам: отсутствие самокомплиментарности 3'-концов каждого олигонуклеотида, отсутствие комплеметартности 3'-концов прямых и обратных нраймеров, отсутствие вторичных структур, отсутствие тугоплавких повторов (более 3-х GC) на 3'-конце каждого праймера, отсутствие многократных AT (или GC)-повторов внутри каждого праймера.

3.2. Изучение специфичности выбранных праймеров

С помощью специализированных программ FASTA и BLAST on-line была показана гомология выбранных олигонуклеотидов только с генами stxl и stx2, а так же fliCm, и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями генов других бактерий, вирусов или эукариот. Таким образом, предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью.

3.3. Подбор условий ПЦР

Известно, что эффективность ПЦР зависит от температуры отжига праймеров, их концентрации, концентрации ионов Mg2+, а также от количества циклов амплификации и концентрации ДНК-матрицы. Варьирование этих параметров оказалось достаточным для получения стабильных результатов.

Количество ионов Mg2+ варьировали от 1 мМ до 3 мМ (рис.1). В эксперименте использовались ДНК E.coli 0157:Н7 культур штаммов № 43894, № 43895, № 43888, продуцирующих два веротоксина, с концентрацией 103 мк/мл в ПЦР-пробе.

VTl VT2 Н7 VT1 VT2 Н7 VT1 VT2 Н7

1 2 * 1 2 i 1 1 Ч М ¡23 1 г 31 2 3 М 1 2 i 1 2 í I 2 ¿ vi J-мМ 2 1' I/, 1 ¡ jjj M ¡j

"К ьл* Щ л ^

Рис. 1. Выбор оптимальной концентрации Mg2+

1 - ДНК E.coli 0157:Н7 штамм № 43894; 2 - ДНК E.coli 0157:Н7 штамм № 43895; 3 - ДНК E.coli 0157:Н7 штамм № 43888 (концентрация 103 мк/мл); М -маркер: набор фрагментов ДНК длиной 1200, 550, 450 и 200 п.н.

Во всех случаях неспецифических реакций амплификации на отрицательных контролях замечено не было. При увеличений концентрации Mg2+, как правило, наблюдается увеличение концентрации специфического продукта реакции, что наблюдается и в данном случае. Оптимальной концентрацией Mg2+ для тестируемых праймеров, которая обеспечивает высокий выход специфического продукта реакции без дополнительных неспецифических фрагментов выбрана концентрация ЗмМ.

Эффективность амплификации при разных температурах отжига изучали отдельно для каждой пары праймеров. В качестве ДНК-матрицы использовали последовательные 10-ти кратные разведения ДНК E.coli культуры штамма № 43894 с концентрацией от 104 мк/мл до 102 мк/мл в ПЦР-пробе (рис. 2).

Варьирование температуры отжига праймеров в диапазоне от 57 до 63°С не оказывало влияние на чувствительность теста, в то время как увеличение температуры отжига до 65°С уменьшало чувствительность амплификации ДНК stxl, stx2 и Н7. Однако, при температуре отжига 57°С, во всех случаях наблюдались неспецифические фрагменты.

57°С 63°С 65°С М .-к- 1 ;2.-3 1 2 3 1 2 3

VT 2Ы : . ^ <-

/щЩ^Щ-^и jgtg^gfe»li» .ygyji^

тШшяШ

iVi i 2 ; i , J J i v -J

Рис. 2. Выбор оптимальной температуры отжига праймеров

1 - ДНК Е.соН 0157:Н7 штамм № 43894 в концентрации 104 мк/мл; 2 - ДНК Е.соН 0157:Н7 штамм № 43894 в концентрации 10* мк/мл; 3 - ДНК Е.соН 0157:Н7 штамм № 43894, в концентрации 102 мк/мл; М — маркер: набор фрагментов ДНК длиной 100,200,300,400,500,800 п.н.; К-. отрицательна контрольный образец

В результате проведенных экспериментов была определена оптимальная температура отжига, равная 63°С, при которой одинаково успешно работают как праймеры «УП», так и праймеры «УТ2», что позволило в дальнейшем объединить их в одной реакционной смеси. Для праймеров «Н7» также оптимальной была выбрана температура 63°С.

С целью снижения себестоимости теста и предотвращения возможных неспецифических реакций была подобрана оптимальная концентрация праймеров.

Количество праймеров в реакционной смеси варьировали от 5 до 15 пмоль. В качестве ДНК-матрицы использовали последовательные 10-ти кратные разведения ДНК Е.соН культуры штамма № 43894 с концентрацией от 104 мк/мл до 102 мк/мл в ПЦР-пробе (рис. 3).

Как видно из рис. 3, оптимальное содержание праймеров «УТ1», «УТ2» и «Н7» в реакционной смеси - 10 пмоль. Снижение количества праймеров в 2 раза уменьшало чувствительность ПЦР в 10 раз, а их увеличение до 15 пмоль не влияло на чувствительность реакции.

ш ннн - / у 1 f.

II Mil.ll. Пнмшш

VT2 \! 5 : ; i; • 2: л ..■ ■ : з

{ЙЬ'ё' w — V»

VT1 5 IIMII.II. II) 11МО II>

Ч 1 2 3 ■ 1 »V 1 : л

щ ими II. " ддивя рИИИЯд

Н7 ч 1 2 3 1 2 ö 1 :

iM^SI

"Vi. .':,•

Рис. 3. Выбор оптимальной концентрации праймеров

М - маркер: набор фрагментов ДНК длиной 630 и 330 п.н.; 1 - ДНК E.coli 0157:Н7 штамм № 43894 в концентрации 102 мк/мл; 2 - ДНК E.coli 0157:Н7 штамм № 43894 в концентрации 103 мк/мл; 3 - ДНК E.coli 0157:Н7 гитами № 43894, в концентрации 102 мк/мл

Для объединения праймеров «VT1», «VT2» в одной реакционной смеси было необходимо оценить их минимальное количество в общей реакционной смеси (рис. 4). С этой целью были приготовлены разведения ДНК, которые содержали как матрицу ДИК stxl, так и ДНК stx2. В качестве ДНК-матрицы использовали последовательные 10-ти кратные разведения ДНК Е.соН культур штаммов № 43890, 43889, каждый из которых несет по одному токсину stxl и stx2 соответственно, с концентрацией от 103 мк/мл до 102 мк/мл в ПЦР-пробе. ПЦР ставили в следующих соотношениях: 103 мк/мл ДНК штамма № 43890 и 1-02 мк/мл ДНК штамма 43889, 102 мк/мл ДНК штамма № 43890 и 102 мк/мл

ДНК штамма № 43889, 102 мк/мл ДНК № 43890 и 103 мк/мл ДНК штамма № 43889 в ПЦР-пробе. Амплификацию проводили в присутствии 10 пмоль каждого праймера.

Рис. 4. Выбор оптимальной концентрации праймеров смеси «VT1+ VT2»

| М - маркер: набор фрагментов ДНК длиной 300, 400, 500, 800 п.н.; 1 - ДНК E.coli 0157:117 штамм № 43889 в концентрации 103 мк/мл; 2 - ДНК E.coli ; 0157:Н7 штамм № 43889 в кон1!ентрации 10г мк/мл; 3 - ДНК E.coli 0157.Н7 I штамм № 43890 в концентрации 103 мк/мл; 4 -ДНК E.coli 0157:Н7 штамм № i 43889 в конг{ентрации 102 мк/мл; 5 - ДНК E.coli 0157:Н7 штамм № 43889 в концентрации 10' мк/мл+ДНК E.coli 0157.-Н7 штамм № 43890 в концентрации 103 мк/мл; 6 - ДНК E.coli OJ57.H7 штамм № 43889 в концентрации 102 мк/мл+ДНК E.coli 0157:Н7 штамм № 43890 в концентрации 102 мк/мл; 7 -ДНК E.coli 0157:Н7 штамм № 43889 в концентрации 103 мк/мл+ДНК E.coli 0157.Н7 штамм № 43890 в концентрации НУ мк/мл

Во всех случаях ПЦР позволила детектировать по 102 мк/мл каждой ДНК как отдельно, так и в одной пробе.

В результате проведенных экспериментов было подобрано оптимальное количество праймеров, равное 10 пмоль каждого, обеспечивающее ' максимальную чувствительность при минимальном расходе реактивов.

Для исключения неспецифических реакций и увеличения чувствительности ПЦР была использована методика «горячего старта». В качестве ДНК-матрицы использовали ДНК Е.соИ культуры штамма № 43894 с концентрацией от 103 мк/мл в ПЦР-пробе.

Амплификация без «горячего старта» давала дополнительные полосы на электрофореграмме отличные от специфических полос. Во всех дорожках геля (включая отрицательный контроль ПЦР - ТЕ-буфер), соответствующих амплификации без «горячего старта» отмечено наличие полосы ниже уровня 200 п.н., что соответствует побочному продукту амплификации - праймер-димерам. Очевидно, взаимодействие Тад-полимеразы с праймерами ниже

VTI+VT2 VII

VT2

температуры отжига привело к их самодостройке, несмотря на то, что при выборе праймеров они были проверены на отсутствие самокомплиметарности на 3'-концах. Следует отметить, что интенсивность специфических полос, особенно высокомолекулярной полосы ДНК б1х2 (730 п.н.), при амплификации без «горячего старта» уступала таковой при его наличии, что подтверждает преимущественное накопление низкомолекулярного побочного продукта реакции при отсутствии «горячего старта». Таким образом, применение методики «горячего старта» позволяет добиться стабильных результатов и увеличить эффективность накопления специфического ПЦР-продукта.

амплификация без амплификация с

«горячего старта» I «горячим стартом»

М 1 2 3 23 1 2 3 12 3 Й|§М|||Р

ЙЗ \ 12 - \ 1 I „4. 1 V 12

ттттатт

ШрШШм!

Рис. 5. Влияние «горячего старта» на эффективность амплификации

1, 2, 3 - штамм Е. coli № 43894, К- отрицательный контроль, М- маркер молекулярных масс ДНК (1200, 550, 450 и 200 п.н.)

3.5. Подбор методов выделения (очистки) ДНК

Классическим методом выделения ДНК из биологического материала является фенол-хлороформная экстракция с предварительной обработкой протеиназой К (Maniatis T. et al., 1982). Эта методика позволяет получать высокоочищенную ДНК, однако трудоемка, к тому же включает стадии переноса материала из пробирки в пробирку, что значительно увеличивает риск контаминации от пробы к пробе (Saiki R.K. et al., 1985; Saiki R.K. et al., 1988).

Альтернативой классической методике является метод аффинной сорбции ДНК на силикагеле (Boom R. et al., 1990). В данном случае сорбент вносится в пробирку с лизированным материалом, ДНК связывается с сорбентом, затем отмывается от ингибиторов промывочными растворами и элюируется с сорбента ТЕ-буфером. Так как выделение ДНК происходит в

одной пробирке, это препятствует возникновению перекрестной контаминации и упрощает процесс.

При сравнении вышеописанных методов выделения ДНК было установлено, что метод афинной сорбции не уступает классическому по качеству выделения ДНК, однако является менее длительным и трудоемким. Поэтому для тест-системы была выбрана методика аффинной сорбции ДНК на силикагеле.

3.6. Внутренний контрольный образец (ВКО)

Для исключения ложноотрицательных результатов связанных с ошибками исследователя при выделении ДНК или постановке ПЦР, использовался внутренний контрольный образец (ВКО). В качестве внутреннего контроля качества выделения ДНК использовали ВКО-СМУ. ВКО добавляли в исследуемые образцы на этапе выделения ДНК и подвергали всем этапам выделения ДНК, ПЦР и электрофореза, амплификацию ВКО проводили в отдельной пробирке с праймерами, специфичными для ВКО.

3.7. Отрицательные и положительные контрольные образцы

В связи с многоступенчатостью ПЦР-анализа необходимо контролировать каждую его стадию. Важной задачей является не только исключение ложноотрицательных, но и ложноположительных результатов. Для этого на этапе выделения ДНК использовали отрицательный контрольный образец (ОКО), а на этапе амплификации отрицательный контроль ПЦР (К-).

ОКО служит для оценки возможной контаминации реактивов для выделения ДНК. В качестве материала для отрицательного контрольного образца тест-системы использовали стандартный ОКО, производства ЦНИИЭ. Отрицательный контроль ПЦР представляет собой реакционную смесь, в которой присутствуют все компоненты (праймеры, нуклеотиды, Taq-полимераза), за исключением ДНК-пробы и служит для контроля амплификационных реактивов. В нашей тест-системе в качестве «К-» использовали ТЕ-буфер для элюции ДНК с сорбента.

Контроль работы амплификационной смеси и работы амплификаторов осуществляли с помощью положительных контрольных образцов (ПКО). Положительным контрольным образцом является генно-инженерная конструкция фага >„gtl 0 несущая вставки фрагментов генов stxl, stx2 и fliCm Е. coli 0157:Н7, включающих область праймеров. Амплификат положительного контрольного образца является маркером длины ПЦР-продуктов для последующей электрофоретической детекции, т.е. позволяет контролировать последний этап ПЦР-анализа.

3.8. Состав разработанной тест-системы

Разработанная тест-система включает в себя четыре набора реагентов.

Первый - набор для выделения ДНК из исследуемого материала представляющий собой метод сорбции ДНК на силикагеле.

Второй - набор для амплификации выделенной ДНК, включающий смеси для амплификации ДНК stxl и stx2, для идентификации ЭГКП, и смеси для амплификации генаfliCvn для дифференциации E.coli 0157:Н7.

Третий - набор для электрофоретической детекции ПЦР-продукта.

Четвёртый - набор контрольных образцов, включающий в себя положительный контрольный образец (ПКО) ДНК VT1,VT2,H7 и отрицательный контрольный образец (ОКО).

Состав тест-системы и методика проведения анализа описаны в Наставлении по применению тест-системы «КОЛИ-ДИФ» для идентификации E.coli 0157:Н7 и дифференциации шигаподобных токсинов энтерогеморрагических E.coli методом ПЦР.

3.9. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы

Для оценки специфичности разработанной тест-системы было протестировано 40 штаммов Е. coli (табл. 1), культуры других патогенных энтеробактерий: Salmonella enteritidis, Enterobacter faecalis, Streptococcus faecalis, Citrobacter freundidi, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Yersinya enterocolitica, Campylobacter jejuni subsp. jejuni, а так же суспензии

фекалий здоровых животных. В результате штаммы Е. coli, не нр щуцирующие веротоксины, серологического варианта отличного от 0157:1 7, а так же культуры других энтеробактерий, показали отрицательный резу1 »тат со всеми тремя парами праймеров. Таким образом, аналитическая специс] гчность тест-системы составила 100%.

Результаты тестирования штаммов Е. coli серологичеа )го варианта 0157:Н7 и 0157:Н- из коллекции АТСС (США) приведены в табл це 2.

Как видно из таблицы, полученные результаты под' сердили тип продуцируемого веротоксина и наличие гена ßiCI!7 E.coli 0157: 17. Однако у штаммов № 43888* и № 51675* результат ПЦР показал ore -тствие гена, отвечающего за продукцию VT1. Это может быть следст тем утраты указанными штаммами данных генов в процессе культивирования

Таблица 2

Результаты тестирования штаммов Е. coli серологического варианта

0157:Н7 и 0157-.Н"

Штаммы из АТСС (США)

№ п/п № штамма в АТСС Серовар Тип продуцируемого токсина Резух

1 43889 0157:Н7 VT2 VT2,

2 43890 0157:Н7 VT1 VT1,

3 43888* 0157:Н7 VT1, VT2 VT2,

4 35150 0157:Н7 VT1, VT2 VT1,

5 43894 0157:117 VT1, VT2 VT1,

6 43895 0157:Н7 VT1, VT2 VT1,

7 51675* 0157:Н7 VT1, VT2 VT2,

8 51658 0157:Н7 VT1, VT2 VT1,

9 51659 0157:Н7 VT1, VT2 VT1,

10 161 0157:Н7 VT2 VT2,

И 904 0157:Н7 VT1.VT2 VT1,

12 1271 0157:Н" VT1, VT2 VT1,

■тат ПЦР

17 17 17

/Т2, Н7 /Т2, Н7 ГТ2, Н7 17

П2, Н7 ГГ2, Н7~ 17

П2, Н7

Для определения чувствительности разработанной тест-системы были протестированы 10-кратные разведения культур штаммов № 43894, 43889, 43890 Е. coli серологического варианта 0157:Н7 с концентрацией от 104 мк/мл до 10 мк/мл в ПЦР-пробе, приготовленных на фосфатном буфере и на пробах фекалий, не содержащих ЭГКП. Каждый образец тестировался в пяти повторах. Результаты тестирования панели образцов в фосфатном буфере представлены на рис. 6. Специфические фрагменты амплификации наблюдались в 100% случаев при тестировании образцов, содержащих от 104 мк/мл до 102 мк/мл. Таким образом, аналитическая чувствительность тест-системы на фосфатном буфере составила 102 мк/мл.

Рис. 6. Определение чувствительности разработанной тест-системы

j 7. - штамм Е. coli № 43894, 2. - № 43889, 3. - №43890, -5, -6, -7 -разведения культур штаммов, соответствующие 10000, 1000, 100 кл/мл, К-. ; отрицательный контроль, Кв — контроль выделения, М - маркер молекулярных :

масс ДНК (1419, 517, 396, 214 п.н.) |

При тестирования проб фекалий, контаминированных Е. coli 0157:Н7, ; специфический фрагмент амплификации наблюдался в 100% проб с содержанием от 104 мк/мл до 102 мк/мл. Таким образом, аналитическая чувствительность тест-системы оставалась той же. ! Для сравнения аналитической чувствительности метода 11ЦР с

микробиологическим методом были протестированы 10-кратные разведения (от -5 до -8) культур штаммов Е. coli 0157:Н7 № 43894, 43889, 43890 в пяти 1 повторах. Результаты исследований представлены в табл. 3. | Через сутки учитывали рост на МПА, одновременно разведения культур

исследовали с помощью тест-системы «КОЛИ-ДИФ» на наличие генов VT1, I VT2, Н7. Метод ПЦР давал стабильный положительный результат при в разведениях от -5 до -7, при разведении -8 положительный результат . наблюдался в трех повторах из пяти. При исследовании микробиологическим

VT1+VT2

Н7

Л» К Кв 1 ' 11 2 ' 2 0 2 3 5 J ' 3" U h KB I Ч ГГ.' 2 " ! ' »

■ -

методом рост бактерий наблюдался только в разведениях -5 и -6. Таким образом, чувствительность метода ПЦР оказалась на порядок выше микробиологического.

Таблица 3

Результаты сравнения аналитической чувствительности метода ПЦР с микробиологическим методом

1 № штамма Е. соН 0157:Н7 Антигенная структура Концентра дняЭГКП* Индикация исходных культур в разведении

ПЦР (тест-система «КОЛИ-ДИФ») Микробиологический метод

-5 -6 -7 -8 ' -5 -6 -7 -8

43894 УТ1, УТ2,Н7 1 млрд/см3 + + + ± + + - -

VT1.VT2.H7

43889 УТ2, Н7 1 млрд/см3 + + + ± + + - -

УТ2, Н7

43890 УТ1, Н7 I млрд/см1 + + + ± + +

VT1,H7

* по оптическому стандарту мутности

3.10. Исследование фекалий от животных с помощью тест-системы «КОЛИ-ДИФ»

Исследование фекалий от животных проводили по следующей схеме:

1. Исследование образцов для выявления ЭГКП, с помощью смеси для амплификации ДНК и 51x2;

2. Тестирование положительных в первой реакции проб для выявления Е.соИ 0157:Н7, с помощью смеси для амплификации гена/ЧСщ.

При исследовании проб фекалий с помощью разработанной тест-системы получены следующие результаты (табл. 4). При исследовании 56 образцов фекалий от кре и мрс, ЭГКП были выявлены в 18 пробах. При исследовании 32 проб фекалий собак, ЭГКП не выявлены, из 28 образцов фекалий от кошек, ЭГКП обнаружены только в одной пробе. Затем положительные пробы были исследованы на наличие Н7 антигена Е.соИ 0157:Н7, и показали отрицательный результат. Для исключения ложноотрицательных реакций использовали ВКО СМУ. Специфичность положительных проб подтверждали методом секвенирования.

Таблица 4

Результаты исследования патологического материала от животных с помощью тест-системы «КОЛИ-ДИФ»

Вид животного Количество исследованных образцов Количество положительных проб

VT1 VT2 VT1+ VT2 Н7 Общее количество

кре 42 3 (7,1%) 5 (11,9%) 6 (14,2%) - 14 (33,2%)

мрс 14 - 3 (21,4%) 1 (7,1%) - 4 (28,5%)

собаки 32 - - - - -

кошки 28 1 (12,5%) - - - 1 (12,5%)

3.11. Комиссионные испытания ПЦР-тест-системы «КОЛИ-ДИФ»

В период с 2.05.06 г. по 5.05.06 г. в соответствии с приказом Руководителя Россельхозиадзора № 53 от 20.03.2006 были проведены комиссионные испытания тест-системы для идентификации E.coli 0157:Н7 и дифференциации шигаподобных токсинов энтерогеморрагических E.coli методом ПЦР.

Для комиссионных испытаний была сформирована стандартизованная панель, включающая штаммы E.coli 0157:Н7, штаммы E.coli серологического варианта, отличного от 0157:Н7, и другие патогенные энтеробактерии. Результаты комиссионного испытания обобщены в табл. 5.

Тест-система для идентификации E.coli 0157:Н7 и дифференциации шигаподобных токсинов энтерогеморрагических E.coli методом полимеразной цепной реакции обладает высокой чувствительностью (102 мк/мл) и 100% специфичностью при испытаниях на стандартизованной панели.

Тест-система «КОЛИ-ДИФ» успешно прошла комиссионные испытания и зарегистрирована в РФ (№ ПВР-1-4.6/01807 от 29.12.06).

3.12. Изучение активности и стабильности ПЦР-тест-систсмы в зависимости от срока хранения

Ежемесячно в течение 15 месяцев тест-систему «КОЛИ-ДИФ» проверяли по параметрам заложенным в ТУ 9388-154-00494189-06.

Все компоненты тест-системы сохраняли высокую активность и стабильность в течение всего срока хранения при температуре (2-8)°С.

Таблица 5

Результаты проведения комиссионных испытаний тест-системы «КОЛИ-

ДИФ»

№ п/п № шифра Исследуемый материал Результат ПЦР

ожидаемый ПОЛ1 ученный

VT1 VT2 H7 VT1 VT2 H7

1 4 Е. coli 0157:117 № 43894 + + + + + +

2 2 Е. coli 0157:117 Лг2 43889 - + + - + +

3 8 Е. coli 0157:Н7№ 43890 + - + + - +

4 14 Разведение штамма Е. coli 0157:Н7№ 43894, соответствующее 104мк./мл + + + + + +

5 9 Разведение штамма Е. coli 0157:Н7№ 43894, соответствующее 103 мк/мл + + + + + +

6 12 Разведение штамма Е. coli 0157:Н7№ 43894, соответствующее 102 мк/мл + + + + + +

7 1 Е. coli 0101:F41 №F41, производственный штамм ВГНКИ - - - - - -

8 6 Е. coli Ol 19:К69:Н4№ 733 производственный штамм ВГНКИ - - - - - -

9 3 Е. coli 0147:К89:К88 № 1092 производственный штамм ВГНКИ - - - - - -

10 10 Salmonella enteritidis - - - - - -

11 15 Enterobacter faecalis - - - - - -

12 5 Streptococcus faecalis - - - - - -

13 16 Citrobacter freundidi - - - - - -

14 13 Klebsiella pneumoniae - - - - - -

15 7 Morganella morganii - - - - -

16 17 Yersinya enterocolitica - - - -

17 П Camp, jejuni subsp. jejuni - - - - -

3.14. Использование тест-системы «КОЛИ-ДИФ» для государственного контроля пищевой продукции и кормов

С 2007 г. в лаборатории пищевых инфекций отдела Биотехнологии

проводится государственный контроль пищевой продукции и кормов на

показатели качества и безопасности бактериологическими методами. Контроль пищевой продукции проводится согласно требованиям СанПин 2.3.2 1078, утвержденных Главным государственным санитарным врачом РФ 06.11.2001 и введенных в действие 1.09.2002 г. Все образцы мяса, молока, сыра, яиц и рыбопродуктов, поступающие для госконтроля дополнительно исследовались на обсемененность энтерогеморагическими эшерихиями с помощью тест-системы «КОЛИ-ДИФ».

За 2007 г. протестировано 1268 проб мяса, 1120 проб молока, 1600 проб сыра, 1310 проб яйца столового, 1078 проб рыбопродуктов (рыба замороженная, икра солено-мороженная). При бактериологическом исследовании бактерии группы кишечной палочки (БГКП) были обнаружены в 60 (29,44 %) пробах мяса, 36 (30%) пробах молока, в 7 (11,67 %) пробах яйца столового.

Таблица 6

Результаты исследования пищевой продукции с помощью тест-системы «КОЛИ-ДИФ»

Вид продукции Количество исследованных образцов 2007 г Количество исследованных образцов 2008 г Результат ПЦР

Наличие ЭГКП Наличие E.coli 0157:Н7

VT1 VT2 Н7

Мясо 1268 1648 - - -

Молоко 1120 1185 - -

Сыр 1600 1600 - - -

Яйцо столовое 1310 1365 - - -

Рыбопродукты 1078 1125 - - -

Итого: 6376 6923 - - -

В 2008 году протестировано 1648 проб мяса, 1185 проб молока, 1600 проб сыра, 1365 проб яйца столового, 1125 проб рыбопродуктов. При бактериологическом исследовании БГКП были обнаружены в 53 (29%) пробах мяса, 39 (30%) пробах молока, в 9 (10 %) пробах яйца столового.

Пробы пищевой продукции, в количестве 13 299, в течение двух лет исследовались с помощью тест-системы «КОЛИ-ДИФ» на наличие ЭГКП. Результаты исследований представлены в табл. 6.

4. ВЫВОДЫ

1. На основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей генов кодирующих шигаподобные токсины энтерогеморрагических E.coli (stxl и stx2) сконструированы оригинальные праймеры и оптимизированы параметры ПЦР для идентификации энтерогеморрагических Е. coli.

2. Разработан способ дифференциации Е. coli серологического варианта 0157:Н7 и положительный контрольный образец ДНК VT1, VT2, Н7, являющийся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов.

3. При сравнении аналитических характеристик разработанной тест-системы с микробиологическим методом, установлено, что тест-система «КОЛИ-ДИФ» обладает 100% специфичностью и имеет предел аналитической чувствительности 102 мк/мл.

4. Тест-система «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР позволяет в течение 4 часов выявлять ЭГКП и дифференцировать серовар 0157:Н7.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются следующие нормативные документы, разработанные в ходе выполнения научных исследований по теме диссертации:

1. Инструкция по применению тест-системы «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР (РУ № Р077-1-4.6-1332, утв. Россельхознадзором 29.12.2006);

2. Технические условия на тест-систему «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli

методом ПЦР (ТУ № 9388-154-00494189-06, согл. Россельхознадзором 29.12.2006);

3. Регистрационное удостоверение на тест-систсему «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е, coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР (№ ПВР-1-4.6/01807 от 29.12.06);

4. Сертификат соответствия требованиям нормативных документов тест-системы «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР (№ РОСС 1Ш.ФВ01.В16591).

6. СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Брюсова М.Б., Обухов И.Л., Тугаринов O.A., Пирожков М.К., Стрельченко С.А. Идентификация и дифференциация энтерогеморрагических Е. coli и Е. coli 0157:Н7 методом полимеразной цепной реакции./ Сборник научных трудов ВГНКИ, 2005.- Т.66. с. 161-166.

2. Брюсова М.Б., Обухов И. Л. Разработка ПЦР тест-системы для выявления и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli и Е. coli 0157:Н7./ Сборник научных трудов ВГНКИ, 2007.-T.68.-c. 162-168.

3. Брюсова М.Б., Обухов И.Л., Тугаринов O.A., Пирожков М.К. Идентификация и дифференциация энтерогеморрагических Е. coli и Е. coli 0157:Н7 методом полимеразной цепной реакции./ Сборник трудов 6-ой всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика», 2007.- т. 1. - с. 224-226.

4. Брюсова М.Б., Обухов И.Л., Тугаринов O.A., Пирожков М.К., Панин А.Н. Идентификация энтерогеморрагических Е. coli и дифференциация Е. coli 0157:Н7 методом полимеразной цепной реакции./ Ветеринария, 2008.- № 12. - с.42-49

ГНУВНИИВСГЭ, 2008 г. 123022, Москва, Звенигородское ш., 5 Заказ , тираж 100 экз.

Оглавление диссертации Брюсова, Мария Борисовна :: 2009 :: Москва

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Брюсова, Мария Борисовна, автореферат

Цель и задачи исследования.7

Научная новизна.7

Практическая значимость работы.8

Апробация работы.8

Объем и структура диссертации.9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.10

1. Характеристика возбудителя.10

1.1. Систематика и классификация.10

1.2. Морфологические, культуральные и ферментативные свойства эшерихий.12

1.3. Антигенные свойства эшерихий.13

2. факторы патогенностиэнтерогеморрагических эшерихий и их роль' в" w»<c патогенезе.14

2.1. Колонизация кишечника ЭГКП.15

2.2. шигаподобные вероцитотоксины.<&16

2.2.1. Номенклатура шигатоксинов.!.1 б

2.2.2. Биологические свойства шигатоксинов.19

2.2.3. Строение шигатоксинов и их патогенетическое действие.20

3. Эпидемиология и эпизоотология возбудителя.21„

4. Экология энтерогеморрагических эшерихий.К:.*.27"

5. Методы выделения и идентификации энтерогеморрагических эшерихий.29

6. Принцип полимеразной цепной реакции.34

7. Заключение.39

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.41

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.41

1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе.41

2. Культивирование бактерий и определение концентрации.42

3. Клинический материал и его подготовка.43

4. Методика выделения геномной ДНК из исследуемого материала методом протеиназной обработки и осаждения этанолом с предварительной фенольной экстракцией.44

5. Методика выделения геномной ДНК из исследуемого материала методом аффинной сорбции Д НК на силикагеле.44

6. Методика проведения реакции амплификации.46

6.1 Состав реакционной смеси, условия амплификации.46

6.2 «Горячий старт».47

7. Методика проведения электрофореза в агарозном геле.47

8. Клонирование фрагментов ПЦР в фаг XgtIO.48

8.1 Очистка фрагментов ПЦР.48

8.2 Рестрикция фрагмента ПЦР.48

8.3 Гель-электрофорез, элюция фрагмента из геля.49

8.4 Реакция легирования.49

8.5 Упаковка фаговых частиц.49

8.6 Приготовление клеток Е. сои.50

8.7 Высев упакованных частиц фага.50

8.8 Отбор клонов и элюция фаговых частиц.50

8.9 Наращиваниерекомбпнантных фаговых частиц.50

9. Секвенирование.51

9.1 Подготовка матрицы ДНК- очистка продуктов ПЦР-.51

9.2 Измерение концентрации ДНК на флюориметре.52

9.3 Секвенирующаяамплификация.53

9.4 Очистка отневстроившихсяддНТФ.55

9.5 Детекция продуктов секвенпрования.55

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.57

1. Выбор олигонуклеотидных праймеров и изучение их специфичности.57

2. Подбор условий ПЦР.59

2.1. Выбор оптимальной концентрации ионов Mg2+.59

2.2. Оптимизация температуры отжига праймеров.60

2.3. Подбор концентрации праймеров.*.61

2.4. Применение «горячего старта».64

3. Подбор методов выделения (очистки) ДНК.65

4. Внутренний контрольный образец (ВКО).66

5. Отрицательные и положительные контрольные образцы.66

6. Состав разработанной тест-системы.67

7. Определение аналитической специфичности и чувствительности тест-системы .69

8. Исследование фекалий от животных с помощью тест-системы «КОЛИ-ДИФ» . 72

9. Комиссионные испытания ПЦР-тест-системы «КОЛИ-ДИФ».73

10. Изучение активности и стабильности ПЦР-тест-системы в зависимости от срока хранения.75

11. Использование тест-системы «КОЛИ-ДИФ» для государственного контроля пищевой продукции и кормов.75

ОБСУЖДЕНИЕ.!.77

ВЫВОДЫ.:.83

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.84

ЛИТЕРАТУРА.85

ПРИЛОЖЕНИЯ.104

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Taq Thermits aquaticus

АЕ Attaching and effacing (прикрепление и стирание) вко Внутренний контрольный образец гк Геморрагический колит

ГУС Гемолитический уремический синдром

ДГ Диареегенные кишечные палочки

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота крс Крупный рогатый скот м Моль/л

Мк/мл Микробных клеток/мл мМ Милимоль/л мрс Мелкий рогатый скот

МЭБ Международное эпизоотическое бюро

ОКО Отрицательный контрольный образец п.н. Пар нулеотидов

ДНТФ Дезоксинуклеотидтрифосфаты

ПДРФ Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов пко Положительный контрольный образец пмоль Пикомоль

ПЦР Полимеразная цепная реакция

ТБЕ-буфер Трис-борат-ЭДТА буфер

ТЕ-буфер Трис-ЭДТА буфер

Трис-НС1 Трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид

УПКП Уропатогенные кишечные палочки

ЭАКП Энтероагрегативные кишечные палочки

ЭГКП (ЭГЭК) Энтерогеморрагические кишечные палочки энтерогеморрагические эшерихии коли)

ЭДТА Этилендиамин-тетрацетат натрия

ЭИКП Энтероинвазивные кишечные палочки

ЭПКГ1 Энтеропатогенные кишечные палочки эткп Энтеротоксигенные кишечные палочки

ЭФ Электрофорез

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Впервые энтерогеморрагические кишечные палочки (ЭГКП) идентифицированы в 1982 г., когда штаммы Е. coli ранее неизвестного серотипа 0157:Н7, оказались причиной двух крупных вспышек гемморагического колита у детей в США (89, 97, 98, 118, 123).

Основным резервуаром энтерогеморрагических эшерихий (ЭГЭК) является крупный и мелкий рогатый скот (76, 81, 105, 128). Однако такие домашние животные, как свиньи, лошади, олени, птицы, собаки и кошки так же могут быть носителями ЭГКП (51, 108, 129). Выделяя бактерии с фекалиями во внешнюю среду, животные служат основным источником контаминации различных объектов ЭГКП. При проведениии мониторинга ЭГКП среди сельскохозяйственных животных в Европе, обнаружено, что в Германии около 20,8% животных и 2,6% исследованных проб мяса крупного рогатого скота (крс) были заражены Е. coli 0157:Н7. При исследовании образцов мяса в Финляндии, данный показатель составил 1,4%, а в Бельгии -1,26% (89). При проведении мониторинга1 ЭГКП серовара 0157:Н7 в хозяйствах Рязанской, Воронежской, Тульской и Орловской областей обнаружено, что носительство среди крс составляет 2,6%, среди свиней 0,9% и птиц - 0,8% (29, 30).

Вспышки инфекции у человека возникают при употреблении пищевых продуктов животного происхождения, контаминированных эшерихиями в процессе убоя, переработки, упаковки, хранения и приготовления пищи, а также фруктов и овощей, обсеменение которых происходит в результате контакта с фекалиями домашних и диких животных на какой-либо стадии их выращивания или обработки. По данным Центра Всемирной Организации Здравоохранения Животных (МЭБ), каждый год на территории США в среднем регистрируется до 72 000 случаев заболеваний людей, вызванных ЭГКП, из них около 60 летальных. В Великобритании в период 1995-2000 гг. зарегистрировано 18 вспышек геморрагического колита (ГК) у людей, заболеваемость за это время возросла с 6 до 411 случаев на 100 тыс. населения, а число смертельных исходов составило 2,5% (112, 129).

Наиболее распространенным и значимым для здравоохранения серологическим вариантом ЭГКП является серовар 0157:Н7, тем не менее, при спорадических случаях и эпизоотиях часто выявляются и другие серогруппы эшерихий: 026, 091, 0103, 0104, Olll, 0113, 0117, 0118, 0121, 0128, 0145 (50, 97, 101, 105, 128), идентификация которых имеет немаловажное значение.

Разработка новых высокочувствительных и специфичных экспресс методов для идентификации энтер о геморрагических Е. coli является актуальной задачей. В последние годы широкое распространение во многих странах получил метод выявления факторов патогенности ЭГКП с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Большинство молекулярно-генетических методик, разработанных для идентификации ЭГКП, направлены на прямое выявление генов, кодирующих веротоксины (61, 74, 92, 103, 130, 154, 157). Метод ПЦР отличается высокой чувствительностью, специфичностью и универсальностью и позволяет выявлять ЭГКП не только в биологическом материале, но и в объектах внешней среды.

Цель и задачи исследования

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать олигонуклеотидные праймеры для идентификации энтерогеморрагических Е. coli и дифференциации серологического варианта 0157:Н7, разработать оптимальные параметры ПЦР и оценить эффективность различных способов выделения ДНК из патологического материала;

2. Провести оценку аналитических и диагностических характеристик разработанной тест-системы;

3. Сравнить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы с традиционным методом;

Научная новизна

Разработан положительный контрольный образец (ПКО) ДНК VT1, VT2, Н7, являющийся генно-инженерной конструкцией, несущей вставки Л фрагментов генов stxl, stx2 и fliCm Е. coli 0157:Н7. ПКО позволяет контролировать работу амплификационной смеси и является маркером длины ПЦР-продуктов.

Впервые в России разработана ПЦР тест-система для идентификации Е. coli 0157-.Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli, обладающая

100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 100 мк/мл.

Практическая значимость работы

Апробация работы

- Научно-проблемных методических комиссиях ФГУ «ВГНКИ»

2004-2007 гг.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 104 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003»), и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения. Диссертация иллюстрирована 11 рисунками и 12 таблицами. Приложение к диссертации содержит разработанную нормативную документацию, подтверждающую результаты исследований, их научно-практическую ценность. Список литературы включает 162 источника, в том числе 127 иностранных.

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка ПЦР тест-системы для идентификации энтерогеморрагических E.COLI и дифференциации E.COLI О157:H7"

выводы

2. Разработан способ дифференциации Е. coli серологического варианта 0157:Н7 и положительный контрольный образец ДНК VT1, VT2, Н7, являющийся индикатором работы амплификационной смеси и ^ маркером длины ПЦР-продуктов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

2. Технические условия на тест-систему «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР (ТУ № 9388-15400494189-06, согл. Россельхознадзором 29.12.2006);

3. Регистрационное удостоверение на тест-ситсему «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР (№ ПВР-1-4.6/01807 от 29.12.06);

7. Заключение

В последние годы все большее внимание уделяется случаям пищевых инфекций среди людей, вызываемых ЭГКП, в частности Е. coli серологичекого варианта 0157:Н7. Основным резервуаром ЭГКП является крупный и мелкий рогатый скот, другие домашние животные также могут быть носителями данного патогена. Инфекция возникает при потреблении пищевых продуктов, полученных от больных животных, а также от вторично контаминированной продукции животного и растительного происхождения. Создание тест-систем для скрининга контаминированных энтерогеморрагическими эшерихиями продуктов питания, объектов окружающей среды и выявление животных - бактерионосителей, является актуальным. Анализ литературных данных о применении метода ПЦР для выявления ЭГКП в клинических образцах, продуктах питания и окружающей среде показывает, что данный метод обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционным бактериологическим и серологическим методами, так как сочетает в себе быстроту и простоту исполнения, а также потенциально высокую специфичность и чувствительность при выявлении патогенных микроорганизмов.

Тест-система на основе метода ПЦР должна обладать высокоэффективным методом выделения ДНК, системой амплификации обеспечивающей с максимальной чувствительностью, с последующей детекцией ПЦР-продукта, и набором контрольных образцов, позволяющим осуществлять контроль качества проведения каждого теста. Вышеперечисленные соображения послужили основой проведения собственных исследований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

Для оценки аналитической чувствительности и специфичности разработанной тест-системы использовали штаммы из коллекции ФГУ «ВГНКИ», любезно предоставленные лабораторией качества и стандартизации лекарственных средств против бактерийных болезней животных, - 40 штаммов Е. coli, из них 12 серологического варианта 0157:Н7 и 0157:ЕГ (табл. 4), а так же культуры других патогенных энтеробактерий: Salmonella enteritidis, Enterobacter faecalis, Streptococcus faecalis, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Yersinya enterocolitica, Campylobacter jejuni subsp. jejuni.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Брюсова, Мария Борисовна

1. Бакулина Н. А., Краев Э. Л. Микробиология. М.: Медицина, 1980. -с.68-106

2. Голубева И. В., Улиско И. Н. Классификационное положение E.coli В кн.: Научные достижения в изучении коли-инфекции. Под редак. И.В. Голубевой. М.: ВНИИМИ, 1973. - С. 3-15.

3. ГОСТ 29184-91 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae».

4. ГОСТ 30726-2001 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli.»

5. Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология. //М.1977.

6. Емельяненко П. А., Дунаев Г. В., Кудлай Д. Г. и др. Ветеринарная микробиология. // "Колос" 1982.

7. Золотухин С. Н. // Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных. -Ульяновск, 2004.

8. Ю.Зоценко JI.В. Распространение шиготоксинпродуцирующих эшерихий среди крс и свиней, а также изучение их биологических свойств. // Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. вет. наук. Киев, 2003 - 20 с.

9. П.Калинина Г.П. Санитарная микробиология. М.: Медицина, 1969. 450 с.

10. Коротяев А.И., Бабичев С.А. // Медицинская миробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. вузов. СПб.: СпецЛит, 2002.-591 с.

11. Красильников А.П., Романовская Т.Р. Микробиологический словарь-справочник. 2-е изд., доп. и перераб. //Мн.: "Асар", 1999.

12. Куликовский А.В. Эмерджментные пищевые зоонозы. М.: Крафт +, 2004.-174с.

13. Куликовский А.В. Эмерджментные пищевые зоонозы. Тезисы докладов Четвертой международной научно-технической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельско-хозяйственной прдукции». М.:2002. -С.12-13.

14. Макарова М.А.// Биологические свойства Escherichia coli серологических групп Ol, 0144 И 0157, регистрируемых как возбудители острых кишечных инфекций. // Автореф. дисс. на соиск. уч. степ, канд.меднаук. Санкт-Петербург - 2007. - 20 с.

15. Малов В.А., Пак С.Г.// Эпидемиология и инфекционные болезни. // 1996; 2: 50-53.

16. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: пер. с англ. / Под ред. С.Херрингтона, Дж. Макги. -М.: Мир, 1999. 558 с.

17. МУК 4.2.992-00 Методы выявления и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157:Н7.

18. МУК 13-7-2/2117 по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных.

19. Мюнх Д. Микробиология продуктов животного происхождения. М.: Агропромиздат, 1985. 590 с.

20. Нестерова И.С.; Коптев В.Ю.; Шкиль Н.А. // Распространение Esherichia coli 0157:Н7 среди мелких домашних животных. // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные 2005 - N 3 - С. 33-34.

21. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир, 1997. -Т. 1.- С. 180-196.

22. Рапопорт С.М. Медицинская микробиология. М.: Медицина, 1976.-230с

23. Ратинер Ю.А., Бондаренко В.М., Sitonen А. Энтерогеморрагические кишечные палочки и вызываемые ими заболевания // Журн. Микробиол, эпидемиол. и иммунологии, 1998. №5. - С. 87-96.

24. Сидоров М.А., Корнелаева Р.П. Микробиология мяса и мясопродуктов. М.: «Колос», 1996. 256 с.

25. Степаншин Ю.Г.; Светоч Э.А.; Ерусланов Б.В.; Баннов В.А.; Борзенков В.Н. Возбудитель геморрагического колита Escherichia coli 0157: Н7 в России: мониторинг, экспресс-диагностика / Ульян, гос. с.-х. акад. -Ульяновск, 2006. С. 142-145.

26. Степаншин Ю.Г.; Светоч Э.А.; Ерусланов Б.В.; Баннов В.А.; Борзенков В.Н.; Каврук Л. С. Бактерионосительство энтерогеморрагических эшерихий серовара 0157:Н7 у животных. // Ветеринария, 2005; N 7. С. 17-22.

27. Херрингтон С. и Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. //М. "Мир" 1999.

28. Шуляк Б. Ф. // Руководство по бактериальным инфекциям собак. Том 2. Грамотрицательные бактерии. — Москва, 2003. — 608 с.

29. Зб.Энтеробактерии. Под ред. Покровского В.И. Руководство. М.: Медицина, 1985.-320 с.

30. A1-Ajmi D., Padmanabha J., Denman S.E., Gilbert R.A., A1 Jassim R.A.M., McSweeney C.S. Evaluation of a PCR detection method for Escherichia coli 0157:H7/H- bovine faecal samples. // Letters in Applied Microbiology -2006-V.42-P. 386-391.

31. Aleksic S., Karch H., Bockemuhl J. A biotyping scheme for Shiga-like (Vero) toxin-producing Escherichia coli 0157 and a list of serological cross-reactions between 0157 and other gram-negative bacteria. // Zbl. Bakt. — 1992-V.276-P. 221-230.

32. Altschul S.F., Boguski M.S., Gish W., Wootton J.C. Issues in searching molecular sequence databases. //Nature Genet. 1994. - V. 6. — P. 119-129.

33. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool. // J. Mol. Biol. 1990. - V. 215. - P. 403-410.

34. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 33893402.

35. Appleman S., Ascher D., Park C. Clinical Spectrum of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli (STEC) in Adults and Children. // Clin Pediatr (Phila) 2008 V. 22.

36. Barak J.D., Sananikone K., Delwiche M.J. Comparison of primers for the detection of pathogenic Escherichia coli using real-time PCR // Letters in Applied Microbiology 2005 - V. 41 - P. 112-118 .

37. Bastin D. A., Reeves P. R. Sequence and analysis of the О antigen gene (rfb) cluster of Escherichia coli Olll.// Gene 1995 - V. 164 - P. 17-23.

38. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank: update. // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32(Database issue). - P. D23-D26.

39. Beutin L., Aleksic S., Geier D., Zimmermann S. Virulence factors and phenotypical traits of verotoxigenic strains of E. coli isolated from human patients in Germany. Med. Microbiol. Immunol. 1994 -V. 183 - P. 13-21.

40. Bettelheim K.A., Evangelidis H., Pearce J.L., Sowers E., Strockbine N.A. Isolation of a Citrobacter freundii strain which carries the Escherichia coli 0157 antigen. // Journal of clinical Microbiology 1993 - V. 31 - P. 760761.

41. Bettelheim K.A. Serotypes of VTEC: The VTEC Table. 2003. http://www.microbionet.com.au/vtectable.htm.

42. Beutin L., Geier D., Zimmermann S., Karch H. Virulence markers of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli strains originating from healthy domestic animals of different species. // J. Clin. Microbiol. — 1995 V. 33 -P. 631-635.

43. Boerlin P., McEwen S.A., Boerlin-Petzold F., Wilson J.B.,Johnson R.P.,Gyles C.L. Association between virulence factors of Shiga toxin-producing E. coli and disease in humans. // Journal of clinical microbiology -1999-V. 37-P. 497-503.

44. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M.E., Van Der Noordaa J. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. // Journal of Clinical Microbiology. 1990. - V. 28(3). - P. 495-503.

45. Borczyk A.A., Lior H., Ciebin B. False positive identifications of Escherichia coli 0157 in foods. // Int. J. Food. Microbiol. 1987 - V.4 - P.347. 349.

46. Brownie J., Shawcross S., Theaker J., Whitcombe D., Ferrie R., Newton C., Little C. The elimination of primer dimer-accumulation in PCR. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 3235-3241.

47. Buchanan R.L., Edelson S.G., Snipes K. Boyd G. Inactivation of Escherichia coli 0157:H7 in apple juice by irradiation. // Appl Environ Microbiol 1998 -V. 64-P. 4533^4535.

48. Caprioli A., Morabito S., Brugere H., Oswald E. Enterohaemorrhagic Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. // Vet. Res. 2005 - V. 36 - P. 289-311.i

49. Centers for Disease Control. 1993. Update. Multistate outbreak of Escherichia coli 0157:H7 infections from hamburgers western United States - 1992-1993. // Morbid. Mortal. Weekly Rep. V. 42 - P. 258-263.

50. Chart H., Okubadejo O.A., Rowe B. The serological relationship between Escherichia coli 0157 and Yersinia enterocolitica 09 using sera from patients with brucellosis. //Epidemiol. Infect. 1992 - V.108 -P. 77- 85.

51. Chapman P.A., Siddons C.A., Cerdan Malo A.T. et al. A one year old study of E. coli 0157:H7 in raw beef and lamb products. // Epid. And Infect. -2000-V. 124-P. 207-213.

52. Chen H., Zhu G. Computer program for calculating the melting temptrature of degenerate oligonucleotides used in PCR or hybridization. // Biotechniques.- 1997.-.V. 22(6).-P. 1158-1160.

53. Chenna R., Sugavwara H, Koike Т., Lopez R., Gibson T.J., Tompson J.D., Multople sequence alignment with the Clustal series of programs. // Nucleic Acids Res. 2003 - V. 31 - P. 3497-3500.

54. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extractoin. // Anal. Biochem. -1987.-V. 162.-P. 156-159.

55. Coyne V.E., James M.D., Reid S.J., Rybicki E.P. (ed.). Molecular Biology Techniques Manual. Departament of Molecular and Cell Biology, University of Cape Town. - 2001.

56. Dang C., Jayasena S.D. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. // J.Mol.Biol. -1996. V. 264(2). - P. 268-278.

57. DAquila R.T., Bechtel L.J., Videler J.A., Eron J.J., Gorczyca P, Kaplan J.C. Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. //Nucleic Acids Res. 1991.-V. 11;19(13). -P. 3749.

58. Deng M.Y., Fratamico P.M. A multiplex PCR for rapid identification of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli 0157:H7 isolated from foods. // J. Food. Prot. 1996 -V. 59 - P. 570-576.

59. Dielfenbach C.W., Lowe T.M.F., Dveksler G.S. General concepts for PCR primer desin. // PCR Methods Appl. 1993. - V. 3. - P. S30-S37.

60. Dodd С. C., Sanderson M. W., Sargeant J. M., Nagaraja T. G.,Oberst R. D., Smith R. A., Griffin D. D. Prevalence of Escherichia coli 0157 in Cattle Feeds in Midwestern Feedlots.// The Veterinary Journal 2007.

61. Dytoc M.T., Ismaili A., Philpott D.J., Soni R., Brunton J.L., Sherman P.M. Distinct binding properties of eaeA-negative verocytotoxin-producing E. coli of serotype 0113:H21. // Infect. Immun. 1994 - V. 62 - P. 3494-3505.

62. Erlich H.A. (ed.) PCR technology. Stockton Press, New York. - 1989 - P. 254.

63. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. Recent advances in the polymerase chain reaction.//Science. 1991.-V. 252(5013).-P. 1643-1651.

64. Fegan N., Vanderlinde P., Higgs G., Desmarchelier P. The prevalence and concentration of E. coli 0157 in faeces of cattle from different production systems at slaughter. // J. Appl. Microbiol. 2004 - V. 97 - P. 362-370.

65. Fortin N.Y., Mulchandani A. Chen W. Use of real-time polymerase chain reaction and molecular beacons for the detection of Escherichia coli 0157:H7. // Anal Biochem 2001 - V. 289 - P. 281-288.

66. Friedrich A.W., Bielaszewska M., Zhang W.L., Pulz M. Kuczius Т., Ammon A., Karch H. E. coli harboring Shiga toxin 2 gene variants: Frequency and association with clinical symptoms. // J. Infect. Dis. 2002 - V. 185 - P. 7484.

67. Gannon V. P. J., Teerling C., Masri S. A., Gyles C. L. Molecular cloning and nucleotide sequence of another variant of the Escherichia coli Shiga-like toxin II family. // J. Gen. Microbiol. 1990 - V. 136 - P. 1125-1135.

68. Gelfand D.H., White TJ. Thermostable DNA polymeases. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J J., White T.J.) New York: Academic Press. - 1990. - P. 129-141.

69. Gorelenkov V., Antipov A., Leinine S., Daraselia N., Yuryev A. Set of novel tools for PCR primer design. // Biotechniques. 2001. - V. 31(6). - P. 13261330.

70. Gunzer F., Bohm H., Russmann H., Bitzan M., Aleksic S., Karch H. Molecular detection of sorbitol-fermenting Escherichia coli 0157 in patients with hemolytic-uremic syndrome. // J. Clin. Microbiol. 1992 - V.30 - P. 1807- 1810.

71. Gyles C. L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: An overview. I I J. Anim. Sci. 2007 - V. 85(E. Suppl.) - P. E45-E62.

72. Hara-Kudo Y., Konuma H., Iwaki M., Kasuga F., Sugita-Konishi Y., Ito Y., Kumagai S. Potential hazard of radish sprouts as a vehicle of Escherichia coli 0157:H7. // J. Food Prot. 1997 - V. 60 - P. 1125-1127.

73. Harrington C. S., Thomson-Carter F. M., Carter P. E. Evidence for recombination in the flagellin locus of Campylobacter jejuni: implications for the flagellin gene typing scheme. // J. Clin. Microbiol. 1997 - V.35 - P. 2386-2392.

74. Henegariu О., Neerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H. Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. // Biotechniques. 1997.-V. 23.-P. 504-511.

75. Johnson R.P., Clarke R.S., Wilson J.B., Read S.D. et al. Growing concerns and recent outbreaks involving non-0157:H7 serotypes of verocytotoxigenic E. coli. II J. food Protect. 1996 - V. 59 - P. 1112-1122.

76. Kainz P., Schmiedlechner A., Strack H.B. Specifity-enhanced hot-start PCR: addition of double-strand DNA fragments adapted to the annealing temperature. // Biotechniques. 2000. - V. 28(2). - P. 278-282.

77. Karch H., Bielaszewska M. Sorbitol-Fermenting Shiga Toxin-Producing Escherichia coli 0157:H2 Strains: Epidemiology, Phenotypic and Molecular

78. Characteristics, and Microbiological Diagnosis. // Journal of Clinical Microbiology 2003 - V. 41, No. 6 - P. 2669-2671.

79. Karmali M. A. Infection by verotoxin-producing Escherichia coli. II Clin. Microbiol. Rev. 1989 - V.2-P. 15-38.

80. Karpman D., Connell H., Svensson M., Scheutz F., Aim P., Svanborg C. The role of lipopolysaccharide and Shiga-like toxin in a mouse model of Escherichia coli 0157:H7 infection. // J. Infect. Dis. 1997 - V. 175 - P. 611-620.

81. Lee J.H., Hur J., Stein B.D. Occurrence and characteristics of enterohemorrhagic Escherichia coli 026 and Olll in calves associated with diarrhea. // Applied and Environmental Microbiology 2000 - V. 66, No. 6 -P. 2513-2519.

82. Lior H., С. L. Gyles Classification of Escherichia coli. Escherichia coli in domestic animals and humans. CAB International, Wallingford, United Kingdom - 1994-P. 31-72.

83. McPherson M.J., Haines B.D., Taylor G.R. (ed.) PCR 2. A Practical Approach. Oxford University Press. - 1995.

84. Miyazaki S., Sugawara H., Gojobori Т., Tateno Y. DNA Data Bank of Japan (DDBJ) for genome scale research in life science. // Nucleic Acids Res.-2003.-V. 31.-P. 13-16.

85. Mobassaleh M., Koul O., Mishra K., McCluer R. H., Keusch. G. T. Developmentally regulated Gb3 galactosyltransferase and alpha-galactosidase determine Shiga toxin receptors in intestine. // Am. J. Physiol. 1994 - V. 267 - P. 618-624.

86. Monteiro L., Bonnemaison D., Vekris A., Petry K.G., Bonnet J., Vidal R., Cabrita J., Megraud F. Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces: Helicobacter pylori model. I I J. Clin. Microbiol. 1997 - V. 35 - P. 995998.

87. Moon H. W., Booher S. L., Cornick N. A., Hoffman L. J. Prevalence of Virulence Factors Among Escherichia coli. II Journal of clinical microbiology 1998 - V. 36, No. 4 - P. 878-882.

88. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. // Methods Enzymology (ed. R. Wu). -1987. V. 155. - P. 335-50. Academic Press, London.

89. Nataro J. P., Kaper J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. II Clinical microbiology reviews 1998 - V. 11, No. 1 - P. 142-201.

90. Nielsen E. M., Tegtmeier C., Andersen M. T. et al. Influence of age, sex and herd characteristics on the occurrence of Verocytotoxin-producing E. coli 0157 in Danish dairy farms. // Vet. Microbiology 2002 - V. 88 - P. 245-257.

91. Nielsen E. M., Scheutz F., Torpdahl M. Continuous surveillance of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections by pulsed-field gel electrophoresis shows that most infections are sporadic. // Foodborne Pathog. Dis. 2006 - V. 3 - P. 81-88.

92. O'Brien A.D., Lively T.A., Chen M.E., Rothman S.W., Formal S.B. Escherichia coli 0157:H7 strains associated with haemorrhagic colitis in the United States produce a Shigella dysenteriae 1 (SHIGA) like cytotoxin. // Lancet- 1983 V. 1-P. 702.

93. O'Brien A.D., Holmes R.K. Shiga and Shiga-like toxins. // Microbiology Reviews 1987 - V. 51 - P. 206-220.

94. Ohnishi M., Kurokawa K., Hayashi T. Diversification of Escherichia coli genomes: are bacteriophages the major contributors? // Trends in Microbiology.- 2001 V.9 No.10 -P.481-485.

95. Orrego C. Organizing a laboratory for PCR work. In: PCR Protocols: a guide to methods and applications. Academic Press. 1990.

96. Paton A. W., Paton J. C. Pathogenesis and Diagnosis of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Infections. // Clinical microbiology reviews -1998 V.l 1, No. 3 - P. 450-479.

97. Pearson W. R. Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA // Methods in Enzymology. 1990. - V. 183. - P. 63-98.

98. Pearson W. R., Lipman D. J. Improved Tools for Biological Sequence Comparison. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1988. V. 85. - P. 2444- 2448.

99. Pearson W.R. Flexible sequence similarity searching with the FASTA3 program package. // Methods Mol Biol. 2000. - V. 132. - P. 185-219.

100. Perelle S., Fach P., Dilasser F., Grout J. A PCR test for detecting Escherichia coli 0157:H7 based on the identification of the small inserted locus (SILO 157). // J. Appl. Microbiol. 2002 - V. 93 - P. 250- 260.

101. Pie'Rard D., Muyldermans G., Moriau L., Stevens D., Lauwers S. Identification of New Verocytotoxin Type 2 Variant B-Subunit Genes in Human and Animal Escherichia coli Isolates. // Journal of Clinical Microbiology- 1998-V. 11, No. 11 P. 3317-3322.

102. Ratiner Y. A., Salmenlinna S., Eklund M., Keskima M., Siitonen A. Serology and Genetics of the Flagellar Antigen of Escherichia coli 0157:H7a,7c. // Journal of clinical microbiology. 2003 - V. 41, No. 3 - P. 1033-1040.

103. Ray P. E., Liu X. H. Pathogenesis of Shiga toxin-induced hemolytic uremic syndrome. // Pediatr. Nephrol. 2001 - V.16 - P. 823-839.

104. Read S. et al. Prevalence of verocytotoxigenic E. coli in ground beef, pork and chicken in Southwestern Ontario. // Epidem. And Infect. 1990 - V. 105 -P. 11-20.

105. Reid S.D., Selander R.K., Whittam T.S. Sequence diversity of flagellin (fliC) alleles in pathogenic E. coli. Journal of bacteriology. - 1999 - V. 181 (1)-P. 153-160.

106. Rybicki E. PCR Primer Design and Reaction optimisation. In: Molecular Biology Techniques Manual, (ed. Coyne V.E., James M.D., Reid S.J.,

107. Rybicki E.P.) Departament of Molecular and Cell Biology, University of Cape Town. - 2001.

108. Rychlik W., Spencer W.J., Rlioads R.E. Optimization fo the annealing temperature for DNA ampification in vitro. // Nucleic Acids Research. -1990.-V. 18 (21).-P. 6409-6412.

109. Schoenhals G., Whitfield C. Comparative analysis of flagellin sequences from Escherichia coli strains possessing serologically distinct flagellar filaments with a shared complex surface pattern. // J. Bacteriol. 1993 - V. 175-P. 5395-5402.

110. Selander R. K., Caugant D. A., Whittam T. S. Genetic structure and variation in natural populations of Escherichia coli — 1987 P. 1625—1648.

111. Shaikh N., Tarr P. I. Escherichia coli 0157:H7 Shiga Toxin-Encoding Bacteriophages: Integrations, Excisions, Truncations, and Evolutionary Implications. // Journal of Bacteriology 2003 - V. 185, No. 12 - P. 35963605

112. Sharma V.K. Detection and quantitation of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157, Ol 11, and 026 in beef and bovine feces by real-time polymerase chain reaction. // J. Food Prot. 2002 - V.65 - P. 1371- 1380.

113. Shaw S. Identification of E. coli 0157:H7 and verotoxin-producing of E. coli 0157:NM by the WARNEXTM REAL-TIME PCR system. // MFLP. -2006-V. 12.

114. Shimada Т., Kosako Y., Isshiki Y., Hisatsune K. Enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 possesses somatic (O) antigen identical with that of Salmonella 030. //Curr. Microbiol. 1992 - V.25 - P. 215-217.

115. Son W.G., Graham Т. A., Gannon V. P. J. Immunological Characterization of Escherichia coli 0157:H7 Intimin yl. // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 2002 - V. 9, No. 1 - P. 46-53.

116. Strockbine N.A., Marques L.R., Holmes R.K., O'Brien A.D., Characterization of monoclonal antibodies against Shigalike toxin from Escherichia coli. // Infect. Immun. 1985 - V. 50 - P. 695- 700.

117. Thompson J.S., Hodge D.S., Borczyk A.A. Rapid biochemical test to identify verocytotoxin-positive strains of Escherichia coli serotype 0157. // Journal of clinical Microbiology 1990 -V. 28. - P. 2165-2168.

118. Toma C., Lu Y., Higa N., Nakasone N., Chinen I., Baschkier A., Rivas M., Iwanaga M. Multiplex PCR Assay for Identification of Human Diarrheagenic Escherichia coli. II Applied and Environmental Microbiology 2003 - V. 69, No. 9 - P. 5243-5247.

119. Torres A.G., Kaper J.B. Multiple elements controlling adherence of enterohemorragic E. coli 0157:H7 to HeLa cells. // Infect. Immun. — 2003 -V. 71 P. 4985-4995.

120. Vernozy-Rozand C. Detection of E. coli 0157:H7 and other verocytotoxin-producing E. coli in food. // J. Appl. Microbiol. 1997 — V. 82 -P. 537-356

121. Wang L., Rothemund D., Curd H., Reeves P. R. Sequence Diversity of the Escherichia coli H7 fliC Genes: Implication for a DNA-Based Typing Scheme for E. coli 0157:H7. // Journal of clinical microbiology 2000 - V. 38, No. 5-P. 1786-1790.

122. Waters J. et al. Infection caused by E. coli 0157:H7 in Alberta, Canada and in Scotland. // Clinical Infect. Dis. 1994 - V. 19 - P. 834-843.

123. Welinger-Olsson С., Kaijser В. Enterohaemorragic E. coli (EHEC). // Scand. J. Infect. Dis. 2005 - V.37 - P. 405-416.

124. Wick L. M., Qi W., Lacher D. W., Whittam T. S. Evolution of Genomic Content in the Stepwise Emergence of Escherichia coli 0157:H7. // Journal of Bacteriology 1999 - V. 181, No. 1 - P. 153-160.

125. Zhang J., Madden T.L. Power BLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. // Genome Res. 1997. - V. 7. - P. 649-656.