Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и оценка эффективности вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К

На правах рукописи

ВЕРХОВСКАЯ Анна Евгеньевна

РАЗРАБОТКА И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИН КОМБОВАК-Р И КОМБОВАК-К

16.00.03 "Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2008

003172332

Работа выполнена в Научно-производственном объединении «НАР-ВАК», г Москва

Научный руководитель: доктор биологических наук

Алипер Тарас Иванович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук

Герасимов Виктор Николаевич,

ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г Владимир

доктор биологических наук, профессор Кузнецов Дмитрий Павлович, ОАО «Покровский завод биопрепаратов», Владимирская обл , Петушинский р-н, п Вольгинский

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии им ЯР Коваленко

Защита диссертации состоится 24 июня 2008г в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220 015 01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу 600901, г Владимир, мкр Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья живот-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

ных»

Автореферат разослан » мая 2008 г

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

ГМ Семенова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Респираторные и желудочно-кишечные болезни молодняка крупного рогатого скота остаются одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии животных в большинстве стран мира, включая Россию В большинстве случаев эти заболевания имеют полиэтиологическую структуру, проявляются тяжелыми патологическими процессами и наносят значительный ущерб животноводству Ведущая роль в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота принадлежит вирусам инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагрилпа-3 (ПГ-3), вирусной диареи (ВД), респираторно-синцитиальному, peo-, рино- и аденовирусам (Сюрин В Н с соавт, 1998, Мищенко В А с соавт, 2000, и др) Вирус диареи крупного рогатого скота, рота- (РВ) и коронавирусы (KB) являются наиболее важными вирусными агентами, участвующими в развитии патологического процесса при желудочно-кишечных заболеваниях у телят (Гоголев ММ с соавт, 1989, Соколова НЛ, 1993, Жидков С А, 1994, Сатторов ИТ, 1995 и др ) Гибель животных от вирусных инфекций наблюдают, как правило, при осложнении их вторичной бактериальной микрофлорой (Высокопоясный А И с соавт, 1999, Гуненков В В с соавт, 2002 и др )

В животноводческих хозяйствах РФ все вышеперечисленные возбудители распространены практически повсеместно, вызывая появление смешанных инфекций с многообразием форм клинического проявления, что в значительной степени затрудняет их диагностику, терапию и иммунопрофилактику (Коромыслов ГФ с соавт, 1984, Сисягин ПН с соавт, 2002, Глотов А Г с соавт , 2002, К П Юров с соавт, 2003; Белова Н Б с соавт ,2003, Шеги-девич Э А с соавт, 2003, Соколова Н JI, 2003 и др) При смешанных инфекциях трудно определить ведущую роль того или иного инфекционного агента, поэтому наиболее эффективным средством профилактики таких болезней являются комбинированные (многокомпонентные) вакцины, включающие как вирусные, так и бактериальные антигены (Harkness J W et al, 1985, Pospisil Z et al, 1996, Van Oirschot J T, 1999, Hamers С et al, 2000 и др.) В

связи с этим поиск новых вакцинных препаратов, совершенствование схем и методов их применения, использование средств терапии и иммунокоррекции для профилактики респираторных и желудочно-кишечных заболеваний у телят остается актуальной проблемой ветеринарной науки и практики

В НПО «НАРВАК» (г Москва) с 1996 г выпускается комбинированная инактивированная вакцина КОМБОВАК, предназначенная для специфической профилактики шести основных вирусных болезней крупного рогатого скота (Сергеев В А, Непоклонов А Е , Алипер Т И, Патент РФ на изобретение № 2261111 от 08 04 2004) Однако в ряде животноводческих хозяйств наблюдаются преимущественно респираторные или желудочно-кишечные болезни телят В связи с этим нами были предложены два новых варианта вакцины для профилактики смешанных вирусо-бактериальных инфекций телят различной системной направленности

Цель работы. Разработка и оценка эффективности вакцин КОМБО-ВАК-Р и КОМБОВАК-К, предназначенных для специфической профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пасте-реллеза (КОМБОВАК-Р) и вирусной диареи, рота-, коронавирусной инфек-

-дий-и-эшерихиоза-теляд^КОМБОВАК-К).__

Основные задачи исследований:

1 Изучить эпизоотическую ситуацию по респираторным и желудочно-кишечным заболеваниям у телят в ряде животноводческих хозяйств Московской области

2 Разработать схему изготовления инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К и методы биологического контроля вирусных компонентов, входящих в их состав Для этого оценить специфичность производственных штаммов вирусов, получить моноспецифические гипериммунные антисыворотки, определить режим инактивации вирусов и подобрать концентрацию адъюванта в вакцине

3 В опытах на лабораторных животных определить безвредность и антигенную активность вирусных компонентов вакцин КОМБОВАК-Р и КОМ-

БОВАК-К, а также сохранность их антигенной активности при хранении

4 Изучить гуморальный иммунный ответ у крупного рогатого скота на введение препаратов КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К Определить оптимальную иммунизирующую дозу вакцин и схему их применения Оценить эффективность вакцинации глубокостельных коров и ее влияние на формирование колострального иммунитета у потомства

5 Провести оценку эффективности вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в животноводческих хозяйствах, неблагополучных по респираторным и желудочно-кишечным болезням телят

Научная новизна работы Разработаны два новых вакцинных препарата против основных респираторных и желудочно-кишечных болезней телят, различающихся по антигенному составу с учетом этиологической структуры и системной направленности, и предназначенных для специфической профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза (вакцина КОМБОВАК-Р), вирусной диареи, рота-, коронави-русной инфекций и эшерихиоза телят (вакцина КОМБОВАК-К) Показано отсутствие интерференции между вирусными и бактериальными компонентами вакцин

Практическая значимость исследований. Научно обоснованы принципы изготовления и биологического контроля инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К Экспериментально установлена иммунизирующая доза препаратов, показана их эффективность и возможность оценки на лабораторных и естественно-восприимчивых животных. Показана высокая иммуногенная активность вакцинных препаратов для стельных коров и формирование колострального иммунитета у телят Установлено, что в экспериментальных и производственных условиях вакцинация предлагаемыми препаратами обеспечивает выраженный протективный эффект, значительно снижая показатели заболеваемости и смертности телят

Указанные препараты производятся в НПО «НАРВАК» (г Москва) и применяются в соответствии с нормативной документацией, утвержденной в

установленном порядке

Основные положения, выносимые на защиту

- схема изготовления вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К и методы биологического контроля их вирусных компонентов,

- результаты исследований по изучению антигенных свойств вирусных компонентов, входящих в состав вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К, на лабораторных и естественно-восприимчивых животных,

- эффективность применения разработанных вакцин в качестве средств специфической профилактики респираторных и желудочно-кишечных болезней телят в производственных условиях

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах Международной научной конференции «Актуальные проблемы патологии животных, посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» (г Владимир, 2003), на семинарах и конференциях ветеринарных специалистов (г Уфа, 2004, г Краснодар, 2004, г Казань, 2004), научно-производственных совещаниях сотрудников НПО «НАРВАК» (2003 — 2007 гг )

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 научных

-рабо!, в юм числе две работьгв-издании^екомендованном-ВАК-РФ-

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно В выполнении отдельных этапов работы принимали участие д б н ТВ Гребенникова (раздел 221), кбн ВВ Цибезов (раздел 2 2 1), двн М К Пирожков (раздел 2 2 7), ветеринарный врач А И Кузнецова (раздел 2 3) Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи в организации и проведении исследований научному руководителю д б н Т И Алиперу и сотрудникам НПО «НАРВАК», Института вирусологии им Д И Ивановского, ФГУ «ВГНКИ»

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 стр машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка

литературы и приложения Материалы диссертации иллюстрированы 24 таблицами и 16 рисунками Список литературы включает 190 источников (67 отечественных и 123 зарубежных авторов)

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Вирусы. В работе использовали следующие вакцинные штаммы штамм В-25 вируса ИРТ, штамм В-19 вируса ГТГ-3, штамм СТ-89 вируса ВД, штамм К-88 ротавируса и штамм КВ-90 коронавируса крупного рогатого скота

Бактерии. В качестве бактериального компонента для вакцины КОМ-БОВАК-Р использовали концентрат культур Р multocida (серогруппы А, В, D) и Phaemolytica Для вакцины КОМБОВАК-К использовали концентрат культуры Е coli, содержащий соматические (09, 078, 0115), капсульные по-лисахаридные (К80, КЗО) и адгезивные антигены (К 99, F-41)

Культивирование вирусов. Вирусы ИРТ, ВД, KB и РВ выращивали в перевиваемой культуре клеток МДВК, вирус ПГ-3 - в перевиваемой культуре клеток ЛЭК Для культивирования рота- и коронавирусов в поддерживающую среду добавляли трипсин в концентрации 5 мкг/см3 среды Накопление вирусов в культуре клеток оценивали по цитопатическому эффекту, вирус ПГ-3 также по гемагглютинирующей активности с использованием эритроцитов морской свинки Титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦЦ 50/см3

Инактивация вирусов. Для инактивации вирусов использовали формалин, содержащий не менее 37% формальдегида Полноту инактивации вирусов оценивали по отсутствию их размножения в чувствительной культуре клеток в течение четырех пассажей

Референтные антисыворотки. В исследованиях использовали моноспецифические референтные антисыворотки к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД, рота -и коронавирусам крупного рогатого скота, полученные из Центральной ветеринарной лаборатории, Вейбридж, Великобритания

Гипериммунные антисыворотки. Получение моноспецифических гипериммунных антисывороток к вирусам ИРТ, ГТГ-3 и ВД крупного рогатого скота проводили по разработанной схеме

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлонн (РДП). Применяли для определения активности и специфичности антигена вируса ИРТ При постановке реакции использовали 1%-ный гель агарозы на 0,01 М трис-НС1 буфере, рН 8,0

Полнмеразная цепная реакция (ПЦР). Для идентификации вируса ВД в биологическом материале была использована «Тест-система для обнаружения вируса диареи крупного рогатого скота методом ПЦР» (НПО НАР-ВАК, Россия)

Электрофорез в ПААГ-ДСН. Анализ структурных компонентов вирусных препаратов проведен методом электрофореза белков в полиакрила-мидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН) в буферной системе U К Laemmli (1970)

Иммуноблоттинг (ИБ). Для определения антигенной активности вирусных препаратов белки после электрофоретического разделения перено-^ия1М1а-11итроцеяяюлозную-^1ембрану^<<1штоЬ11оп-К6>)--(М1Нфогег-С111А)-^-«полусухой» буферной системе (J Kyhse-Andersen, 1984)

Адъюванты. В качестве адъювантов при производстве вакцин использовали 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) и сапонин

Экспериментальные животные. В качестве лабораторных животных использовали белых мышей массой 18-20 г, морских свинок массой 350-400 г, кроликов массой 3-3,5 кг, а в качестве естественно-восприимчивых - крупный рогатый скот, сформированных в соответствующие группы по принципу аналогов Материалом для исследований служила сыворотка крови животных, в которой определяли содержание вирус-специфических антител в различных серологических тестах

Реакция нейтрализации (РН). РН ставили микрометодом в 96-луноч-ных планшетах (Nunc, Дания) по стандартной методике с постоянной дозой

соответствующего вируса (1000 ТЦД5о/см3) Вируснейтрализующий титр сыворотки выражали как предельное ее разведение, ингибирующее развитие ЦПД вируса в 50% зараженных культур клеток

Реакция гемагглютинации (РГА) и реакция торможения гемагг-лютинации (РТГА). Методы использовали для обнаружения вируса ПГ-3 и выявления специфических антител в сыворотке крови морских свинок и крупного рогатого скота Для обнаружения KB и специфических антител использовали «Набор для диагностики коронавирусного энтерита крупного рогатого скота методом гемагглютинации» (ВИЭВ им Я Р Коваленко, Россия) Реакции ставили микрометодом в полистироловых планшетах с U-образным дном с использованием эритроцитов морской свинки или мыши

Коммерческие ИФА-наборы. В опытах использовали «Набор компонентов для выявления ротавирусного антигена в фекалиях крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа» (ВИЭВ им Я Р Коваленко, Россия) Для выявления антител к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД, KB и РВ крупного рогатого скота использовали ИФА-наборы соответствующей специфичности (SVANOVA, Швеция)

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программы Excel для Windows Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала Вероятность различий считалась существенной при Р < 0,05

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Серологический мониторинг вирусных инфекций крупного рогатого скота в хозяйствах Московской области

При анализе эпизоотической ситуации по ИРТ, ПГ-3 и ВД в отдельных хозяйствах Московской области (п=7) учитывали отчеты ветеринарных служб обследованных хозяйств, наличие клинических признаков и патолого-анатомических изменений у животных, а также результаты собственных се-

рологических исследований

Результаты серологического исследования показали, что из 135 обследованных голов крупного рогатого скота, антитела к вирусу ИРТ были обнаружены у 87 (64%), к вирусу ПГ-3 - у 93 (68,9%), к вирусу ВД - у 82 (60,7%) животных При этом во всех хозяйствах у 32 - 61% обследованных животных были выявлены вируснейтрализующие антитела к двум или трем возбудителям одновременно, что указывает на необходимость применения поливалентных вакцин в системе противоэпизоотических мероприятий

2.2. Разработка схемы изготовления и методы биологического контроля вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К

2 21 Характеристика производственных штаммов вирусов, используемых для производства вакцин Основным методом идентификации всех производственных штаммов вирусов крупного рогатого скота была РН с использованием моноспецифических референтных антисывороток Кроме того, специфичность вируса ИРТ подтверждали в РДП, вируса ПГ-3 и KB - в РТГА и в иммуноблоттинге, вируса ВД - в ПЦР и РВ - в ИФА (табл 1)

Таблица 1.

_Оценка специфичности производственных штаммов вирусов, входящих

в состав вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К

Метод идентификации Вирусы

ИРТ ПГ-3 ВД РВ KB

РН* + + + + +

РДП* + - - - -

РТГА* - + - - +

ПЦР - - + - -

ИФА - - - + -

ИБ* - + - - +

Примечание «+»- означает положительный результат идентификации вируса соответствующим методом, «-»- исследование не проводилось, * - в данном методе использованы референтные антисыворотки соответствующей специфичности

В РДП вирус ИРТ с титром инфекционной активности 7,6 ^ ТЦЦ<о/см3 формировал видимый преципитат с гомологичной референтной антисывороткой в разведении 1 8 Моноспецифичность вируса была подтверждена отсутствием реакции с референтными антисыворотками к гетерологичным ви-

русам крупного рогатого скота

Параллельно с РН антиген вируса ПГ-3 был исследован в РТГА Гомологичная референтная антисыворотка тормозила развитие гемагглютинации вируса ПГ-3 в титре 1 1024

Вирус ВД, кроме РН, идентифицировали с помощью ПЦР Геномная РНК вакцинного штамма СТ-89 соответствовала геному вируса ВД

Коронавирус крупного рогатого скота проверяли с помощью набора для РТГА Исследуемый антиген агглютинировал эритроциты мыши в титре 1 128, а в РТГА с положительной референтной антисывороткой давал задержку гемагглютинации в титре 1 160

В ИБ испытуемые препараты ПГ-3 и КВ при взаимодействии с референтной антисывороткой формировали четкие окрашенные полосы в соответствующих зонах миграции

Идентификацию ротавируса крупного рогатого скота помимо РН проводили в ИФА При учете полученных результатов было установлено, что значение ОП 450 в лунках с испытуемым РВ-антигеном соответствовало показателям ОП 450 положительных контролей

Таким образом, в результате проведенных исследований была подтверждена идентичность производственных штаммов вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД, РВ и КВ и сделан вывод о том, что данные штаммы можно использовать в дальнейшей работе

2 2 2 Получение и гшмунохимическая характеристика гипериммунных антисывороток к производственным штаммам вирусов В результате проведенных экспериментов была разработана схема иммунизации кроликов концентрированными вирусными антигенами и получен набор моноспецифических гипериммунных антисывороток (ГИС) к вирусам ИРТ, ПГ-3 и ВД (табл 2) для дальнейшего контроля специфичности вирусных компонентов вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К

Таблица 2.

Оценка содержания вирус-специфических антител в ГИС

Метод определения Титр антител к вирусам

ПГ-3 ИРТ ВД

ГИС Референс-антисыворотка ГИС Референс-антисыворотка ГИС Референс-антисыворотка

РН 1 512 1 2048 1 1024 1 320 1 1024 1 1280

РТГА 1 64 1 1024 - - - -

РДП - - 1 16 1 2 - -

2 2 3 Определение режима инактивации вирусов формалином В качестве инактиванта вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД, РВ и КВ использовали формальдегид в различных концентрациях Инактивацию проводили при 37°С в течение 24, 48 и 72 час Полноту инактивации вирусов определяли по отсутствию их размножения в культуре клеток МДВК в течение 4-х пассажей (табл 3)

Таблица 3.

Результаты определения режима инактивации вирусов формалином

Вирус Концентрация формальдегида, % Экспозиция при 37°С, час

24 48 72

0,1 + + +

ИРТ 0,2 + + +

0,3 + + -

ВД ПГ-3 од +

0,2 -/-

0,1 + ■

0,2 - -/-

РВ 0,1 ■ + -/-

0,2 + - -/-

КВ 0,1 + + -/-

0,2 + - -/-

Примечание «+»- означает наличие остаточной инфекционности вируса, «-»- вирус

инактивирован полностью, «-/-» - исследование не проводилось

Как видно из данных табл 3, формальдегид полностью инактивировал вирус ИРТ в концентрации 0,3% при экспозиции 72 час ; вирус ВД - в концентрации 0,1% при экспозиции 48 час и 0,2% при экспозиции 24 и 48 час , вирус ПГ-3 - в концентрации 0,2% при экспозиции 24 и 48 час , рота- и коро-

навирус - в концентрации 0,2% при экспозиции 48 час

22 4 Определение оптимальной концентрации адъюванта Для определения оптимальной концентрации ГОА были приготовлены экспериментальные серии вакцины КОМБОВАК-Р против респираторных инфекций телят и вакцины КОМБОВАК-К против инфекций желудочно-кишечного тракта телят, в состав которых вошли вирусы и бактерии соответствующей направленности Приготовили несколько вариантов с различным содержанием ГОА В контроле вместо бактериального компонента в том же объеме добавили физиологический раствор, ГОА - 10% от общего объема препарата Для приготовления всех вариантов вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К использовали вирусные компоненты, полученные в одно время, с определенной инфекционной активностью и инактивированные формалином в определенном ранее режиме В каждом варианте вакцины вирусы содержались в одинаковых соотношениях В качестве экспериментальной модели использовали морских свинок, сформированных в группы (п=10 в каждой группе), которых иммунизировали изготовленными вариантами вакцин подкожно однократно в дозе 1,0 см3 Взятие крови проводили на 21 сутки после инъекции вакцины, полученные сыворотки крови исследовали в РН (табл 4,5)

Таблица 4.

Антигенная активность вирусных компонентов, входящих в состав

различных вариантов вакцины КОМБОВАК-Р

Концентрация ГОА, % № группы Титр вируснейтрализующих антител *, (М ± т)

ИРТ пг-з вд

10 I 20,8 ± 6,7 12,8 ±4,3 64,0 ± 3,9

20 II 32,0 ± 0 38,4 ±4,3** 134,4 ± 17,9**

30 III 14,4 ±3,5 28,8 ±7,1** 51,2 ±7,5

контроль IV 22,4 ± 8,7 14,4 ±3,5 57,6 ±4,2

Примечание- * - здесь и далее в таблицах и рисунках татры антител приведены в обратных величинах, ** - статистическая достоверность различий по отношению к контрольной группе, Р < 0,05

Сравнительный анализ полученных результатов позволил заключить, что оптимальная концентрация ГОА при изготовлении вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К должна составлять 20% от общего объема препарата Кроме того, показано, что добавление бактериальных компонентов к вирус-

ным вакцинам не влияет на антигенные свойства вирусных компонентов, входящих в их состав

Таблица 5.

Антигенная активность вирусных компонентов, входящих в состав _различных вариантов вакцины КОМБОВАК-К_

Концентрация ГОА, % № группы Титр вируснейтрализующих антител *, (М ± т)

ВД РВ КВ

10 I 57,6 ± 14,3 140,8 ±17,1 140,8 ± 17,1

20 II 140,8 ± 17,1** 204,8 ± 17,6** 179,2 ± 14,5**

30 III 121,6 ± 18,5 ** 108,8 ±14,2 140,8 ±17,1

контроль IV 76,8 ± 12,8 153,6 ±15,7 115,2 ±28,6

2 2 5 Изготовление опытных серий вакиин КОМБОВАК-Р и КОМБО-ВАК-К На основе полученных данных были изготовлены опытные серии вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К В состав первой вошли вирусы ИРТ, ПГ-3, ВД и концентрат культур Р multocida и Р haemolytica, в состав второй - вирусы ВД, РВ, КВ и концентрат культуры Е coli

При проведении технологических производственных мероприятий вирусные антигены выращивали в перевиваемой культуре клеток МДВК (ИРТ, ВД, РВ и КВ) и ЛЭК (ПГ-3) Инфекционная активность вирусов, использованных для изготовления препаратов, составляла не менее 7,5 lg ТЦЦ5о/см3 Вирусы инактивировали формалином в ранее установленных режимах

Инактивированные вирусные и бактериальные1 компоненты смешивали с ГОА (20% от общего объема), добавляли сапонин в концентрации 500 мг/л (аналогично технологии изготовления прототипной вакцины КОМБО-ВАК) и мертиолят натрия в концентрации 1 10000 в качестве консерванта Концентрация вирусных антигенов в готовых препаратах составила не менее 7,0 lg ТЦЦ5о/см3, концентрация пастерелл в вакцине КОМБОВАК-Р составила 9 млрд мтв дозе (шт Р multocida 8683 (тип А), 1231 (тип А),656 (тип В), Т-80 (тип D), Р haemolytica 169 в равных количествах), концентрация Ecoli (антигены* соматические 09, 078, 0115,капсулъные полисахаридные К 80, К 30, адгезивные К 99, F-41) составила 60 млрд м.т в дозе

1 производства ФГУП «Армавирская биофабрика»

Каждую опытную серию вакцины проверяли на стерильность путем высева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро, а также исследовали на полноту инактивации вирусных компонентов путем проведения четырех последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток МДВК

Готовые препараты проверяли на безвредность в опытах на белых мышах и морских свинках Морским свинкам (п=5) вакцину вводили подкожно в дозе 1,0 см3, белым мышам (п=5) - внутрибрюшинно в дозе 0,2 см3 За привитыми животными наблюдали в течение 10 дней Опытные серии вакцин были безвредными, не вызывали общей температурной и местных воспалительных реакций, и все животные оставались здоровыми в течение срока наблюдения

2 2 6 Контроль антигенной активности вирусных компонентов вакцин Антигенную активность вирусных компонентов препарата КОМБОВАК-Р определяли на морских свинках Для определения иммунизирующей дозы вакцины КОМБОВАК-Р использовали 3 группы морских свинок по 10 голов в каждой Морских свинок прививали однократно подкожно животных 1-ой группы - в дозе 0,25 см3, животных П-ой группы - в дозе 0,5 см3, животных Ш-ей группы - в дозе 1,0 см3 Контролем служили 5 неиммунных морских свинок У всех животных через 21 сут после иммунизации исследовали сыворотку крови на наличие антител к вирусам ИРТ, ВД в РН, к вирусу ПГ-3 -в РТГА (табл 6)

Таблица 6

Уровень антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных

вакциной КОМБОВАК-Р в различных дозах

Группа жив-х Доза препарата, см3 Титр антител к вирусам, М±ш

ИРТ (РН) ПГ-3 (РТГА) ВД(РН)

I 0,25 0 19,2 ±7,1 51,2 ±7,2

II 0,5 54,0 ±5,5 80,0 ± 3,2 96,0 ± 10,7

III 1,0 13,3 ±4,6 10,6 ±0,9 213,3 ±27,3

контроль - 0 0 0

Из данных, приведенных в таблице 6, видно, что вакцины в дозе 0,25

см3 оказалось недостаточно, а доза 1,0 см3 оказалась избыточной для формирования выраженного иммунного ответа к вирусам ИРТ и ПГ-3. При этом титр антител к вирусу ВД прямо пропорционально зависел от дозы введенного препарата Таким образом, на основании сравнительного анализа полученных результатов, оптимальной иммунизирующей дозой вакцины, была выбрана доза равная 0,5 см3

Определение антигенной активности вирусных компонентов препарата КОМБОВАК-К проводили по аналогичной схеме (табл 7)

Таблица 7.

Уровень антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных

вакциной КОМБОВАК-К в различных дозах

Группа жив-х Доза препарата, см3 Титр вируснейтрализующих антител, М±т

ВД РВ KB

I 0,25 28,8 ±2,1 35,2 ±1,7 86,4 ±5,7

II 0,5 120,4 ±13,2 192,5 ±18,5 160,2 ± 14,5

III 1,0 104,0 ± 14,8 160,0 ±16,4 183,0 ±19,2

контроль - 0 0 0

Из приведенных в таблице 7 данных видно, что введение морским -свинкам-вакцины-КОМБОВАК-1^в^цозах-0г5-и410-см1-вызывает-образовани{> антител ко всем вирусным антигенам приблизительно на одном уровне При введении вакцины в дозе 0,25 см3 уровень антител в 3-4 раза ниже, чем у животных П-ой и Ш-ей групп Таким образом, доза 0,5 см3 является оптимальной для контроля антигенной активности вакцин на морских свинках

227 Контроль иммуногенной и антигенной активности бактериальных компонентов вакцин При проведении испытаний вакцину КОМБОВАК-Р вводили внутримышечно кроликам (п=5) в дозе 1,5 см3, через 30-35 сут инъекцию повторяли, удваивая дозу Через 14 сут после последней инъекции вакцины у кроликов отбирали пробы крови, полученные сыворотки крови смешивали в равных объемах и сборную пробу вводили подкожно белым беспородным мышам в дозе 0,5 см3 Через сутки 10 иммунизированных и 10 контрольных мышей заражали вирулентным штаммом Pmultocida №1231

(тип А) в дозе 5 LD50 В течение 7 сут все контрольные мыши погибали, а 90% опытных животных остались живыми

Для определения антигенной активности адгезивных антигенов Е coli в вакцине КОМБОВАК-К, препарат вводили кроликам (п=5) однократно подкожно в дозе 1,0 см3 Через 21 сут сыворотку крови от каждого животного исследовали на наличие антител к адгезивным антигенам К99, F-41 в реакции агглютинации Реакцию оценивали в крестах по общепринятой методике В результате исследований было установлено, что у большинства (85-95%) им-муннизированных животных титр специфических антител в сыворотке крови превышал значение 1 200 при оценке реакции не ниже чем в два креста

Иммуногенную активность вакцины КОМБОВАК-К по отношению к соматическим антигенам Ecoh проверяли на белых беспородных мышах массой 18-20 г, которым подкожно двукратно с интервалом 10 сут вводили испытуемый препарат в дозе 0,1 см3 На каждый эксперимент брали по 20 опытных и по 20 контрольных (неиммунизированных) животных Через 18 сут после повторной инъекции вакцины мышей заражали внутрибрюшинно оттитрованной летальной дозой двух штаммов Ecoli серогрупп 078 и 0115 На штамм каждой серогруппы использовали 10 вакцинированных и 10 контрольных животных В течение 7-12 сут в среднем 90% контрольных мышей погибали, а 85% опытных животных оставались живыми

2 2 8 Контроль антигенной активности вирусных компонентов вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в процессе хранения Необходимым условием внедрения в практику новых вакцинных препаратов является сохранность их активности в процессе хранения Поэтому мы определяли антигенную активность вирусных компонентов опытных серий вакцин в процессе их хранения в течение 12 месяцев при температуре 4°С Для этого морских свинок (п=10 в каждом опыте) иммунизировали испытуемой вакциной, хранившейся 3, 6, 9 и 12 мес, однократно подкожно в дозе 0,5 см3 Через 21 сут после вакцинации сыворотку крови животных исследовали в РН (рис 1)

Рисупок 1. Содержание ВНА в сыворотке крови животных, иммунизированных вакцинами КОМБОВАК-Р (А) и КОМБОВАК-К (В) в различные сроки хранения

Из приведенных данных видно, что при хранении препаратов при 4°С антигенная активность вирусных компонентов вакцин снижается незначительно Введение препаратов через 3, 6, 9 и 12 мес после изготовления приводит к формированию выраженного гуморального иммунного ответа у морских свинок, который характеризуется высоким содержанием ВНА к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД, РВ и КВ соответственно

2.3. Оценка антигенной активности и определение оптимальной иммунизирующей дозы вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К для крупного рогатого скота

2 3 1 Оиент гуморального иммунного ответа у стельных коров и телят, иммунизированных вакциной КОМБОВАК-Р Для оценки антигенной активности вирусных компонентов вакцины КОМБОВАК-Р и определения иммунизирующей дозы препарата были использованы 3 группы глубокостельных коров (п=20 в каждой группе), которых иммунизировали за 40-50 суток до предполагаемого отела внутримышечно в дозах 2,0, 3,0, и 5,0 см3 соответственно Второй эксперимент был поставлен на телятах в возрасте 40-50 сут, полученных от невакцинированных матерей, сформированных также в 3 группы по 20 голов в каждой Животных каждой группы вакцинировали внутримышечно в дозах 1,0, 2,0, и 3,0 см3 соответственно Ревакцинацию ко-

ров и телят проводили через 14 суток после первой иммунизации в тех же дозах Перед каждым введением препарата и через 21 сутки после 2-й вакцинации у всех животных брали кровь и определяли уровень вирус-специфических антител в сыворотке крови методами РН и ИФА (табл 8,9)

Таблица 8.

Уровень специфических вируснейтрализующих антител в сыворотке _крови коров после иммунизации вакциной КОМБОВАК-Р_

Группа животных Доза вакцины, см3 Титр вируснейтрализующих антител*, М±т

К вирусу До вакцинации Через 14 сут после 1-й вакцинации ** Через 21 сут после 2-й вакцинации **

I 2,0 ИРТ 64,9 ±8,1 176,3 ± 15,3 181,3 ±10,3

ПГ-3 64,6 ± 4,9 156,4 ±25,5 170,7 ±39,5

вд 30,2 ± 8,3 346,1 ± 18,8 391,1 ±29,6

II 3,0 ИРТ 57,3 ± 6,6 234,7 ±31,1 209,1 ±16,2

ПГ-3 54,9 ±5,2 241,8 ±18,8 233,2 ±25,3

вд 28,6 ±2,2 412,4 ±26,9 412,5 ±18,2

III 5,0 ИРТ 55,4 ±4,8 102,8 ±26,1 136,6 ± 18,5

ПГ-3 57,1 ±8,6 182,2 ± 16,4 211,7 ±27 8

вд 18,5 ±7,4 507,1 ±33,0 339,7 ±25,5

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что на 21-е сутки после второй вакцинации глубокостельных коров вакциной КОМБОВАК-Р, титр ВНА к вирусу ИРТ вырос в 2,8 раза при введении препарата в дозе 2 см3, в 3,6 раза - при введении препарата в дозе 3 см3 и в 2,4 раза - при введении препарата в дозе 5 см3 В среднем по группам титр составил 1 181,3, 1 209,1 и 1 136,6 соответственно Уровень ВНА к вирусу ПГ-3 увеличился в 2,6 раза при введении препарата в дозе 2 см3, в 4,2 раза - 3 см3, в 3,7 раза - 5 см3 и составил 1 170,7, 1 233,2 и 1 211,7 соответственно Титр ВНА к вирусу ВД вырос в 12,9 раза при введении препарата в дозе 2 см3, в 14,4 раза- 3 см3, в 18,4 раза- 5 см3 и составил 1 391,1, 1 412,5 и 1 339,7 соответственно Результаты ИФА подтвердили результаты РН (г=0,82, Р < 0,05) Таким образом, для практического применения для стельных коров была выбрана доза 3 см3

Таблица 9.

Уровень специфических антител в сыворотке крови телят после иммунизации вакциной КОМБОВАК-Р

Группа жив-х Доза вакцины, см3 Титр вируснейтрализующих антител*, М±т

К вирусу До вакцинации Через 14 сут после 1-й вакцинации ** Через 21 сут после 2-й вакцинации **

I 1,0 ИРТ 1,1 ±3,0 12,5 ±1,1 85,7 ±3,1

ПГ-З 5,7 ±6,9 18,3 ± 5,2 117,1 ± 17,9

ВД 2,6 ±2,1 53,7 ±15,1 401,7 ±38,0

II 2,0 ИРТ 7,0 ±8,8 76,0 ± 9,4 205,0 ± 33,7

ПГ-З 5,0 ±9,5 36,5 ± 8,7 294,0 ± 24,5

ВД 5,0 ±7,3 96,0 ±21,9 664,0 ± 52,9

III 3,0 ИРТ 6,2 ±2,3 71,2 ± 12,2 198,3 ±23,5

ПГ-З 6,2 ±6,8 35,1 ± 16,3 288,3 ±21,3

ВД 3,9 ± 1,5 96,2 ± 11,2 506,1 ±48,6

Данные таблицы 9 свидетельствуют о том, что вакцинация телят вакциной КОМБОВАК-Р привела к формированию выраженного иммунного ответа и статистически достоверному приросту антител (Р <0,01) Максимальное содержание антител к вирусам ИРТ, ПГ-З и ВД было зарегистрировано на 21-е сутки после второй вакцинации каждой из трех испытуемых доз вводимого препарата Однако наиболее высокий титр, как вируснейтрали-зующих антител, так и всего пула специфических антител выявляемого в ИФА, был зафиксирован у телят при введении вакцины КОМБОВАК-Р в дозе 2 см3 (доза для практического применения) При этом установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью РН и ИФА (г=0,88, Р < 0,05)

2 3 2 Опенка гуморального иммунного ответа у стельных коров, иммунизированных вакциной КОМБОВАК-К Антигенную активность вирусных компонентов вакцины КОМБОВАК-К и определение иммунизирующей дозы препарата проверяли ^а глубокостельных коровах Схема опыта была аналогична описанной в п п 23 1 Результаты исследований приведены в табл 10

Таблица 10.

Уровень вируснейтрапизующих антител в сыворотке крови коров __после иммунизации вакциной КОМБОВАК-К_

Группа жив-х Доза вакцины, см3 Титр вируснейтрализующих антител*, М±т

К вирусу До вакцинации Через 14 сут после 1-й вакцинации ** Через 21 сут после 2-й вакцинации **

I 2,0 вд 26,2 ± 2,3 254,3 ± 15,6 310,2± 15,0

кв 25,9 ± 6,8 428,4 ± 16,8 514,5 ±22,0

РВ 19,6 ± 11,5 684,1 ±21,3 870,6 ± 27,9

II 3,0 ВД 18,9 ±6,4 476,7 ±30,1 512,0 ±21,3

КВ 29,0 ±5,6 1351,6 ± 14,0 1792,6 ± 19,1

РВ 23,6 ± 2,9 961,3 ±26,2 1229,0 ±31,4

III 5,0 ВД 23,5 ± 5,3 383,1 ±20,1 258,0 ±35,1

КВ 26,7 ±8,1 898,2 ± 10,9 717,2 ± 14,9

РВ 21.9 ±6,3 872,1 ±25,4 1024,3 ± 12,9

Полученные нами данные показали, что после применения вакцины КОМБОВАК-К титр антител к вирусу ВД в сыворотке крови коров при введении препарата в дозе 2 см3 достоверно увеличился в 11,8 раз, при введении препарата в дозе 3 см3 - в 27 раз и при введении препарата в дозе 5 см3 - в 10,9 раз Титр антител к коронавирусу вырос в 19,8 раз при вакцинации в дозе 2 см3, в 61,8 раз - в дозе 3 см3, в 26,8 раз - в дозе 5 см3 Уровень антител к ротавирусу увеличился в 44,4 раза при введении препарата в дозе 2 см3, в 52 раза - в дозе 3 см3, в 46,7 раза - в дозе 5 см3

В результате проведенных исследований было установлено, что наиболее выраженный иммунный ответ ко всем трем вирусным компонентам вакцины КОМБОВАК-К наблюдался у стельных коров, вакцинированных в дозе 3 см3, при этом титр антител был в 2-3 раза выше, чем при иммунизации животных препаратом в дозе 2 см3 Увеличение дозы с 3 до 5 см3 не оказывало существенного влияния на прирост специфических антител в сыворотке крови иммунизированных животных Таким образом, доза 3 см3 была признана оптимальной для практического применения

2 3 3 Оценка колострального иммунитета у новорожденных телят Применение вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К направлено, в первую очередь, на создание колострального иммунитета у новорожденных телят,

поэтому важно было оценить не только иммунный ответ у вакцинированных коров, но и уровень колостральных антител у потомства

В эксперименте были использованы 7-14 дневные телята (п=55), рожденные от коров иммунизированных различными дозами вакцин КОМБО-ВАК-Р и КОМБОВАК-К, контролем служили телята аналогичного возраста (п=10) полученные от невакцинированных коров Все опытные и контрольные телята своевременно получали молозиво от своих матерей в течение первых двух часов после рождения и содержались в одинаковых условиях Оценку колострального иммунитета проводили путем определения титра ВНА в сыворотке крови всех опытных и контрольных животных (табл И, 12) Помимо РН, содержание специфических антител к вирусам ИРТ, ПГ-3 и ВД крупного рогатого скота определяли в ИФА

Таблица 11.

Уровень колостральных антител у 7-14 дневных телят, полученных

Группа животных Доза вакцины, см3 Титр ВНА к вирусу*, М±т

ИРТ ПГ-3 вд

опыт 2,0 169,5 ±25,6** 155,3 ±32,1** 340,8 ±15,6**

3,0- 214,1 + 15,2** 205,5± 29,7** 4*5 V- ± 16,9**

5,0 115,3 ±26,3** 180,6 ±35,0** 340,1 ±20,8**

контроль - 35,6 ± 9,8 42,9 ± 3,3 8,9 ±2,6

Таблица 12.

Уровень колостральных антителу 7-14 дневных телят, полученных

Группа животных Доза вакцины, см3 Титр ВНА к вирусу*, М±ш

вд КВ РВ

опыт 2,0 256,5 ±32,8** 597,2 ± 22,7** 597,9 ± 16,4**

3,0 704,3 ±24,2** 768,2 ± 12,8** 1067,0 ± 13,7**

5,0 340,9 ±25,3** 870,5 ± 36,8** 640,5 ±11,8**

контроль - 12,6 ±2,8 14,9 ±6,3 8,1 ±4,6

Сравнительный анализ содержания колостральных антител в сыворотке крови телят, получавших молозиво от вакцинированных коров (опыт), и телят, получавших молозиво от невакцинированных животных (контроль), показал, что титр специфических сывороточных антител ко всем вирусам у

телят опытной группы был значительно выше, чем у телят контрольной (Р < 0,01) Результаты ИФА подтвердили результаты РН (г=0,82, Р < 0,05) Самые высокие титры антител отмечали у телят, получавших молозиво от матерей, иммунизированных испытуемыми вакцинами в дозе 3 см3

Установлена высокая степень коррелятивной зависимости между содержанием вирус-специфических колостральных антител в сыворотке крови 7-14-дневных телят и титром вирус специфических антител в сыворотке крови вакцинированных матерей (i=0,79, Р < 0,05)

2.4. Эффективность использования вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в производственных условиях

Эффективность разработанных вакцин изучали в производственном опыте в четырех хозяйствах Московской области, неблагополучных по респираторным и желудочно-кишечным болезням молодняка крупного рогатого скота В каждом хозяйстве опыт проводили на фермах с самым высоким процентом заболеваемости, гибели и выбраковки молодняка (опытные) На одной из ферм каждого хозяйства испытания не проводились, и животные данной фермы являлись контрольными

2 41 Испытание эффективности инактивированной комбинированной вакиины против инфекционного ринотрахеита. парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза телят (КОМБОВАК-Р) Для профилактики респираторных болезней телят использовали вакцину КОМБОВАК-Р При проведении опытов вакцинировали а) глубокостельных коров с целью формирования колострального иммунитета у потомства и б) телят старше 1,5 мес возраста Глубокостельным коровам вакцину вводили внутримышечно двукратно в дозе 3 см3 Первую вакцинацию проводили за 45-60 сут до отела, вторую - через 10-14 сут В течение года было вакцинировано 448 глубокостельных коров, количество контрольных животных составляло 175 голов Телят в возрасте 1,5-4 мес возраста вакцинировали дважды в дозе 2 см3 с интервалом 20-25 сут Телят старше 4 мес возраста вакцинировали двукратно в дозе 3 см3 с интервалом 3-4 недели В экспериментах было задействовано 435

телят, контролем служили 146 телят

Эффективность вакцины определяли по эпизоотологическим показателям снижению уровня заболеваемости телят респираторными болезнями, а также по снижению процента их гибели и вынужденной выбраковки

По результатам исследований было установлено, что заболеваемость новорожденных телят респираторными болезнями на опытных фермах снизилась в среднем с 62 до 19%, гибель и вынужденная выбраковка телят снизилась с 9,3% до 2,6%, тогда как на контрольных фермах аналогичные показатели составили 53% и 8,1% соответственно

2 4 2 Испытание эффективности инактивированной комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят (КОМБОВАК-Ю Для профилактики желудочно-кийц1шечных инфекций новорожденных телят использовали вакцину КОМ-БОВАК-К Вакцинировали глубокостельных коров с целью создания напряженного колострального иммунитета у потомства Вакцину вводили внутримышечно двукратно в дозе 3 см3 первый раз за 45-60 сут до отела, второй раз - через 10-14 сут Эпизоотологическую эффективность вакцины определяли по снижению уровня заболеваемости новорожденных телят желудочно-кишечными болезнями, а также по снижению процента гибели и выбраковки телят В течение года было вакцинировано 815 глубокостельных коров и нетелей, контролем служило 348 невакцинированных животных

По результатам исследований было установлено, что после применения вакцины заболеваемость новорожденных телят желудочно-кишечными болезнями на опытных фермах снизилась в среднем с 68 до 23%, гибель и выбраковка телят снизилась с 8,6% до 3,2%, тогда как в контрольных группах средние показатели заболеваемости и смертности телят по причине желудочно-кишечных болезней составили 56% и 9,4% соответственно

3. ВЫВОДЫ

1 Серологическими методами установлена циркуляция вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи крупного рога-

того скота в животноводческих хозяйствах Московской области При этом во всех семи хозяйствах у 32-61% обследованных животных были выявлены вируснейтрализующие антитела к двум или трем возбудителям одновременно

2 Для специфической профилактики респираторных и желудочно-кишечных болезней крупного рогатого скота разработана схема изготовления инактивированных комбинированных вакцин против инфекционного ринот-рахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза телят (КОМБОВАК-Р) и против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят (КОМБОВАК-К)

3 Подтверждена специфичность производственных штаммов вирусов, входящих в состав вакцин КОМБОВАК, КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К Получены и охарактеризованы моноспецифические гипериммунные сыворотки к вирусам инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи крупного рогатого скота Для производства безопасных и иммуноген-ных препаратов определены режимы инактивации вирусов и концентрация адъюванта в вакцинах

4 В опытах на лабораторных животных установлено, что разработанные вакцины безвредны, обладают выраженной антигенной активностью и индуцируют формирование гуморального иммунного ответа у морских свинок и кроликов, а также сохраняют свою активность в течение всего срока хранения

5 В экспериментальных условиях на естественно-восприимчивых животных установлены схемы применения и определена оптимальная иммунизирующая доза инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К для стельных коров, составляющая 3,0 см3 При этом двукратная иммунизация коров вакцинами КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К приводит к увеличению титра вируснейтрализующих антител ко всем вирусным компонентам вакцин в 3-4 раза и в 10 и более раз соответственно Для телят оптимальная иммунизирующая доза вакцины КОМБОВАК-Р составила

2,0 см3 Двукратная вакцинация телят препаратом КОМБОВАК-Р приводит к увеличению титра вируснейтрализующих антител к возбудителям инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи крупного рогатого скота в 7 и более раз

6 Вакцинация стельных коров препаратами КОМБОВАК-Р и КОМБО-ВАК-К приводит к формированию выраженного колострального иммунитета у потомства Уровень вирус-специфических антител в сыворотке крови 7-14 дневных телят, полученных от вакцинированных матерей, более чем в 5 раз превышает аналогичные показатели у телят, полученных от невакцинирован-ных животных

7 В производственных условиях установлена профилактическая эффективность вакцинации стельных коров и телят разработанными вакцинами В результате использования инактивированной комбинированной вакцины КОМБОВАК-Р в неблагополучных хозяйствах уровень заболеваемости респираторными болезнями снизился в 3,3 раза, процент гибели и вынужденной выбраковки телят - в 3,6 раза Вакцинация глубокостельных коров инактивированной комбинированной вакциной КОМБОВАК-К и своевременная импойтся мопотира новорожденным телятам позволила снизить уровень заболеваемости молодняка желудочно-кишечными болезнями в 3 раза, процент гибели и выбраковки телят - в 2,7 раза

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы исследований по разработке и применению вакцин КОМ-БОВАК-Р и КОМБОВАК-К вошли в следующие нормативные документы

- Извещение №1 0б изменении ТУ 9384-003-42418073-01 «Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синтициальной, рота- и коро-навирусной болезней телят (КОМБОВАК)» от 01 03 2001 г, согласовано с Департаментом ветеринарии МСХ РФ 02 02 2004,

- Инструкция по применению вакцины инактивированной комбинированной против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи

и пастереллеза телят (КОМБОВАК-Р), утверждена Россельхознадзором 30 03 2007,

- Инструкция по применению вакцины инактивированной комбинированной против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшери-хиоза телят (КОМБОВАК-К), утверждена Россельхознадзором 30 03 2007 5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Хитрова, А Е Профилактика заболеваний органов дыхания и пищеварения телят с использованием вакцины КОМБОВАК в хозяйствах промышленного типа / А Е Хитрова, М И Швыдкова // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» - Воронеж, 2002 - С 613-614

2 Хитрова, А Е Получение и характеристика гипериммунных сывороток к вирусам инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота / А Е Хитрова, О А Верховский, И В Непоклонова // Материалы международной научной конференции, посвященной 45-летию ФГУ «ВНИ-ИЗЖ» «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» - Владимир, 2003 -С 222-226

3 Хитрова, А Е Оценка антигенной активности вирусных компонентов опытной серии вакцины «КОМБОВАК-К» на лабораторных животных / А Е Хитрова // Материалы Международной научной конференции, посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» - Владимир, 2003 -С. 438-440

4 Хитрова, А Е Антигенная активность вакцин Комбовак-Р и Комбо-вак-К / А Е Хитрова, Г Л Соболева, В А Сергеев, Т И Алипер, И В Непоклонова // Ветеринария -2004 - №11 -С 21-24

5 Хитрова, А Е Эффективность применения комбинированных вакцин серии КОМБОВАК / А Е Хитрова, В А Сергеев, Т И Алипер, О А Верховский//Ветеринария -2006 -№9 - С 17-20

Подписано в печать 16 05 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 429 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Респираторные и желудочно-кишечные болезни молодняка крупного рогатого скота продолжают оставаться одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии животных в большинстве стран мира, включая Россию. Они имеют массовый характер, сопровождаются высокой заболеваемостью и смертностью телят и наносят значительный экономический ущерб животноводству. В большинстве случаев эти заболевания имеют сложную этиологическую структуру, проявляются в форме тяжелых патологических процессов и развиваются на фоне выраженных иммунодефицитных состояний. Ведущая роль в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота принадлежит вирусам инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальному вирусу, рео-, рино- и аденовирусам. Гибель животных от респираторных болезней наблюдается, как правило, при осложнении вирусной инфекции вторичной микрофлорой (Сюрин В.Н. с соавт., 1998; Высокопоясный А.И. с соавт., 1999; Grooms D.L., 1998 и др.).

Эпизоотологический мониторинг показывает, что вирус диареи крупного рогатого скота, рота- и коронавирусы являются наиболее важными вирусными агентами, участвующими в развитии патологического процесса при желудочно-кишечных заболеваниях у телят (Гоголев М.М.и др., 1989; Соколова Н.Л., 1993; Жидков С.А., 1994; Сатторов И.Т., 1995 и др.). Течение этих вирусных инфекций, как правило, осложняется энтеротоксигенными E.coli, которые выделяются взрослыми животными и попадают в кишечник новорожденных телят (Гаффаров Х.З. с соавт., 2002; Гуненков В.В с соавт., 2002 и др.). В животноводческих хозяйствах РФ вышеперечисленные возбудители распространены практически повсеместно, вызывая появление смешанных инфекций с многообразием форм клинического проявления, что в значительной степени затрудняет их диагностику, терапию и иммунопрофилактику

Коромыслов Г.Ф. с соавт., 1984; Мищенко В.А. с соавт., 2000; Никулин Д.М., 2001; Сисягин П.Н. с соавт., 2002; Глотов А.Г. с соавт., 2002; К.П.Юров с соавт., 2003; Белова Н.Б. с соавт.,2003; Шегидевич Э.А. с соавт., 2003; Соколова H.JL, 2003 и др.). При смешанных инфекциях трудно определить ведущую роль того или иного инфекционного агента, поэтому наиболее эффективным средством профилактики таких болезней являются комбинированные (многокомпонентные) вакцины, включающие как вирусные, так и бактериальные антигены (Harkness J.W.et al., 1985; Pospisil Z. et al., 1996; Van Oirschot J.T., 1999; Hamers C. et al., 2000 и др).

Разработка новых вакцинных препаратов, совершенствование схем и методов их применения, использование средств терапии и иммунокоррекции для профилактики и терапии респираторных и желудочно-кишечных заболеваний у телят является актуальной проблемой ветеринарной науки и практики. В НПО НАРВАК (г. Москва) с 1996 г. выпускается комбинированная инактивированная вакцина КОМБОВАК, предназначенная для специфической профилактики шести основных вирусных болезней крупного рогатого скота (Сергеев В.А., Непоклонов А.Е., Алипер Т.И., Патент РФ на изобретение № 2261111 от 08.04.2004). Однако в ряде животноводческих хозяйств наблюдаются преимущественно респираторные или желудочно-кишечные болезни телят. В связи с этим нами были предложены два новых варианта вакцины для профилактики смешанных вирусо-бактериальных инфекций телят различной системной направленности.

Цель работы: Разработка и оценка эффективности вакцин КОМБО-ВАК-Р и КОМБОВАК-К, предназначенных для специфической профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пасте-реллеза (КОМБОВАК-Р) и вирусной диареи, рота-, коронавирусной инфекций и эшерихиоза телят (КОМБОВАК-К).

Основные задачи исследований:

1.Изучить эпизоотическую ситуацию по респираторным и желудочнокишечным заболеваниям у телят в ряде животноводческих хозяйств Московской области.

2.Разработать схему изготовления инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К и методы биологического контроля вирусных компонентов, входящих в их состав. Для этого оценить специфичность производственных штаммов вирусов, получить моноспецифические гипериммунные антисыворотки, определить режим инактивации вирусов и подобрать концентрацию адъюванта в вакцине.

3.В опытах на лабораторных животных определить безвредность и антигенную активность вирусных компонентов вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К, а также сохранность их антигенной активности при хранении.

4.Изучить гуморальный иммунный ответ у крупного рогатого скота на введение препаратов КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К. Определить оптимальную иммунизирующую дозу вакцин и схему их применения. Оценить эффективность вакцинации глубокостельных коров и ее влияние на формирование колострального иммунитета у потомства.

5.Провести оценку эффективности вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в животноводческих хозяйствах, неблагополучных по респираторным и желудочно-кишечным болезням телят.

Научная новизна работы. Разработаны два новых вакцинных препарата против основных респираторных и желудочно-кишечных болезней телят, различающихся по антигенному составу с учетом этиологической структуры и системной направленности, и предназначенных для специфической профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза (вакцина КОМБОВАК-Р), вирусной диареи, рота-, коронави-русной инфекций и эшерихиоза телят (вакцина КОМБОВАК-К). Показано отсутствие интерференции между вирусными и бактериальными компонентами вакцин.

Практическая значимость исследований. Научно обоснованы принципы изготовления и биологического контроля инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К. Экспериментально установлена иммунизирующая доза препаратов, показана их эффективность и возможность оценки на лабораторных и естественно-восприимчивых животных. Показана высокая иммуногенная активность вакцинных препаратов для стельных коров и формирование колострального иммунитета у телят. Установлено, что в экспериментальных и производственных условиях вакцинация предлагаемыми препаратами обеспечивает выраженный протективный эффект, значительно снижая показатели заболеваемости и смертности телят.

Указанные препараты производятся и применяются в соответствии с нормативной документацией, утвержденной в установленном порядке.

Основные положения, выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

• схема изготовления инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К и методы биологического контроля их вирусных компонентов;

• результаты исследований по изучению антигенных свойств вирусных компонентов, входящих в состав вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К, на лабораторных и естественно-восприимчивых животных;

• эффективность применения разработанных инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в качестве средств специфической профилактики респираторных и желудочно-кишечных болезней телят.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международной научной конференции «Актуальные проблемы патологии животных, посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2003); семинарах и конференциях областных ветеринарных специалистов (г. Уфа, 2004; г. Краснодар, 2004; г. Казань, 2004); научно-производственных совещаниях сотрудников НПО НАРВАК (г. Москва, 2003 - 2007 гг.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 5 научных работ, в том числе две работы в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие д.б.н. Т.В. Гребенникова (раздел 2.2.1), к.б.н. В.В. Цибезов (раздел 2.2.1), д.в.н. М.К. Пирожков (раздел 2.2.7), ветеринарный врач А.И. Кузнецова (раздел 2.3). Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи в организации и проведении исследований научному руководителю д.б.н. Т.И.Алиперу и сотрудникам НПО «НАРВАК», Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, ФГУ «ВГНКИ».

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 135 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 24 таблицами и 16 рисунками. Список литературы включает 190 источников (67 отечественных и 123 зарубежных авторов).

6. ВЫВОДЫ

1. Серологическими методами установлена циркуляция вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Московской области. При этом во всех семи хозяйствах у 32-61% обследованных животных были выявлены вируснейтрализующие антитела к двум или трем возбудителям одновременно.

2. Для специфической профилактики респираторных и желудочно-кишечных болезней крупного рогатого скота разработана схема изготовления инактивированных комбинированных вакцин против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза телят (КОМБОВАК-Р) и против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят (КОМБОВАК-К).

3. Подтверждена специфичность производственных штаммов вирусов, входящих в состав вакцин КОМБОВАК, КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К. Получены и охарактеризованы моноспецифические гипериммунные сыворотки к вирусам инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи крупного рогатого скота. Для производства безопасных и иммуноген-ных препаратов определены режимы инактивации вирусов и концентрация адъюванта в вакцинах.

4. В опытах на лабораторных животных установлено, что разработанные вакцины безвредны, обладают выраженной антигенной активностью и индуцируют формирование гуморального иммунного ответа у морских свинок и кроликов, а также сохраняют свою активность в течение всего срока хранения.

5. В экспериментальных условиях на естественно-восприимчивых животных установлены схемы применения и определена оптимальная иммунизирующая доза инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К для стельных коров, составляющая 3,0 см3. При этом двукратная иммунизация коров вакцинами КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К приводит к увеличению титра вируснейтрализующих антител ко всем вирусным компонентам вакцин в 3-4 раза и в 10 и более раз соответственно. Для телят оптимальная иммунизирующая доза вакцины КОМБОВАК-Р составила 2,0 см3. Двукратная вакцинация телят препаратом КОМБОВАК-Р приводит к увеличению титра вируснейтрализующих антител к возбудителям инфекционного ринотрахеита, парагриппа-З и вирусной диареи крупного рогатого скота в 7 и более раз.

6. Вакцинация стельных коров препаратами КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К приводит к формированию выраженного колострального иммунитета у потомства. Уровень вирус-специфических антител в сыворотке крови 7-14 дневных телят, полученных от вакцинированных матерей, более чем в 5 раз превышает аналогичные показатели у телят, полученных от невакцинирован-ных животных.

7. В производственных условиях установлена профилактическая эффективность вакцинации стельных коров и телят разработанными вакцинами. В результате использования инактивированной комбинированной вакцины КОМБОВАК-Р в неблагополучных хозяйствах уровень заболеваемости респираторными болезнями снизился в 3,3 раза, процент гибели и вынужденной выбраковки телят - в 3,6 раза. Вакцинация глубокостельных коров инактивированной комбинированной вакциной КОМБОВАК-К и своевременная выпойка молозива новорожденным телятам позволила снизить уровень заболеваемости молодняка желудочно-кишечными болезнями в 3 раза, процент гибели и выбраковки телят - в 2,7 раза.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы исследований по разработке и применению инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К вошли в следующие нормативные документы:

- Извещение №1 об изменении ТУ 9384-003-42418073-01 «Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синтициальной, рота- и коро-навирусной болезней телят (КОМБОВАК)» от 01.03.2001 г, согласовано с Департаментом ветеринарии МСХ РФ 02.02.2004;

- Инструкция по применению вакцины инактивированной комбинированной против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза телят (КОМБОВАК-Р), утверждено Россельхознадзором 30.03.2007;

- Инструкция по применению вакцины инактивированной комбинированной против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшери-хиоза телят (КОМБОВАК-К), утверждено Россельхознадзором 30.03.2007.

В заключение по данному разделу работы были сделаны следующие выводы:

1) установлено, что опытные серии инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К обладают выраженной антигенной активностью в отношении всех вирусных компонентов, входящих в их состав, и стимулируют синтез вируснейтрализующих антител у естественно-восприимчивых животных при одно- и двукратном введении препарата, независимо от объема иммунизирующей дозы препарата.

2) двукратная иммунизация коров и телят вакциной КОМБОВАК-Р и двукратная иммунизация коров вакциной КОМБОВАК-К приводит к увеличению титра ВНА ко всем вирусам более чем в 3-4 раза.

3) вакцинация стельных коров вакцинами КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К приводит к формированию выраженного колострального иммунитета у потомства. Уровень вирусспецифических антител в сыворотке крови 7-14 дневных телят, полученных от вакцинированных матерей, более чем в 5-10 раз превышает аналогичные показатели у телят контрольной группы.

4) оптимальная иммунизирующая доза инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К для стельных коров составляет 3,0 см3.

5) оптимальная иммунизирующая доза инактивированной комбинированной вакцины КОМБОВАК-Р для телят составляет 2,0 см3.

4.4. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВАКЦИН КОМБОВАК-Р И КОМБОВАК-К В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

Результаты исследований отечественных и зарубежных ученых свидетельствуют о том, что возбудители респираторных и желудочно-кишечных болезней телят в большинстве обследованных хозяйств встречаются в ассоциации. Это стимулирует разработку и внедрение в ветеринарную практику более эффективных комбинированных биопрепаратов, обеспечивающих надежную защиту одновременно против нескольких наиболее распространенных инфекционных агентов.

Заключительный раздел нашей работы посвящен оценке эффективности разработанных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в производственных условиях.

В течение 2003-2004 гг. эффективность инактивированных комбинированных вакцин изучали в производственном опыте в четырех хозяйствах Московской области, неблагополучных по респираторным и желудочно-кишечным болезням молодняка крупного рогатого скота (в качестве опытных использовали хозяйства, где проводили серологическое обследование поголовья — см. раздел 4.1). Так, по данным ветеринарной службы этих хозяйств, в 2002 году заболеваемость новорожденных телят респираторными болезнями составила от 48 до 82%, а желудочно-кишечными - от 32 до 75% от общего количества полученных телят. При этом гибель и выбраковка молодняка по причине респираторных болезней составила в среднем по хозяйствам за год 9,3%, а по причине желудочно-кишечных болезней - 8,6 %. Предварительные серологические исследования показали, что у животных в этих хозяйствах присутствуют антитела к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД, РВ и КВ.

Таким образом, иммунопрофилактика в этих хозяйствах является необходимым звеном в системе противоэпизоотических мероприятий, а применение вакцин - научно и практически обосновано.

В каждом хозяйстве опыт проводили на фермах с самым высоким процентом заболеваемости, гибели и выбраковки молодняка (опытные). На одной из ферм каждого хозяйства испытания не проводились, и животные данной фермы являлись контрольными.

4.4.1. Испытание эффективности инактивированной комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-З, вирусной диареи и пастереллеза телят (КОМБОВАК-Р)

Для профилактики респираторных болезней телят использовали вакцину КОМБОВАК-Р экспериментальных серий №2 и №3, изготовленных в 2003 году, и производственных серий №1 и №2, изготовленные в 2004 году в НПО НАРВАК. При проведении опытов вакцинировали: а) глубокостельных коров с целью формирования колострального иммунитета у потомства и б) телят старше 1,5 мес. возраста. Глубокостельным коровам вакцину вводили внутримышечно двукратно в дозе 3 см3. Первую вакцинацию проводили за 45-60 сут до отела, вторую - через 10-14 сут. В течение года было вакцинировано 448 глубокостельных коров, количество контрольных животных составляло 175 голов. Телят в возрасте 1,5-4 мес. возраста вакцинировали дважды в дозе 2 см3 с интервалом 20-25 сут. Телят старше 4 мес. возраста вакцинировали двукратно в дозе 3 см3 с интервалом 3-4 недели. В экспериментах было задействовано 435 телят, контролем служили 146 телят.

Эффективность вакцины определяли по эпизоотологическим показателям: снижению уровня заболеваемости телят респираторными болезнями, а также по снижению процента их гибели и вынужденной выбраковки.

Результаты анализа эпизоотической ситуации до и после применения вакцины представлены на рисунке 15.

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что заболеваемость новорожденных телят респираторными болезнями на опытных фермах снизилась в среднем с 62 до 19%, гибель и вынужденная выбраковка телят снизилась с 9,3% до 2,6%, тогда как на контрольных фермах аналогичные показатели составили 53% и 8,1% соответственно.

Таким образом, в результате использования инактивированной комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза телят (КОМБОВАК-Р) для иммунизации глубокостельных коров и телят на опытном поголовье, уровень заболеваемости респираторными болезнями снизился в 3,3 раза, процент гибели и вынужденной выбраковки - в 3,6 раза.

70 и 60 -50 -40 -30 -20 -10 -0

62

19

До применения вакцины

После применения вакцины

9,3

И2'

I I I 6

Рисунок 15. Эффективность применения комбинированной инактивированной вакцины КОМБОВАК-Р в неблагополучных хозяйствах.

3 и С - процентные показатели заболеваемости и смертности (вынужденной выбраковки) соответственно. Приведены средние геометрические значения величин.

В результате исследований был сделан вывод о том, что инактивирован-ная комбинированная вакцина КОМБОВАК-Р оказалась безвредным и эффективным препаратом, предотвращающим развитие респираторных инфекций телят, вызываемых вирусами инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи, а также пастереллами.

4.4.2. Испытание эффективности инактивированной комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят (КОМБОВАК-К)

Для профилактики желудочно-кишечных инфекций новорожденных телят использовали вакцину КОМБОВАК-К экспериментальных серий №2 и №3, изготовленных в 2003 году, и производственных серий №1 и №2, изготовленных в 2004 году в НПО НАРВАК. Вакцинировали глубокостельных коров с целью создания напряженного колострального иммунитета у потомства. Вакцину вводили внутримышечно двукратно в дозе 3 см3 первый раз за 45-60 сут до отела, второй раз - через 10-14 сут. Эпизоотологическую эффективность вакцины определяли по снижению уровня заболеваемости новорожденных телят желудочно-кишечными болезнями, а также по снижению процента гибели и выбраковки телят. В течение года было вакцинировано 815 глубокостельных коров и нетелей, контролем служило 348 неиммунных животных (рис.16).

80 70 -60 -50 40 -30 -20 -10 -0

68 ш

I -\г . •

До применения вакцины

После применения вакцины

23

8,6

3,2

Рисунок 16. Эффективность применения комбинированной инактивированной вакцины КОМБОВАК-К в неблагополучных хозяйствах.

3 и С - процентные показатели заболеваемости и смертности (вынужденной выбраковки) соответственно. Приведены средние геометрические значения величин.

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что после применения вакцины заболеваемость новорожденных телят желудочно-кишечными болезнями на опытных фермах снизилась в среднем с 68 до 23%, гибель и выбраковка телят снизилась с 8,6% до 3,2%, тогда как в контрольных группах средние показатели заболеваемости и смертности телят по причине желудочно-кишечных болезней составили 56% и 9,4% соответственно. Таким образом, в результате использования инактивированной комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят (КОМБОВАК-К) для иммунизации глубокостельных коров и своевременной выпойки молозива новорожденным телятам уровень заболеваемости желудочно-кишечными болезнями снизился в 3 раза, процент гибели и выбраковки телят - в 2,7 раза.

В результате исследований был сделан вывод о том, что инактивирован-ная комбинированная вакцина КОМБОВАК-К оказалась безвредным и эффективным препаратом, предотвращающим развитие желудочно-кишечных инфекций новорожденных телят, вызываемых рота- и коронавирусами, вирусом диареи, а также энтеропатогенными E.coli.

Таким образом, можно сделать общее заключение по данному разделу нашей работы о том, что в производственных условиях показана эффективность разработанных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в качестве иммуно-профилактических препаратов респираторных и желудочно-кишечных заболеваний у телят со сложной этиологической структурой. Применение данных биопрепаратов в неблагополучных животноводческих хозяйствах дает возможность резко сократить потери молодняка от вышеуказанных болезней и наносимый ими экономический ущерб.

5. ОБСУЖДЕНИЕ

Респираторные и желудочно-кишечные болезни молодняка крупного рогатого скота и, прежде всего, новорожденных телят имеют сложную этиологическую структуру и представляют важнейшую экономическую проблему в современном животноводстве. Основу экономического ущерба составляет высокая смертность и выбраковка заболевших животных, затраты на диагностические и лечебные мероприятия, задержка в росте и развитии. В настоящее время стало очевидным, что респираторная и желудочно-кишечная патология у телят является примером мультифакторной патологии, в развитии которой участвуют организм теленка, окружающая среда, кормление и инфекционные агенты.

При промышленной технологии выращивания телят массовые заболевания органов дыхания проявляются преимущественно в первые три месяца после рождения. Ведущую роль в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота играют вирусы инфекционного ринотрахеита, парагриппа-З, вирусной диареи, респираторно-синцитиальный вирус, рео-, рино- и аденовирусы I и II подгрупп. Гибель животных от респираторных болезней наблюдается, как правило, при осложнении вирусной инфекции секундарной микрофлорой (P.multocida, P.haemolytica, Klpneumonia, Chlamidia и др.) (Высокопоясный А.И. с соавт., 1999; Сюрин В.Н. с соавт., 1998; Юров К.П. с соавт., 2003; Grooms D.L., 1998 и др.).

Эпизоотологический мониторинг показывает, что вирус диареи крупного рогатого скота, рота- и коронавирусы являются наиболее важными вирусными агентами, участвующими в развитии патологического процесса при желудочно-кишечных заболеваниях у телят (Коромыслов Г.Ф. и др., 1984; Гоголев М.М.и др., 1989; Соколова H.JL, 1993; Жидков С.А., 1994; Сатторов И.Т., 1995).

Течение этих вирусных инфекций, как правило, осложняется энтеро-токсигенными E.coli, которые выделяются взрослыми животными и попадают в кишечник новорожденных телят (Гаффаров Х.З. с соавт., 2002; Гу-ненков В.В с соавт., 2002 и др.). Возникновению и развитию заболеваний способствуют нарушения в технологии содержания и выращивания животных, а также несоблюдение ветеринарно-санитарных требований (Ким Р.Е., 1992; Каврук Л.С., 1994).

Успех в борьбе с респираторными и желудочно-кишечными болезнями телят зависит от своевременного распознавания факторов ее обусловивших и средств ее коррекции. Идентификация инфекционных агентов является важным обстоятельством, поскольку позволяет правильно определить стратегию контроля болезни. Соответствующие корректировки в кормлении молозивом, вакцинации, гигиене содержания и кормления, использовании лекарственных средств могут быть применены только в случаях, когда становится ясным, какие инфекционные агенты участвуют в развитии патологического процесса и какова их роль в возникновении болезни.

Нами было проведено эпизоотологическое и серологическое обследование различных возрастных групп крупного рогатого скота из семи неблагополучных хозяйств Московской области на наличие антител к вирусам инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что из 135 обследованных голов крупного рогатого скота, у 64% животных были обнаружены антитела к вирусу ИРТ, у 68,9% - антитела к вирусу ПГ-3 и 60,7% были серопозитивными на В Д. В 6 из 7 обследованных хозяйств у 32 — 100% обследованных животных были выявлены вируснейтрализующие антитела к двум и более возбудителям. Таким образом, наши результаты полностью совпадают с результатами цитированных выше отечественных авторов и свидетельствуют об активной циркуляции вирусов ИРТ, ПГ-3 и ВД в стадах крупного рогатого скота на территории РФ. Это указывает на их значительную роль в этиологии массовых болезней телят и необходимость применения поливалентных вакцин в системе противоэпизоотических мероприятий.

При смешанных инфекциях трудно определить ведущую роль того или иного инфекционного агента, поэтому наиболее эффективным средством профилактики таких болезней являются комбинированные вакцины, включающие как вирусные, так и бактериальные компоненты (Harkness J.W.et al., 1985; Pospisil Z. et al., 1996; Van Oirschot J.T., 1999; Hamers C. et al., 2000 и др). Поэтому целью нашей работы была разработка технологии производства и методов биологического контроля двух различных комбинированных инактивированных препаратов, предназначенных для специфической профилактики смешанных респираторных: инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза (КОМБОВАК-Р), и желудочно-кишечных: вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза (КОМБО-ВАК-К), инфекций телят. Основой для разработки данных препаратов служили технологии и методы, внедренные в промышленное производство инактивированной комбинированной вакцины КОМБОВАК против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-З, вирусной диареи, респираторно-синци-тиальной, рота- и коронавирусной болезней телят, выпускаемой НПО НАР-ВАК (г. Москва).

Анализ ситуации на рынке препаратов аналогичной направленности показал следующее. Близкими по структурному составу предлагаемой нами вакцине КОМБОВАК-Р являются наиболее распространенные в мире и странах Европейского Союза вакцины Biopoligen-HS (Biogenesis, Аргентина; содержит инактивированные вирусы ИРТ, ВД, ПГ-3, бактерии P.multocida А, В, D, P.haemolytica, Н. Somnus и гидроокись алюминия в качестве адъюванта); Trivirus Р Som (ISG, Аргентина; аналогична по составу предыдущей); Ri-novac 4 (ImmunoVet, Испания, содержит инактивированные вирусы ИРТ, ВД, ПГ-3 и бактерии Pasteurella с масляным адъювантом) и др. Структурному составу вакцины КОМБОВАК-К наиболее близки Bovilis Lactovac (Intervet, Голландия; содержит ротавирус, коронавирус, E.coli (К99 и F41) ГОА и сапонин); TRIVACTON 6 (Rhone Merieux, Франция, содержащая ротавирус, коронавирус и E.coli, гидроокись алюминия и сапонин); SCOURGUARD 3 (Pfizer, США, содержащая ротавирус, коронавирус, E.coli и гидроокись алюминия) и др. В России также разрабатываются поливалентные вакцины аналогичной направленности. Таким образом, на основании литературных данных, собственных исследований и анализа аналогичных коммерческих продуктов был сделан вывод о правильности поставленной цели и задач нашей работы.

Известно, что инактивированные комбинированные вакцины являются наиболее сложными по составу препаратами (Duffy J.I., 1980; Сюрин В.Н. с соавт., 1984, 1998). Их производство требует большого количества вируса, в котором должна быть полная и необратимая инактивация вирусного генома при максимальной сохранности антигенных детерминант, вызывающих образование специфических антител и иммунную защиту привитых животных. При разработке технологии изготовления необходимо решить сложные задачи конструирования вакцинных препаратов из антигенов различной природы и учитывать возможность их интерференции в организме животных в процессе иммуногенеза. Кроме того, создание поливалентных вакцин требует наличия методов контроля антигенных и иммуногенных свойств каждого компонента вакцины на основе чувствительных и специфичных тест-систем.

Исходя из этого, на первом этапе разработки технологии производства вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К была подтверждена специфичность производственных штаммов используемых вирусов, определен оптимальный режим инактивации вирусов формалином и подобрана оптимальная концентрация адъюванта для каждого препарата. Кроме того, были получены и охарактеризованы гипериммунные сыворотки к вирусам ИРТ, ПГ-3 и ВД.

Идентификацию всех производственных штаммов вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД, РВ и KB крупного рогатого скота проводили методом РН с использованием моноспецифических референтных сывороток, а также методами ИФА, ПЦР и РТГА. В результате проведенных экспериментов была подтверждена идентичность штаммов и возможность их использования в качестве производственных.

В качестве инактиванта был использован формальдегид, который широко используется для производства инактивированных вакцин (Осидзе Д.Ф. с соавт., 1981; Сюрин В.Н. с соавт., 1984; Ласкина О.М., 2003 и др.). Полноту инактивации вирусов определяли по отсутствию ЦПД вируса в культуре клеток МДВК в течение 4-х пассажей. В результате исследований был установлен следующий режим инактивации вирусов, входящих в состав вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК: вирус ИРТ инактивировали формальдегидом в концентрации 0,3% в течение 72 час., вирусы ВД и ПГ-3 — в концентрации 0,2% в течение 24 час., рота- и коронавирусы - в концентрации 0,2% в течение 48 час.

Следующим этапом наших исследований был выбор и определение оптимальной концентрации адъюванта, повышающего иммуногенную активность вирусных и бактериальных компонентов вакцин. Известно, что многие вещества различного происхождения обладают адъювантной активностью вследствие своего химического состава и строения (Gard S., 1960; Gall D.et al., 1972 и др.) Например, минерально-солевые адъюванты (гидроокись алюминия, фосфат алюминия, алюмокалиевые квасцы) адсорбируют антиген посредством ионного взаимодействия. Наиболее часто используют смешивание антигена с заранее сформированными гелями. Такие вакцины иногда вызывают образование стерильных абсцессов и персистирующих узелков. Алюминиевые соли стимулируют синтез антител в регионарных лимфоузлах и вызывают скопление плазматических клеток в местах образования поствакцинальных гранулем (McKercher P.D., 1986).

В качестве компонентов классического неполного адъюванта применяют минеральные масла (маркол, дракеол 6VR), в которых растворяют до 10% (по объему) липофильного эмульгатора — маннида моноолеата (арласел А, монтанид). Кроме токсичности, значительными недостатками масляных адъювантов являются высокая вязкость и недостаточная стабильность. Твин 80 добавляется 1-5% (по объему), повышает дисперсность водных капель в масляной фазе и обеспечивает стабильность эмульсии.

Полный адъювант Фрейнда (Freund J., 1956) содержит также убитые клетки микобактерий. Однако из-за острой боли, формирования абсцессов, лихорадки, возможности повреждения органов его используют только в экспериментальных целях.

Сапонин, экстрагируемый из коры южно-американского дерева Guillaja saponaria Molina, давно применяется в качестве адъюванта в ветеринарной иммунологии (Glauert Н.М. et al., 1962). Очищенный препарат сапонина, получивший название квил-А, относится к гликозидам и является поверхностно-активным веществом. В основе адъювантного действия квил-А лежит образование иммуностимулирующего комплекса (ИСКОМ). Квил-А хорошо растворяется в воде и, достигая концентрации 300 мг/л, образует мицеллы, которые благодаря гидрофобному взаимодействию связывают мономерные формы поверхностных вирусных белков. При этом образуются структуры типа пчелиных сот, обладающие иммуностимулирующим действием, намного превышающим эффективность исходных вирусных белков, не организованных в надмолекулярные структуры (Сергеев В.А., 1993).

Нами на основании данных литературы и результатов собственных исследований в качестве адъювантов были выбраны гидроокись алюминия (ГОА) и сапонин. Эксперименты были направлены на определение оптимальной концентрации ГОА, тогда как сапонин был взят в определенной концентрации - 500 мг/л, подобранной в предварительно проведенных экспериментах. На основании результатов проведенных опытов на лабораторных животных с вакцинными препаратами, содержащими различные концентрации ГОА, было сделано заключение о том, что оптимальная концентрация ГОА при изготовлении вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К составляет 20%.

Таким образом, результатом основного этапа нашей работы было изготовление опытных серий инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К. В состав первой вошли вирусы ИРТ, ПГ-3, ВД и концентрированная бакмасса P. multocida и P. haemolytica, в состав второй - вирусы ВД, РВ, KB и концентрированная бакмасса E.coli, содержащая как соматические, так и адгезивные антигены. Для изготовления вакцин использовали следующие производственные штаммы: В-25 вируса инфекционного ринотрахеита, В-19 вируса парагриппа-3, СТ-89 вируса диареи, КВ-90 коронавируса и К88 ротавируса крупного рогатого скота. Вирусы ИРТ, ВД, KB и РВ выращивали в перевиваемой культуре клеток МДВК, вирус ПГ-3 - в перевиваемой культуре клеток ЛЭК. Для выращивания культуры клеток использовали питательную среду Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Опытные серии вакцин готовили из антигенов, свободных от бактериальной и грибной микрофлоры, инактивировали формалином, добавляли 20 % ГОА и 500 мг/л сапонина. Каждую серию проверяли на стерильность, безвредность, полноту инактивации и антигенную активность на морских свинках и кроликах. Установлено, что однократная иммунизация морских свинок испытуемыми вакцинами в дозе 0,5 см3 стимулирует у них выраженный иммунный ответ ко всем вирусным компонентам вакцины.

Известно, что иммунногенную специфическую активность вакцин оценивают в опытах прямого заражения иммунизированных животных, а антигенную активность характеризует уровень образования специфических антител в сыворотке крови вакцинированных животных (Осидзе Д.Ф. с соавт, 1981). Поэтому, следующей стоящей перед нами задачей было проведение испытаний изготовленных опытных серий инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в опытах на естественно-восприимчивых животных. Антигенную активность вирусных компонентов и иммунизирующую дозу испытуемых вакцин определяли в сравнительных экспериментах на стельных коровах и телятах. Результаты экспериментов с использованием вакцины КОМБОВАК-Р показали, что наиболее высокий титр вируснейтрализующих антител ко всем вирусным компонентам установлен у коров при введении препарата в дозе 3 см , а у телят - в дозе 2 см . При сравнительном анализе результатов ИФА и РН установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью этих двух методов (г= 0,82 - 0,88, Р < 0,05). Иммунизация глубокостельных коров вакциной КОМБОВАК-К в подобранной дозе 3 см3 обеспечивала наиболее выраженный иммунный ответ ко всем трем вирусным компонентам препарата. При этом титр антител был в 2-3 раза выше, чем при вакцинации животных в дозе 2 см3. Увеличение дозы вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К с 3 до 5 см3 не оказывало существенного влияния на прирост специфических антител в сыворотке крови иммунизированных животных.

Известно, что пассивная иммунизация телят через вакцинацию матерей является эффективным методом профилактики желудочно-кишечных болезней, вызываемых различными энтеропатогенами (Федоров Ю.Н., 1986; Ellis J.A. et al., 1996; Snodgrass D.R., 1996; Barragy Т., 1997). При этом наилучшая защита достигается при адекватном получении теленком молозива в первый день жизни. Защитный эффект у телят определяется уровнем антител в молозиве матери, количеством выпоенного молозива, эффективностью абсорбции антител в пищеварительном тракте, а также присутствием колостральных антител в кишечном тракте теленка.

Поскольку разработанные вакцины КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К предназначены для создания колострального иммунитета у новорожденных телят, следующие эксперименты были посвящены определению содержания колостральных антител у телят, родившихся и получавших молозиво от вакцинированных матерей. В опытах использованы 7-14-дневные телята, рожденные от коров, иммунизированных различными дозами вакцин КОМБО-ВАК-Р и КОМБОВАК-К, контролем служили телята аналогичного возраста, полученные от неиммунных животных. Сравнительный анализ содержания колостральных антител в сыворотке крови телят опытной и контрольной групп показал, что титры вирус-специфических антител у животных первой группы более чем в 5-10 раз превышают аналогичные показатели у животных второй. Наблюдалась положительная корреляция между содержанием вирус-специфических колостральных антител в сыворотке крови 7-14-дневных телят и титром вирус-специфических антител в сыворотке крови вакцинированных матерей (i-0,79, Р < 0,05). При этом самые высокие титры антител отмечали у телят, получавших молозиво от матерей, иммунизированных испытуемыми вакцинами в дозе 3 см3.

Полученные положительные результаты исследований позволили нам провести испытания комбинированных инактивированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в производственном опыте в подобранных опытным путем дозах. Эпизоотологическую эффективность разработанных препаратов проверяли в условиях четырех животноводческих хозяйств, неблагополучных по респираторным и желудочно-кишечным болезням крупного рогатого скота.

Для профилактики респираторных болезней телят использовали экспериментальные серии вакцины КОМБОВАК-Р, которыми вакцинировали глубокостельных коров внутримышечно двукратно за 40-50 суток до предполагаемого отела в дозе 3 см3 с целью формирования колострального иммунитета у потомства. Телят вакцинировали внутримышечно двукратно в дозе 2 -3 см в зависимости от возраста. Для профилактики желудочно-кишечных инфекций у новорожденных телят использовали экспериментальные серии вакцины КОМБОВАК-К, которыми вакцинировали только глубокостельных коров с целью создания напряженного колострального иммунитета у потомства. Вакцину вводили в те же сроки и в тех же дозах, что и вакцину КОМБОВАК-Р. В качестве контрольных были взяты неиммунные животные, подобранные по принципу аналогов.

Эпизоотологическую эффективность испытуемых вакцин определяли по снижению уровня заболеваемости телят, а также по снижению процента их гибели и вынужденной выбраковки.

Результаты анализа эпизоотической ситуации до и после применения вакцины КОМБОВАК-Р свидетельствуют о том, что заболеваемость телят респираторными болезнями на опытных фермах снизилась в среднем с 62 до 19%, гибель и вынужденная выбраковка - с 9,3% до 2,6%. После применения вакцины КОМБОВАК-К заболеваемость новорожденных телят желудочно-кишечными болезнями на опытных фермах снизилась в среднем с 68 до 23%, гибель и выбраковка телят - с 8,6% до 3,2%.

Таким образом, установленная в производственных условиях эффективность разработанных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К позволила нам подготовить необходимую нормативную документацию и в 2004 году на основе разработанной технологии начать серийное производство препаратов.

Завершая обсуждение результатов проведенных исследований, можно сделать общее заключение о том, что разработанные нами средства специфической профилактики респираторных и желудочно-кишечных болезней молодняка крупного рогатого скота адекватны этиологическому спектру возбудителей болезней и поэтому эффективны при применении в неблагополучных хозяйствах. Однако иммунопрофилактика является лишь одним из звеньев комплексной профилактики, в которую также включают зоогигиени-ческие условия, кормление, способы комплектования животных и ветери-нарно-санитарные мероприятия.