Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические и технологические основы совершенствования средств и методов специфической профилактики сибирской язвы и клостридиозов животных

КАЗАХСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

КАЗАХСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ лп ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК 619:615.371.372.616.981.51.

ГОРЕЛОВ ЮРИЙ МИХАЙЛОВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И КЛ0СТРИДИ030В ЖИВОТНЫХ

16.00.03 -ветеринарная микробиология, иммунология, эпизоотология и инфекционные болезни животных.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Алматы, 1994 г.

Работа выполнена в лаборатории болезней овец Казахского научно-исследовательского ветеринарного института Казахской академии сельскохозяйственных наук.

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор,

академик КазАСХН - 3. К. КОЖЕВЕКОВ

Ведущая организация - Институт биохимии и физиологии

национальной академии наук Кыргызской Республики

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор - Ж. Ж. ЖУМАШЕВ доктор медицинских наук , профессор - А. Л. КОТОВ*

доктор ветеринарных наук , старший научный сотрудник - К. Р. РЫСКУЛОВ

• дедд 1994 года в

Защита состоится " <Л. т~ " с;< 1~1ЛС) ¡У*> 1994 года в Ч'С часов на заседании с пе ц и а л из и р Ьл а н н о г </ совета Д 55.03.01 при Казахском научно-исследовательском ветеринарном институте по адресу: 480029, Алматы, проспект Райымбека, 223.

С дисертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан___19 94 г

нся сГ/?^

т

Ученый секретарь специализированного совета, доктор ветеринарных наук

Б. Ф. Коримжанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время ореол сибирско:"; язви а клостридиозов охватывает ьсе континенты земного шара.

На территория Казахстана учтено 3386 неблагополучных пунктов по сибирской язве, где заболело 21 304 ;клеотных, а пз кло-стридиозоз значительное место занимают инфекционная энтероток-семкя, брадзот, злокачественный отек, некротический гепатит, анаэробная дизентерия ягнят, эмфизематозный карбункул и др. Нередко клоетридяи обусловливают раневые ( гангрена) и послеродовые осложнения ( эндометрит, вагинит, мастит), а так;:» токси-коонтериты у человека , кивотннх и птиц.

Относительно стойкое благополучие по сибирсгсоп язве и гло-стрцдлозам "лестных в республике обеспечивается за счет проведения плановых профилактических мероприятий, которыми е::'.огодно охватывается 26-30 млн овец и 10 млн голов крушгого рогатого скота.

Несмотря на определенные успехи в изучении природы данных заболеваний, разработке специфических т-ер пробилактики и общих ветеринарно-санитарных мероприятий, сибирская язва и клостридя-озы продожавг наносить значительный торб ялвстноводству и тлеют 'больное социальное значение.

Такое положение объясняется особенностями биологических свойств возбудителей болезней, способностью гас длительно сохраняться в почве, наличием предрасполагающих к заболевании пасторов, механизмов передачи возбудителе!; инфекции, ослаблением реактивности ала даке иммунологической толерантностью квотных под воздействием различных стресс-Факторов, кормовых токсикозов и других причин, а такг-се недостаточно;': эффективностью вакцинных препаратов, большинство из которых применяются на протяжении 25-45 лет и нугдаготся в совершенствовании.

Кроме того, ассортимент бактериальных препаратов, предлагаемых для активной профилактики инфекций, в настоящее время настолько Еозрос, что в ряде случаев приводит к чрезмерно частей иммунизации некоторых групп жвотных и несоблюдению установленных интервалов между прививками.

Зое это настоятельно требует объединения отдельных антигенов в возможно более удобные комплексы, в частности, для

специфической профилактики сабирсво*. язвы и ян4ешщ4;, вызывающих клос тридиятли.

Ь ряде высокоразвитых стран ( СиА, Франция, Германия, Бен-грая я др.), наряду с традиционными коновале иным*. вакцинами, получили признание ассоциированные препарты (лауп-ьгах, 1по1-охс ^у.'лр-Ьошл^е, 11оу1?ап, КоаХсуах, ОуспЪого, ;.'е!оя1а, Суд.уох ог а!

х> нахей стране ассоциированные вшэдшы все еше ¿шевт огра ниченное сршененке. В настоящее время в ветеринарной практике применяется поливалентная ГОА вакцина против брадзота, злокачественного отека, инспекционной энтеретокеамии овец и анаэроб-нон дизентерии ягнят С <*.А.Каган, А.л.Колесова и др. ,1Ь5с-1'гб4) поливалентный анатоксин против клостридиозов овец ( п.Каган, и.Р.Ургуев, л.л.лкрхллов и др. ; ассоциированная вакцина против эмфизематозного карбункула ь строкой йзвк к 1>.„.Х'рйЗШ .и..., сдаренно, ; д. и ¿пожни;», с в п и. А. Плесках,

х^ь^, ) ассоциированная вакцина против экзематозного карбункула и лвптоспароза ( ^.т.иорвсва, хьос); вакцин против пасю-реллеза, сальмонеллеза и днплококксвоп свптец.адии поросят л.Г.^аляБПН, а.м.Никифорова, хгЫ ) и некоторые другие.

Основным препятствием мирского применении ассоциированных следует признать недостаточную изученность взаимного влияния антигенов и законсл'.ерностеп развития и,¿¿упелагического ответа организм гсивотных на их одновременное введение. поэтом, определение оптимальных соотношений входящих в препарт антигенов, разработка технологий изготовления, контроля и схем применения вакцин против наиболее распространенных бодезне*. мивст-нкх является важной в теоретическом и практическом плаке.

Внедрение в ветеринарную практику ассоциированных вакцин против сибирской язвк и клосградиозов позволит значительно сократить затраты труда на проведение профилактические меропри-яти; , снизить потер/, дрс^ктпвностн животных и искать пм", не; статус поголовья животных еппеврегленпо против ^и^еигин.

Цель заботь:. Изыскать пути совершенствования и :.ать науч-нмеоретичсское обоснование разработке средств специфической профилактики сибирское язва и клостридиозов аивотных, технологи* их изготовления и повышения эффективности применения.

Задачи исследований:

1. Провести анализ причин низкой специфической активности квасцового концентрированного анатоксина против инфекционной энтеротоксеглии овец, вызываемой С1.реггггпеепа типа Д и на основе полученных данных разработать технологию изготовления препарата, обладающего высокими иммуногеннкми свойствами.

2. Изучить биологические и технологические аспекты создания ассоциированной вакцины против сибирской язвы и инфекционной онтеротоксеша овэц, вызываемой Сх.РегГг1пгепз типа Д.

3. Разработать технологию изготовления ассоциированной Еакцины против сиб!грской язвы и клостридиозов овец ( брадзот, некротический гепатит, злокачественный отек, инфекционная энтеротоксемия, анаэробная дизентерия ягнят).

4. Разработать технологию промышленного производства ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота и овец.

Научная новизна. Разработано новое направление по изысканию современных прививочных препаратов, применяемых в ветеринарной практике, на основе создания ассоциированных комплексов из нивых сибиреязвенных и обезвреженных формалином клостридиозных антигенов ( анакультура, анатоксин). Использование этого принципа и усовершенствованных приемов контроля позволило определить оптимальные дозы антигенов и их иммунологически сбалансировании е соотношения и создать новые более эффективные препараты:

-сухую ассоциированную вакцину против сибирской язвы и инфекционной энтеротокеемии овец типа Д;

-ассоциированную вакцину против сибирской язвы и клостридиозов овец ( брадзот, некротический гепатит, злокачественный стек, инфекционная энтеротоксемия, анаэробная дизентерия ягнят).

Научно обоснованы параметры технологических процессов обезвреживания, очистки я сорбции антигенов, а такке проведен подбор штаммов, изысканы питательные среды для выращивания микроорганизмов и установлены режимы их культивирования, что позволило пятикратно о 0,2 до 1,0 АЕ/мл увеличить активность анатоксина сь.регГггшсепз Д и разработать новую технологию его производства.

Установлена зависимость интенсивности роста и токсинообра-зования анаэробных микроорганизмов от наличия б питательной среде свободных незаменимых аминокислот и пизкомолекулярных фракций пептидов ( А.с. # 652216 ),

Выявлена возможность повышения активности анатоксина за счет предотвращения разрушения токсинов протвазами микроорганизмов путем внесения формалина при кислых значениях рН на стадия очистки и проведения сорбции продукта.

Определена возмоашость и отработаны режимы обезвреживания клострвдиозных токсинов перекисью водорода, глутаровым альдегидом, озоном. Это позволило повысить активность прививочных препаратов и расширить ассортимент анатоксинообразувщкх веществ.

Установлена прямая зависимость величины показателя концентрации водородных ионов (рН ) от количества добавляемого сульфита натрия. Это позволило, при нейтрализации остаточного и обратимосвязанного формальдегида б анавакцинах ( анатоксинах), исключить использование щелочи для корректировки рЫ ( Свидетельство Васкомизобретений ^ 0020112 ).

• Доказана возможность проведения контроля специфической активности анатоксинов С1.регГгхп£епз на кроликах, по титру антитоксинов в сыворотке их крови, что позволяет более объективно определять этот показатель на стадии разработки препарата и в конечном продукте.

Установлена зависимость эффективности применения ассоциированной вакцины против сибирской язвы и клострздиозов от сроков введения препаратов и интервалов медцу ними с учетом сезонного проявления энзоотии.

Разработана схема иммунизации животных против сибирской язвы и клострздиозов, которая позволяет сократить кратность прививок и обеспечить максимальную специфическую защиту глвотных

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволили обеспечить ветеринарную службу новыми, более эффективными прививочными средствами против сибирской язвы и клостридиозов животных, применение которых значительно снижает заболеваемость и затраты на проведение вакцинаций.

Применение предложенной питательной среды для культивирования анаэробных микроорганизмов ( ПЛОД ) повышает выход бакте-

риальной масси и токсинов, что способствует получению более активных анатоксинов ( 12-40 АЕ/шг ) по сравнению с аналогичными препаратами, полученными на коммерческих ■питательных средах ( 0,2 - 0,25 АЕ/мл ). В настоящее время разработанная нами питательная срода используется при изготовлении сухой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и инфекционной энтеротоксемии ( Т7-Ю-09-74-90 ) и квасцового концентрированного анатоксина С1. реггГ1пяепз типа Д ( ТУ-Ю-09-73-9С ).

Применение разработанного квасцового концентрированного анатоксина против инфекционной энтеротоксемии овец, вызываемой С1, ^ег1г1псепа типа Д, не менее чем в пять раз повышает иммуноло-гячеисую защиту вакцинированных кивитных. Нормативно-техническая документация на его изготовление и применение утверждена ГУБ СССР '¿7.12.1990г.

Разработана я испытана в производственных условиях, сухая ассоциированная вакцина против сибирской язвы и инфекционнной энтеротоксемии озец типа Д, освоена биологической промышленностью технология ее изготовления. Применение этого препарата сокращает на 25-50;".* материальные и трудовые затраты на проведение Еакщшацлй, в два раза повисает напряженность иммунитета у вакцинированных .ливотных. Изготовление вакцины по утвержденной 17В СССР нормативно-технической документации ( ТУ-10--С9-74-90 ) позволяет упростить условия хранения ( -25 + 25°С ) и увеличить срок годности препарата до 3-х лет.

Применение ассоциированной вакцины против сибирской язвы и клостридиозов овец снизит в первый год на 25 , а в последующие годы на 75^ затраты труда и средств на проведение вакцинаций. Кроме того, за счет передачи иммунитета от вакцинированных матерей исключит заболевание новорожденных ягнят анаэробной дизентерией л снизит затраты , связанные с применением специфической сыворотки. '

Освоено промышленное производство ассоциированной вакцины против сибирской язвы я эмфизематозного карбункула ( ТУ-Ю-19-98-89 ) и осуществлено внедрение ее в ветеринарную практику. Преимущество этого препарата перед существующими средствами профилактики указанных болезней состоит в однократной; прививке, шесто четырех, обеспечивающей напряженный иммунитет длительно-

стью более года.

Материалы выполненных исследований вошли в отраслевой стандарт "Ягнята"- технология ветеринарного обеспечения при получении и выращивании ( ОСТ 10.172-88 ), соблюдете которого позволит снизить заболеваемость и падеж молодняка овец на 5% и получить здоровое полноценное потомство.

Разработанные препараты удостоены золотой и серебряной медалей ВДНХ СССР в 1989 г, и ошечены дипломами I- 2-ой степеней ЭДНХ КазССР в 1987, I990-I99I гг.

Основные положения диссертации,выносимые на защиту.

-Результаты изучения и экспериментальное обоснование новых технологий изготовления и контроля профилактических препаратов против клострвдяозов животных.

-Теоретичесшю и практические аспекты создания ассоциированных препаратов к результаты сравнительного изучения их нмму-ногекной" эффективности в экспериментальных я производственных условиях.

' -Промышленная технология изготовления анатоксинов и ассоциированных вакцин,

-Результаты применения ассоциированных вакцин против сибирской язвы и клостридиозов в хозяйствах Республики Казахстан

- Система иммунизации животных против сибирской язвы к клостридиозов в неблагополучных по этим инфекциям хозяйствах.

- Данные изучения состояния клеточной к гуморальной систем иммунитета у животных, иммунизированных ассоциированной вакциной.

Апробация. Основные результаты работы доложены и обсуждены

на :

-Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы ветери нарной и зооиклсенерной науки в интенсификации животноводства"., М. ,'ЖА, I9S0 г.

-Всесоюзной научно-технической конференции "Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и ¡щеточной инженерии в ветеринарной медицине", Пеший -Новгород, 1990г.

-1У Всесоюзной конференции "Научные основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов", M. 1991.

-üi ¡.иодардод заседании ^ЬсЕОдадсгЕОНПо" каучно-глотодотсс-ко'" кодпссд но борьбе с спбпрк».. .туг.о;!, "аают, IbSI.

::017';0реэдд;: "Cosopt о мет восайде ;:ото. \о~. государственного додтролд воторддарни;: препаратов", гогцрезбритов, -i-, 1СЛ.

- ?есиуЛ'1лкапск.г; хзаучпо-проловодс.^онылс ше". срешщгз: по борзое с йн'евдионгкц;, дкдаздошгчд: г ггэзарсзкагл! болезнл:;;г овец: "Голознд свод, :: .дои борьбы с лави е liaccxcraiio", Алд:а-Лтс-. 1С73; "Ij:сд^во болсодд овец" , Фруддэ, ICTC; ":¿; 'е:-:-

*:::oi:hi;o болззил соль<к;о::озл."сг.:епл12с siisoï-inc", ¡¡оглсибцрс::, h С*.j.

- --'ово.двюоко'. !;о:.::;сс:::. до ба:л'ордалвд1д.: дропсратв,.! ВГФ1С1 вс-тд.рс^арауов Госдвоодгсдд СССР, Мосдва, ICcC, IL£С гг.

- Сводов совете ВГ. LC". всвдоодарагов Гооавроввода СССв, Лосева, ICcí., lío'l, ПСС гг.

- Учено:: совете Казахского I1T3" ¡:рд оассдотрсддд 2ТД па

про царить:, ISCC, ICSI, ICoC, lùiZ гг. и ежегодно up:: заслупиванхп отчетов.

- ЛеввгаСордгоодо:.: соведвад: соврдддддо Каз;В.В'., IС С,0 г.

Кроле того, датордглд деодо д)вад:д' о::;::, '"додо'д:. "лнлч в сдсдоздвдд павдлъсда "Зововдддрдв" СССР -j ICGC г.;

В IClw', lt. wO', ГВ.

IM^X,:-;^. рсз^а^з;; ^'Q^-lP:^^ Седовддо давовдслч ддесорта:;дд о::;, блддовадв в -il no'-uvir-u: раСотах, 3 дордв. ::д:ю-ве ;:дв:ссд:в: доку; дддчд:, дввор^двдддд вдвэсвоввдв :;: орвв^.оа^вд-

авторских снидетс.^дсввад л uvo.vícb°.g:;ií.;.

СС"-од - от д-л-:туоа длсссооацлл. Г^ссор.'ацлг: ::зло:'еда да 4LG страпдга:: . .в-длодлсдово такс: а д eibbübbcb ввододдо, обзор литературы, соСоввовдде досдо. ;эводдя, обсуд. цвддо результатов, вдво--дд, вддвддвсддв' дрсддо: д:дд:, сддсод .дтворстурв д кр.вдг:o¿b:o.

Работ:: д:д:;св;-дроладв г, 3 таолдд;.,. :д, 2 р.:е;/д:в;дл д IV '.ото-гра"дл.д:. Оддсод дслодвсоваддод литературы ^ггзча-зт 54 :• дсвод-ддда . С д.д;ю::с:д:д дродеводл :::о доху.лсдтсъ , г:одгвср::в;а:о-

д.лд результаты расов-: л сс драдтлчеедуд здадд гость.

1и

ООЬЯТЬ^НЬЬЙ ЫССладОВАН^Л

Работа „;;из:..м.л::,св с 1910 ад 1503 1г -I Казахское ааучло-г,есле^д£азслб01а» во те дикарь:;.: „ист;.:; ¿е, Дльлгпкско;. й'по:;с;у>8и~ нате и отдельных хозяйствах Ресоубликл Каэдхсгдж

отдельные этапы :.ссло д;за-то а^пвсщдпо^ гсЕлссг-о о К.^Одлреипо, В.О.Осляксвси, Г.Х.Мзрйкепс^ой,

и.'и.Уанапсвым. В ксйпссиокию: оылех принимали участие представители IVь оио?, Б В ..азС^?, ветпрспа;ггов и практические ветеринарные специалисты.

Ма1ерпалы и методы исследовании.

В океперкма1тальных исследованиях но изучению токсичности и вирулентности культур м-лкроорганизмов, безвинности моноанти-гб нов и ас с Си^уивашшх вак: пн било использовано более 380 кроликов, морских свинок, белых мине: , сиен, ьи ягнят о возрасте 1-4и дне: , о^ гслсек молодняка круш-.огс рсгагогс скота в возраста 6-15 месяцев.

производственнке испытания вакдин проводилась в неблагополучных но сибирской язве и клострпдиозам хозйгсава-ч Казахстана па поголовье СЕыде '±?С тыс. овец и 15 млн. крупного рогатого скста. Внедрение ассоциирование;, вакцины претив сибирской язвы п эмфизематозного карбункула осуществлялось в ¿ьги-цл-^ гг в

страна:: О.д', где ежегодно использовалось хо-аС млн. ^сз препарата.

В работе ^рп^знлли мпк¿сЪиОьОРичха'иг, £ио-

хпмлчеелке, серологические. №мк1олх<№Ш(:КЪ£ >ш*/одк исследовании СО-М-,/*«/ Я^КЙЗТГ»»'

эпепериыш'.цсс.нецс1>ги-,ии и Ёасциньпе.и х£нгЦ|/1«.01. регГгхпаопз ?иай: 6 - ; Ь^Э,, ЙгЗл , '

С - { N 2.16, 48, С-оЧ ), я - ( :;• 213, £1, 29 ); С1. веро1сиш N 1094; С1. оес1ел1а"Ь1еп0 - ,1,- 34; С1. еЬаиуое! ? г 2/14;

Б. апгьгас±з - ИИ, ^ 55, 4-7, ^ 71 - 2-ой вакцины Ьенков-ского.

Выращивание микроорганизмов с далью изучения их культурально-морфологичестис': и бйохлшгческ;:х свойств проводили на мясопсптонпом бульоне ОШШ- Китт-Тарощгаи), 2;",- келатюго-глтозокровяноу агаре (по Цейслеру), п.4тагольних средах с сахарзгдх и многоатомными сп;грта:.'л (цбст*;о" ряг,}.

Повинтило вирулентности и селекцию культур Сх.сЬаиуоез., си. аерЗДсип,С1.оеиеиаи-эпз, В. ап1;гас18 проводит;: путем пас-

сата через орглллзл лллсглых по ол'лпргл'лпл" методика:-.

Для получения токсинов л анатоксинов при: :епллл "орлентатиз-исо л клслотнчэ гидролизные питательные среды: гксопачепочиогсзеи-лсг-тую ( ), ла:лсреа~;:ческого порзгара мяса ( ), среду, изготовленную на ось'ове перевара Ноттингера С среда Хоттингера ) и злсперлсектальлул - на оскоре '.•орглонтатяЕШСС глдролпзатог впгареп-кого мяса, лазе ила, лочелп с -обаалвнпег: экстракта дро\лзй, пептона, плела л сро л: ¿'¡по ( ЛГл-1Г, ).

Ллчостло питательных сред огоедолядш ло содерлашгз облсго ( . лег од Леслера ), амквного азота'( метод "ормольного тизровсшж по Сзренсену-Гавретову ), триптофана ( по лолкову ), полкяеитддов ( колориметрически по блурэтовол реакции ), гонцестрации водородных лоло? (яатешщометричоска). Отепояь раслеплсллл Селка характеризовали амяняк.. коо.Т'Шают'ог.

Холсчостзо микробных ¡леток н I сл'"' взнес:: устьнакшввла по опт;:чесло:.:;/ бактериально; ¡у стаиларту Г.1011 л.л .[.А.Тарасовича и бактериологически - внсенол последовательных разведении взвесей культур на плотные питательные среди ( -.ПЪ\ л чайках Петр л ) с псслоду:г';г* ло^счето:. вкросшас колоний.

Бактериологические псследозакяг проводтии обцоцрлнлтклл лето-дамп ллл изучен:«; типичное?;: штатов, лзготоккжш и контроле г..онопрешратоп л ассоциироваины:; гакцзл ва стеральпость, чистоту I; типичность роста, концентрацию микроорганизмов л бактериальных взвесях, а такле при определеллл обселелеллостл органов л тканей заваленных яякогинх.

Ассоциированные вакцлн:: конструировал:: лз прлпяоьлопасс антигенов в л.глунолог:шес:ск оттитрованных соотношениях, с учет от,: антигенной, активности препаратов. Пря наличии в них ливых и убитых ("юргдалинлзировашлсс) аптпгепоЕ, л последних определяли количество свободного ( несвязанного ) формальдегцда {;,1.Я.'Зельд-мап, 1С68) л проводили его нейтрализацию.

При разработке технологии изготовления сухой ассоциированной вакцины проводили исследования по подбору стабилизаторов ( защитных сред высушивания) и установлению оптимальных режимов лиофшшзации с учетом эвтектических температур.

Сублимационную сушку вакцины осуществляли в вакуум- оушиль-ных аппаратах КС-30 ( ЧССР) или ТГ-50 ( 1ДР).

Безвредность и реактогенность изготовдешшх препаратов проводили путем подконного введения их лаборатории.! зщвотнш л последующего клинического наблюдения за ними в течение 1С суток.

Специфическую активность препаратов изучали е сравнении о таковой известных вакцин или моноантигенов, входящих в состав ассоциированных вакцин.

Напряженность и продолжительность иммунитета у животных, после введения им опытно!? вакцины, проверяли в сравнении со специфической устойчивостью глвотных, вакцинированных мокопре-паратамн. Перед вакцинацией, а такке через 1-6-12-18-24 месяца после ее проведения, от животных брали кровь и определяли наличие в сыворотке специфических нейтрализуюгцех антител. В отдельных случаях проводили комиссионную проверку напряженности иммунитета путем экспериментального заракения подопытных и контрольных ;?лвотных.

Срок годности вакцин при хранении устанавливали путем учета сохранения млзнеспособных' спор СТК ( бактериологически) и проверки активности препаратов на квотных через различные сроки

Наличие колострального иммунитета у новорожденных ягнят изучали в динамике через 1-3-5-10-20-40 суток. Для этого от ягнят, до употребления молозива, а затем через указанные сроки, брали кровь и в сыворотке устанавливали содержание антител. Полученные данные сравнивали с результатами по определению антител в сыворотке крови, молозиве и .молоке матерей.

Производственные испытания опытных Еакцин проводили в неблагополучных по сибирской язве и глострвдиозам хозяйствах 1Сазахстана.

Учет и анализ результатов производственной апробации проводили комиссионно путем обобщения лабораторных исследований и эпизоотологических наблюдений в хозяйствах, где применяли опытную вакцину и соответствующих результатов из тех хозяйств, где применяли монопропаратн или биофабричнке вакцины.

Уровень иммунологической активности ассоциированных вакцин и мопопреиаратов устанавливали такие лутем определения 30'/—oii эффективной дози ( EHgg). Олнкпгд путем определял;'! дозу Жй^шшрувдпс препаратов с учетом проявления всех степеней о::шдаемого эйфекгп: с: его отсутствия ( минимальная доза), до 100,'йоГ. зсшты (гибели) в группе "исотпш:, вакцинированных ( зараяекннх ) s максимальной дозо. Расчет ( ЛД~0), Г' проводили используя метод лербери ( '.¡.¡Ыпкарин, Л.А.Воробьев, 1С62 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Разработка технологии получения анатоксина Cl. perfrin^ens типа Л

1.1. :;звскаш:е питательной среды для выращивания клострлдкй, изучение их б:;ологлчес:;их свойств и подбор штаммов- продуцентов токсина.

Для ::ультпвироЕания анаэробных микроорганизмов группы ci. periringens широкое использование получ^ти питательные среди па основе перевара Хоттпнгора, '-«тсопэченочио-Еазеиновая среда (T.HIK ), среда из панкреатического перевара мяса (ПТГЛ ) и др. Б основе большинства из них используются "ерментативные и кислотные гидролнзаты мяса, печет;, казеина. Часто в составе питательных сред находятся побочные продукты- гуцуснке вещества и недо-окисдекные продукты ферментативно несозревшего мяса, качество которого зависит от многих факторов, в частности возраста и пола гдпзотпого, условий содержания, кормления, сезонности года и др.

Ка;.:и в качество основа питательной среды, были использованы Ферментативные гидролизатн казеина неглубокого расщепления, а также гдцролязат вываренного мясного фарпа- продукта отхода после получения мясной воды, экстракт хлебных дро.тлой, пептон, ппэно и среда Згдо,

Проведешше исследования показали, что мясные среды обеспечивают хороший рост микроорганизмов и накопление бактериальной массы, :ю препараты, изготовленные из этих культур обладали слабыми иммуногенными свойства:.ш. 1>ерментат явные и кислотные гидролизаты казеина, представляющие собой Госфорсодерп;ащу1Э белковую Фракцию молока, позволяют получать стабильные резуль-

таты по росту и токсинообразованию культур микроорганизмов, но с малым накоплением бакмассы. Испытано свыше 10 вариантов питатель них сред с различным соотношением компонентов, из которых лучшей оказалась среда, содержащая панкреатический гидролиза? казеина, гидролазат Еываренного мясного фарша и дрожжевой экстракт, взятке в соотношении 2:2:1 . Для лучшего роста микроорганизмов, накопления токсина к его индикации в состав среды были введены пшено и среда Эндо, содержащая лактозу, агар-агар и бисульфит натрия .

Приготовленная питательная среда после стерилизации путем автоклаварования имела малиново- красный цвет и содернала общего азата-42С-о70 мг/£, амшшого азота-1?6-?00 мг/о, безбелкоЕОГо амин-него азота-120-124 остаточного азота- 250-400 мг/ь, белка-0,. 1,3«, пептона -1,5-3,5%, триптоцана-оО-биыГ/ъ, показатель концентрации водородных ионое в среде был равен -3,15-В,55 ^рЫ ), коэффициент протеолиза ^ остаточный азот к обще.му)-0,7.

11<ж инкубировании культур микроорганизмов С1. рег1г1г^епз среда необратимо изменяла цвет, что соответствовало окончанию процесса выращивания культур и максимальному накоплению токсина. Таким образом, введение индикатора в среду позволило нам визуалы контролировать рост культур и избавиться от дополнительных процессов по определению токсичности культур на белых мышах.

Биохимические исследования состава этой среды до и после культивирования с1. р=ггг1пвепз еыяеили закономерности,происходя^ в процессе токсиногенеза- значительный расход низкомолекулярных ; тистых соединений, с незначительным изменением аминного азота и триптофана и постепенное снинение показателя концентрации ьодоро; них ионов (рЫ ).

Определение биологических сеойств различных штаммов (л.^еггг ^епз показало, что их метаболические процессы достаточно полно у; летворяются сочетанием компонентов питательной среды ППС.Щ. В культуральной жидкости отмечено накопление микробных клеток дс

о

3,0-3,5 млрд/ см , а токсинообразование составляло 2500-20 ООО ДШ/ьи.

Сравнительное изучение активности квасцовых концентрированных анатоксинов, изготовленных путем выращивания микроорганизма на различных питательных средах в лабораторных условиях, позволило заключить, что для выращивания С1»рег£г1пйепв типов В а ^ наилучшими питательными средами являются мясопеченочноказеино-

вал среда ( »¡ПК ) я опытная среда лз панкреатических гидролнзатов казеина, вываренного мясного фарша п дрожжей I ПГдМД ).

Кз тппоЕых атаммов С1.реггг:1п£;епв лучшие шдмунизпруздлс свойства проявляет антигены, изготовленные из (я.ре^гЗлсепв типов 1>Д-Ь,, О-Ге '¿Та, Д- ¿5 213 ( табл.1 ).

¡.сдчтысая пидкпе питательные среды при культивировании различных ггашозС1,рогГг1ак«по была установлена высокая степень вариабельности морйслогаи культур, что позволило нам увязать это явление с тсис/¿необразованней и проводить селекцию штаммов, отбирая популяции культур способных расти при более высоких ( щелочных ) значениях рЛ-о,3-е,;5. За счет этого, мы смогли отабилизирс-вать рост п получить вне окот окоичка е культуры, из которых приготовить соответственно и более активные анатоксины.

¿лодуе? отметить, что при культивирований С1.рогГг1г^сиз в течении ¿-1.2 часов не отмечено изменении морфологических свойств микроорганизмов, тогда как вырацивание на других питательных средах I ШШ, МШБ, ¡.¡ПК ) изменяло корфологичеекпе признаки кло-страдл;и ¡>яи приобретая:: парообразную форму с неровномзрным окрашиванием клеток анилиновыми красителями и сохраняли жизнеспособность не более 3-х месяцев.

Разпабстка оешмов л способов культивирования клостридий.

Изучая динамику роста и токсинообразовачия культур клостри-лпй в зависимости от способа культивирования было отмечено, что визуалыю видимый рост культуры начинается через часа после засева матрсво!! расплода в :.;идку:-о питательную среду, аиксплс-нле биомассы продолжается в течение 4-6 часов при культивировании ■л. рег/г1п;";епз типа Ь и и 12-20 часов--при культивировании 01. регГ2-1г-^'епз типа Д. зтациоларнак фаза непродолжительна -2-4 часа. В этот период происходит максимальное накопление бактериальной массы и токсинов. Дальнейшее инкубирование культур приводило к замедления роста, отмиранию клеток и снижению ^разрушению ) токсина. В это время показатель концентрации еодо-'родных ненов снижллся с 7,6-3,3 до 0,0-6,3.

Внедрение предложенной нами питательно;] среды привело к необходимости пересмотра производственных режимов культивирован; ння микроорганизмов и обезвреживания их токсинов.

В процессе работы нами выявлено, что при. 5олее высоких температурных режимах культивирования некоторых штаммог микроор:

Та блюя I

Токсичность культуралнюй жвдкост;: л активность квасцовых концентрированных анатоксинов С1.рех*г±псепя танов 3, и, Д, полученных на различных питательных средах

№ | ппм ; МПК ! ! Хоттинге^а - МППБ | ПГШ - опытная

штаммов ; 1 ¡Токсичность!Активность ; ¡Токсичность 1 ¡Активность ¡Токсичность! ; f Активное? 1 ь!Токсичное? г ь}Активност

_ _ _ _ 1 _ 1 _АЕ/мл_ _ 1 JШZш[ __АЕ/мл_ _ 1 _ 1 _ АЕ/гл __ 1 _ _АЕ/ш[_

В-1 1000+300 0,8+0,1 3000+100 2,2+0,1 1500+200 0,8+0,2 1800+200 2,4+0,1

В-4 1200+200 0,6+0,2 2000+500 2,0+0,5 800+100 0,6+0,1 1800+250 1,8+0,2

С-219 1550+440 1,0+0,2 1950+100 2,0+0,2 1580+650 0,5+0,2 1620+250 2,7+0,3

С-18 1700+200 0,9+0,4 1500+200 1,8±0Д 1600+300 0,8+0,6 880+600 1,6+0,9

С-ЕГ 3500+550 0,8+0,2 2500+500 1,6+0,5 2200+550 0,7+0,2 2570+350 0,8+0,1

Д-213 1500+250 2,9+0,3 1250+400 1,1+0,5 1300+290 1,6+1,2 2733+500 5,9+2,3

Д-29 1700+545 2,5+0,6 1050+200 0,4+0,7 2000+320 1,5+0,8 2980+450 4,1+1,4

Д-91 2000+145 0,9+0,3 1500+200 0,5+0,2 1800+270 1,0+0,6 2500+225 3,8+0,7

м сг>

;и:з;:ог увеличилаотел ;дгдл10?0лла:: а::тлЕлсстл препарата, которая завис;:? л от след-' ллрлдилаи;л: (?а0,л.2).

ОаО лп:а Л

Оралллл аллкле даллле алллллоегл а кат лссллсзл Ci.por-t'rin.^enrî vruo; В :: .,, лзг'/гоьсеа-кг. л^л

лйгллдл;

; лплослл.

голь-

лал cco— :'iocT-.o : zyrj/j'ji. да * vi *

: -^оксдчлостл лл-дл:ллост:.

¡анатоксинов,

.1. 'Jl.per-i'j'i л^.-пи длил

CUL „г LLLU

.L ; -11; ЧДС

0. Ci.per- 0 — û

frin:;e:n3 т;Л:а C-o Час

1! ~ И

¡ОООЦ : i

17-10 лас

'ivJ'w^+OCC

II^'j+v 30

и ,1гС+С, la

С ,Ç5 I ,<-0+0, £u

n ~ л;;дло, что ллатолсднн, полу-бидл л û-IO т»з алтллдео лтю-

.»з лрллодоллл.. даннид таи: чоллла па оллдло" сродл - îLAÛ.U паралол, пэлучлдллд ла 101!.

В лрллллоделлолплх условиях лрл лугътлвлроллклл ллдроорга-ллзлов в реакторах и,5-1,0 токсичность культур достигало 20 tf:c.^¡OL.I/лл:, а активность изготовленных препаратов, л опытах ла оегд::; древьлала -lu ¿¿/»л.

Олт;л,:алънл:' л иплоплолк: : для производства плллатсл лел:в.: лу^ьтлвлрованлл Cl.perfrin^ens тина Д - при 07-0c.J0 л течение 17 -lu часол, а типов В л С при 4:00; л тепелнл с-; лас .-.а OÏOOu.

Оапн оОразо-., те:. поритурныО ро:ли;: и продол'л:тальностъ л::-радиланил зависят от вида :лнгаооргаллзлол и состава питательно" сродл. 1а.юпе того, нал;: отмочено, что двул.-атлое добавление л лдталелънул! среду но (к сухом;.. недоет::;/) лдннозл, нар-

лич.-о - после глубинного засова культуре и повторно - в стадно-нарно! 'азе с корреляцией р:1 до уровня 7,0-о,0, способствовало увеличению бактериальнол :.:acci: л токсинов. Отл данные но в нол-ло.' ::?ро согласуй с,- с наблюдениями J1.В..0:р;л:доЕа (108-,).

1.3. Разработка способа непрерывного культивирования клсстридий

Экономические расчеты производства продукции микробного синтеза показывают, что непрерывный способ их получения является наиболее рентабельным, экологически чистым и удобным., при этом биохимический состав среды и состояние микроорганизмов обусловл! ваат изменения скорости и интенсивности биосинтеза. Б этом случае еле,дует учитывать, что часто возникают быстрорастущие популяции, превосходящие исходную культуру, которые могут не только сохранить или улучшить ростовые свойства, но и снизить количество и качестве конечной продукции. Вышеизложенное побудило нас npOEecTf специальные исследования в этом направлении.

объектом наших исследований явились микроорганизмы c*j .periri sens типа J, штамм # ¡319 и ci.chauvoei штамм Зт=. Опыты были

XV

проведены в специально сконструированном реакторе обьемем Юл, позволяющим учитывать и регулировать на заданном уровне показания бактериальной массы, рН, температуры и проводить культивирование микроорганизмов в непрорывном режиме с частичной заменой ш. тательной среды.

изучение морфологии и динашпш токсинообразования при непрерывном культивированииС1.рйгГг1пе;ог1з типа С позволило определит! оптимальный объем подачи питательной среды. Нами установлено, чте стабильное накопление, бактериальной массы в пределах 3,0-3,5 г.ир! м.т. и токсинообразование 2-4 тыс. л¡LM/мд происходит на 2-е сутки культивирования при скорости подачи питательной среды 150-200м<1/ час,то-есть с заменой 1/50- 1/70 части объема реактора, при увеличении подачи среды до ЮйОмл/час, отмечалось ьышвание культуры и снижение накопления токсина i. ¿00- 8GU ДЕ,1/мл). Уменьшение подачи питательной среды до 50 мл/часv т'акке оказывает отрицатель нее влияние на рост микроорганизмов и активность токсиное i ¿50-5G0 да1/мл ). Имели место нехарактерные изменения в морфологии клеток, в ферментативной и биохимической активности.

Ваяно отметить, что наибольшее токсинообразование наблюдается при исходном значении рН- 8,0-8,5 с последующим, в процессе роста культуры, сдвигом реакции среды в сторону кислотности v рН-о,5-6,0 ). Поддержание рй на уровне 7,4-7,6 в течение всего процесса культивирования, как е вариантах с добавлением питательной среды I непрерывный способ), так и в вариантах с поддержанием рп на одном уровне в течение 6-8 часов без добавления

энергетического материала не приводило к увеличению токсичности.

Из результатов проведенных опытов по непрерывному культивированию ci.perfrintiGna типа 0 мы заключили, что данным способом возможно получать значительные объемы бактериальной массы, но малое количество целевого продукта-токсина. Эти данные были использованы нами для изготовления анавакцины против эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

Установлено, что длительное культивирование вирулентного птамма Cl. caauvoei приводит к заметшем изменениям его

вирулентных свойств. Более иммунсгенннми был:', образцы вакцин, полу ченные из исходной * 24 часовой i л 4-х суточной культур, по сравнению с препаратами, изготовленными из культур 6-8 суточного культивирования oí. chauvoeí Е непрерывном потоке, что бале учтено при дальнейшей работе.

1.4. Очистка, обезвреживание и концентрация анатоксинов.

Б технологии изготовления анатоксина весьма вамное место занимает очистка и инактивация исходного продукта i токсина). При этом необходима лакелмазьная сохранность антигенных детерминант. J этой целью используют физические и химические методы. Однако токсины при этом часто подвергается разрушению и утрачивают необходимые свойства, а изготовленные из них анатоксины малоэффективны. Кроме того, при культивировании микроорганизмов в реакторах большой емкости ^ 1-3 м°), когда на процесс очистки через сепараторы i центрифуги^ затрачивается несколько часов, отмечается явление переростания культуры, что ведет к потере токсичности.

Ь это.<; сеязи с целью сохранения антигенной и иммуногенной активности анатоксинов ci. perirín^nns , а также для исключения еозмонного загрязнения токсина посторонней микрофлорой в процессе его очистки, нами разработана и предложена следующая технология его получения: засеЕ и выращивание культуры С1.рехдГг1пкспэ типа Л проводить на ПГЩ в танкерах емкостью 0,3-1,0 м^ в течени< 17-20 часов до обесцвечивания питательной среды, затем для активирования ярототоксина добавить стерильный раствор трипсина или панкреатина ( I: 200 ) и через 20-30 минут - формалин í!0,6-0,8% из расчета на 4Ó;¿ раствор формальдегида] Одновременно начинать очистку культуры от микробных тел и взвешенных частиц.

Л с следование 7 серии анатоксина с 1. ре1-х\гд.вдзпз типа Д, <

исходной гоксйчкоогьо 6-l-5zi° да/мл и 35-50 Ь'С/мл, показало, что токсические свойства культуры начинают изменяться уле через 15-20 при рК-Ь,Е-3,4 и к кокну очистки С центрифугирования)

т.е. через 2-3 часа, снижались в 3-5 раз, в то время, как акт'я-генность ( 20 ) оставалась без ХЕменендС. Лвгепсирнов сайкекяо токсичности пределталось 1-2 суток при 37-3£°ü и составляло к концу С,1-е,±5 от исходно;'. В дальнейшем эгог процео; гесядлтся, и для полней ветокенкепин требовалось 3-Ю суток,

■«.гмечена поймал зависимость сдввения в.ллгодяод активности и детоксикацнд препарата от ксддчоотьа добавленного ^ср:..аднна, температурь: и величину показателя дедороднк.; ионов.

.учитывая, что J ормальдегид реагирует с нуклеиновыми основаниями, а продукты реакции очень нестабильна и удаление дзбвтка ,, еомальдегида ».окег привести к практически полно;, регенерации .„сходных соединений, нами проввдонк исследования по обезвоезванию бета-опеплон токсинов Ol, perrria^ens гл,утарйвым альдегидом , нерекиоыз водорода, этанолом и озоком.

добавление перекиси водорода в предела?; С,2у, сбзси:е«д£&лс препарат ¿.с оледно-нелтого цвета и приводило и дегокепно. .;в ;свсн-..ов на о--5 сjiiBi. .'¡с,!ол евленнкс хак^!« образом анатоксинв г. с еле i-0;.übb. од..сд м^ели ^ыхльл. гслогбпкк:. осадок,

безвредны дли лабораторных цветных й ¿с„ел^ большую спевиГичеснуд активность, немели анатоксины доомалиновке.

1лутасовки альдегид в. количествах обезьре^гзл

тсисньь. на сутки ей01ьеютвеш:с. Йолучепнве при этом

анатоксины обладали в два раза более низкими *у низ прущими сво£> CTBaivUä, чем препараты обработанное формалином, плоде сорбировалась и светло-коричневыи цвет.

отанол v IC'/* ), озон v ;.дк.) обладали слаок.» АвЕокси-

двЦ:.оннк:.и. свойствами, но хорошо сохраняли антигенную и ¡ай«укогеа-нуtj активность.

'iакнм образом, оптимальные услоьил обезвреживания бета-эпсилон токсинов Cl.perfrin^sns создается при однократном или дрои-i;o;.i ¿обавлении С,С-С,Ь- усомалина, с,<;/5 пеоек.хн водорода,

. 4.0/ъ этанола ,„ гакгв озоном пул телнературе о д ¿М-С,Ь-б,"±. лнатоксидь: Ol. pari'rincons Типов j и д , полученные нр;; ссблвден;н, олдх 5СлСьи1, обладав вдео^и...., ^.рнс-генныди ивовстзад:.

1.5. Изготовление квасцового концентрированного дианаток-спна против инфекционной энтеротоксемии, вызываемой

01.рпп'гхп^епз ТИПОВ С+ Д .

ири ярог,паленном освоении технологии изготовления дианаток-сина С1.рзг::-г>п. типов 0+ Д было установлено, что независимо от взятых количественных соотношений антигенов, отмсчаетсч их взапмо-угнетащеэ действие ( табл.3 )

Таблица 3

Кмууногенная активность производственных сепий эданатсксияа и.регГгги^. типов ¿+Д и соответствующих моноантигенов•

а ерии :!пп анаток-: сияа :^оотно-: :шение : :антиген: ¿¡ЗГОТОЕ- лено,л. : Активность, АЕ/мл

: по типу 3 : по типу ЗГ

3 + Д 2:1 ¿10 35 с 5,0

Мои о -5 лоно - Д - - 3,2 30,0

с 3 + Д 1:1 115 0,6 У,0

У. он 0-3 ;.|ОНО-Д — — 2,0 2в~0

3 3 + д 1:1 262 0,1 6,0

;.1оно- з ЛОНО— Д — — 0,3 40,0

4 3 + Д 2:1 240 0,2 4,0

у; он о-з лсно-Д - - 0,3 40,0

Устрани,ть конкуренцию антигенов мы попытались путем изменения технологии I. исключали добавление трипсина ), а такке путем подбора соотношений антигенов с учетом антигенной и иммуногенной активности кандого из них.

Этим нам удалось несколько снизить взаимоугнетаюцее действие антигенов, но не полностью решить эту проблему. Установлено, что на 240-320 антигена дл. перфрингенс типа 3, необходимо брать ¿3-50 антигена лл. перфрингенс типа Д. У ОЕец,привитых этш дианатоксином в дозе по 5 мл двукратно, антитела в сыворотке крОЕИ отмечались в титре 0,05-0,6 АЕ/мл по типу 3 и 0,2-1,2 АЕ/гл. по типу Д. У квотных привитых монопрепаратамп- 0,4-0,6 А'¿/¿и и 1,0-1,6 А¿/мл, соответственно. Этот принцип конструирования ассоциированных вакцин был использован в дальнейшей работе.

Tî!»uj3i.rv4f»0'^!S ксллллтгл ллгллйллоллл ;лл.ллот.лл-liue свойства суллф .уалллл:

олбллслл,; л Ллу с>лл;олллл ллли.^г е.'ллл1 Л

л-ï- Нсдбор oui ч!.-jл-ллллол.л; ;лллл ллгл; .

известно, что одллл л/- вллсь.уллл лол;-лс^, лрл лсготеьлл л; ассоциированных, лрслэратол слл ЛЛЛУ;,:: ллт'О

оооткскеигл вхо/л^'а). .¡; аесопд¿ало лл'ллч-лсв. ь ¿лл св.юл лелдс лолтрлллзл'ул: осталоллол': ло-рлл; лл-л ;."д у лулл'^ллл лл л; л.?:"..; j-

ü..1 •гг torons тлл; л h., л iitMTy .л; л л ;л1тллл':-л;1-

„и.'лдлм jn л лс ' • ' :лсл :л. ; ..;,-лллл

оо. ?BpOrjHÜCT4, рс еллопл: лллтл л;.', лулллелл^;: глл- ллллл^'л сл^л'л-.:;-

.лс- л'^иЛЛЛ^-кллоы лаллл.л ; л -y-j, с 'у г л .л: л о: ■

лл лорсллл с^лллллл -ллллл сллл>

л ллрлол о:ллл- Сллп i7:; л.лст'лл.- лл- : лл. - ; • л ;л:;л /:..\л-"-лл--1ЛЛ;<0/ иллллл с ллл;лллл;ал-!л: л;0 ."л -- _л .-,С лл~ -л-р Лл-в однсл ;ллллл.:л'ри ллллллллл. лл'ллслл лл^:р«Л| лл- ллсл-.^-.ы: лс Jj лоссллх о.!;,л л-лл и лрс л.лл. лл;.. л рл.ллллл л ;.лллл" л л дозах 1,0 л 2,0 лл сглгллсглл-!^:; ■ ■■";-! л-л: лллллр.л-.ллл что у кроллксэ тлллуллпй-лл-ллл лллллл.р-'ллл.л/ л.лл.ллл. лл,.л;л^. ■ лел л лрлвллал.лл уоло л : л !'-■ ■■ л л у ' г .л: ЛЛ'^.. .-'л л лл> леУтрвллсуллл. ллтлтсл л ллорллл; лу„>л. ллллллл - 0 лл

Лл/лЛ, Л V Л:ЛЛЛЛЛЛ ...СЛлу. уЛЛ- ЛЛа ЛЛлЛЛЛ!, ■

лллэл г,0 л ЛС, Л ллл сл?- О, л л .Л'1 л J . ;Л ..-д:-; /• :.л.л л^-лл-г лувэп.л;- ;ЛЛлЛЛЛЛ- ЛрСЛЛЛГЛ; л,л лллл лл. v : л'у--ЛЛЛ < Л л;л:.::'"'. л-лл. ллллучллл. л'л; ллллллх.лгу оллл.лл- ■ . -лл-/

лллц ллр1лллллл сллс[:;л'ллл ллл ллл.'.ллл л-лл' "', ; •• р у;лллл:"-

сл.пй ,тп.;с 3 г с1 - " л j 'лл ;.у.р,;к;л _■■■.> л л .".;."■ ч злч

тогд'"1 лл\л. в луулыпл, ;л„л :л; ллллл.ч;...!, л.. ллллл:у лл, чллл ь ло'л л. л.1л сллр— лл.л лнл л~ л". : ллпл л; ''сл,

!ллс.л:л лв'л''. слл'л;лл; i лл~лл ллл л г ллл'..л''' ..лллл'л ллл-логе л;л5ллЛегл л .ллле :.,'лллл\. лл сл. 1 ллл\л., , ; л „¿>л-лле ~сло:;ллрлвгллсл лллуллл, лгу л :ллл:ллгл ллл л^-уулл'лл;лт!"' аллоксл-пэ , но проивлллл *'лг0;ллтл..0':л. л ллллл:* л л;лл.

Лорокла лвлллл 1л.лцлл::рллл::лле -¿сл.ллюл оодорлалеи в лолвл1.ас.?.л:; доле 3,0 +0,33 ллл илор после злра;;:е-глл; 2-с-Л ес.кцллол ).,слл.олололо в Ь? /о случлглс оставались кишт.

100/j устсччллсст^ л еилеле-ваила была у ллвотыил лрлвлткх асселллревлллол г.алллпе5 -лл ело?.; л"": л пр"-л]ла'л.:с;

дозе.

Таким образом, однократное введение ассоциированной вакцины с концентрацией 3,0 и о,0 млн спор ЛИ в одном миллилитре обусловило в организме кроликов выработку более высокого антитоксического иммунитета, по сравнению с животными, иммунизированными моноанатоксялом ci.t>erfr-Ln¿ono типа Д и привело к устойчивости организма кроликов и морских свинок к заражению сибирской язвой.

Результаты проведенных исследований показали, что ассоциация спор сибиреязвенного штамма ЛИ и анатоксина ci. peri'rinsüns приводит к синергическсму взаимодействию антигенов. Титр антитоксина, как после однократной вакцинации ассоциировачяой вакциной, так и после повторной иммунизации животных, на I0-30/L выше, чем в аналогичных опытах о применением моноанатоксина С1.ре-Л'г±пй;епз типа Д. Минимальное количество спор сибиреязвенного штамма ЗГИ-1 в дозе ассоциированной вакцины, обеспечивающей ICC>¿ иммунитет у овед к этой инфекции, как показывают опыты прямого заражения йиеотных, должно составлять не менее 15-25 млн.

Значительное, до 100 млн., увеличение спор ЛИ в дозе ассоци-ироЕанной вакцины, снижает ее эффективность по отношению компонента ül » perfri 1U,01;G ,

2.2. Технология изготовления сухой ассоциированной вакцины поотив сибирской язви и пн(*екцискнс{; энтеротоксемии типа'Д и испытание ее свойств.

3 целью увеличения срска годности препарата, стабилизации его свойств и расширения диапозона температурного ре:кпма хранения, нами проведены исследования по разработке сухой ассоциированной вакцины, изготовленной из квасцового концентрированного анатоксина ji.poi-nrincons тша Д и живых спор сибиреязвенного штамма ЛИ.

Были приготовлены образцы указанной Еакцины с добавлением ( 1:1 ) Ю/Ь келатшо-сахарозной среды высушивания, 10$ пептона, обрата молока, а также без добавления стабилизаторов.

Вакцину стерильно оазливали во флаконы вместимостью 200-

О *

500 см по 70-200 см препарата. Для уменьшения толщины лиофилп-зированного слоя, препарат намораживали на стенки флаконов в обкаточном холодильном аппарате ZZ 150/50 яри температуре -60-(-65 )°3 и подвергали сублимационной сушке в вакуум-сушильном аппарате типа ХЗ-ЗО Í ЧЗЗР ) в течение 48-66 часоЕ.

В результате проведенных лабораторных опытов получена сухая ассоциированная вакцина ( 27 серий, 181,3 л.), представляющая собой мелкопористую массу бело-келтого цвета, расположенную равномерным, слоем на стенках флаконов в виде пологе цилиндра толщиной 5-7 мм. Остаточная влажность составляла 3,5- 5,7/ь, выживаемость сибиреязвенных спор- 74- ЬЭЦ, Вакцина хорошо растворялась в воде v в течение 16-30 сек.) с образованием устойчивой гомогенной смеси. Все изготовленные варианты Еакцины были безвредны для лабораторных киеотныхи овец, умеренно реактогенны и обладали выраженными иммунизирующими свойствами. Установлено, что наиболее высокие титры эпсилон-антитоксина отмечены у животных, вакцинированных ассоциированной Еакциной Еысушаяной без защитной ерзды ( у оейц- 6,66+ 0,8 АЕ/мл, кроликов- 3,0+ 1,2 АЕ/мл) и с жела-тино-сахарозной средой высушивания i 5,с0+0,7 АЕ/мл у свец и I,'>'¿± G,& АЕ/ш у кроликов). Низкие титры антитоксина наблюдались у овзц -1,10+ 0,3 АЕ/мд и кроликов- 1,00+ 0,4 АЕ/мл, вакцинированных ассоциированной Еакциной лио^илкзцрованяой с обратом молока £ сравнении с данными, полученными у привитых моноанатоксином ci.perfrinaonsTiuia Д ^ У овец- 6,60+ 0,3; у кроллков-1,40+ 0,5-АЕ/мд). Дальнейшая отработка технологии изготовления сухой ассоциированной вакцины проводилась на Алматинском биокомбинате.

Было приготовлено 17 серий препарата в количестве 1105 л i 364,6 тыс. доз ). Лиофилизацию вакцины осуществляли в вакуум-'сушильном аппарате T1?-j0 ГДР объем каздой серии составлял 50-70 литров. В процессе изготовления Еакцины в производственных условиях было выявлено, что процесс.намораживания вакщшы на стенки флаконов трудоемок и требует много времени. Поэтому были поставлены опыты по лиофвлизации вакцины разлитой по 100 см^ во флаконы емкостью 200 см^, при толщине замороженного слоя 40-45 ш, с экспозицией высушивания Ьи-131 час. Изготовленная таким образом сухая ассоциированная вакцина имела вид мелкопористой массы в виде таблетки, хорошо растворимой в воде. Остаточная ьланиость колебалась от 1,6 до 3,2/¿ , выживаемость сибиреязвенных спор штамма JTH составляла 7о-£ё /¿.

Результаты опытов позволили разработать параметры изготовления сухой ассоциированной вакщшы в условиях производства ( рис. I ).

Т-ос

40 30 20 10

i -г

) 20

40 _

50

60

70

80 SC

100 Н

-10,

-20 -30 -40

/ ■

CL)'-J-luJLLJ >

Г

р'

''i:", от. ст.

Г~гт-——гт

3

График лкофглъиой супкл ассоциированной взкцйны против сибирской ДЗШ И ¡ИПЧОК.УЮШЮЙ SHTSpOTOKGQSSiíX овец

'1 о

( Сублиматор- ТГ-30, .•"лаконп-Г.ОО cif по ICO стл^ вакцины) I- температура продукта; 2- температура полок; 3- даакешш ч камере

Ъ опытах на овцах установлено, что на 5-7 сутки в сыворотке их крови обнаруживаются антитоксины в тире 0,Ой- 0,10 ЛЗ/мд, количество которых резко угеличдваетсн, достигая максимальных язличш иа 20 сутки у мивотных иммунизированных анатоксином С1. рсггпг^аис и аа 50 сутки- у изднизированных сухо;; ассоциированной вакциной. Б группе овец I голова), принтах ассоциированной вакциной, средний титр эпзилон-аитятоксиаа составил 4,41 + 1,54 ¿\3/ш, и в контрольной I 47 овец). вакцинированиях анатоксином соответствующих серия- 2,¿2+ 1Д7 АЕ/'мл, что указывает ьа синергию взятых в ассоциацию алтагеноЕ.

Средний титр эасилон-аятй?сксияа в сыворотке крови 200 кроликов, два;,-да иммунизированных ассоциированной вакциной составил 1,31 + 0,6 АЕ/мл и был выше, чем у кроликов, привитых моноанатск-сином Л ( 0,96+ 0,30 А2/мл ).

после внутривенного введения эпсилон-токсина 01.ре1Тг1исепв типнд, отмечалась высокая Еыживаемость I ¿¿,3 /ь ) кроликов, ярини-тых ассоциированной вакциной, тогда как'в группе амглунизированных натиБНым и сухим анатоксином, выживаемость составила 77,7 и 63,3 /о соответственно.

■ Ь опытах на морских свинках проверена активность изготовленных серий ассоциированной вакцины к возбудителю сибирской язвн » табл. 4 )

Таблица 4

Результаты проверки активности ассоциированной вакцины к сибирской язве в опытах на морских свинках

:Количэ- ;Кол-ео ;лОл-ео

:ство ' :миеотпых

Препарат .спор ЛИ:опытов ' в

"в дозе, . :опытах : млн

Результаты

.нвы/аал^-ва-^

Нативная аосоци-

ароБанная гакцина Ь,3+1,2 5 оО оО/ 0 ¿00

,;ухая ассоциированная вакцина 10,0+2,4 39 231 27о/ 6

Нативная вакцина сти 3,0+0,5 2 12 11/1 Ы,7

Сухая вакцина ЛИ 10,6+1,0 4 22 21/ I ■ Со, 0

лОЛРОЛЬ - II 117 Ъ/ 114 ¿,4

при Р< 0,0о

2С

Результаты, представленные в таблице 4 показывают, что устойчивость морских сванок к антраксу была одинакова, как при использовании дативной, так и сухой ассоциированных вакцин.

Установлено, что напряксшш игмунитет у морских овинок , вакцинированных ассоциированной вакциной наступает к седьмого дню после ее индекции. К этому времени индекс инипцированнеоти составлял 22,2 т&еоть, установленный срок формирования гшукитета в острых опытах коррелировало*. с освобождением организма от микроорганизмов сибирской язвы штамма ЛИ.

Результат;! олытсе на овцах и кроликах показали, что «цветные, вс.'сцинироваякые однократно я двукратно ассоциированной вакциной С в прививаемой доза 16,6 и ¿5,0 млн. алор Лй), в 100 и ¿7,3 /о соответственно, оказалась устойчивыми к заразэнда сибирской

Я320Л.

х..Ъ. йрсизвсдстьеккые испытания сухой ассоциированной вакцшш против сибирской язв« и инфекционной энтеротоксемии овец*

испытание ассоциированной вакцины против сибирской язеы и инфекционной эитсродскоемии в производственных условиях проводилось с разрешения ГУБ 7иХ и Ееюрннарного управления '..¡¿X Казахской -¡ОР в трех районах Алмат;шскоц области на поголовье сЕьше 462 тыс. овец.

О этой целью было подобрано 13 хозянстг, из которых в 3 применяли суху.о ассоциированную Ейкцняу, а о - с поголовьем #>7Ь6 овец, были оставлены з качестве контроля, т.г. в них использовали моаовакцааы.

избранный нами регион на дретям&нпи ряда лет яелядся неблагополучным по сибирской язве и шпекцисниоЛ энтеротокеемки, ¿негодно , осенью, здесь проводили поголовную вакцинацию овец против сибирской язвы с применением вакцины Лй, а е зимне- ве-сенее время стары овцематок давды обрабатывались поливалентной гйдроокиссалиглшюво:! вакциной против брадзота, злокачественного отека, инфекционной эятерстаксемии овец и дизентерии ягнят. Тем не менее, заболеваемость знтеротоксемией продолжала регистрироваться весной- с марта по май, осенью- с августа по ноябрь месяцы и носила спородический характер, проявляясь чаде в тех местах, где животные выпасались на хорошем травостое или по стер

Учитывая, что у животных Еырабатывается недостаточно напряженный иммунитет к инфекционной энтеротоксемии и исключая

прививки овцематкам во втором периоде суягности ( за 1,5-2 месяц; до окота), наш была намечена схема вакцинации овец по которой ранее незакцинированных против инфекционной энтеротоксеши овец, е первый год тонизировали двукратно анатоксином сх.регГгз-пйепа типа д и однократно ассоциированной вакпдной претив сибирской язвы и инфекционной энтеротоксемли. Б последующие года С осенью . проводили только однократную вакцинации ассоциированной"вэхцпной. ;1о другой схеме- в первый год овцам прививали однократно анатоксин, а в псследувщем-асаохушраваккую Еакцпну. Негодно осенью это поголовье животных прививалось ассоциированной вакциной .

Установлено, что нишотные, получившие в перьий год трехкратную приЕИЕКу, обусловили выработку эпсилон-антитоксина з титре 3,7 ЛЬ/мл. Антитела устойчиво сохранялись в течение года а достигали уровня 3,2 АЕ/мл, через б месяцев после применения ассоциированной вакцины и ¿,6 АЕ/мл- через год. на следущай год после однократной ЕакцЕнацоа-увеличилиоь до уровня 7,6 АЗ/ья и сохранились в титре 2,3 АЕ/мл к концу года.

Животные, вакцинированные по второму варианту схемы, в первый. год двукратно, а ¿диорвалом мс::;ду прививками ±20 и ¿40 дней, имели защитные титры антител перед повторной вакцинации 0,35 и 0,17 АЕ/мя, соответственно и значительно, е 1С- 20 раз, повысили уровень антитоксинов после ее проведения ( 2,2 и 3,6 АЕ/мл ). Эти животные активно реагировали на отдаленную ( через 300 и 120 дней) ревакцинацию. Уровень антител повысился до 4,0-4,8 АЕ/мл. продолжительность напряженного иммунитета превысила 12 месяцев. Титры антител через 6 месяцев составили 2,4 и 3,4 АЕ/мл, через год- 0,8- 1,2 АЕ/мл. :1а следующий год , после однократной вакцинации антитела сохранились черео 12 месяцев в титре 1,4-2,4 АЕ/мл

Зледовательяо, независимо от последовательности применения антигенов, у вакцинированных овец вырабатывается специфическая ответная реакция, причем иммунологической конкуренции антигенов не наблюдается. Значительный подъем уровня антител, отмечается в группах хиеотных, где последняя иммунизация проводилась в период угасания антитоксинов, когда их содержание составляло 0,170,35 АЕ/мл.(рис. 2 ).

Проверка фактического состояния иммунитета к сибирской язге и инфекционной онтеротоксемии, проведенная через различные сроки после иммунизации ассоциированной вакциной 4-17 месяцев), показал^ у яивотных напряженный и продоляителный'иммунитет С табл.5 ).

4-15 мая -Анатоксин

Г;

6-10 июня- Анатоксин У

5-30 сентября Асооц. вакн&на

3 апреля Анатоксин

5-20 августа Ассоц. вакцина

II - 16 совгября Ассоц. вакцина

Таблица о

Напрякенность и продолжительность иммунитета у овец к сибирской язве и инфекционной знтеротоксемии через различные сроки после иммунизации ассоциированной вакциной

-роки

после вакцинации,

К сибирской язве

Животных :из них :ВыЕива-зараке- "осталосьемость, но : кквых : "Л

К инфекционной энтеротоксемпа

Титр антиток-:.^°т" сина в сывс-

РОТНОМ,

:ьшнива-"емость,

I /с

1 6

12-14 15-17

ЛСНТИОЛЬ

13 10

12 1С

17 10 3 II

Ь'4,4 2,4-6,0 100

100 и,4-1,6

, и

100

100 100

Результаты, представленные е таблице 5, свидетельствуют о наличии напряженного и продолжительного иммунитета у оеоц, иммуни-зированнцх аосоцаирсванаой вакциной- Зти результаты были подтвэ-ркдены при комиссионной проверке ассотчтрогшшоч вакцины с представителями ГУБ МЗ/, ЗЗЗР и ВГНКИ ветпрепаратов ч Акт о- .¿.08.83г.).

Опыты проведенные по изучению неатрализуэдих свойств сывороток крови, полученных от иммунных животных, показали, чтс сыворотки обладают нейтрализующими свойствами в разведении 1:о0- 1:100,

Превентивные свойства этих же сывороток изученные в опытах на белых мышах показали , что они защищают их от заражения сибиреязвенной культуры штамма Л'К-1 в разведении 1:¿0-1:100, через 1-6 месяцев после вакцинации овец, и в разведении 1:60- через год.

Зыворотки крови от контрольных, неьакцянированных кивстных обладают слабой превентивной активностью, предохраняя ЗС?о взятых в опыт белых мышей в разведении 1:10.

Зухая ассоциированная вакцина против сибирской язвы и инфекционной энтеротоксемии отполирует интенсивную фагоцитарную реакцш которая несколько выше реакции, вызванной введением моносибиреяз-Еенной вакцины ЛК и коррелируется с устойчивостью морских сеянок к заракеншо 2-ой вакциной ЦенкоЕСКого и образованием антитоксинов е сыворотке крови овец.

Проведенные исследования позволили такие выявить существенные различия активности клеток РЭС у вакцинированных и яевакцинироваян кньстных е отношении сибиреязвенных микробов штамма ЛИ.

Таким образом, проведенные нами исслздоЕашж по специфической про^&шктяке огец против сибирской язвы и инфекционной энтеротсксемаи с использованием ассоциированной вакцины показали, что в хозяйствах, стационарно неблагополучных по этим заболеваниям необходимо в первый год проводить 3-х кратную привавку-ассоциарозаннол вакциной и двукратяо-аяатоксином С1.рб1-?г1п£спз тала Д. 5 аослздуздиг года это поголовье кивстных ревакцинарОЕать однократно ассоциированной вакцинсз.

Ь потенциально-опасной зоне по этим инфекциям, целесообразно проводить двукратную вакщшащш. Осенью (сентябрь-октябрь-1 провести вакцинацию всех янвотпых ассоциированной вакциной против сибирской язвя а екцаснно;1 энтеротоксемии типа Д, затем через .ч-л месяца- повторно их привить анатоксином. Ь последующие годы достаточно проводить однократную осенях.-;; ревакцинацию ассоциированное вакпдной.

2, Изучен не срока годности ассоциированное вакцина против сибирской язвы и тТекцисшой энтеротоксемии типа Д.

Как было показано выле, сухая ассоциированная вакцина против сибирское язеы и ингекциспной энтеротоксемии является полноценным прививочным препаратом а обладает выракеяныма пммуяизаругь-дими свойствами, как для лабораторных диеотных, так и овец.

Исследования показала, что в процессе хранения препрата в естественных условиях 1-15-1тйо)°и отмечается уменьшение числа милых микробных клеток. Через год после изготовления ассоциированной ьакцаны, концентрация спор -¿Т*; в препарате, высуденном без задитной срепи составила 83,6 +3,75^, а с добавлением обрата молока-73,2+8,4;^, мелатино-сахарозной срэды-67,8+5,57о, пептона-61,3 ±7,±%. Значительная гибель спор Л'Л наблюдалась в нативной вакцине- 35,6 +2,05,«.

Дальнейшее хранение вакцины привело к постепенному отмиранию сибиреязвенных спор. Так, через два года, концентрация спор в ассоциированной вакцине, Еысушенноа без задитной среды составила 56,6 +6,22л<, а в г.хносибиреязЕенной вакцине-¿7,8+ 5,5о, через 30 месяцев- ^5,16+1,84 а 43,3 +3,77,3 соответственно, ¿ниненае концентрации до 30,1 +¿,0% и 25 +3,С> отмечалось на 42 и 54 месяца после изготовления препарата и до 11,0 +2,0?'- через ¿6 месяцев.

Ь опытах на 362 морских свинках установлено, что вакцина

сохраняет псподиые свойства в течение Ь6 месяцев. Овцы, вакцинированные ассоциированной вакциной, хранившейся после изготовления

24 и 30 месяцев в 100$ случаях противостояли заражению сибирской язвой ( табл.6 ).

Таблица 6

. Напряженность иммунитета к возбудителю сибирской язвы у овец, кроликов и морских свинок, привитых ассоциированной вакциной с различным сроком хранения

Ввд животных :Кол-во :Кол-во : Результаты :Существ.

:опытов :&ивотных: :заражено. Живы • » : Пали : Зыжива-емость, iразличая, т

После изготовления вакцины

Овцы Кролики М/свинки 4 10 37 18 18 73 70 203 202 3 6 100 35 • 9 97,12

Овцы Кролики М/свянкл Через 4 2 7 6 месяцев хранения 20 20 12 12 35 35 вакцины 100 100 100 0,89 1,45

Овцы Кролики М/свинки Через 2 2 4 12 месяцев хранения вакцины 9 8 1 12 II I 22 22 88,9 91,7 100 0,27 0,51 1,10

Овцы Кролики М/свинки Через 2 I с и 18 месяцев хранения 9 8 6 6 25 25 вакцины I 88,9 100 100 0,27 0.8S 1,24

Овцы Кролики М/свинки. Через I 5 5 24 месяца хранения 20 20 27 26 вакцины Í 100 100 96,2 0^5

Овцы Кролики М/сеянки Через 1 2 3 30 месяцев хранения вакцины 5 5 -7 5 2 15 14 I 100 71,5 93,4 0~47 0,57

Овцы М/свшки Через I I 42 месяца хранения 2 2 10 10 вакцины 100 100 0~85

М/свинки Через I 54 месяца хранения вакцины 100 0,85

М/свинки Через Г 96 месяцев хранения 10 10 вакцины 100 0,85

Изучение продолжительности приобретенного иммунитета у овец, вакцинированных ассоциированной вакциной, имеющей срок хранения 3-14 месяцев,показало: иммунитет достаточной напряженности

сохраняется 13 месяцев у животных,привитых однократно, а до 17 месяцев- у привитых двукратно ассоциированной вакциной ( сроки наблюдений).

Сохранение специфической активности ассоциированной вакцины в отнесения инфекционной экторотоксешш изучали. путем

определения эпсилон-антитоксина в сыворотке крови у овец и кроликов, вакцинированных прививочными препаратами , гмйюзиил различные сроки хранения, а также в острых опытах- путем внутривенного введения эпеяяоя-г океана ох.рст^апу-эпа типа Д.

Обобщенные результаты опытов представлены в таблице 7.

Таблица 7

Устойчивость овец Е О ПСИЛОН~Т О колку С1. регГг 1п;.;еп£з после вакцинации ассоциированной вакциной шютяв сябкв-ско5 язвы 2 .инфекционной энторотоксемаи типа Д.

Продол-;Кол-во: Кол-зо: Титтз эпсилон: Доза : Результаты

яит, :прове--.заражена антитоксина ¡эпсилона-

хране- :ренных:ных : :токслна; : :Вылива-

ния,мес.сепий :животн.: АЕ/мт : ДЛМ :Жавн : Пали :емость,

После изго-

тоатения 6 26 0,05-0.2 2 4 3

вакцины 0,4-0,6 0,8-1,6 2 3 7 6 — 68,4

3 6 -

6 мес. 3 16 0,8 _ 3 2 „

I,2—2,4 •з и 3 - 100

3|2 3 II -

о 2 6 2,4 4,0-6,0 2 3 з 3 - 100

18 X 3 1,0-1,7 2 3 - 100

27 3 г* О 0,6-2,0 2 6 - 100

31 I 3 0,6-0,8 /•*> А, 3 - 100

108 2 6 0,8-1,2 2 6- - 100

Данные опытов показывают, что сроки хранения сухой ассоциированной вакцины не оказывают влияния на напряженность вызываемого ею иммунитета. Чем выше поетвакцпнальвзй титр актптоксина в сыворотке крови, тем устойчивей животные к заражению эпсилон-токсином. Поэто1лу, проверку годности ассоциированной вакцины к антигену С1. рёггг1п5епя типа Д, можно ограничить' путем определения титра" антитоксина ( АЕ/мл) в сыворотке крови вякндклроваккнх овец или кролякоз

Такая проверка годности вакцзни, как показывает накопленный опыт, является достоверно:"-, поскольку все другие свойства вакцины (в-хоинк." вид, растворимость, безвредность и др.) не изгоняется

¿Фоводеннне исследования позволяют зшдвячдть, что сухая ассоциированная вакцина против сибирской яздл и индэкционнол энтеротоксемли сохраняет 1гл,;уногенлыс свойства к сибирской язве 56 месяцев, к индокциспно;'. оптаротокселлд - ICfc месяцев с депонта изготовления (срок кйбладепяя).

3. Разработка технолог;;;: изготодненид ассоциированной вакцины против сибирской язвы и глострцдиозсв овец (брадзог, злокачественный отек, некротический гепатит, инлокдпонпла эптеротсксемид овец и анаэробная дизентерия ягнят).

йдд; расширения сдерн использования дредарата при различно:: эпизоотической обстановке, нами проведены исследования но разра-■ ботке ассоциированной ьак;ддш из анатоксинов Cl. pci-friagens типое В,С,Д, 01. oodemtiens, акакультуоы Cl.septicur.i и гл;-вых спор сибирской язви дта:д,"а Сгл-1.

Спиты, нроведенп-ые с антигенам;; био'йбрдчного изготовления (долпанадоксин против киостр;1диозов и сибиреязвенная вакцина СТ;Г), ползали их нестабильную и слабую иммуксгеинуи uktiiehoctb как в ;лоно, так к в ассоциированных вариантах. 13 лабораторных опытах были приготовленн моноваглуди; и проведен подбор хсомыонои-<-* тоз л состав ассоциированной зза.лдаы но их антигенной (ОС) и пмцумогсшо2 активности. Установлено, что для антигенов ci.per-fringeas типов В и С отс доза состаддяет IUC-I50 ЕС, для cl. porlringens тина Л и cl. oederaatiens-2G-i3u АС. Антиген. с1. septicura вызывал зациту кроли:соЕ от заболевания при его введении д дозе 0,5-1,0 ул. дз приготовлении;; мопоантпгенов, с учете:.: антигенной активности, были соста:лге1-ш варианты ассоциированной ' вакцина с разлкчдглд содержанием спор в прививаемой дозе: 2-612-24 млн/мл, и затем - шн/гл. 3 опытах на 4и кроликах и 120 морских свинках установлено, что минимальная концентрация спор СГл, обеспечивающая заапту СО..- :д;вотных от забодеван;дя, составляет GSC тыс., a ILO'j устой:чпкэсты'. к за-рад.сщдо обеспечивает вакцина, содервдгдая д прививаемой дозе 24-50 млн спор СТн. ¡Значительное увеличение спор О'Гн в дозе ассоциированной дактиль: (32G млн), енхает образование опсидох-антитсксина, по не влияет па образование бота-антитоксина и антитоксина Cl. oedematiens.

■J J

В целях проверки напряженности а продолжительности иммунитета у овец, привитых ассоциированной вакциной с различным соотношением антигена^ и изучения передачи иммунитета народившимся ягянтам, нами проведен опыт на 13С суягнях овцематках, '^иеотных ( по 3040 голое в группе) вакцинировали подкомно ассоциированной вакциной включающей 3,3-12,5- 40,о млн спор а о мл. полианатсксина. Через •*0 дней, за I - 1,5 месяца до окота, половика овцематок в каждой группе бала повторно иммунизирована поливалентным анатоксином, остальные- оставлены для наблюдения за угасанием иммунитета к кло-отрадиозам и изучения его наличия к сибирской язве.

«шашка чармирования антитоксического иммунитета к клостра-диозам бала более выражена в группах еивотных привитых двукратно.

лататоксины в титре 0,3-1,2 АЕ/мл обнаруживались е сыворотке крови через 30 суток после повторной Еакцанации и сохранялись в течение года ^ 0,1-0,2 АЕ/мл ). У нивотних привитых однократно ассоциированной вакциной, антитела сохранялись в течение 6-7 месяцев.

Проверка напряженности иммунитета к сибирской язве через 20 месяцев после вакцанацаи показала прямую завасимость выживаемости ;;;иеотных от количества введенных спор в составе ассоциированного препарата V табл.8).

Таблица 5

Напряженность иммунитета к сибирской язве у овец чеоез ^.0 месяцев после вакцинации ассоциированной вакцинол против сибирской язвы и клсстраднозов

-и---

лсл-во • Кол-во : доза : Результаты_

спор Ля Е ы :заоажения; . " Время :Выаава-с .._„„ :заражено. ~ ' :гибели,:емость, 5 ~ . : спор Пала . <~ивы. час. мл. Еакцины'_*____)_______"__

3,5 4 7 ООО I 120 120 75

12,5 4 -"- - * - ■ 100

'¿О, 5 о - 5 - хОО

Контроль 3 -"- 3 - оО-ЬО

Овцы в 100,а случаях противостояли заражению сибирской язвой через «¿0 месяцев после однократной вакцанацаи ассоциированной вакциной, содержащей в прививаемой дозе 12,о- -±0,5 млн. спор ЛИ и 75% иивотных проявила устойчивость при введении 1дя асссцааро-

ванного препарата, содеркащего 3,5 млн опор СТИ.

Полученные результаты позволит: разработать схему хгоахстп-ческого использования ейходшк, обеспечивающей в период возшпшо-венюг знзоотя£ кпксидглъноо образование антител у привитых ад-вотных. Лра этом,овцы хдг.хухьчз.трунотса сссоцаировашюЯ вакциной в августе - сентябре,то-есть за 10-15 дней до возмогшего появления глострщнозов и енбярег.ои новы. ;; довгорнуэ ревакцшкщкэ проводят в более отдаленные сроки- в конце йовраля- марте месяцев. 3 после дувдхе го:т,н это поголовье овец сакцгщруге однократно, осенью, ассошкхрованнок вгкхщнои.

Опиты проведенные в производственных условиях ( совхозы: ' РослаглъскпзТ, БазопскаЛ1, Тцдарлинский," 6С-лз?ля СССР Ллмгтпххской области) на поголовье 14560 овец показали, что ассоциированная вокцппа является безвредны;.!, умеренно резктогехшыц препаратом и облодает достаточным яро'илахппчеекпм оЛуектом, обеспечивающих состояние певослршютхшоархх гнивотных к хслострпдпозам п епбпрехоп язве, 3 период начала возмогших энзоотии болезней у япвотнхсс возникает самый напряженный иммунитет ( в первый год -0,5-1,2 в последующие годы 3,2-6,0 л болое АЗ/мл,к клостридиозам ).Цуглуна-тет к сибирской язве сохраняется евчие 20 мссяцев, к глостридп-озам- до 16 месяцев.

Антитоксины л сыворотке крови ягнят обнаруживаются в первые сутки после употребления :,:олозива от акунтос маток и сохраняются в течехше подсосного периода, причем их уровень коррелпру-отся с наличием антитоксинов в молоко п сыворотке крови матери.

В острых опытах, путем внутривенного введения летальных доз бета-токспха сх.регГгзл^спз типа В, определена устойчивость ягнят к анаэробно!, дизентерии в зависимости от наличия антител в сыворотке крови. Содержание 0,1 и болое Д2/мл антитоксинов, предохраняет ягнят от заболевания при инъекции мпшвдалыхой дозы бета-токсина С1.реп'г1п£опс типа В.

Проверка бозвродностп и спех'Хр'гчкостп ассоциированной закххп-ны против сибирской язвы и клострххдиозов показала, что препарат сохраняет эти свойства в течение 18 месяцев ( срои кнблюдехпхя) хранения при температуре +4+8°С.

4. Усовершенствование технологи! изготовления, контроля и применения ассоциированном вакцины против скбирскол язвы и эмфизематозного кабункула крупного рогатого скота и овец

Поя освоении технологии промышленного изготовления ассоциированной вакцины против сибирской язвы п зм^-зэматозпого кар-буш:ула нами ( К.П.Одаренко, П.М.Горелов, ISS0.ISSI ) было отмечено, что рекомендованный и обычно применяемый для обезвремива-пия культуры ci.ciiauvoei фордалин, проявляет свое действие неодинаково и продукты реакции очень нестабильны и обратимы, особенно это отмечено при связывании избытка формальдегида бисульфитои натрия. lie были регламентированы некоторые технологические параметры, в частности, допустимая концентрация бактериальной массы ex. chauvoei в составе ассоциированной вакцины, рЗ при шюкгивацип, сорбции, допустимое наличие остаточного формальде-гдцо в шковакцпне эмкара до и после его нейтрализации, срои: проверь активности препарата на лабораторных лпвотних и др. Хроме того, было отмечено, что в некоторых cop:inx изготовленной ассоциированной ваквднц наблюдается значительное сшшепие концентрации мпзноспособных спор СТП в процессе хранения препарата Б этой связи нами проведены исследования по изысканию других реагентов для нейтрализации остаточного ормальдегцца, так как бисульфит обладает сильными агрессивными свойствами.

Полученные данные поззолили нам рекомендовать более стабиль-нь:е и доступные химические седеетЕа: метабисульфит натрия и сульфит натрия и установить предельное содержание остаточного фор;лальдегида в анавакцине, которое не долкно превышать 0,03"J.

Применение сульфита натрия позволило упростить технологию изготовления препарата, так как он одновременно повышает показатель концентрации водородных попов -рН (табл. S ) .Б результате было исключено добавление едкого натра для корректировки отого показателя в готовом продукте.

Из представленных в таблице S данных видно, что добавление сульфита натрия в количествах, необходимых для проведения полной нейтрализации, приводило к защелачивашзо среды на 0,6-1,0 значении рН, что в дальнейшем позволило нам упростить технологию изготовления анавакцины и проводить обезвреживание культуры при рК—5,5-6,0 с последующей нейтрализацией формалина.

Таблица 8

Нейтрализация остаточного л обаатдмосвязанного Формальдегида в вакцине против эмфизематозного карбункула

( р11-о,3 ; остаточный Гошальдогид - 0,053,0 ),

•;сп.ользуемое вэдсство

1ЧОЛ-ВО

добавленного реагента,

Остаточ - : Выживаемость ныл "'ормэль- спор, дег , . ^

цуль;д:т , цат шт.

I.Оттитрован. £,Увеличено 2 3 —п—

::ол-во 0,3 6,0 0,041 65

■раза т г-1 , ^ 0,0±8_ , С08О 77

■""оаза Т О ^ ,о 6, ъ Со

ваза 2,4 7,6 р Г ■".'V. и , и^/О 1 ¿'7

."йотабнс.уль У.т натрия

.Оттнтрова:пюе кол-во С .Увеличено в2 раза С, 3. -"- -''- 3 саза ¿,3 5,05 0,00073 82

I.Оттитрованное кол-во 0,4 5,4 0,024 75

Увеличено в2 раза 0,8 о,15 0,0С47 85

Зопоставление рзактогенностп, безвредности, активности антигенов, изготовленных с сульфитом и бисульфитом натрия показало, что вакцины оказывают одинаковое действие.

В опытах на морских свинках установлено, что реакция в месте введения препарата изготовленного с сульфитом натрия елаб< Еыракена и не сопровождалась осложнениями. Морские сеинки, при-Еитые ассоциированной вакциной, содержащей в иммунизирующей дозе I 0,5 мл) 6-12-24-48 млн. спор ЛИ в Ь2-100 % случаях противостояли заражению возбудителями эмфизематозного карбункул* и сибирской язеы.

Наш уделено внимание изучению влияния концентрации водородных ионов 1рН ) на выживаемость спор ЛЬ в составе ассоциированной вакцины. На основе проведенных исследований установлено, что наилучшая сохранность спор ЗТИ достигается при щелочных значениях рН I 7,8- 8,0)..

В опытах по испытанию различных адьювантОЕ С алюмокалиеЕые квасцы, гидрат окиси алюминия, минеральное масло) установлено, что испытанные адъюванты могут быть использованы .для изготовлена ассоциированной вакцины, но менее реактогенным и приемлемым для крупного рогатого скота является гидрат окиси алюминия,

оптимальное количество которого должно устанавливаться опытным путем с учетом показателя рН. Наилучшие сорбционные свойства гидрата окиси алюминат проявляются при рН-5,4-6,4.

Изучая действие адьювантоь, нагла проведены исследования по возможности их использовании; в составе питательно:,; среды при выравдвании клостридий. применение 0,3-0,5;® гидрата окиси алюминп квасцов и 50/у легкого минерального тела с эмульгатором е составе среды Еыраашвааая культур, способствовало большему накоплению бактериальной массы, интенсивному росту культур и получению в 1,о-2 раза более эффективных препаратов. Кроме того, при этом упрощается технология изготовления.

С полью стандартизации ассоциированной вакцшш и определения степени пд.туногеыпости каздой серии препарата проведены исследован по разработке количественных методов :<о^тро;у: а::т;нн;ости асоолд-ирозанпод вакщшы против сибирской язвы и эмфизематозного кар-буглсула. Отобраны стандарте: имдуногеккоетп (ре'ерепс натддди:) указанных препаратов, стабилизации: свойств кодеры:: достигалась за счет лес~ильного высушивания и со::рз:д:дась на еднд уровне в течение 5 лот. Оценку ;д:.дд:оге:пюй актнвдостд образцов катдоГ серди вакцины и вхедяддх к ее состав антигенов проводили до едд-ной методике путем определения 50;? защиты млеотных от зарадения. используя данный метод контроля, нами проверены образце гакади, йзготоЕхеняих в производственных условия:; и установлено, что имеются знач::тедыше колебания в иммуноленной активности препаратов, ¿саг. в отнолешш к антигену эмфизематозного карбункула

1:3 - 1:52), так и сибиреязвенному антигену 1:2 -

1:10). Поэтот4у, используя количественный метод оценки препарата, можно изменять его гакцинцу» .дозу и проводить коктролыше исследования па технологических стадиях производства.

йзготовденная промышленным способом ассоциированная ватецина против сибирской .язвы и эмфизематозного карбункула по старой, с новой технологиям тела активность 80-100,^ и была нр:д.:оненз в хозяйствах Казахстана, Кыргызин, Украины и других странах СНГ, неблагополучных до эмфизематозному карбункулу и находящихся в потенциально опасно", зоне по сибирской язве, где проводится плановая двукратная вакцинация глшоткнх против этих ан'лекцкГ:.

Б период с 1287 по 1й£0 гг. на Адматитхком бнокомбинате изготовлено 24 серии вакцины в объеме 113 тыс.литров (00,5 млн.доз)

В ходе производственных испытаний у вакцинированных животных не было отмечено осложнений ни общего, ни местного характера.

Злучаи заболевания эмфизематозным карбункулом и сибирской язвой не зарегистрированы.

Преимущества прстивоэпизоотической эффективности ассоциированной вакцины против сибирской: язвы и эмфизематозного карбункула проверены в нескольких районах и областях республики в очагах периодических вспышек змкара в 1Ь8Ь-1ъ£4 гг.

Применение ассоциированной вакцины на условно здоровом поголовье позволило на 6 -е сутки полностью приостановить заболевание и отход кпеотных. следует отметить, что в неблагополучных гуртах илш откормочных площадках, где выделяются больные эмфизематозным карбункулом мпвотнпе, гибель латентно больных кивотных, как после применения ассоциированной в&яцгка против сибирской язг и эмфизематозного карбункула, так и моновакципы эмкара составляет 0,.

Этими", опытами установлено, что в лротивоэпизоотпческом плане на фоне проявления инфекции мс&ет быть применена ассоциированная вакцина.

Комиссионный! опытами с представителям ГУВ ОЗЗР и ВГНЛа ветпрепаратов установлено, что ассоциированная вакцина против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула создает у крупного рогатого скота и овец 100% иммунитет продолжительностью до 14 месяцев юрок наблюдения ), а у кивотных, привитых монопрепаратами, напряженность ¡иммунитета в этот же срок составила 80;» против сибирской язеы и 55- против эмфизематозного карбункула V Акт от ±6 августа ХЬ37 г.).

Применение ассоциированной вакцины эконошчески оправдано и позволяет сократить кратность вакцинаций с 4 до I, потери в продуктивности и соответственно уменьшить затраты труда, по сравнению, с использованием существующих моновакции.

3 учетом сделанных нами дополнений, ГУБ ссср в октябре

года утвердило нормлтиЕНО-техническухз документацию по изготовления, контролю и ярикенеаио ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула.

Полученные результаты позволили расширить масштабы производственной проверки препарата. По новой технологии на Алматия-ском биокомбинате ежегодно готовится 20-50 тыс. л. ( Ю- 25 млн. доз) ассоциированной вакцины, которая применяется в странах ЗНГ.

■j. Комплексная (одновременная) иммунизация овец против сибирской язеы , клостридиозов и бруцеллеза.

o.I. Комплексная иммунизация овец поотие сибирской язвы, инфек цлоннод энтеротоксеми овец типа Д и бруцеллеза была изучена нами в совхозах: им.М.И.Калинина и "Зарытаукумский" ¿латинской области на поголовье СЕыше 10 ткс. овец, ¿лвотных иммунизировали разработанной нами ассоциированной вакциной против сибирской язеы и инфекционной эатгротоксемии типа Д е комплексе с вакцинам: против бруцеллеза из штаммов lü, К-24 и Рзв-1. Ассоциированная вакаи евопилась подконно в безлерстную область за локтевым суставом в дозе 5,0 мл.,а бруцеллезные антигены- е области крупа :а дозе •'.,0 мл., взрослым овцематкам и баранам- штамм 12 и К-24, яркам-Рл .сследоЕания показали, что :::;:вотные, привитые данными антигенами, проявляли более выраженную иммунологическую реакцию в отношении инфекционной эатеротоксемиа. Токсинонелтратизуюдпе антп тела в сыЕсротке крови обнарукивали в титре 2,4-3,6 Ачерез <-0 дней после вакцинации к сохранялись в течение года '.0,4-0,6 AU

г.. бруцеллезному антигену антитела е РА выявляли в тире 1:100 i. три креста). Зппзоотологнческими набладенйймл констатировано отсутствие абортов бруцеллезной этиологии и появление ссложн нил после вакцинации.

5.2. Комплексная иммунизация ОЕец против сибирской язвы и клостридиозов изучена нами в совхозах им. 30 летая JJJP и "Айдар-линский" Ялтинского района Алматинской области в декабре 1087 и октябре Ii,38 годов на поголовье 17750 овец.

Исследования были направлены на изучение еозмоености кош-лесного применения противосибиреязвенной вакцины ЗТй с иоливалент ним анатоксином против клостридиозов.

Установлено, что вакцинация овец против сибирской- язеы и кло стоидйозое с применением моноЕакцин обусловливает образование адекватного иммунитета к кавдому антигену. Повторная вакцинация полианатоксином не угнетала напрякеннооти иммунитета к сибирской язЕе, а нейтрализующие антитела образовывались в титрах аналогичных, как при введении только моновакдан. Лапрякенность иммунитета к сибирской язве, проверенная е остром опыте, через 20 месяцев после вакцинации составила öü/i, из пяти заракенкых оеец в лнеух осталось-четыре. Ь этот срок, антитоксины были на стадии угасания и обнаруживались е титрах 0,03- 0,2 АЕ/мл.

Таким образом, в процессе исследований, проведенных нами за период 1971-1993 гг., предложена принципиально новая технология изготовления квасцового концентрированного анатоксина против инфекционной энтеретоксемии овец, вызываемой 'Л. реггг1лееп5 типа Д.

Разработаны новые ассоциированные гйкцины против сибирской язвы и клострздиозов овец. Внесены изменения и дополнения в технологию изготовления и контроля ассоциированной вакцины против сибирской язвы я эмфизематозного карбункула. Освоено ее про-мыдденное производство.

Предложена я внедрена в практику новая питательная среда для культивирования микроорганизмов, усовершенствованы существующие к разработаны новые, более эффективные биологические препараты, используемые для активной профилактики сибирской язвы и клострадиозов животных, применение которых сыграло позитивную роль в борьбе с инфекционной патологией.

ВЫВОДЫ

1. Питательная среда, состоящая из панкреатических гвдроля-затов казеина, вываренного мясного фарша ядрожней, обеспечивает основные метаболические потребности микробных клеток и пригодна для промышленного культивирования производственных штаммов

ох.рсгГгХп^епз , предназначенных для изготовления анатоксинов.

2. Квасцовые концентрированные анатоксины, изготовленные на питательной среде ПГКМД, сохраняют необходимый уровень иммуногвн-но? активности в течение 12 месяцев.

3. Анатоксины 01. рег1г1п^опз типов С и Д, полученные модифицированным методом, обладают высокими антигенными я иммуноген-ныгли свойствами, в 5 раз превышающими аналогичные коммерческие препараты.

4. АкТИВННе токсины И анатоксины С1.регГг1п;.;епз возможно получать путем периодического культивирования микроорганизмов по предложенному нами технологическому режиму или непрерывным выращиванием культур с заменой питательной среды 1/10 - 1/20 объема/час, позволяющим увеличить объемы бактериальной.массы при малом количестве токсина.

5. Непрерывный способ культивирования млкрорганизмов ci. chauvoeiB течение с суток приводит к изменений морфологических признаков miaría S;¡j. шкцины, изготовленные из этих культур, обладают слабыми; пммуногенными свойствами.

в. Анатоксины ci.perfrin-ens .возможно получать путем детоксикацпк токсинов глутаровым альдегидом, перекисью водорода и озоном.

7. Выявленная конкуренция антигенов при ассоциации oi.per-í^ingensiEna О и Д проявляется в уменьшении продукции антител у вакцинированных животных, причем в бсльаей степени к ci. p¿r-fringsпс типа Д.

контроль специфической активности прогивоклостр;даозкьх анатоксинов можно проводить на кроликах и овцах. При этом имеет место корреляционная связь зе с хитром специфически антител.

ь. оптимальным соотнесенным антигенов в составе ассоциированной вакцины против сибирской язвы и инфекционной энтаротоксе-мии является содержание 25-45 шн. спор Clvi в 5 мл анатоксина ci.porfrinsens тша л, которое обеспечивает напряженный иммунитет у овац против обеих инфекций длительностью более 17 месяцев.

¿. Вакцина, изготовленная из квасцового концентрированного анатоксина против инфекционной онтероюксвмпп овац типа д к апвкх Сибиреязвенных спор штампа Cía-i, высуженная методом сублылацпи с желатино-сахарознои средой высушивания и баз добавления защитных сред, одинаково сохраняет ишуногенные свойства и создает у вакцинированных животных болев напряженный иммунитет к возбудителю сибирской ЯЗВЫ И ЭПСИЛОН-ТОКСИНУ (Я. регГгхп^еио типа А, чем та же вакцина, изготовленная с такими защитными среда,ш, как обезжиренное молоко и ±Cyj раствор пептона.

±0. Сухая ассоциированная вакцина против сибирской язвы и инфекционной энтерогоксеши с остаточной злажностыо 2,5-3,5^ сохраняет исходные свойства без снижения активности не менее 3-х лет, при хранении ее в сухом, темном месте при температуре .неоднократно изменяющейся в пределах - 25 + 3U°C.

II. Ассоциированная вакцина, состоящая из живых спор сибирской язвы штамма CT*i и поливалентного анатоксина против клострп-дпозов, повышав продолжительность и напряженность иммунитета у вакцинированных животных против сибирской язвы до 16 месяцев, против клостридиозов - до 12 месяцев.

12. Дозирование антигенов, входящих в состав ассоциированной вакцинн, необходимо осуществлять по антигенной ( ЕС ) и иммуногенной активности.

13. Наиболее приемлемой схемой иммунизации овец против сибирской язвы к инфекционной эктеротоксемии и против сибирской язвы и клостридиозов, в неблагополучных по этим инфекциям хозяйствах. является осенняя их вакцинация и отдаленная - через 3-6 месяцев ревакцинация. В последующие годы достаточно ежегодной однократной осенней ревакцинации ассоциированной вакциной.

14. Ягнята, рожденные от иммунизированных маток, в первые сутки после употребления молозива приобретет устойчивость к заражению анаэробной дизентерией' и инфекционной эктеротоксемией. Антитоксины в сыворотке их крови обнаруживаются в течение подсосного периода.

15. Иммунитет, создаваемый у морских свинок ассоциированными вакцинами против сибирской язвы и клостридиозов, а такке сибирской язвы и эмфизематозного карбункула, наступает на 3-10-е сутки после вакцинации, его напряженность зависит от количества спор вакцинного штамма СТИ, введенных з организм в составе ассоциированного препарата.

16. Напряденный (100$) иммунитет у крупного рогатого скота и овец сохраняется е течение 14 месяцев после однократной вакцинации ассоциированной вакциной против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула. У привитых монопрепаратами животных,напряженность иммунитета в этот же срок составляет 80$ против сибирской язвы и 55 - против эмфизематозного карбункула.

17. С применением ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула, число прививок в течение года, вместе 4-х при раздельном применении соответствующих моновакцин, сокращается до одной.

18. Предлагаете колетественные методы контроля активности ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула позволяют выпускать стандартный но а-сявности препарат и оценивать взаимодействие антигенов на стадиях производства.

13. Иммунизация крупного рогатого скота ассоциированной вакциной против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула по истечению 6-ти суток обеспечивает полную защиту животных в течение года . Гибель от эмкара больных жлзотных, не имеющих клини-

ческих признаков болезни, на 3-4 сутки после вакцинации может составить C,4-i,5/í от имеющихся в неблагополучном стаде животных.

20, нейтрализацию остаточного и обратимосвязанного формальдегида в анавакцинах ( анатоксине) можно проведать сульфатом натрия, одновременно повышая показатель концентрации водородных ионов (рН) в препарате.

21. Оорбция антигенов и выживаемость спор СТЙ в состава ассоциированных препаратов находятся в обратной зависимости

( до определенных пределов) ог показателя концентрации водородных ионов (рй).

¿2. При применении предлагаемых ассоциированных вакцин против сибирской язвы и клосгридиозных инфекций не наблюдается суммации реакгогенпссти взятых антигенов и резкой выраженности местной реакции. 1шшические показатели в организме вакцинированных животных находятся в пределах, не превышающих физиологических норл.

23. Превентивные и нейтрализующие свойства сыворотки, сяго-цитарная реакция и активность клеток РЭй у вакцинированных групп животных свидетельствуют об отсутствии взаимоугнзтащего действия спор сибиреязвенного штамма 01»» и анатоксина Cl. pei-fx-ii^-ons типа Д в составе ассоциированной вакцины.

24. Одновременная прививка овцам противосибиреязвенной вакцины (Ли и поливалентного анатоксина против клостридиозоз или вакциной против бруцеллеза и ассоциированной вакцины против сибирской язвы и инфекционной знтерогоксемии типа Д, является безвредной, иммунологичеекп полноценной, экономически выгодной

и целесообразной в практических условиях.

5. ilrAKlVi4ÜCKviE ИРЕДДОйпНИЯ

i. бактериологическим лабораториям, научне-хеслс^оватлль-ским институтам и биологической промышленности для ищикацал анаэробных микроорганизмов и получения вакцинных препаратов против токсикопнфекций, использовать питательную сроду на основе ферментативных гидролизатов казеина, вываренного мясного ¿apea и дрожжей ( ПГКшД ), согласно авторскому свидетельству Л Ó5¿2i6.

2. Для профилактики заболевания огец инфекционной энтероток-семией применять "Квасцовый концентрированный анатоксин против инфекционной знтерс-иксеши овец, вызываемой С1. регГггпцепа ткяа Д". ¿го применение осуществлять согласно утвержденному ГУВ ЗЗЗР 1, ¿7. 12.1Э90г.) наставлению по применению.

3. В комплекс., дрставоэпазоотаческах мероприятий для вакцинации животных протиЕ сибирской язва и клостридиозов использовать

- сухую вакцину против сибирской язвы и инфекционной энтеро-токсемиа овец типа Д, согласно наставлению по применению, утЕер-аденному ГУВ Jj.jP от ¿6.декабря 1990 г.;

- ассоциированную Еакцину протиЕ сибирской язвы и клссгрп-диозов ОЕец, согласно наставлению по применению, утверздеаноглу директором лазМПБП, 1^89 г.;

- ассоциированную Еакцину против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого окота и овец, согласно даставлеяша по применению, утвержденному ГУВ ЗЗЗР 17 октября 1951

4. С целью создания у животных напряженного и продолжительного иммунитета к сибирской язве и клостридпозам применять схему иммунизации овец, включающую 2-3 -х кратную вакцинацию животных: в первый' год и однократную - в псоле;у;одие годы, которая исключает профилактическую обработку овцематок во второй половине беременности и позволяет, за счет передал.. д.дуадгегл

'.гнлтам, нре упредить заболевание сибирско;. лево'; д ;:лост.д..;ло^с-.д' в первые педели казна.

с. /;зготовлзние квасцового анатоксина против налекцасааой эпторотоксемпл своц типа Д и ассоциированных вакшш осуществлять согласно угвгр;.л;еннси 13Ь нсрмат^впо-техничсокой ;ск;;®атацай: 13-^0-0^-73 - ¿и; ТУ- 10-09-74- 90; ТУ-10. 19. 98- 89.

3. ,изготовление асссцдароьанных вакцин до ....выл антигенов и иормалинизированныл анавакцпн V ааатокеанов / осуществлять дсслз нейтрализации остаточного и сзрат.ло^вясанного чормалл ;с-гада сульфатом натрия-

V. для профилактики сибирской язвы :: клоотрпднозев у овец, в сложной эпизоотической обстановке, применять комплексную прививку монопрепаратами против этих болезней, согласно наставлениям по ах применению.

8. Осуществлять ветеринарное обеспечение при получении и вырадпЕании ягнят согласно ОЗТ хО.172 - 38.

'ОПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. ГорелоЕ ü.M. Специфические и неспецифические факторе имму-питета при ассоциированной вакцинации оеец против сибирской язеы и инфекционной энтеротоксеши //Болезни овец и меры борьбы с ниш в Казахстане.-Алма-Ата., IS75.-C.6I-S3.

2. Горелов Ю.М., Орешкин A.C., Панкратов л.Д., Трошнн И.у?., Умербаев А.У.,АбдрахманОЕ U.A. Опыт производственного испытания сухой ассоциированной вакцина против сибирской язвы и инфекционной знтеротоксемии ОЕец типа "Д" // Болезни овец и меры борьбы

с ниш е Казахстане .-Алма-Ата., 1076.-С. 63-65.

3. Панкратов Л.Д., Горелов iü.M., Орешкин A.C. Изучение некоторых вопросов иммунитета у лабораторных киеотных и овец, привитых ассоциированной вакциной против сибирской язеы и инфекционной знтеротоксемии // Инфекционные болезни овец.- }рунзе.:Илим,-

19 76. -С. ПО-Ш.

4. Панкратов Л.Д., Орешкин A.C., Горелов ¿.'1., Полякова Б.С. Изучение вопросов иммунитета у овец, привитых, сухой ассоциированной вакциной против сибирской язвы и инфекционной знтеротоксемии// инфекционные болезни овец.-Срунзе.: !аим,- IS76.-C.38-91.

3. Горелов jü.'ii.,Орешкин A.C. Изучение блеяния некоторых защат-ных сред высушивания на антигенную активность сухой ассоциированной вакцины против сибирской язеы и инфекционной знтеротоксемии // Инфекционные'болезни овец.-£рунзе.:Илим.-1976.-С.114-116.

6. Панкратов Ji.Д., Орешкин A.C., ГорелоЕ ¡j.v.. Испытание ассоциированной вакцины против сибирской язеы и инфекционной знтеротоксемии // Ветеринария.-1977.-::= 2.-C.33-39.

7. ГорелоЕ ¡Ü.M., Орешкин A.C. Питательная среда для культивирования микроорганизмов // Авторское св. 652216,- ¿1 ноября 1073.

В. Панкратов Л.Д., Горелов iü.tt..Пальчикова B.C. Опыт получения сухой ассоциированной'гакцины против сибирской язвы и инфекционной знтеротоксемии// Науч.Труды / Казахский НИЗИ, Алма-Ата,-Iii79.-С. 39-44.

£. Орешкин A.C., Горелов jJ.M., Панкратов Л.Д., Умербаев У., Набиев А. Ассоциированная вакцинация жиеотных как наиболее прогрессивный метод // Науч. тр./ Казахский ШшИ, -Алма-Ата,1379.-C.4B-5I.

10. Горелов ¿J.M. Фагоцитарная активность лейкоцитов у животных, вакцинированных ассоциированной вакциной против сибирской язвы и инфекционной энтеротоксемаи // Науч.тр. / Казахский НиБЙ, -Алма-Ата, II'733. 51-34.

11. Горелов Ю.М., Орешкин A.J. Зреда для культивирования клостоидий // Ветеринария.-1£3и.-.'О 10.-3. 2S-30.

12. Орешкин А.З., ГорелоЕ iu.Ll. Колостральный иммунитет у ягнят к инфекционной энтеротоксемии// Ьестник сельскохозяйственной науки Казахстана.-ISSC.-.') 12.-3.30-61.

13. Орешкин А.З., Горелов Иванов Н.П., Белобаб Б.л. Комплексная и ассоциированная вакцинация овец против сибирской язви, инфекционной энтеротоксемш типа Д и бруцеллеза //Науч.тр. / Казахский ШВИ.-Алма-Ата, I98C.-C. 1I4-II8.

14. Горелов jü.M., Наурнзбаев И.Б. Распылительная головка к ручному опрыскивателю "Росинка" //Рационализаторское предложение / Казахский НКБИ.-Алма-Ата,IS3Ü .-J: 9.

13. Горелов Ю.M.,Орешкин А.З., Умербаев К.У. Комплексная иммунизация ярок против бруцеллеза и инфекционной энтеротоксемаи типа Л // Науч.тр./ Казахский гВДЖ,-Алма-Ата.-1983

16. Орешкин А.З., Горелов ¡и.П., Панкратов Л.Д. Сухая ассоциированная ьакцина против сибирской язвы и инспекционной знтеооток-семии овец, вызываемой ci.perfin¿;en.3Tnna Д //Инфекционные болезни сельскохозяйственных животных / Науч, тр. 30 ВАОХННЛ.- Новосибирск.- 1933.-3.3,>-83.

17. Горелов iü.ívl., Орешкин А.З., Одаренко К.П. Ассоциированная Еакцина и ее роль в профилактике инфекционных болезней овец //Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана.- 1935.-й 7.

13. Орешкин А.С., Одаренко К.П., Горелов Û.U. Специфическая профилактика овец против сибирской язвы и инфекционной энтероток-семии тша Д с помощью ассоциированной вакцины // Каз НШНТИ, МЗХ.:Кайнар.- 1985.

19. Горелов Х).:л., Орешкин А.З., Одаренко К.П. интенсификация ветеринарных мероприятий в овцеводстве // Пндсорм. листок, Каз НШНТП .-Кайнар.-1936.

30. Горелов (U.yi., Ореикян A.J., Абуталипог А.А. ¡иммунологическая активность сньороток крови овец при ассоциированной Еакцинации //Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана, 1987. —¿. —

21. Горелов &).М. О длительности сохранения иммуногенных свойств сухой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и инфекционной энтеротоксемии овец // Науч.тр./'Казахский 11уйВу1 . — Алма-Ата, 1987.- б. 17-25.

22. Маланин Л.П., Антипов В.А. , Алухтов НЛ.1..Горелов и I "Ягнята"- Технология ветеринарного обеспечения при получении и

ЕырадиЕании //Отраслевой стандарт ССОР , ОЛ 10. 172-88.- Зарег. БИФ0-13.02.85. Л 8424775.

23. Какимов О.Ф. , Горелов Энтеротоксемия ОЕец //Болезь сельскохозяйственных киеотнкх,-Сказ.),Алма-Ата.-Кайнар.-1282.-

3. 102-112.

24. Какимов С.Ф.,Горелов Ю.М. Брадзот// е кн." Болезни сельскохозяйственных диеотных'; кказ.).-Алма-Ата, 1282.-3. 105-107.

25. Одаренко К.И., Горелов *).М., Ореккан А.С. Лвершенство-вание средств специфической профилактики сибирской язвы и кло-стридиозов сельскохозяйственных кивотных //Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана.-122и.-;;: 2.-3. 7д-7о.

26. Одаренко К.О., Орешкин А.С., ГорелоЕ Применение ассоциированных вакцин для профилактики сибирской язеы и клостр; диезов у диеотных в промышленных комплексах и специализированных хозяйствах // Бсесоюзн. науч. конф. / Актуальные проблемы Еетеринарной и зооинженерноЯ науки в интенсификации жиеотноеодс! Ivl.-I22U.-J. 26-2-7.

27. Колесникова Т.3. .ГорелоЕ и.'Л., Одаренко К.К., Орешкин А РаханоЕ С.К. Сравнительное изучение средств специфической профилактики инфекционной энтеротоксемии оьец, ьызываемой С1.рег£-гхп^апз типа Д // Депонированные науч. работы.-;'.■!.-1220.й4.-

3. 114-118.

28. Орешкин А.О., Раханов С.К. , ГорелоЕ 10.М. Аэрозольный метод лечения и профилактики гастроэнтеритов у ягнят // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана.-1220.5.-3.37-82.

22. Орешкин А. С., Одаренко К.Й., Горелов ли.;,!. Причины обусловливающие желудочно-кишечные заболевания у ягнят //Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана,-1220.-1,1 6.- 0. 76-78.

30. Горелов а/'. 1,1., Одаренко К.Й., Орешкин А.О. испытание иммунобиологических сеойств производственных серий ассоциированной вакцины поотие сибирской язеы и инфекционной энтеротоксемии овец // Современные проблемы иммунологии, биотехнологии,

генной и клеточной инненерди в Еетеоинарной медицине/ Всесоюзн. конф.-Нижний Новгород,-1220.С.-36-38.

31. ЗафоноЕ А.Ф., Горелов JU.M., Ушаков И.К. ,Помыткин Г.А. специфическая сыворотка из сборно;} крови ОЕец // Зовременные проблем иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине / Бсесоазн. конф. -Нижний -Новгород ,-1990.-J. 36-38.

32. Горелов iJ.ul. , Одаренно К.л. Диагностика иммунитета

к клсстридаозам // Научные основы технологии производства ветеринарии х препаратов. -1,1.-ДелкоЕС ,1991.

33. ГорелоЕ »ü.M., Зароков А.5., Колесникова Т.о. Получение специфического гамма-глобулина против инфекционной энтерстоксе-маа овец и анаэробной дизентерии ягнят //' Научные основы технолог

гаи производства ветеринарных препаратов,-М.-Делково, 1991.

34. Горелов iJ.Iv'u, Одаренно К.л. Пути интенсификации периодических процессов микробиологического синтеза бета- эпсилон -ток-синое ei.perfг1п;;епз // Научные осноеы технологии производства ветеринарных препаратов,';!.-Щелково, 23-24 апреля, 1991г.

35. Горелов ü.M., Одаренно К.И. Испытание иммуногенных свойств промышленных серий ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота // Xll Пленарное заседание межведомственной научно-методической комиссии по борьбе с сибирской язвой. 9-10 октября 1991г.,Ташкент.

36.Горелов Б.М. сравнительное изучение методов контроля активности протиЕОклостридиозкых препаратов //ЗОЕершенствованае методов государственного контроля ветеринарных препаратов/ БГНКн ветпрепаратов.-М. 14-16 мая 1991г.

37.Одаренно К.П., ГорелоЕ ¡u.M. Зпособ получения ассоциированной вакцины против сибирской язеы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого окота// ЗвидетельстЕО Ц 0020II2 Васкомизобре-тений "Привилегия".-1991.

33. РаханоЕ З.К., ГорелоЕ -ü.M. К вопросу этиологаа, профилактики а терапии пневмогастроэнтеритов ягнят // Науч.тр. / ¡казахского НлВИ.-Алматы,1993.-3. 1Jj-1j5.

39. Факимов 8.Ф. ,Горелое u.U. Эффективность применения гипериммуняой сыворотки крови лошадей при ротавирусяой инфекции а дизентерии ягнят// Актуальные проблемны вирусологии/ Тез докл. науч. конф. ,НКЗХИ Республики Казахстан, 13-20 мая 1994г.0.63-69.

40. Какимов З.Ф., Горелов ¡u.M., Раханов O.K. Профилактические а лечебные свойства сыворотки реконЕалесцентов при диарее ягнят.// Республ. конф. / HäUXH п.Гвардейский, 18-20 мая 1994г.

41. Горелов м.;.!. Способ непрерывного культивирована клос-трядкй // ¡Секционные болезни сельскохозяйственных животных / науч. тр. Казахского НлВЛ., Алматы.-1994.

Горелов ЬОрий :,и-.ха!лл^лы

"Топалаь; ауруы мен жануарлардыц нло стридко г>дарын алдын алудын о.-лне тан амалдары мен эд!отер1н жетшд1рудш би-слогиг-лык, кэне технелогиглык; нехл.-.дерх"

16.00.03. - мал дер1герл1К микробиология, иммунология, эпизоотология жене жануарлардыц жукпалы аурулары туралы мамандыгы бойынша биологиклык; гылымыныц докторы дережес1не аталган диссертация.

Зерттеулердщ мацеаты топалац ауруы мен жануарлар кло-стридиигын е'дхххнше алдын алудыц амалдары болад ы.

■ Зеллтеу кэтижесиеде топалац закцинасымен клестридиогдыц анатокелнхн досу арцылы шывдан бхрлескен вакцинаеыныц енпд-рхсте шыгарылуыныц технологиглын; тупк1л1кт: елшемх аньщта-лыкып, ауруларды болдырмауда алдын-ала к;олданылудыц ти!мд1-Л1Г1 керсет1лд1.

Д типт1 клостридиум перфрингенс себеп болатык к,ойлардыц жудпалы жыбырлад ауруына дарен анатоксиндердщ темен белсен-дхлхгтшц себептер1 аньщталды жэне керектлк орталарды.штам-дарды,технологиглык; режимдердг сурыптау нег1РШде вакцинаныц тихмдхлплн 5 мерте кетеруге мумкщпдк беретхн жаца технологи г сы курылды.

^алдардын топалац мен жудпалы жыбырлак; ауруларына, топалац мен клистридио^арга /сек1ртпе, жааыриьн 1с1ну1, бауыдыл е.'ллтух, жыбырлак жэне цопынын, к,ан тьшщагы/ топалац мен дарасан ауруларына царсы бхрлескен вакциналарды усыныл-ган жебе бойынша к°лданып, жогарьда керсетз:лген 1ндеттерден барынша аман садтауды цамтиды.

HopMaTHBTi - TexHHKiuiKi; «rpcaTTap tfofthmma CipjiecKeH BaKUjH-Hajiapflbi^ eHepicacinTiK Teeijii wrepijifii / Ty - 10 - 19 - 96 - 89, TY - 10 - C9 -74 - 90, Ty - 10 - 09 - 7b - 90 /.

OptiHaajiraH repTTey.nenin, HSmKeoinfle t6ji,n,i ajiy K9He ecipy majiaspirepjiik tex ho no t hf oh "Kpptaiap" any cajiajibik, ctakn,aptk;a eH/4.

GCHLLCV Ouri llihuil ovic'i "The bioiosioal una technological buses of perfection of (.'•ear.s and uuthoita of specific profilaxis of Siberian ulcer a/ii clOi'tridieyis of aniruil.o."

The theaia for the doctor 'a decree of biological science according to tiie speciality 16.00,03 - veterinary :aicnbioio~,y, inr.ur.olory, 6i>ii4ootolO£j- und the infectious dioea»»eis of uai»ii3

i'he ooj'eot of the reseroiieg were the means of specific prophylaxis of ¡siueria ulcer ana the oio^tricliosis of animals.

Tile liaraiao terj ol* technological prcceoocc of preauc lion of a&x associated vaccina« and e.natoxinca rara jjiven, and tAo effectiveness of practical using of their. in prophylaxis of Sibei'ian ulcer and olo;!tridiouia of animals are ;;hov,Ti.

i'he reasons of low specific activity cC anatoxin against Iho infectious GnT.erotuxej.d_a of the shewp were established caush.f; with Clostridium pori'i-in^eno of the typo D, and on the baoos of selection of the nutrient .v.odium and Uichnolo^ical rori;.:oy, ilg new technology cf tu'ouuc tion was worked up which allowed to raise Iho activity of a preparation b tisaes.

Tho use v/orl'ied up associated vaccines: against the sioe-rian ulcer and the infectious er.tero toxemia, the Siberian nicer and iho clos tr Ldiooeo (bradzot, malignant oedema, infectious enterotoxomia, anaerobic dysen lory of the laKsbs), .the Siberian ulcer and iho eiaphysematous carbuncuio, according to our scheme v/ith duo regard for seasonal displaying of onaootie, reduce« the expenditures to conduct the vacoiniscitions and provides the maximum specific protection, of animals from shown infection«.

i'he production of associated vaccines was mastered by the normative-technical documentations (TU-10-13-9'o-uj, TU-10-09-

Sa

-74-90, ÏU-10-09-73-90).

The materials of realized гезеагспс-s entered the branch stanaart "Lan.bs" - the tecunology Ox veterinary px-oviaing by receipt mid breeding.

Подписано к печати 24.Al.94. Зякяз ¿1. Титгск ICO экземпляров TCO "Багига". г.Ллуэты, пр. Райыибека, 157