Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка экспериментальной (лабораторной) модели для воспроизведения инфекционного процесса, вызываемого вирусом иммунодефицита крупного рогатого скота

На правах рукописи

ООЭ4884Э7

Бурба Василий Григорьевич

Разработка экспериментальной (лабораторной) модели для воспроизведения инфекционного процесса, вызываемого вирусом иммунодефицита крупного рогато скота

Специальность 16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

10 ДЕК 2009

МОСКВА-2009

003488497

Работа выполнена на кафедре биологии, вирусологии и генной инженерии ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Валихов Алексей Федорович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

профессор Брагин Геннадий Иванович

заслуженный ветеринарный врач РФ, кандидат биологических наук Надточей Григорий Андреевич

Ведущая организация - ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защита состоится <ДЗ» О&ЫзЕлЛ 2009г в часов на заседании диссертационного совета^ 1Д.212.149.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, дом 33.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета прикладной биотехнологии

Автореферат разослан «?/_» К&ды^^Л 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совет]

кандидат ветеринарных наук, профессор

Серегин И.Г.

1.0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (вирус бычьего иммунодефицита, ВБИ) относится к семейству Retroviridae и роду Lentivirus, который включает также вирусы иммунодефицита человека, кошек, обезьян, вирус инфекционной анемии лошадей, вирусы артрита - энцефалита коз и мэди-висна овец (Van Regenmortel et al 2000). Особое' внимание к вирусу бычьего иммунодефицита вызвано его филогенетической близостью к вирусу иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), что позволяет использовать ВБИ в качестве удобной модели для изучения иммунодефицитных состояний животных и человека.

Впервые ВБИ был выделен из крови коровы с повышенным лимфоцитозом, прогрессирующей слабостью и истощением (Van der Maaten et al 1972). При экспериментальном заражении телят у них появлялись противовирусные антитела и развивалась гиперплазия лимфатических узлов. Вирус бычьего иммунодефицита, встречается во многих странах мира и часто сопутствует другой ретровирусной инфекции, вызываемой вирусом бычьего лейкоза (ВБЛ) (Carpenter et al 1992, Meas et al 2003, Usui et al 2003, Snider et al 2003).

Работы, посвященные изучению ВБЛ, начали появляться в 70-х годах, сразу после доказательства вирусной природы лейкоза, КРС. К настоящему моменту изучена природа возбудителя, степень распространенности вируса в стадах разных стран, созданы системы диагностики и разработаны рекомендации по оздоровлению хозяйств (Гулюкин и др. 2005, Бурба, Шишков и др. 1985, 1992). Имеются только отдельные сообщения о выявлении ВБИ на территории Российской,Федерации, что не позволяет сделать объективные выводы о степени его распространения в популяции крупного рогатого скота (Колотвин В.В. и др. 2006, Федоров, Верховский 1996). В тоже время процент инфицированное™ животных в скотоводческих хозяйствах разных стран достигает 33%, на основании чего можно сделать вывод о широком распространении. ВБИ (Scobie, Venables, Sayers et al 2001). Получение информации о циркуляции вирусов в популяциях домашних животных. является достаточно важным для обеспечения здоровья КРС и безопасности продуктов питания.

Воздействие вируса бычьего иммунодефицита на организм КРС недостаточно изучено, а воспроизведение инфекции на естественном хозяине требует значительных материальных затрат. В связи, с чем возникает потребность в удобной, чувствительной к экспериментальному заражению ВБИ лабораторной модели. к

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным целью нашей работы является разработка лабораторной (экспериментальной)

модели для воспроизваения инфгкционного процесса вируса бычьего иммунодефицита.

Для достижения укданной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработка и огтимизация ПЦР тест-системы для индикации провируса ВБИ;

-изучить степень рспространенности ВБИ в различных хозяйствах Российской Федерации;

- получить инфекциошый вирус бычьего иммунодефицита;

- изучить динами;у инфекционного процесса ВБИ на экспериментально зараяенных лабораторных животных;

-определить локали:ацию провируа вируса иммунодефицита КРС в органах и тканях экспериментально зараженных лабораторных животных;

-изучить патологоенатомические и гистологические изменения экспериментально инфицированных ВБМ животных.

Научная новизна. Установлена чувствительность кроликов к ВБИ при экспериментальном заражении. Показано, что патоморфологические изменения у ВБЕ-инфицированных кроликов характеризуются спленомегалией и юражением легких. Гистологические изменения проявляются дистрофическими изменениями во всех системах органов и пролиферацией лилфоидных элементов. Установлена локализация провируса вируса бычьего иммунодефицита в тканях и органах инфицированных жиютных. Подобраны видоспецифичные праймеры для идентификации ДНК провируса ВБИ. Проведено исследование крови крупного рогатого <кота из нескольких животноводческих хозяйств на содержание провир^сной ДНК.

Практическая значимость. Установлено, что кроликов можно использовать в качестве лабораторной модели для изучения инфекционного прцесса ВБИ. Получена перевиваемая линия клеток легкого эмбриона коровы (FBL), продуцирующая инфекционный вирус бычьего иммунодгфицита. Разработанная тест-система способна выявлять провирусную ДЖ у естественно инфицированных животных и экспериментальна зараженных кроликов. Материалы диссертационной работы исполоуются в учебном процессе. Результаты работы использованы для составления учебно-методического пособия для слушателей ветфинарно-санитарного факультета по курсу «Ветеринарная вирусология» го специальностям 110500, 110501 и 110502, утвержденные советом по издательской деятельности МГУПБ.

Основные положения, выносимые на защиту:

- патоморфоюгические изменения у ВБИ-инфицированных кроликов;

-локализация провируса вируса бычьего иммунодефицита в органах и тканях инфицированных животных;

-получение перевиваемой линии клеток легкого эмбриона коровы (FBL), пригодной для размножения ВБИ;

- создание видоспецифических праймеров для выявления провирусной ДНК ВБИ методом ПЦР;

-исследование проб крови крупного рогатого скота из различных хозяйств РФ на содержание провирусной ДНК ВБИ методом ПЦР;

- обнаружение инфекции вызываемой ВБИ в хозяйствах РФ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены

и обсуждены на VII Международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2008r), II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008г), VI Международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007г), заседаниях ученого совета ГОУ ВПО МГУПБ в 2008-2009гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, вывода и практических предложений, приложения и списка литературы, включающий 149 источников. Работа содержит 8 таблиц, 17 фотографий и 16 рисунков.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Подбор видоспецнфичных праймеров для идентификации провирусной ДНК вируса бычьего Иммунодефицита

Создание тест-системы ПЦР включает в себя подбор специфичных олнгонуклеотадных праймеров, обладающих сродством к определенным участкам выявляемой нуклеотидной последовательности, создание адекватных позитивного и негативного контродей, оптимизация процесса амплификации по температурному и временному профилю реакции, изучение специфичности и чувствительности разработанной тест -системы.

Выбранная стратегия создания праймеров для детекции провируса ВБИ основана на компьютерном анализе максимально возможного

количества нуклеотидных последовательностей гена или фрагментов гена ВБИ для уменьшения вероятности ложноотрицательных результатов ПЦР-анализа.

Из представленных в базах данных EMBL, GenBank и DDBJ была создана подбаза, содержащая все известные данные о нуклеотидных последовательностях генома и отдельных генов ВБИ. Следующим шагом было множественное выравнивание участков генома выбранных изолятов с помощью пакета прикладных программ LaserGene MegAlign_v6. Оценку вариабельности выбранных последовательностей ДНК и поиск консервативных участков для конструирования видоспецифичных лраймеров осуществляли с помощью системы ClastalW Multi Sequence Alignment. При разработке наборов праймеров были проанализированы различные локусы генома ВБИ - гены gag, pol и env, фрагменты которых могут быть маркерами для детекции провируса ВБИ. В результате были обнаружены высококонсервативные участки в гене gag, на основании которых были подобраны специфические праймеры: gagl (5'-GTCTTCCCACATCCGTAACАТСТССТ-3') gag2(5'-CCCCAGGTCCCATCAACATTCATCAG-3') Праймеры, синтезированные на синтезаторе ASM - 102 ("Биоссет", Новосибирск) и очищенные посредством электрофореза в ПААГ, были получены от фирмы "Синтол" (Россия).

Сравнительный анализ методов выделения ДНК из цельной крови

Известно, что эффективность выделения и качество очистки ДНК оказывает непосредственное влияние на результаты ПЦР, так как низкая концентрация ДНК-матрицы и присутствие в пробе ингибиторов реакции являются наиболее частой причиной ложноотрицательных результатов ПЦР. В связи с этим в наши задачи входил выбор и оценка способов экстракции ДНК. Для выделения ДНК из образцов крови, были подобраны четыре различные методики выделения ДНК: лизис на основе гуанидингиоционатг. с последующей нуклеосорбцией ДНК на силикагеле с использованием набора для выделения ДНК Diatom™ DNA Prep 100 (ООО «Лаборатория Изоген»^ комплект реагентов для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы *оови (НПФ «Литех»); набор «ДНК-ЭКСПРЕСС-кровь» (НПФ «Литех); лизгс с использованием ионного детергента (SDS) с фенол-хлороформовой экстракцией и осаждением ДНК этанолом. Параметрами оценки являлись уровень чувствительности и воспроизводимости результатов ПЦР с использованием того или иного способа экстракции ДНК, а 1акже наличие или отсутствие фоновой амплификации, приводящей к поздению шмера на электрофореграмме.

Исследования показали, что наиболее эффективным оказался метод выделения ДНК с использованием готового набора реагентов Diatom™ DNA Prep 100 (ООО «Лаборатория Изоген»),

Получение первичной культуры клеток легкого эмбриона коровы (FBL) и инфекционного ВБИ

Линия диплоидной культуры клеток (FBL) была получена из первичной культуры трипсинизированных клеток легкого эмбриона коровы, образовывала монослой, прошла несколько десятков пассажей и сохранялась в замороженном состоянии при -196°С (рис.1). Клетки культивировали в среде DMEM с 10%-ной эмбриональной бычьей сыворотки.

Рис.1. Монослой культуры клеток FBL

Плазмида pBIV127, содержащая полный провирус ВБИ (Gonda et al., 1987), была получена из коллекции национального института здоровья США (NIH, USA).

Путем трансфекции первичных клеток эмбриона коровы плазмидой pBIV127, получена клеточная культура продуцирующая инфекционный ВБИ. В инфицированных культурах размножение вируса сопровождалось индукцией синцития и образованием очагов морфологически измененных

или поврежденных клеток (рис.2). В культуральной жидкости появлялся инфекционный вирус.

Рис.2. Цитопатический эффект (синцитий) в монослое культуры клеток FBL после трансфекции плазмидой pBIV127

Цитопатические изменения появлялись примерно через три дня после заражения нормальных клеток FBL и развивались с увеличением срока инкубации инфицированных культур. ВБИ-инфицированные клетки FBL (ВБИ-FBL) выдерживали обычно не более трех пассажей, поскольку клетки разрушались в результате цитопатического действия вируса.

Для поддержания продукции ВБИ в культуре клеток, ВБИ-инфицированные клетки ко-культивировали с нормальными FBL. Работа проведена совместно с Л.М. Пискаревой и к.б.н. Н.Ф. Гриненко (Институт биологии гена РАН, Москва).

Постановка ПЦР для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита КРС

Полимеразную цепную реакцию для выявления провирусной ДНК ВБИ проводили в оригинальных пробирках «МастерМикс» набора GenePak PCR Core («Лаборатория Изоген», Россия).

В необходимое количество пробирок добавляли 10 мкл ПЦР-растворителя. После полного растворения сухого содержимого пробирок в них добавляли по 5 мкл пробы ДНК из исследуемых образцов и по ! мкл каждого npaftMepagagl и gag2.

После этого содержимое всех пробирок перемешивалось путем встряхивания на вортексе. Затем в пробирки добавлялось по 2 капли минерального масла (20-25 мкл). Пробирки центрифугировались 10 сек при 2000 оборотах в минуту. После чего смесь помещали я амплификатор ("Терцик") и проводили амплифицию по выбранной программе:

- 1 этап - 94°С - 3 мин (1 цикл),

- 2 этап - 94°С - 45 сек, 58°С - 45 сек, 72°С - 70 сек (45 циклов),

- 3 этап - 72°С - 4 мин (1 цикл).

Для регистрации результатов использовали метод электрофореза реакционных смесей в 1,5%-ном агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием, путем добавления последнего непосредственно в гель до конечной концентрации 0,5мкг/мл.

Электрофорез проводили при напряженности электрического поля 5 В/см. Детекцию осуществляли в ультрафиолетовом излучении с длиной волны 260 нм. Результаты документировали с помощью видеосистемы, состоящей из трансиллюминатора, цифровой фотокамеры и программного обеспечения «ViTran Photo» (ООО «Биоком»).

Апробация чувствительности и специфичности ПЦР тест-системы для идентификации провирусной ДНК ВБИ

Для определения чувствительности тест-системы ПЦР использовали различные концентрации плазмиды pBIV127, содержащей полный геном ВБИ, ДНК из культуры клеток FBL и инфицированной ВБИ-FBL, а так же пробы крови КРС.

Проведенные анализы подтвердили высокие показатели чувствительности и специфичности разработанной системы.

Отработка методики ПЦР проводилась с использованием положительного контроля - ДНК из инфицированной FBL-BBH и отрицательного контроля - ДНК из нормальных клеток FBL. Постановка ПЦР с ДНК-матрицами, содержащими провирус ВБИ, приводила к выявлению ампликонов ожидаемого размера 382 п.н. (Рис.3). Сконструированные праймеры способные выявить около 1000 копий матрицы в 1 мл крови. Чувствительность и специфичность реакции можно считать достаточной для подтверждения инфекционного статуса животных.

Рис.3. Результаты ПЦР при использовании праймеров gagl-gag2, плазмиды рВ1У127 и ДНК клеток, хронически зараженных ВБИ (РВЬ-ВГУ):

1 - маркер молекулярной массы;

2 - отрицательный контроль амплификации;

3 - ДНК, выделенная из неинфицированной культуры клеток РВЬ;

4 - ДНК, выделенная из инфицированной культуры клеток РВЬ;

5 - плазмидная ДНК, содержащая клонированную провирусную ДНК ВБИ;

6 - отрицательный контроль амплификации.

Подбор ДНК-мишени и конструирование видоспецифичных I

праймеров для идентификации провирусной ДНК вируса лейкоза КРС

В связи с тем, что при подборе специфических олигонуклеотидных праймеров для полимеразной цепной реакции к вирусу лейкоза КРС, используются, как правило, данные о нуклеотидных последовательностях штаммов вируса, циркулирующих в странах Северной Америки и Европы мы поставили задачу, создать собственные ДНК-зонды для выявления ВБЛ, способные идентифицировать штаммы вируса, циркулирующих на территории РФ.

Из представленных в базах данных ЕМВЬ, СепВапк и ОЭВ1 была создана подбаза, содержащая все известные данные о нуклеотидньк последовательностях генома ВБЛ. Следующим шагом было

множественное выравнивание участков генома выбранных изолятов помощью пакета прикладных программ LaserGene MegaAlign_v6.

При разработке наборов праймеров были проанализированы различные локусы генома ВБЛ - гены gag, pol, и env, фрагменты которых могут быть маркерами для детекции ВБЛ. На основании компьютерного анализа были подобраны две пары праймеров:

Blv2 (прямой) 5'-CTGACCTAGAACAACnTGCCAATATATTGC-3', Blv9 (прямой) 5'-TTTGTCAACCGGTTACAAATrTCATTAGC-3'), Причем в том и другом случае использовали один и тот же обратнный праймер

BlvlO 5'-GTAGCCAATTGTATCTGTTCCGGGAGA-3' Оценка специфичности сконструированных праймеров при помощи программы BLAST подтвердила гомологичность выбранных праймеров с нуклеотидиой последовательностью гена gag, и отсутствие значимой гомологичности с нуклеотидными последовательностями других вирусов. Праймеры синтезированы на синтезаторе ASM-102 и очищены посредством электрофореза в ПААГ, были получены от фирмы «Синтол» (Россия).

Апробация чувствительности и специфичности разработанных праймеров для идентификации ВБЛ

В неблагополучном по лейкозу хозяйстве были отобраны 28 коров с различным серологическим статусом. От животных брали кровь с периодичность 2-3 месяца для исследования на наличие противовирусных антител и провирусной ДНК. ДНК выделяли из лейкоцитарной массы, полученной после лизирования эритроцитов. ПЦР ставили с двумя парами праймеров: Blv2/ BlvlO и Blv9/ BlvlO

ПЦР с праймерами Blv9-Blvl0 выявлено 6 положительно реагирующих проб ДНК, в то время, как с праймерами Blv2-Blvl0 дополнительно выявлено еще 3 положительно реагирующие пробы. Проведено секвенирование ампликонов, полученных с праймерами Blv2-BlvlO тех образцов ДНК, которые были отрицательные в ПЦР с праймерами BIv9-BlvI0. Во всех трех образцах ДНК в позиции 279 установлена одна и та же замена азотистых оснований - тимина на аденин по сравнению провирусной ДНК американского штамма ВБЛ, выделенного из культуры клеток FLK-BLV.

Хорошо известно, что краткосрочное культивирование лейкоцитов периферической крови коров, больных лейкозом, было ключевым моментом в открытии возбудителя. При культивировании лейкоцитов in vitro усиливается экспрессия провирусной ДНК, что приводит к

формированию внеклеточных вирионов ВБЛ. Мы использовали этот методический прием для исследования образцов клеточной ДНК и РНК, выделенных после краткосрочного культивирования лейкоцитов от тех же коров. Провирусная ДНК выявлена в 7 пробах с праймерами В1у9-В1у10 и в 18 пробах с праймерами В1у2-ВМ0. По всей видимости, такие результаты связаны с повышением конечной концентрации провирусной ДНК, как следствия культивирования.

Результаты сравнительного исследования животных в РИД и ПЦР с праймерами В1у2-В1уЮ приведены в таблице I. Животные, у которых в сыворотке крови были установлены антитела к ВБЛ, считались инфицированными.

Таблица I

Сравнительное исследование животных в РИД и ПЦР с праймерами

ВЬ2/ВМ0

Серологический статус животных К-во положительных в ПЦР проб К-во отрицательных в ПЦР проб Всего

РИД(+) 12 2 14

РИД(-) 6 8 14

Всего: 18 10 28

Из 28 исследованных коров антитела к ВБЛ установлены у 14 (50%) животных, из которых провирусная ДНК была обнаружена в 12 пробах, что составило 85,7% от общего количества инфицированных животных. Пробы ДНК от 2 инфицированных ВБЛ коров в ПЦР были отрицательны. Из 14 коров, которые по РИД были отрицательными, провирусная ДНК выявлена только у 6 животных.

Выявление инфицированных ВБИ/ВБЛ животных

В своих исследованиях для выявления неблагополучных по ВБИ или ВБЛ хозяйств мы применяли метод ПЦР. В работе использовалась ДНК, выделенная из цельной крови, либо лейкоцитарной массы животных различных возрастных групп и пород. Всего в работе было исследовано 224 проб из 4 хозяйств Московской, Вологодской, Калужской областей и Ставропольского края.

Пробы ДНК были исследованы в ПЦР с праймерами направленными на выявление вирусы бычьего иммунодефицита (рис.4), и праймерами Ыу2/Ыу10 на выявление вируса бычьего лейкоза. В качестве положительного контроля на ВБИ использовались образцы ДНК,

выделенной из инфицированной культуры клеток легкого эмбриона коровы (РВЬ-ВБИ): для положительного контроля на ВБЛ использовалась ДНК, выделенная из перевиваемой культуры клеток почки эмбриона овцы (РЬК-ВЬУ). В качестве отрицательного контроля использовали дистиллированную воду. Результаты исследований представлены в табл 2.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

382 ан.

-т тк * - т - #».♦•#»>

Рис. 4. Результаты исследования ДНК из образцов крови КРС в ПЦР с использованием праймеров gagl/gag2 1 - отрицательный контроль амплификации;

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, И, 12, 13, 14,15,16, 17-ДНК, выделенная из крови КРС;

18-положительный контроль.

Таблица 2

Выявление ВБИ- и ВБЛ-инфицированных животных в полимеразной цепной реакции

Субъект РФ Число исследованных животных Число животных, положительных на ВБИ (%) Число животных, положительных на ВБЛ (%)

Московская область (Шатурский район) 52 7(13,6%) 17(32,69)

Вологодская область 28 0 (0%) 18(64,28%)

Калужская область 24 0 (0%) 11 (45,83%)

Ставропольский край 120 19(15,83%) 32 (26.6%)

Итого 224 26(11,60%) 78 (34,82)

Как видно из таблицы, во всех регионах выявлены ретровирусные инфекции, вызванные ВБИ либо ВБЛ. Только в Вологодской и Калужской областях мы не обнаружили животных, инфицированных ВБИ. Тогда как в остальных, были обнаружены животные, зараженные обоими вирусами, или одним из них, или свободные от инфекции обоими вирусами. В среднем, из 224 проб 26 (11,60%) дали положительный результат на наличие ВБИ, что несомненно уступает зараженности тех же животных ВБЛ (34,82%).

Заражение кроликов ВБИ

15 кроликов, 2-4 мес. возраста, были разбиты на две группы -опытную (животные под номерами с 6 по 15) и контрольную (животные под номерами с 1 по 5). Каждому кролику опытной группы внутривенно инокулировали 1х106 культуры клеток легкого эмбриона коровы (ИВЬ-В1У) инфицированной ВБИ. Кроликам из контрольной группы инокулировали 1x106 клеток не инфицированной культуры РВЬ-В1У. В инфицированных культурах размножение вируса сопровождалось индукцией синцития и образованием очагов морфологически измененных или поврежденных клеток. Данная клеточная культура была получена путем трансфекции первичных клеток легкого эмбриона коровы плазмидой рВ1У127, содержащей полный провирус ВБИ.

В течение года, до момента убоя, за животными вели клиническое наблюдение. Кровь для исследований забирали одноразовыми шприцами с ЭДТА. Б-Мог.оуеИе с периодичностью раз в 1-2 месяца, результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы, в течение одного года у всех кроликов из опытной группы был выявлен провирус ВБИ, что свидетельствует о наличии инфекции. Особое внимание обращает тот факт, что у большинства уже инфицированных животных провирус исчезал из крови, но через некоторое время вновь появлялся, что может быть связано с особенностями течения ретровирусных инфекций. Через год, на момент убоя, у всех кроликов как опытной, так и контрольной групп провирус ВБИ в крови отсутствовал.

На протяжение всего эксперимента кролики оставались клинически здоровыми. Однако на момент убоя три кролика пали по неизвестной причине. Данная работа выполнена на экспериментальной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ совместно с Институтом Биологии Гена РАН.

При патологоанатомическом обследовании убитых кроликов в основном отмечали поражения легких: ателектазные участки, в некоторых

случаях ^спадение легочной ткани, отечность. У нескольких кроликов опытной группы печень была с явными признаками дистрофического поражения, мускатного цвета, дряблая на ощупь, желчный пузырь наполнен густой, темно-зеленого цвета желчью. Селезенка увеличена в размерах, на разрезе фолликулы плохо различимы.

Таблица 3

Исследование крови кроликов экспериментально зараженных вирусом иммунодефицита крупного рогатого скота методом ПЦР

№ кролика Дата взятия крови

Май 2007 Июнь 2007 Август 2007 Октябрь 2007 Октябрь 2007 Декабрь 2007 Февраль 2008 Май 2008

1 - -

2 - - -

3 - - -

4 - - -

5 - - -

6 - - + + +

7 - - + - -

8 - + • + +

9 + - + + - +

10 - + - + + -

И - + + + -

12 - + - - - -

13 + + + + + +

14 - + + + + -

15 - + + + - -

Изучение микроскопических изменений органов и тканей кроликов выполняли по стандартной методике с предварительной фиксацией органов в 10%-ном формалине с последующей заливкой в целлоидин («Методические указания по патогистологической технике», Москва, 2005). Работа проведена совместно с Якушевой О.В. (ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко, Москва)

Основными гистопатологическими изменениями в тканях являлись дистрофические изменения и пролиферация лимфоидных элементов. Поражения были обнаружены в почках, печени, сердце, легких, селезенке.

В печени убитых кроликов, опытной группы, отмечали сходные изменения. Увеличение межклеточного пространства сопровождалось инфильтрацией лимфоидными, печеночные балки истончены. Разная

степень окраски печеночных балок свидетельствует о дистрофии. В селезенке выявляли преобладание макрофагальных элементов и ретикулярной стромы.

В легких отмечали пролиферацию лимфоидных элементов как вдоль сосудов, так и в паренхиме, на фоне отсутствия воспалительных процессов.

Выявленные патоморфологические изменения у кроликов, инфицированных ВБИ, свидетельствуют о поражении в основном паренхиматозных органов и, как следствие, возникновении структурных и функциональных нарушений в работе других систем организма. Однако, представленные патоморфологические изменения у животных не дают нам оснований позиционировать данный вирус в качестве единственного инфекционного агента, ответственного за возникновение данной патологии.

Параллельно с гистологическими исследованиями был произведен анализ органов и тканей на предмет выявления провируса вируса бычьего иммунодефицита с помощью ПЦР (табл. 4).

Таблица 4

Локализация провируса вируса ВБИ в органах и тканях, инфицированных __кроликов_

№ Кролика* Органы и ткани

Сердце Почки Легкие Печень Селезенка Красный костный мозг Кровь посмертно

3 -

4 -

5 - •

6 -

7 +

8 +

9 +

10 + +

И + +

13 + -

14 + + - +

15 + - + + -

'Примечание: на момент убоя, три кролика пали ло неизвестным причинам

Следует отметить, что обнаружить провирус ВБИ в крови, взятой перед убоем, не удалось; все положительные результаты можно рассматривать как локализацию провируса непосредственно в клетках тех или иных органов.

При посмертном исследовании экспериментально зараженных кроликов провирус ВБИ выявлен в селезенке - у 66,6% животных, в легких

- 55,5%, в почках - 11,1%, в сердце - 22,2%, в красном костном мозге -11,1%; в печени провирус не был выявлен ни у одного животного опытной группы. У контрольной группы провирус в органах и тканях отсутствовал.

3. ВЫВОДЫ

1. Разработана тест-система ПЦР для идентификации ДНК провируса ВБИ в различных пробах патологического материала, крови, а также инфицированных культурах клеток.

2. Степень распространенности ВБИ в различных хозяйствах РФ составляет от 0 до 15,83%. Так в Шатурском районе Московской области процент инфицированных животных составляет 13,6%, Ставропольском крае - 15,83%, в Вологодской и Калужской областях инфицированных животных не обнаружено.

3. Получена перевиваемая линия клеток легкого эмбриона коровы (ГВЦ, продуцирующая инфекционный вирус бычьего иммунодефицита.

4. Кролики являются чувствительными к ВБИ при экспериментальнм заражении и могут быть использованы в качестве лабораторной модели для изучения инфекционного процесса.

5. При посмертном исследовании экспериментально зараженных кроликов провирус ВБИ выявлен в селезенке - у 66,6% животных, в легких

- 55,5%, в почках - 11,1%, в сердце - 22,2%, в красном костном мозге -11,1%; в печени провирус не был выявлен ни у одного животного опытной группы. У контрольной группы провирус в органах и тканях отсутствовал.

6. Основными патоморфологическими изменениями у инфицированных ВБИ кроликов являются поражения респираторного тракта, характеризующиеся дистрофическими изменениями паренхимы органа и увеличение селезенки. Микроскопические изменения в тканях характеризуются инфильтрацией незрелыми клетками лимфоидного типа

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны и предложены для практического использования:

-тест-система для обнаружения вируса иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции.

Результаты работы использованы для составления учебно-методического пособия для слушателей ветеринарно-санитарного факультета по курсу «Ветеринарная вирусология» по специальностям 110500, 110501 и 110502, утвержденные советом по издательской деятельности МГУПБ.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Экспериментальное заражение кроликов вирусом бычьего иммунодефицита / Бурба В.Г., Гулюкин М.И.// Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2007. -с.320-321.

2. Изучение распространения вируса иммунодефицита КРС в стадах Российской Федерации и мясопродуктах импортируемых из стран Европы и Южной Америки методом ПЦР / Колотвин В.В., Бурба В.Г., Альтштейн

A.Д., Валихов А.Ф. // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии. Материалы II Международной научно-практической конференции. Казань, 2008. - с. 53-54.

3. Разработка полимеразной цепной реакции для выявления ретровирусных инфекций крупного рогатого скота / Бурба В.Г И Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VII Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2008. -с.287-288.

4. Применение ПЦР для выявления вируса иммунодефицита КРС у животных в крови и пробах мяса / Бурба В.Г., Меграбян Д.С., Колотвин

B.В., Гриненко Н.Ф., Альтштейн А.Д., Валихов А.Ф. // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. - М., - 2009. -№2. - с.29-30.

Подписано в печать 19.11.09 Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 10/01 МГУПБ. 109316 Москва, ул. Талалихина, 33.

ООО «Полисувенир», 109316 Москва, ул. Талалихина, 33. Тел. 677-03-86

Ч- / 19