Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Разработка двухуровневой системы контроля полихлорированных бифенилов в кормах и пищевом сырье

На правах рукописи

□03069992

Крапивкин Борис Анатольевич

РАЗРАБОТКА ДВУХУРОВНЕВОЙ СИСТЕМЫ КОНТРОЛЯ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ В КОРМАХ И ПИЩЕВОМ СЫРЬЕ

16 00 06 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 2007

003069992

Работа выполнена в отделе безопасности кормов и пищевых продуктов Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный Ценпр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»)

Защита диссертации состоится « 23 » мая 2007 г в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 006 008 01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу 123022, г Москва, Звенигородское шоссе, д 5, ГНУ ВНИИВСГЭ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии

Автореферат разослан «-Ю » апреля 2007 г

Ведущая организация:

Официальные оппоненты:

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Комаров Александр Анатольевич

доктор ветеринарных наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ

Таланов Герман Александрович

ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии

доктор ветеринарных наук, профессор

Андрианова Татьяна Геннадьевна

Московский государственный университет прикладной биотехнологии

Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии

имени К.И. Скрябина

Ученый секретарь диссертационного совета

Е С Майстренко

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Полихлорированные бифенилы (ПХБ) принадлежат к группе хлорированных углеводородов ПХБ производились промышленностью в больших количествах начиная с 1929 г Благодаря их физико-химическим свойствам, таким как негорючесть, химическая стабильность, высокая температура кипения, низкая теплопроводность и высокие диэлектрические постоянные, технические смеси ПХБ широко использовались в ряде промышленных производств в трансформаторах, конденсаторах, тепловых и гидравлических системах, красителях, клеях, пластиках и т д Термическая, химическая стабильность и способность ПХБ биоаккумулироваться в пищевых цепях, сделали их опасными контаминантами окружающей среды (Ошин JIА и др , 1978, Ivanov V and Sandell Е , 1992, Смирнов А М , Таланов Г А , 1994, 2000, SCAN, 2000, Комаров А А , 2003, CICAD 55, 2003)

Практически все страны запретили производство ПХБ в 70-е годы из-за их высокой токсичности и стойкости в окружающей среде, однако большие количества этих веществ все еще используются в электротехническом оборудовании, на предприятиях машиностроения, химической, легкой, нефтегазовой промышленности (ATSDR, 2000, SCAN, 2000, CICAD 55, 2003, Gallam В and Boix A , 2004)

Сейчас, когда производство ПХБ запрещено, загрязнение окружающей среды происходит за счет их испарения и утечки из промышленного оборудования, а также в ходе неправильной его утилизации По оценкам экспертов, около 35% общего объема произведенных ПХБ все еще присутствует в окружающей среде (Ruth Е et al, 1998, Руднева В Я , 2003, Международный проект по ликвидации СОЗ, 2006)

До последнего времени, при определении допустимого содержания ПХБ в кормах и пищевых продуктах, учитывалось содержание только «маркерных» конге-неров, которые являются доминирующими контаминантами Однако токсичность данных конгенеров относительно низка, а данных по содержанию наиболее опасных «диоксиноподобных» конгенеров ПХБ, которые по своим токсикологическим свойствам намного важнее, до сих пор недостаточно (Комаров А А, 2003, Майстренко В Н , Клюев Н А , 2004)

Диоксиноподобные ПХБ относятся к группе стойких экотоксикантов, обладающих канцерогенным, тератогенным, эмбриотоксическим, мутагенным действием и способных наносить вред человеку, сельскохозяйственным, диким животным и окружающей среде даже в очень низких концентрациях (Ahlborg U G et al, 199'!, Попова А Ю , 2000, Руднева В Я , 2001, Жуленко В Н и др , 2002, Hahn М , 2004, Colborn Т , 2004, Kimura-Kuroda J et al, 2005)

Негативное воздействие ПХБ на здоровье человека сделало актуальным проведение мониторинга контаминации кормов и пищевого сырья этими соединениями Для обеспечения выполнения работ по мониторингу необходимо создание чувствительных и специфичных методов контроля В соответствии с международными правилами, контроль опасных контаминантов должен осуществляться в рамках двухуровневой системы, включающей скрининговые и арбитражные (подтверждающие) методы анализа (Commission Decision 2002/657/ЕС, 2002)

Наиболее перспективным является использование ГЖХ-ЭЗД для скринингово-го определения индивидуальных конгенеров ПХБ, поскольку она обладает высокой чувствительностью, простотой проведения анализа и низкой стоимостью Для арбитражных исследований перспективным является использование Г'ЖХ-МС-МС, так как этот метод обладает высокой чувствительностью и селективностью определения ПХБ

Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка двухуровневой системы контроля маркерных и диоксиноподобных ПХБ в кормах и пищевом сырье, включающей скрининговое определение этих ксенобиотиков методом ГЖХ-ЭЗД и арбитражный анализ положительных образцов методом ГЖХ-МС-МС

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

• Разработать эффективные способы экстракции, очистки и фракционирования ПХБ из образцов кормов и пищевого сырья,

• Оптимизировать условия хроматографического определения маркерных и диоксиноподобных ПХБ с использованием детектора электронного захвата и масс-спектрометрического детектора типа «ионная ловушка»,

• Разработать методики скринингового и арбитражного определения ПХБ в кормах и пищевом сырье и провести их метрологическую аттестацию,

• Оценить правильность разработанных методов путем испытания международных стандартных образцов с аттестованным содержанием ПХБ,

• Провести мониторинговые исследования образцов рыбной муки и рыбы для оценки степени их загрязненности ПХБ

Научная новизна. Разработаны оригинальные условия подготовки проб методом ускоренной экстракции растворителями (УЭР) (экстрагент — н-гексан, температура экстракции 80°С, два цикла экстракции по 5 мин , микроволновая сушка и гомогенизация пробы с сернокислым натрием, многослойное заполнение экстракционной ячейки силикагелем и силикагелем, импрегнированным серной кислотой), позволяющие повысить эффективность извлечения маркерных и диоксиноподобных ПХБ из пищевого сырья и кормов, значительно сократить время экстракции, объемы экстрагентов и одновременно проводить очистку экстрактов

Впервые арбитражное определение маркерных и диоксиноподобных ПХБ в кормах и пищевом сырье реализовано на хромато-масс-спектрометре с масс анализатором типа «ионная ловушка» в резонансном режиме тандемной масс-спектрометрии (МС-МС) и регистрации положительных ионов, что существенно снижает стоимость проведения анализов при сохранении высокой чувствительности и соблюдении международных требований по анализу этих контаминантов Разработаны условия скринингового определения методом ГЖХ-ЭЗД как маркерных, так и диоксиноподобных ПХБ

С целью гармонизации отечественных и международных подходов к оценке качества результатов измерений, проведена оценка расширенной неопределенности измерения индивидуальных конгенеров ПХБ при анализе кормов и пищевого сырья методами ГЖХ-МС-МС и ГЖХ-ЭЗД

Практическая значимость работы Создана комплексная двухуровневая система контроля содержания ПХБ в пищевом сырье и кормах, позволяющая проводить определение маркерных и диоксиноподобных ПХБ скрининговым и арбитражным (подтверждающим) методами

Проведена метрологическая аттестация методик выполнения измерений (МВИ) маркерных и диоксиноподобных ПХБ, позволяющих проводить их количественное измерение в соответствии с международными требованиями

Разработанные МВИ включены в методические рекомендации (МР) по арбитражному и скрининговому определению маркерных и диоксиноподобных ПХБ в кормах, кормовых добавках и пищевом сырье МР утверждены Минсельхозом РФ и используются при государственном мониторинге образцов пищевого сырья и кормов для оценки их загрязненности ПХБ

Использование относительно недорогих и простых в эксплуатации масс-спектрометров типа «ионная ловушка» позволило обеспечить невысокую стоимость анализа при достижении высокой чувствительности и селективности определения ПХБ

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 3-ей Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005), конференции молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2006), 15 Международном симпозиуме по анализу гормонов и остатков лекарственных средств в пищевых продуктах (Антверпен, Бельгия, 2006), международном конгрессе по аналитической химии 1СА8-2006 (Москва, 2006)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей и тезисов докладов, 2 методические рекомендации

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1 Разработка способов экстракции и очистки ПХБ из пищевого сырья и кормов с использованием метода УЭР

2 Оптимизация условий анализа маркерных и диоксиноподобных ПХБ методами ГЖХ-ЭЗД и ГЖХ-МС-МС

3 Проведение метрологической аттестации и контроля правильности результатов определения ПХБ в пищевом сырье и кормах с использованием международных аттестованных стандартных образцов

4 Результаты мониторингового определения маркерных и диоксиноподобных ПХБ в рыбной муке и рыбе

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 203 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 223 источника, 40 из которых опубликовано в отечественных и 183 - в зарубежных изданиях, и приложения Работа иллюстрирована 38 рисунками и 42 таблицами

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Оптимизацию условий экстракции ПХБ из образцов кормов и пищевого сырья проводили методом УЭР Использовали УЭР установку ASE 200 (Dionex, США) с экстракционными ячейками на 33 см3 и приемными флаконами на 60 см3 Изучали влияние параметров работы экстрактора на эффективность извлечения ПХБ Исследовали различные варианты заполнения экстракционных ячеек для получения экстрактов пригодных для анализа методами ГЖХ-ЭЗД и ГЖХ-МС-МС без проведения дополнительных стадий очистки При заполнении экстракционных ячеек использовали комбинацию различных сорбентов (флорисил, диатомитовая земля, силикагель, сернокислый натрий, сернокислый магний), а также проводили подбор органических растворителей, позволяющих эффективно извлекать ПХБ из различных матриц

Подбор УЭР условий экстракции ПХБ выполняли на образцах кормов и пищевого сырья с искусственной добавкой нативных конгенеров ПХБ, а также на международных аттестованных стандартных образцах При разработке методики пробо-подготовки использованы следующие матрицы рыбная мука, рыбий жир, рыба, комбикорм, растительное масло, мясокостная мука, животные жиры, мясо, печень, почки, молоко

Для коррекции потерь ПХБ при пробоподготовке вносили в экстракционную ячейку смесь меченых изотопами ,3С аналогов маркерных и диоксиноподобных конгенеров производства Wellington Laboratories (Канада) Полученные УЭР экстракты упаривали на ротационном испарителе с 20 — 50 мкл ундеканового раствора изотопно-меченых внутренних стандартов до объема 0,5 —1,0 см3 с последующим

концентрированием в токе азота на нагревательном модуле Pierce (США) При ГЖХ-ЭЗД анализе в качестве внутреннего стандарта использовали октахлорнафта-лин

Для повышения селективности определения диоксиноподобных конгенеров ПХБ проводили фракционирование полученных У ЭР экстрактов методом колоночной хроматографии на активированном угле Для этого готовили 10% смесь активированного угля на обращеннофазном сорбенте Bondesil С18 - 40 мкм (Vanan, США) В качестве хроматографической колонки использовали пастеровские пипетки, заполненные приготовленной смесью активированного угля с обращеннофазным сорбентом (высота слоя сорбента 10 ±1 мм) Для промывки колонки после нанесения УЭР экстракта использовали смесь дихлорметана с н-гексаном (50/50, об /об ) Элюирование копланарных конгенеров проводили 10 см3 толуола Полученные элюаты очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле, импрегниро-ванным серной кислотой

Анализ полученных концентратов проводили методами ГЖХ-ЭЗД на газовой хроматографе модели «3800» с детектором электронного захвата (Varían, США) и ГЖХ-МС-МС на хромато-масс-спектрометре модели «Saturn 2000» (Vanan, США) с масс-спектрометрическим детектором типа «ионная ловушка»

При разработке хроматографических условий проводили оценку селективности анализа ПХБ на трех капиллярных колонках VF-5 ms (50мх0,25ммх0,25мкм), CP-Sil 8 СВ for РСВ (50мх0,25ммх0,25мкм) и CP-Sil 5/С18 СВ for РСВ (100мх0,25ммх0,1мкм) (Vanan, США)

Для идентификации и количественного определения ПХБ использовали аттестованные стандартные растворы нативных и изотопно-меченых конгенеров ПХБ производства Wellington Laboratories (Канада), IRMM (Бельгия) и Restek (США) Количественное определение осуществляли методом внутреннего стандарта с помощью программного обеспечения Saturn WS и Star WS (Vanan, США) по площади пиков идентифицированных соединений Идентификацию аналитов проводили с соблюдением международных критериев в соответствии с Решением Комиссии ЕС 2002/657/ЕС от 12 августа 2002 года

При ГЖХ-МС-МС анализе использовали метод ионизации электронным ударом с автоматическим определением времени ионизации и воздействие на ионы методом МС-МС Настройку параметров воздействия на ион предшественник проводили в резонансном режиме МС-МС

Метрологическую аттестацию разработанных МВИ выполняли по результатам их метрологической экспертизы, проведенной ФГУП «ВНИИМС» (г Москва) и расчетно-экспериментального оценивания неопределенности измерения на основе определения основных показателей, характеризующих эффективность МВИ, в соответствии с руководством ЕВРАХИМ/СИТАК «Количественное описание неопределенности в аналитических измерениях» (2002), ГОСТ Р 8 563-96 и ГОСТ Р ИСО 5725-2002

Контроль правильности результатов измерения массовой доли ПХБ с использованием разработанных МВИ проводили путем анализа международных стандартных образцов IRMM-446 - свиного жира с аттестованным содержанием маркерных ПХБ, BCR-349 - рыбьего жира из печени трески с аттестованным содержанием маркерных ПХБ, WMF-01 лиофилизованного мяса карпа с аттестованным содержанием диоксиноподобных ПХБ

С использованием разработанных методик проводили мониторинговые исследования содержания маркерных и диоксиноподобных ПХБ в рыбной муке и рыбе В ходе исследования было проанализировано 220 образцов рыбной муки и 60 образцов рыбы

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Отработка условий хроматографического разделения ПХБ

При отработке газохроматографических условий анализа ПХБ на начальном этапе работы использовали растворы стандартных образцов ПХБ AROCHLOR 1016/1254 (Restek), ВР-МХМ (Wellington Laboratories), содержащий конгенеры 3, 15, 28, 52, 101, 114, 138, 153, 180, 194, 206, 209, TK-BPA-CST (Wellington Laboratories), содержащий диоксиноподобные конгенеры 81, 77, 105, 114, 118, 123, 126, 156, 157, 167, 169, 189 и BP-MS (Wellington Laboratories) содержащий 62 конгенера ПХБ ГЖХ-ЭЗД идентификацию конгенеров проводили по времени удерживания При

ГЖХ-МС идентификации кроме времени удерживания использовали масс-спектры электронного удара

В результате проведенной работы были оптимизированы хроматографически г условия анализа ПХБ и определено время их удерживания на указанных капиллярных колонках с учетом условий ГЖХ-ЭЗД и ГЖХ-МС-МС детектирования В таблице 1 приведены хроматографические условия анализа ПХБ на использованные капиллярных колонках Капиллярная колонка УР-5шз показала необходимую селективность, наименьший уровень фона и стабильность работы при максимальные температурных режимах и поэтому была использована для системы ГЖХ-МС-МС' В таблице 2 приведено время удерживания ПХБ в разработанных условиях ГЖХ-МС-МС на колонке УР-5 гш

Таблица 1

Газохроматографические условия определения ПХБ

№ Метод Капиллярная колонка Хроматографические условия

1 ГЖХ-ЭЗД ГЖХ-МС CP-Sil 8СВ for PCB (50м*0,25ммх0,25мкм) Газ носитель гелий - 1,1 см3/мин Инжектор 1079, вкладыш ID 2 мм 1 для проб объемом до 1 мкл температура 280°С, 0-3 мин в режиме splitless, с 3 мин режим split 1/10, 2 для проб объемом от 1 до 3 мкл температура 90°С - 0,3 мин, нагрев 90° - 280°С 200°С/мин , 280°С до 30 мин ,0-0,3 мин split 1/10, с 0,3 мин до 3 мин splitless, с 3 мин split 1/10, Термостат колонки 90°С - 2,0 мин , нагрев от 90°С до 150°С - 15,0°С/мин , от 150°С до 300°С - 3,0°С/мин , 300°С до 60 мин

2 ГЖХ-ЭЗД ГЖХ-МС CP-Sil 5/С18СВ for PCB ( 100м*0,25ммх0,1 мкм) Газ носитель гелий - 2,0 см3/мин Параметры инжектора по №1 Термостат колонки 75°С - 2,0 мин , нагрев от 75°С до 150°С - 15,0°С/мин , от 150°С до 280°С - 1,5°С/мин , 280°С до 100 мин

3 ГЖХ-МС VF-5 ms (50мх0,25ммх0,25мкм) Газ носитель гелий - 0,8 cmj/mhii Параметры инжектора по №1 Термостат колонки 120°С - 1,0 мин , от 120°С до 150°С - 15,0°С/мин, от 150°С до 280°С - 2,5°С/мин , 280°С до 60 мин

Таблица 2

Время удерживания (ИТ) ПХБ на колонке УР-5 шб (50мх0,25мм*0,25мкм)

при ГЖХ-МС-МС детектировании

№ № конгенера по ИЮПАК ЯТ, мин № №конгенера ИЮПАК ЯТ, мин N2 № конгенера по ИЮПАК Ю\ мин № № конгенера по ИЮПАК КТ, мин

1 1 13,71 38 65/62 28,81 75 145/81 35,98 112 159/187/182 43,27

2 2 14,85 39 35 29,06 76 116/115 36,28 113 183 43,62

3 3 15,86 40 104 29,09 77 120/85 36,47 114 162 43,63

4 10/4 17,09 41 44 29,36 78 136/148 36,48 115 128 43,93

5 9/7 18,52 42 59 29,52 79 77 36,49 116 167 44,04

6 6 19,18 43 42/37 29,60 80 110 36,68 117 185 44,36

7 8/5 19,60 44 72 29,95 81 154 36,82 118 174/181 44,88

8 14 20,12 45 71 30,14 82 82 37,29 119 177 45,24

9 19 20,86 46 64/41 30,23 83 151 37,58 120 202 45,52

10 30 21,43 47 68 30,39 84 135/144/124 37,88 121 171 45,58

11 11 22,12 48 96 30,57 85 147 38,16 122 156 45,66

12 13/12/18 22,33 49 40/57 30,79 86 108/107 38,18 123 173 45,95

13 17 22,48 50 103 30,84 87 123 38,41 124 157 46,01

14 15 22,49 51 100 31,20 88 139/149 38,42 125 201/204 46,08

15 27/24 23,05 52 67 31,21 89 118/106 38,53 126 172/192 46,35

16 16/32 23,61 53 58 31,44 90 140 38,69 127 197 46,57

17 34/23 24,22 54 63 31,60 91 143/134 39,16 128 180 46,80

18 29 24,53 55 94 31,80 92 131/142 39,26 129 193 46,98

19 54 24,56 56 61/74 31,88 93 122 39,29 130 191 47,26

20 26 24,83 57 70/76 32,13 94 114 39,35 131 200 47,64

21 25 25,01 58 98/102 32,31 95 133/165 39,46 132 169 48,30

22 31 25,41 59 80/66 32,41 96 188/146/161 39,71 133 170 48,79

23 50 25,45 60 93/95/121/88 32,45 97 153/184 40,15 134 190 48,89

24 28 25,52 61 91 32,91 98 105 40,31 135 198 49,21

25 21/33/20 26,17 62 55 33,01 99 132/168 40,35 136 199 49,42

26 53 26,23 63 155 33,48 100 127 40,54 137 203/196 49,79

27 51 26,57 64 56/60 33,59 101 141 41,02 138 189 50,75

28 22 26,69 65 92 33,69 102 179 41,16 139 208 51,73

29 45 27,06 66 84 33,95 103 137 41,66 140 195 51,79

30 36 27,07 67 101/89/90 34,09 104 176 41,67 141 207 52,26

31 46/39 27,61 68 113/99/79 34,47 105 130 41,70 142 194 53,13

32 69 27,74 69 119/112 34,99 106 164/163/138/160 42,06 143 205 53,50

33 52/73 27,91 70 150 35,00 107 158 42,25 144 206 55,67

34 43/49 28,21 71 83/109/78 35,25 108 186 42,26 145 209 57,84

35 38 28,22 72 152 35,57 109 178 42,61

36 47 28,43 73 97/86/125 35,61 110 129/126 42,75

37 48/75 |28,50 74 87/111/117 35,97 111 166/175 43,08

2.2.2. Отработка условий ГЖХ-ЭЗД и ГЖХ-МС-МС детектирования ПХБ

На этапе разработки методик контроля ПХБ были выбраны две системы де тестирования - ГЖХ-ЭЗД и ГЖХ-МС-МС Выбор такого тандема обусловлен целым рядом причин ГЖХ-ЭЗД является наиболее простой, высокочувствительной и дос тупной системой на аналитическом рынке РФ, а также широко представлена в про изводственных лабораториях Для арбитражных исследований в международной практике используют масс-спектрометрические детекторы (Commission Décision 2002/657/ЕС, 2002) Среди масс-спектрометрических детекторов для анализа ПХБ наибольшее распространение получили масс-спектрометры высокого разрешения и тандемные масс-спектрометры с тройным квадруполем или квадрупольной ионной ловушкой Важными аргументами в пользу МС-МС низкого разрешения служат высокая чувствительность, простота в обслуживании и сравнительно низкая стоимость подобных систем

Полученные сравнительные результаты определения чувствительности двух детекторов в разработанных условиях детектирования показали сопоставимые результаты Однако отклик ЭЗД существенно зависел от количества атомов хлора и молекуле ПХБ и отличался в 40 раз для монохлорбифенила и нонахлорбифенила Для ГЖХ-МС-МС отклик детектора не зависел от уровня хлорирования бифенила, а существенное влияние на чувствительность оказывал подбор оптимальных условии диссоциации иона предшественника, ионный фон колонки или пробы Предел обнаружения для ионной ловушки в режиме МС-МС при резонансной диссоциации выбранного иона составил 0,4 - 0,6 пкг для индивидуального конгенера, что соответствует в пересчете на навеску (Зге концентрированием экстракта в 20 мкл ундекана и вводом в ГЖХ-МС-МС систему 3 мкл концентрата) - 0,9 - 1,3 пкг/г

Условия МС-МС оптимизировали с использованием программного обеспечения Satura WS Для расчета оптимального уровня удерживающего поля использовали следующее правило значение m/z наименьшего дочернего иона делили на коэффициент 1,4 Значение этого коэффициента получено из соотношения между qz max = 0,908 (Pz = 1) and qz = 0,64 (Pz = 0,5) При использовании данного правила, дочер-

ние ионы попадают в область наивысшей стабильности работы ионной ловушки (March R Е and Hugues R J , 1989)

При рассчитанном уровне удерживающего поля (CID RF, m/z) определили оптимальные значения амплитуд активации (CID, Вольт) для ионов предшественников маркерных и диоксиноподобных ПХБ Для повышения селективности МС-МС анализа резонансную активацию выполняли на М+2 или М+4 ионах предшественниках с окном изоляции 1,5 m/z Количественная обработка данных на дочерних ионах, полученных после потери двух атомов хлора показала более воспроизводимые результаты, чем при использовании ионов [(М+2/+4)-С1]+ Соотношения относительных ионных интенсивностей кластера ионов [(М+2/+4)-2С1]+ показали наибольшую стабильность в соответствии с требованиями к МС-МС детектированию (Commission Decision 2002/657/ЕС, 2002) В таблице 3 приведены оптимизированные параметры метода воздействия на ионы в режиме МС-МС

Таблица 3

Основные параметры метода воздействия на ионы в режиме МС-МС

Ион CID CID, Дочерние

Конгенер ПХБ предшественник, RF, ионы,

m/z m/z Вольт m/z

28 258 (М+2) 133 1 2 186/188

28L 270 (М+2) 141 1 2 198/200

52,81,77 292 (М+2) 157 1 2 220/222

52L, 81L,77L, 70L 304 (М+2) 166 1 2 232/234

101, 105,114, 118, 123, 126 326 (М+2) 181 1 6 254/256

101L,105L,114L, 118L, 123L, 126L, 111L 338 (М+2) 190 1 6 266/268

138, 153, 156, 157, 167, 169 360 (М+2) 206 1 6 288/290

138L, 153L, 156L, 157L, 167L, 169L 372 (М+2) 214 1 6 300/302

180, 189 396 (М+4) 231 1 6 324/326

180L, 189L, 170L 408 (М+4) 240 1 6 336/338

В результате оптимизации специализированных условий МС-МС получили следующие значения параметров

1. Общие параметры: температура ионной ловушки - 220°С, температура блока сопряжения - 250°С, температура вакуумируемого блока - 60°С, диапазон регистрируемых значений масс - 126 - 500 m/z, окно изоляции масс — 1,5 m/z, продолжительность периода сканирования - 0,5 сек , дополнительное напряжение на умножи-

теле - 200 Вольт, ток эмиссии катода - 50-90 мкА, значение «Target TIC» - 2000, значение напряжения продольной модуляции - 4,0 Вольт

2. Специализированные параметры резонансного метода: уровень удерживающего RF поля - 48 m/z, амплитуда вспомогательного широкополосного сигнала - 40 Вольт, амплитуда широкополосного сигнала - 30 Вольт, время изоляции - 5 мсек , время диссоциации - 20 мсек , диапазон модуляции - 2, скорость модуляции удерживающего поля - 5600 микросекунд, величина сдвига сигнала активации - 0 Герц На рис I приведены МС-МС масс-спектры диоксиноподобных ПХБ в разра ботанных условиях резонансной диссоциации

Рис 1 Масс-спектры нативных и изотопно-меченых диоксиноподобных ПХБ

2.2.3. Экстракция ПХБ и методы очистки экстрактов

На этапе пробоподготовки отрабатывали эффективные и экономичные способы экстракции и очистки ПХБ из кормов и пищевого сырья для дальнейшего определения методами ГЖХ-МС-МС и ГЖХ-ЭЗД Важными критериями в выборе метода пробоподготовки были время пробоподготовки, расход растворителей и сорбентов, степень очистки образцов для целей ГЖХ-МС-МС и ГЖХ-ЭЗД

Основной целью при разработке условий экстракции методом УЭР была оптимизация условий экстракции, при которых конечный экстракт использовался длч стадии концентрирования без дополнительных стадий очистки Такой подход обусловлен, прежде всего, необходимостью анализа максимального количества образцов в течение рабочего дня Минимизация времени пробоподготовки особенно актуальна при широкомасштабных мониторинговых исследованиях Например, стан-

дартная процедура экстракции в аппарате Сокслета занимает 12-18 часов, что не приемлемо при массовых исследованиях Деконтаминация стеклянной посуды после экстракции по методу Сокслета также занимает значительное время Недостаточная деконтаминация стеклянной посуды может приводить к ложноположительным результатам Главное преимущество УЭР заключается в значительном сокращении времени экстракции и расходуемого количества реактивов Так большинство анали-тов методом УЭР может быть экстрагировано с высокой эффективностью за 15 — 30 мин При этом расход растворителей будет минимальным, а процесс экстракции можно совмещать с процессом очистки или селективной экстракции аналитов

В качестве экстрагента использовали н-гексан и н-гексан с добавкой более полярных растворителей (ацетон, дихлорметан, этилацетат, толуол, изопропанол) На рисунке 2 приведены разработанные схемы заполнения экстракционных ячеек, позволяющие сочетать процесс экстракции и очистки

Схема № 1 Схема № 2

Фильтр бумажный Сернокислый натрий

_до фильтра_

3 г пробы с 10 г сернокислого натрия Фильтр из стекловолокна Силикагель с 40% серной кислоты (С/С) 2 г

_Силикагель 1 г_

_С/С 2 г_

_Силикагель 1 г_

_С/С 2 г_

_Силикагель 2 г_

Фильтр бумажный

Фильтр бумажный Сернокислый натрий

_до фильтра_

1 г пробы с 5 г сернокислого натрия Фильтр из стекловолокна

_С/С 2 г_

_Силикагель 1 г_

_С/С 2 г_

_Силикагель 1 г_

_С/С 3 г_

_Силикагель 1 г_

_С/С 2 г_

_Силикагель 2 г_

Фильтр бумажный

Рис 2 Схемы заполнения экстракционных ячеек для экстракции маркерных (схема № 2) и диоксиноподобных ПХБ (схема № 1) методом УЭР

Для разработанных схем заполнения экстракционных ячеек получили оптимизированные условия параметров экстракции методом УЭР, которые приведены в таблице 4

Таблица 4

Оптимизированные условия экстракции ПХБ методом УЭР

Параметры Условия

Температура 80°С

Время нагрева 5 мин

Количество циклов 2

Растворитель н-гексан

Давление 10 МРа

Время термостатирования 5 мин

Объем растворителя 60% от объема ячейки

Объем ячейки 33 см3

Время продувки азотом 100 секунд

Суммарное время экстракции одной пробы в разработанных условиях УЭР составило 20 мин, объем экстракта - 42 - 45 см3

Абсолютные извлечения маркерных и диоксиноподобных ПХБ (без коррекции изотопно-мечеными стандартами) в разработанных условия приведены в таблицах 5 и 6 В качестве матрицы использовали следующие образцы комбикорм, рыбная м> -ка, жмых, отруби пшеничные, мясокостная мука, растительное масло, свиной жир, рыбий жир, мясо, печень, почки, рыба, молоко Для каждой матрицы было исследовано по шесть образцов

Таблица 5

Извлечение маркерных ПХБ из проб кормов и пищевого сырья

№ Конгенер ПХБ Извлечение, Относительное

по номенклатуре %, стандартное

ИЮПАК п=78 отклонение (СКО)

результатов определения

извлечения, %

1 28 97 4

2 52 96 3

3 101 99 4

4 138 93 3

5 153 96 3

6 180 90 5

Таблица 6

Извлечение диоксиноподобных ПХБ из проб кормов и пищевого сырья

№ Конгенер ПХБ по номенклатуре ИЮПАК Извлечение, %, п=78 СКО результатов определения извлечения, %

1 81 88 12

2 77 90 12

3 123 84 8

4 118 88 5

5 114 81 7

6 105 89 5

7 126 85 10

8 167 84 12

9 156 82 17

10 157 85 20

11 169 71 9

12 189 55 16

Для сравнения двух систем концентрирования, полученные УЭР экстракты упаривали до объема 0,5 - 1,0 см3 на ротационном испарителе при температуре 35 -37°С и остаточном атмосферном давлении 0,2 - 0,3 атм, а другую часть экстрактов упаривали до объема 0,5 см3 на концентраторе Кудерна-Дэниша Время упаривания на ротационном испарителе составило 5-6 мин Время упаривания экстракта на концентраторе Кудерна-Дэниша - 25 - 30 мин Результаты количественного определения ПХБ в зависимости от условий упаривания отличались в границах погрешности измерения Поэтому дальнейшую работу проводили с концентрированием экстрактов на ротационном испарителе

Так как в процессе исследований установлено, что на эффективность УЭР экстракции влияет содержание влаги в образце, были оптимизированы условия сушки образцов в микроволновой печи в течение 2-5 мин При разработке схем заполнения экстракционных ячеек изучали влияние содержания жира в образце на эффективность комбинированной экстракции и очистки Подобраны оптимальные количества сорбентов и органических растворителей для селективной экстракции ПХБ с сорбцией жира в экстракционной ячейке

2 2.4. Метрологическая аттестация методик определения ПХБ

Аттестацию методик проводили расчетно-экспериментальным способом совместно с ФГУП «ВНИИМС» (г Москва) МВИ аттестованы в соответствии с ГОСТ Р 8 563-96 и ГОСТ Р ИСО 5725-2002 и устанавливают скрининговый и арбитражный (подтверждающий) методы для идентификации и количественного определения маркерных (28, 52, 101, 138, 153 и 180 конгенеры) и диоксиноподобных (77 81, 105, 114, 118, 123, 126, 156, 157, 167, 169 и 189 конгенеры) ПХБ в кормах, кор мовых добавках и пищевом сырье

С целью реализации алгоритма оценивания неопределенности выполняли из мерения массовой доли ПХБ в образцах рыбной муки с добавкой маркерных и диоксиноподобных конгенеров ПХБ Исследования проводили в следующих диапазона?, концентраций - 1,0 - 1500,0 мкг/кг при массе анализируемой пробы 1 г для маркерных и 2,0 - 2500,0 нг/кг при массе анализируемой пробы 3 г для диоксиноподобных ПХБ Анализируемые диапазоны были разбиты на 4 - 6 поддиапазонов Всего на каждой пробе в аттестуемых диапазонах выполнено 40 - 60 измерений по процедуре МВИ На основании результатов исследований вычисляли неопределенность измерений и промежуточные сопутствующие величины В ходе метрологической аттестации была рассчитана расширенная неопределенность для аттестованных диапазонов массовой доли маркерных и диоксиноподобных ПХБ (таблицы 7-8)

Таблица 7

Расширенная неопределенность измерений маркерных ПХБ методом ГЖХ-МС-МС

Диапазон измерений массовой доли ПХБ, мкг/кг

от 1,0 до 10,0 вкл св 10,0 до 100,0 вкл св 100,0 до 1500,0 вкл

Конгенер ПХБ Расширенная неопределенность при коэффициенте охвата к=2 (границы относительной погрешности, %, при Р=0,95)

28 17 13 10

52 14 12 8

101 14 15 13

138 22 20 15

153 21 19 14

180 35 14 11

Таблица <

Расширенная неопределенность измерений диоксиноподобных ПХБ методом ГЖХ-МС-МС

Конгенер ПХБ Диапазон измерений массовой доли ПХБ, нг/кг

от 2 0 до 10,0 вкл | св 10,0 до 250,0 вкл | св 250,0 до 2500,0 вкл

Расширенная неопределенность при коэффициенте охвата к=2 (границы относительной погрешности, %, при Р=0,95)

81 30 16 15

77 17 14 10

123 14 11 12

118 24 19 15

114 24 11 12

105 16 11 12

126 16 11 11

167 11 13 9

156 13 12 11

157 20 18 14

169 31 20 12

189 16 14 14

2.2.5. Контроль правильности результатов измерения ПХБ с использованием международных аттестованных стандартных образцов

Для подтверждения правильности результатов измерений, получаемых с использованием разработанных МВИ, проводили контроль смещения (степени близости полученных результатов к аттестованному значению) результатов количественного химического анализа с использованием аттестованных стандартных образцов в соответствии с алгоритмом расчета, приведенным в Руководстве ЕВРА-ХИМ/СИТАК Результаты количественных измерений признавали удовлетворительными при условии выполнения неравенства

(1)

где

Хк - среднее значение массовой доли к-го конгенера в анализируемой пробе, Хка - аттестованное содержание к-го конгенера в стандартном образце,

Uka— расширенная неопределенность с коэффициентом охвата 2 аттестованного значения k-го конгенера в стандартном образце

Ukc~ расширенная неопределенность с коэффициентом охвата 2 результатов количественного анализа k-го конгенера, полученных при соблюдении требований МВИ Идентификацию аналитов в стандартных образцах проводили с соблюдением международных требований, регламентируемых Решением Комиссии ЕС № 2002/657 Для идентификации ПХБ необходимо обеспечить наличие не менее 3-> идентифицирующих критериев Для МС-МС данное количество критериев соответ ствует двум дочерним ионам при условии, что отклонения относительных ионных интенсивностей не превышают регламентируемые Решением допустимые значения

В таблице 9 приведены сравнительные данные по извлечению маркерных ПХБ разработанным способом и аттестованному содержанию в стандартном образце IRMM-446

Таблица № 9

Результаты определения ПХБ в свином жире (IRMM-446)

Маркерные ПХБ Аттестованное содержание в IRMM-446, мкг/кг *Неопреде- ленность стандартного образца, мкг/кг Результаты анализа, п=10 мкг/кг Неопределенность рез-тов анализа, мкг/кг Контроль смещения результатов количественного анализа,

28 29,6 4,2 31,1 3,7 1,5 <5,6

52 25,5 3,6 24,5 5,3 1,0 <6,4

101 30,0 8,0 31,0 3,5 1,0 <8,7

118 30,2 5,4 30,9 3,2 0,7 < 6,3

138 32,0 8,0 32,9 2,6 0,9 < 8,4

153 30,8 4,8 31,8 3,4 1,0 <5,9

180 29,8 5,0 28,7 2,1 1,1 <5,4

Сумма 207,0 22,0 210,9 21,1 3,9 < 30,5

*- расширенная неопределенность с коэффициентом охвата 2

В таблице 10 приведены сравнительные данные по извлечению диоксинопо-добных ПХБ разработанным способом и аттестованному содержанию в стандартном образце \VMF-01

Таблица № 10

Результаты определения ПХБ в мясе карпа (\VMF-01)

Диоксиноподобные ПХБ Аттестованное содержание в \VMF-01, п=70 нг/кг *Неопреде- ленность стандартного образца, нг/кг Результаты анализа, п=10 нг/кг *Неопреде-ленность рез-тов анализа, нг/кг Контроль смещения результатов количественного анализа,

зд чш

77 2233 720 2840 400 607 < 824

81 201 58 245 74 44 <94

105 49050 14200 45160 5193 3890 <15120

114 3523 1670 3050 329 473 <1702

118 130100 32500 122360 18354 7740 < 37325

123 4233 2620 4130 471 103 <2662

126 739 260 615 65 124 <268

156 14890 5020 13150 1407 1740 <5213

157 3488 870 2980 525 508 <1016

167 9750 3090 8760 823 990 <3198

169 76 30 84 26 8 <40

189 2016 611 1820 260 196 <664

*- расширенная неопределенность с коэффициентом охвата 2

Результаты количественного определения маркерных и диоксиноподобных ПХБ согласуются с неравенством (1) Таким образом, результаты их количественного определения можно признать удовлетворительными 2 2.6. Результаты мониторингового определения ПХБ

С использованием разработанных методик проводили мониторинговые исследования содержания маркерных и диоксиноподобных ПХБ в рыбной муке и рыбе В таблице 11 суммированы полученные данные по контаминации рыбной муки и рыбы

Таблица 11

Результаты определения маркерных и диоксиноподобных ПХБ

Наименование образцов Количество образцов Количество образцов не соответствовавших МДУ Показатели, не соответствовавшие МДУ

Рыбная мука 220 4(1,8%) Маркерные ПХБ 1

20 (9,1%) Диоксиноподобные ПХБ2

Рыба 60 2 (3,3%) Маркерные ПХБ 3

5 (8,3%) Диоксиноподобные ПХБ4

1 - 2,0 мг/кг - МДУ маркерных ПХБ в рыбной муке (МР, 2007),

2 - 2,5 нг/кг ТЭК ВОЗ - МДУ диоксиноподобных ПХБ в рыбной муке (МР, 2007),

3 - 2,0 мг/кг - МДУ маркерных ПХБ в рыбе (МР, 2007),

4 - 4,0 нг/кг ТЭК ВОЗ - МДУ диоксиноподобных ПХБ в рыбе (МР, 2007)

С целью гармонизации международных и отечественных нормативов по контаминации ПХБ, были утверждены в составе МР допустимые уровни ПХБ в кормах, кормовых добавках и пищевом сырье Представленные в таблице 11 результаты оп ределения ПХБ получены при соотнесении данных количественного анализа с утвержденными в РФ допустимыми уровнями для маркерных и диоксиноподобных ПХБ На рис 3 приведена типичная ГЖХ-МС-МС хроматограмма экстракта рыбной муки при анализе диоксиноподобных ПХБ в разработанных условиях МВИ

Chrom atoqtam Plot

чщ п.». п.™. n nn «во

118 l«gi 210 t 240 J24 Н54

167 ¡157 189 ] 7 f, 1 ll. 161__

Рис 3 ГЖХ-МС-МС хроматограмма УЭР экстракта рыбной муки

В результате мониторинговых исследований рыбной муки и рыбы установлено, что большинство проб содержали маркерные ПХБ в диапазоне 0,02 - 0,15 мг/кг, что значительно ниже МДУ для этих контаминантов 4 образца рыбной муки и 2 образца рыбы с превышением МДУ маркерных ПХБ (2,4 - 7,4 мг/кг) были из Каспийского моря, что вероятно связано с локальным загрязнением Причем содержание диоксиноподобных ПХБ в этих образцах было в диапазоне 1,8 - 2,6 нг/кг ТЭК ВОЗ

Однако в 8,3% образцов рыбы и 9,1% рыбной муки обнаружено превышение МДУ по содержанию диоксиноподобных ПХБ

Диапазон загрязненности диоксиноподобными ПХБ рыбной муки и рыбы составил 0,2 - 9,0 нг/кг ТЭК ВОЗ Образцы рыбной муки и рыбы из Атлантического и Тихого океанов отличались низкой контаминацией диоксиноподобными ПХБ на уровне 0,2 - 1,4 нг/кг ТЭК ВОЗ Загрязненность образцов рыбной муки и рыбы из Балтийского моря составила 1,0 - 9,0 нг/кг ТЭК ВОЗ На долю 126 конгенера в этих образцах приходилось свыше 80% суммарной токсичности выраженной в нг/кг ТЭК ВОЗ

ВЫВОДЫ

1 Разработана двухуровневая система контроля загрязненности кормов и пищевого сырья маркерными и диоксиноподобными ПХБ, включающая скрининговое определение этих ксенобиотиков методом ГЖХ-ЭЗД и арбитражное - ГЖХ-МС-МС

2 Предложены эффективные условия извлечения ПХБ из проб кормов, кормовых добавок и пищевого сырья методом УЭР (экстрагент - н-гексан, температура экстракции 80°С, два цикла экстракции по 5 мин, микроволновая сушка и гомогенизация пробы с сернокислым натрием, многослойное заполнение экстракционной ячейки силикагелем и силикагелем, импрегнированным серной кислотой), позволяющие в течение 20 минут проводить их экстракцию и очистку с использованием 42 — 45 см3 растворителя

3 Оптимизированы условия ГЖХ-ЭЗД и ГЖХ-МС-МС методом резонансной диссоциации, позволяющие с высокой селективностью и чувствительностью проводить скрининговое и арбитражное определение маркерных ПХБ в диапазоне 1,0 -1500,0 мкг/кг и диоксиноподобных - 2,0 - 2500,0 нг/кг

4 Проведена метрологическая аттестация разработанных методик, в результате которой оценена расширенная неопределенность измерения массовой доли маркерных и диоксиноподобных ПХБ в кормах и пищевом сырье методами ГЖХ-ЭЗД и ГЖХ-МС-МС Правильность результатов измерений, полученных с использованием

аттестованных методик, подтверждена путем идентификации и количественного определения маркерных и диоксиноподобных ПХБ в международных аттестованных стандартных образцах

5 В результате мониторинговых исследований установлено превышение МДУ диоксиноподобных ПХБ в 8,3% образцов рыбы и 9,1% рыбной муки Полученные данные свидетельствуют о необходимости проведения системного мониторинга контаминации кормов и пищевого сырья ПХБ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны и внедрены в практику

1 «Методические рекомендации по арбитражному определению полихлориро-ванных бифенилов в кормах, кормовых добавках и пищевом сырье методом газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором», Свидетельство о метрологической аттестации МВИ № 22-07 от 15 марта 2007 г, утверждены Минсельхозом РФ 5 апреля 2007 г

2 «Методические рекомендации по скрининговому определению полихлори-рованных бифенилов в кормах, кормовых добавках и пищевом сырье методом газожидкостной хроматографии с детектором электронного захвата», Свидетельство о метрологической аттестации МВИ № 21-07 от 15 марта 2007 г, утверждены Минсельхозом РФ 5 апреля 2007 г

Разработанные МР предназначены для проведения мониторинга маркерных и диоксиноподобных ПХБ в кормах, кормовых добавках и пищевом сырье

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Комаров, А А Извлечение полихлорированных бифенилов из рыбной муки методом ускоренной экстракции под давлением / Комаров А А , Крапивкин Б А // Доклады РАСХН -2005 -№2 - С 233-234

2 Komarov A A Application of gas chromatography - ion trap mass spectrometry for determination of dioxin-like PCBs in food and feed / Komarov A A , Krapivkin В A , Panin AN // Book of Abstracts International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 Moscow, Russia 25-30 June, 2006 - V 2 - P 476

3 Komarov A Accelerated solvent extraction and gas chromatography - ion trap mass spectrometry determination of PCBs from feed and food matrices / Komarov A, Krapivkin В , Panin A // 5 th International Symposium On Hormone And Veterinary Drug Residue Analysis held at the Province of Antwerp House, Antwerp, Belgium May 16-19, 2006 Abstract Book - University Gent -2006 -P 137

4 Комаров, А А Определение полихлорированных бифенилов в рыбной муке и рыбе методом тандемной масс-спектрометрии / Комаров А А, Крапивкин Б А // Материалы Всероссийского ветеринарного конгресса и XIV Международного Московского конгресса по болезням мелких домашних животных -М —2006 - С 179180

5 Крапивкин, Б А Определение диоксиноподобных полихлорированных бифенилов методом тандемной масс-спектрометрии в рыбной муке / Крапивкин Б А , Комаров А А , Панин АН// Журнал Ветеринарная практика - 2007 - № 3(34) - С 26-29

6 Крапивкин, Б А Разработка методов определения полихлорированных бифенилов / Крапивкин Б А , Комаров А А , Панин АН// Российский ветеринарный журнал -2007 -№ 1 -С 6-8

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Всемирная Организация Здравоохранения газожидкостная хроматография газожидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектором газожидкостная хроматография с тандемным масс-спектрометрическим детектированием газожидкостная хроматография с детектором электронного захвата

Международный союз чистой и прикладной химии методика выполнения измерений максимально допустимый уровень тандемная масс-спектрометрия методические рекомендации полихлорированные бифенилы токсический эквивалент смеси диоксиноподобных веществ полученный с использованием ТЭФ ВОЗ коэффициент (фактор) эквивалентной токсичности ВОЗ для диоксиноподобных веществ ускоренная экстракция растворителями Федеральное государственное унитарное предприятие «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы»

институт референтных материалов и измерений (Бельгия) Retention Time (время удерживания) режим работы инжектора хроматографа с делением потока газа носителя

режим работы инжектора хроматографа без деления потока газа носителя

Заказ № 146/04/07 Подписано в печать 16 04 2007 Тираж 150 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www cfr ru , e-mail info@cfr ru

Актуальность темы

Полихлорированные бифенилы (ПХБ) принадлежат к группе хлорированных углеводородов, которые синтезируются прямым хлорированием бифенила. В зависимости от числа атомов хлора в молекуле и их положения различают 209 конгенеров ПХБ [54].

В отличие от диоксинов, которые являются побочным продуктом химического синтеза или образуются в результате термического воздействия на хлорированные углеводороды, ПХБ производились промышленностью в больших количествах, как технические жидкости, начиная с 1929 г. Благодаря их физико-химическим свойствам, таким как негорючесть, химическая стабильность, высокая точка кипения, низкая теплопроводность и высокие диэлектрические постоянные, технические смеси ПХБ широко использовались в ряде промышленных производств: в трансформаторах, конденсаторах, тепловых и гидравлических системах, промышленных маслах, красителях, клеях, пластиках и т.д. Термическая, химическая стабильность и способность ПХБ биоаккумулироваться в пищевых цепях, сделали их опасными контаминантами окружающей среды [28, 126, 35, 36, 17, 86].

Практически все страны запретили производство ПХБ в 70-е годы из-за их высокой токсичности и стойкости в окружающей среде, однако большие количества этих веществ до настоящего времени используются в электротехническом оборудовании, на предприятиях машиностроения, химической, легкой, нефтегазовой промышленности [47, 48, 205, 86, 106].

Сейчас, когда производство ПХБ запрещено, загрязнение окружающей среды происходит за счет их испарения и утечки из промышленного оборудования, а также в ходе неправильной его утилизации. По оценкам экспертов, около 35% общего объема произведенных ПХБ все еще присутствует в окружающей среде [193, 32, 20].

До последнего времени, при определении допустимого содержания ПХБ в кормах и пищевых продуктах, учитывалось содержание только «маркерных» конгенеров (28, 52, 101, 138, 153 и 180), которые являются доминирующими контаминантами. Однако токсичность данных конгенеров относительно низка, а данных по содержанию наиболее опасных «диоксиноподобных» конгенеров (77, 81, 126, 169, 105, 114, 118, 123, 156, 157, 167 и 189), которые по своим токсикологическим свойствам намного важнее, до сих пор недостаточно [17,19].

Диоксиноподобные ПХБ относятся к группе стойких экотоксикантов, обладающих канцерогенным, тератогенным, эмбриотоксическим, мутагенным действием и способных наносить вред человеку, сельскохозяйственным, диким животным и окружающей среде в очень низких концентрациях. Причем, данные последних лет показывают, что главная опасность диоксиноподобных ПХБ не столько в их острой токсичности, сколько в кумулятивном действии и отдаленных последствиях [41,32,9, 110,81, 133].

Негативное воздействие ПХБ на здоровье человека сделали актуальным проведение широкомасштабного мониторинга контаминации кормов и пищевого сырья этими соединениями.

Для обеспечения выполнения работ по мониторингу необходимо создание чувствительных и специфичных методов контроля. В соответствии с международными правилами контроля опасных контаминантов, система их контроля должна включать скрининговые и арбитражные (подтверждающие) методы анализа [82].

Наиболее перспективным является использование ГЖХ-ЭЗД для скрининговых исследований, поскольку она обладает высокой чувствительностью, простотой проведения анализа и низкой себестоимостью. Для арбитражных исследований перспективным является использование ГЖХ-МС-МС, так как этот метод обладает чувствительностью, сопоставимой с ГЖХ-ВРМС, но более низкой стоимостью.

Цель и задачи исследований

Целью работы являлась разработка двухуровневой системы контроля маркерных и диоксиноподобных ПХБ в кормах и пищевом сырье, включающей скрининговое определение этих ксенобиотиков методом ГЖХ-ЭЗД и арбитражный анализ положительных образцов методом ГЖХ-МС-МС.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Разработать эффективные способы экстракции, очистки и фракционирования ПХБ из образцов кормов и пищевого сырья;

• Оптимизировать условия хроматографического определения маркерных и диоксиноподобных ПХБ с использованием детектора электронного захвата и масс-спектрометрического детектора типа «ионная ловушка»;

• Разработать методики скринингового и арбитражного определения ПХБ в кормах и пищевом сырье и провести их метрологическую аттестацию;

• Оценить правильность разработанных методов путем испытания международных стандартных образцов с аттестованным содержанием ПХБ;

• Провести мониторинговые исследования образцов рыбной муки и рыбы для оценки степени их загрязненности ПХБ.

Научная новизна работы

Разработаны оригинальные условия подготовки проб методом ускоренной экстракции растворителями (УЭР) (экстрагент - н-гексан, температура экстракции 80°С, два цикла экстракции по 5 мин., микроволновая сушка и гомогенизация пробы с сернокислым натрием, многослойное заполнение экстракционной ячейки силикагелем и силикагелем, импрегнированным серной кислотой), позволяющие повысить эффективность извлечения маркерных и диоксиноподобных ПХБ из пищевого сырья и кормов, значительно сократить время экстракции, объемы экстрагентов и одновременно проводить очистку экстрактов.

Впервые арбитражное определение маркерных и диоксиноподобных ПХБ в кормах и пищевом сырье реализовано на хромато-масс-спектрометре с масс анализатором типа «ионная ловушка» в резонансном режиме тандемной масс-спектрометрии (МС-МС) и регистрации положительных ионов, что существенно снижает стоимость проведения анализов при сохранении высокой чувствительности и соблюдении международных требований по анализу этих контаминантов. Разработаны условия скринингового определения методом ГЖХ-ЭЗД как маркерных, так и диоксиноподобных ПХБ.

С целью гармонизации отечественных и международных подходов к оценке качества результатов измерений, проведена оценка расширенной неопределённости измерения индивидуальных конгенеров ПХБ при анализе кормов и пищевого сырья методами ГЖХ-МС-МС и ГЖХ-ЭЗД.

Практическая значимость работы

Создана комплексная двухуровневая система контроля содержания ПХБ в пищевом сырье и кормах, позволяющая проводить определение маркерных и диоксиноподобных ПХБ скрининговым и арбитражным (подтверждающим) методами.

Проведена метрологическая аттестация методик выполнения измерений (МВИ) маркерных и диоксиноподобных ПХБ, позволяющих проводить их количественное измерение в соответствии с международными требованиями.

Разработанные МВИ включены в методические рекомендации (МР) по арбитражному и скрининговому определению маркерных и диоксиноподобных ПХБ в кормах, кормовых добавках и пищевом сырье. МР утверждены Минсельхозом РФ и используются при государственном мониторинге образцов пищевого сырья и кормов для оценки их загрязненности ПХБ.

Использование относительно недорогих и простых в эксплуатации масс-спектрометров типа «ионная ловушка» позволило обеспечить невысокую стоимость анализа при достижении высокой чувствительности и селективности определения ПХБ.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на:

1. 3-ей Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005).

2. Конференции молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2006).

3. 15 Международном симпозиуме по анализу гормонов и остатков лекарственных средств в пищевых продуктах (Антверпен, Бельгия, 2006).

4. Международном конгрессе по аналитической химии 1СА8-2006 (Москва, 2006).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Разработка способов экстракции и очистки ПХБ из пищевого сырья и кормов с использованием метода УЭР.

2. Оптимизация условий анализа маркерных и диоксиноподобных ПХБ методами ГЖХ-ЭЗД и ГЖХ-МС-МС.

3. Проведение метрологической аттестации и контроля правильности результатов определения ПХБ в пищевом сырье и кормах с использованием международных аттестованных стандартных образцов.

4. Результаты мониторингового определения маркерных и диоксиноподобных ПХБ в рыбной муке и рыбе.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 статей и тезисов докладов, 2 методические рекомендации.

Диссертация изложена на 203 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 223 источника, 40 из которых опубликовано в отечественных и 183 - в зарубежных изданиях, и приложения. Работа иллюстрирована 38 рисунками и 42 таблицами.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана двухуровневая система контроля загрязнённости кормов и пищевого сырья маркерными и диоксиноподобными ПХБ, включающая скрининговое определение этих ксенобиотиков методом ГЖХ-ЭЗД и арбитражное - ГЖХ-МС-МС.

2. Предложены эффективные условия извлечения ПХБ из проб кормов, кормовых добавок и пищевого сырья методом УЭР (экстрагент - н-гексан, температура экстракции 80°С, два цикла экстракции по 5 мин., микроволновая сушка и гомогенизация пробы с сернокислым натрием, многослойное заполнение экстракционной ячейки силикагелем и силикагелем, импрегнированным серной кислотой), позволяющие в течение

20 минут проводить их экстракцию и очистку с использованием 42 - 45 см3 растворителя.

3. Оптимизированы условия ГЖХ-ЭЗД и ГЖХ-МС-МС методом резонансной диссоциации, позволяющие с высокой селективностью и чувствительностью проводить скрининговое и арбитражное определение маркерных ПХБ в диапазоне 1,0 - 1500,0 мкг/кг и диоксиноподобных - 2,0 -2500,0 нг/кг.

4. Проведена метрологическая аттестация разработанных методик, в результате которой оценена расширенная неопределённость измерения массовой доли маркерных и диоксиноподобных ПХБ в кормах и пищевом сырье методами ГЖХ-ЭЗД и ГЖХ-МС-МС. Правильность результатов измерений, полученных с использованием аттестованных методик, подтверждена путем идентификации и количественного определения маркерных и диоксиноподобных ПХБ в международных аттестованных стандартных образцах.

5. В результате мониторинговых исследований установлено превышение МДУ диоксиноподобных ПХБ в 8,3% образцов рыбы и 9,1% рыбной муки. Полученные данные свидетельствуют о необходимости проведения системного мониторинга контаминации кормов и пищевого сырья ПХБ.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны и внедрены в практику:

1. «Методические рекомендации по арбитражному определению полихлорированных бифенилов в кормах, кормовых добавках и пищевом сырье методом газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором», Свидетельство о метрологической аттестации МВИ № 22-07 от 15 марта 2007 г., утверждены Минсельхозом РФ 5 апреля 2007 г.

2. «Методические рекомендации по скрининговому определению полихлорированных бифенилов в кормах, кормовых добавках и пищевом сырье методом газожидкостной хроматографии с детектором электронного захвата», Свидетельство о метрологической аттестации МВИ № 21-07 от 15 марта 2007 г., утверждены Минсельхозом РФ 5 апреля 2007 г.

Разработанные МР предназначены для проведения мониторинга маркерных и диоксиноподобных ПХБ в кормах, кормовых добавках и пищевом сырье.