Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Исследование механизмов развития анемии при подострой интоксикации полихлорированными бифенилами (экспериментальное исследование)

07-5

3271

На правах рукопк<

КАРИМОВ РАВИЛЬ РАМИЛОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РАЗВИТИЯ АНЕМИИ ПРИ ПОДОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫМИ БИФЕИИЛАМИ (экспериментальное исследование)

14.00 Л 6.....«Патологическая физиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Тюмень - 2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Каюмова Алия Фарнтовна

Официальные оппоненты: Академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Захаров Юрий Михайлович доктор медицинских наук, профессор Сторожок Сергей Анатольевич

Ведущая организация:

Гематологический научный центр РАМН (г. Москва)

Защита диссертации состоится «___»______________________2007 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д.208.101,01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 625023, г. Тюмень, ул, Одесская, 54.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия Росздрава» (625023, г. Тюмень, ул. Одесская, 54)

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета докгор медицинских наук, профессор

Фролова О.И.

—--- ОВЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди экологических опасностей, угрожающих человечеству в настоящее время, ведущая роль отводится антропогенному химическому загрязнению окружающей среды. В биосферу с продукцией или отходами поступает огромное число веществ чужеродных живым организмам (ксенобиотиков). Особого внимания заслуживает группа стойких органических загрязнителей (СОЗ), обладающих рядом общих свойств. Все эти вещества относятся к классу хлорорганических соедииений, имеют высокую стойкость к разложению, длительно циркулируют в природной среде, накапливаются в живых тканях и могут быть обнаружены там, где вообще не существует промышленности (Бобовникова Ц.И., 1982; Гусаков А.Е., 1992; Кагамова А.Ф., 1996; Майстренко В.А., 1998; Воронов В.В„ 1999; Клюев H.A., 2001; Dachs J., 2002).

Полихлорированные бифенилы (ПХБ) относят к хлорорганическим соединениям, которые являются суперэкотоксикангами, распространяющиеся далеко за пределы своего первоначального местонахождения и на уровне микропримесей, оказывающие негативное влияние, которое связано с повреждением мембраны клеток и нарушением всех видов обмена в организме человека и животных (Бенсс В., 1980; Ревич Б.А., 2002, 2006; Singh А., 1997; Dachs J., 2002).

ПХБ широко применяются в производственной деятельности человека. Это черная металлургия, энергетика, лесная промышленность, сельское хозяйство. Накопившиеся «запасы» бифенилов в биосфере, даже при медленном приостановлении их производства, не позволяют ликвидировать возникшую проблему (J. Dachs, R. Lohmann, W.A. Ockenden et al., 2002), так как ПХБ очень устойчивы в окружающей среде. Они не подвергаются гидролизу, окислению, биораспаду. В окружающую среду ПХБ попадают, главным образом, за счет сброса промышленных вод в реки, где они накапливаются в иловых отложениях, которые затем могут применяться в качестве удобрений. ПХБ поступают во внешнюю среду преимущественно в парообразном состоянии (Бенес В., 1980; Dachs J., 2002).

ПХБ кумулируют в пищевых продуктах таких как молоко, крупы, зелень, также в организме животных и рыб, в основном в их жировой ткани (Крыжановская М.В., 1993). При подостром и хроническом воздействии ПХБ на организм человека и животных возникает комплекс патологических симптомов. Среди них - нарастающая печеночная недостаточность, гиперкератоз, пигментация кожи, поражения эндокринной, нервной, половой систем (Лашнева Н.В., 1989; Абдуллина Г.М., 1999; Галимов Ш.Н., 2000; Муфазалова H.A., 2004; Мышкин, В.А., 2006; Хабиров Р.Э., 2006). В экспериментальных

работах доказано эмбриотокснческое, тератогенное, мутагенное, иммуносупрессивное воздействие ПХБ (Тутелмн В.А., 1986; Волков B.C., 1998, Волкова Е.С., 2000; Басырова Н.К.,2001; Сабирова И.Р., 2004).

Биологическое действие ПХБ отличается многогранностью токсических эффектов в различных тканях. В настоящее время доказано влияние бифенилов на псрекисное окисление липидов мембран клеток, которое выражается в инициации и усилении ПОЛ (Тугельян В.А, и соавт., 1986; Волков B.C., 1998; Басырова Н.К., 2001; Шайхуллина Л.Р., 2004).

Гайсина А.Ф. (2000-2002) и Богданова A.B. (2004-2006) доказали, что ПХБ вызывают развитие гемолитической анемии у экспериментальных животных, сопровождающееся образованием эритроцитов с низким содержанием гемоглобина. Однако, механизмы возникновения гипохромной анемии при интоксикации экспериментальных крыс различными дозами ПХБ не были раскрыты - не исследованы процессы обмена железа, порфирииовый обмен, функциональное состояние макрофагов селезенки и костного мозга при интоксикации экспериментальных крыс различными дозами ПХБ.

В связи с этим исследование природы анемии, сопровождающую интоксикацию ПХБ осуществляли по системному принципу с использованием патофизиологических, биохимических и морфологических методов. Оценивали состояние прооксидантно-антиооксидантной системы, в частности, ферментов ангаоксидантной защиты -суиероксиддисмутазы, каталазы, продуктов ПОЛ в эритроцитах, костном мозге и печени, антиокислительной активное™ сыворотки крови и печени, а также люминолзависимую хемилюминесценцию в эритроцитах, сыворотке крови, костном мозге и печени, показатели обмена железа и порфиринового обмена, периферический и центральный отдел эритрона у экспериментальных крыс при введении ПХБ в дозе 0,5 ЛДзо, 0,05 ЛД50 и 0,025 ЛДм.

Цель исследования: Изучить механизмы развития гемолитической гипохромной анемии у крыс при интоксикации различными дозами ПХБ, путем исследования обмена железа и порфиринового обмена, эритропоэза в зритробластических островках костного мозга, функционального состояния макрофагов селезенки и костного мозга, характера изменений процессов ПОЛ, а также АОА в эритроцитах, сыворотке крови, костном мозге и печени.

Для реализации цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать показатели периферической крови (содержание эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, индексы красной крови, гематокрит) при по дострой интоксикации ПХБ в дозе 0,5 ЛД», 0,05 ЛД51) и 0,025 ЛДзд.

2. Исследовать характер обмена железа (количество ионов сывороточного железа, ОЖСС, НЖСС, процент насыщения траисферрина железом, уровень сывороточного ферритина, количество свободного гемоглобина в сыворотке крови, наличие гемосидерина в суточной моче, отложение гемосидерина в клетках селезенки и печени) в организме экспериментальных животных при подострой интоксикации ПХБ в дозе 0,5 ЛД», 0,05 ЛД50 и 0,025 ЛД50.

3. Изучить состояние норфиринового обмена (количество копро- и протопорфирина в эритроцитах, количество копропорфирина и 5-аминолевулиновой кислоты в суточной моче, количество общего билирубина в сыворотке крови) при подострой интоксикации экспериментальных животных ПХБ в дозе 0,5 ЛД», 0,05 ЛД» и 0,025 Л Дзо.

4. Оценить функциональное состояние системы фагоцитирующих мононуклеаров, в частности, макрофагов селезенки и центральных макрофагов костного мозга при интоксикации крыс ПХБ дозами 0.5 Л Дм, 0,05 ЛД» и 0,025 ЛДм.

5. Исследовать состояние прооксидантно-ангиоксидантной системы в сыворотке крови, мембране эритроцитов, костном мозге и печени экспериментальных животных в период введения ПХБ в дозе 0,5 ЛД50, 0,05 ЛДи и 0,025 ЛДм-

6. Исследовать люминолзависимуго хемилюминесценцию в сыворотке крови, эритроцитах и костном мозге крыс, получавших ПХВ в дозе 0,5 ЛД50, 0,05 ЛД» и 0,025 ЛД5о-

Научная новизна. Полученные данные позволили установить характер нарушений обмена железа и порфиринового обмена, функциональное состояние макрофагов селезенки и центральных макрофагов костного мозга у экспериментальных крыс, получавших ПХБ в дозе 0,5 ЛД50, 0,05 ЛДм и 0,025 ЛДзо. Впервые проведены исследования ггерекисного окисления липидов и хемилюминесценция в костном мозге и состояние активности ферментов антиоксидантной защиты. Выявлено увеличение промежуточных и конечных продуктов ПОЛ, снижение активности антиоксидантных ферментов в костном мозге и печени, а также общей антиокислительной активности сыворотки крови. Показано, что у животных, подвергнутых воздействию ПХБ, гематологические нарушения, характеризующиеся ускоренным разрушением

эритроцитов, с последующим усилением их новообразования в костном мозге, зависят от дозы введенного ПХБ.

Научно-практическая значимость. Экспериментально подтверждено развитие гипохромной анемии у крыс при интоксикации различными дозами ПХБ. Полученные данные создают возможность разработки алгоритмов диагностики и профилактики различных нарушений в системе красной крови и в печени (при развитии токсического гепатита) у лиц, непосредственно связанных с производством и применением ПХБ, а также у жителей экологически неблагоприятных районов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на бб-й Республиканской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ с международным участием (Уфа, 2001); 68-й Республиканской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ с международным участием (Уфа,

2003); Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука - 2003» (Уфа, 2003); 69-й Республиканской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ с международным участием (Уфа,

2004); IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине - 2004» (Казань, 2004); Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Типовые патологические процессы» (Уфа, 2005); 71-й Республиканской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ с международным участием (Уфа, 2006); Республиканской научно-практической юбилейной конференции «Актуальные вопросы современной медицины и здравоохранения», посвященная 70-летию кафедры общественного здоровья и организации здравоохранения БГМУ (Уфа, 2006); Международном симпозиуме «Актуальные проблемы адаптации в условиях Севера» (Ханты-Мансийск, 2006); Международной научной конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2006); III съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», главы «Собственные данные», обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста, включает 17 таблиц, 33 рисунка из них 8 микрофотографий. Указатель литературы включает 183 отечественной и 60 зарубежной литературы (всего 243).

СОДЕРЖАНИЕ РАБО ТЫ Материал и методы исследования. Экспериментальные исследования выполнены на 480 белых беспородных крысах-самцах половозрелого возраста массой 180-200 г.

Интоксикацию вызывали воздействием отечественной смеси «Совол», включающую 26% тетра-, 64,6% пента-, 9% гексахлорбифенююв и следовые количества гептахлорбифенилов путем внутрижелудочного введения раствора в растительном масле с помощью специального металлического зонда. Экспериментальные животные были разделены натри группы по 150 крыс. Подострое отравление осуществляли ежедневным введением токсиканта в течение 28 дней в суммарных дозах - первой группе крыс токсикант вводился в дозе 3000 мг/кг (0,5 ЛДзо), второй 300 мг/кг (0,05 ЛД50) и третьей 150 мг/кг (0,025 ЛД50). Контрольным группам животных (30 крыс) вводили эквивалентное количество растительного масла.

Сроки забора материала составили 1-, 7-, 14-, 21- и 28-е сутки для каждой группы животных. Исследование контрольной группы крыс осуществляли на 1- и 28-е сутки эксперимента.

Методы исследования: I. Оценка гематологических показателей периферического звена эритрона (количество эритроцитов, концентрация гемоглобина; гематокрит, относительное количество ретикулоцитов) проводилось по общепринятым традиционным методикам (Тодоров Й., 1968; Тиц Н., 2003). Рассчитывали индексы красной крови (цветовой показатель крови (ЦП), среднее содержание гемоглобина (ССГ), средний объем эритроцита (СОК), средняя концентрация гемоглобина (СКГ) в эритроците). П. Исследование обмена железа:

1. Определение концентрации железа сыворотки крови (мкмоль/л) проводилась по методу Hallman L. (1966).

2. Определение железосвязывающей способности сыворотки крови (мкмоль/л) проводили методом Ramsay W., усовершенствованный Ringelhann В. (1957).

3. Определение ненасыщенной железосвязывающей способности сыворотки крови (мкмоль/л) определяли расчетным методом:

НЖСС = ОЖСС - Сывороточное железо

4. Оценка насыщения железом трансферрина (%) сыворотки крови находили расчетным методом:

_ Сыв.жемезо , .„

Сатурация =-хЮО

ОЖСС

5. Количество сывороточного ферритина (мг/л) определяли с помощью реакции непрямой гемагглютинации тест-системы «Скринферр» производства НПК «Препарат» г. Н.Новгород (Ивашкина С.Г., 1998).

6. Определение свободного гемоглобина сыворотки крови проводили гемоглобинцианидиым методом (Тиц Н., 2003).

7. Определение гемосидерина в суточной моче проводили методом Henry J.B. (1991). Для этого животные помещались в обменные клетки, где находились в течение суток. Интерпретацию результатов проводили по насыщенности осадка мочи гранулами синего цвета (гемосидерин).

8. Изучение отложения железа в селезенке и печени проводили методом Перлса (Карпищенко А.И., 1999). Результат оценивали по наличию гранул железа в цитоплазме клеток селезенки и печени.

III. Исследование порфиринового обмена:

1. Определение концентрации свободного протопорфирина и копропорфирина в

эритроцитах проводили методом Grinatein М. и Wintrobe М. в модификации Gajdos-TorokM. (1959).

2. Определение 8-аминолевулиновой кислоты в суточной моче (мг% креатинина) проводили по методу Rijks L.O. в модификации Семеновой JI. С. и соавт. (1982). Для сбора суточной мочи животные были помещены в обменные клетки.

3. Количество копропорфиринов в суточной моче (мг% креатинина) определяли по методу Rinington А. в модификации Soulsby G. (1961). Для сбора суточной мочи животные были помещены в обменные клетки.

4. Определение общего билирубина в сыворотке крови проводили с помощью тест-

системы фирмы "Lachema" (Венгрия).

IV. Оценка функционального состояния макрофагов селезенки и центральных макрофагов костного мозга:

1. Подсчет абсолютного количества эритробластических островков / бедренную кость и распределение ЭО костного мозга по классам зрелости проводили методом предложенным Захаровым Ю.М. (2002).

2. Изучение функционального состояния центральных макрофагов проводили путем вовлечения их в фагоцитоз микрочастиц латекса (Захаров Ю.М., 2000).

3. Оценку функционального состояния системы фагоцитирующих мононуклеаров определяли по методу Васкевича H.H. (1981).

V. Оценка состояния прооксидантно-аитиоксидантиой системы.

1. Определение содержания малонового диальдегида (ТБК-продуктов) в гомогенатах печени и костного мозга (мкмоль/л) проводили по методу описанному Карпищенко А.И. (1999). После выделения костного мозга из бедренной кости экспериментальных крыс подсчитывали абсолютное количество ЭО. Количество ЭО в каждой пробе доводили до З0х103/на бедро путем разведения средой выделения, после чего материал гомогенезировался.

2. Определение продуктов липопероксидации (диеновые конъюгаты (Е/мл), сопряженные триены (Е/мл), шиффовых оснований (Е/мл)) и изолированных двойных связей липидов (Е/л) в гептан-изопропанольных экстрактах гомогенатов печени и костного мозга определяли по методу Волчегорского И.А. с соавторами (1989).

3. Уровень активности каталазы в эритроцитах и сыворотке крови (мкмоль/мл) оценивали по методу, предложенному Королюк МА. с соавторами (1988).

4. Уровень активности супероксидцисмутазы сыворотки крови и эритроцитов (Е/мл) оценивали по методике Терехиной H.A. и Петрович Ю.А. (1992).

5. Общую антиокислительную способность сыворотки и печени определяли с использованием системы, содержащей липопротеиды, полученной из куриного желтка путем гомогенизации и разведения в фосфатном буфере (pH 7,45) по методике Клебанова Г.И. (1999). Результаты оценивали путем вычисления процента торможения пероксидации в присутствии сыворотки.

VI. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции проводили по методу предложенному Фархутдиновым P.P. (1995). Измерения на приборе XJI-003 проводили в костном мозге и эритроцитах, для чего использовали костный мозг, где количество ЭО в каждой пробе доводили до З0х103/на бедро путем разведения средой выделения. Результаты оценивались по светосумме.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование показателей периферической крови выявил, что во всех опытных

группах восстановление количества эритроцитов и гемоглобина не наблюдалось в течение

всего эксперимента. ЦП, ССГ и СКГ оставались низкими во все сроки забора материала.

Возможно, уменьшение показателей ССГ, СКГ и ЦП в опытных группах свидетельствует

о недостаточном уровне синтеза гемоглобина в эритробластах костного мозга при интоксикации крыс в дозе 0,5 ЛД50, 0,05 ЛД50 и 0,025 ЛД50. Таюке наблюдалось уменьшение гематокрита во всех экспериментальных группах, что объясняется усиленным гемолизом эритроцитов. Средний объем эритроцитов был высоким во всех опытных группах до 21-х суток, известно, что действие гемолитических факторов вызывает первоначально характерные изменения рельефа мембраны эритроцитов: из диекоцитов они превращаются в эхиноциты (Веэ813 М., 1986). Причиной этих изменений является уменьшение воспроизводства молекул АТФ в эритроците, нарушение работы К+-Ыа+-АТФазы, накопление в эритроцитах ионов натрия и, как следствие, гидратация эритроцита. В группе крыс, получавших ПХБ в дозе 0,5 ЛД50, данные изменения носили более выраженный характер. Однако и в группах с меньшей дозой токсиканта гематологические показатели не восстанавливались к концу эксперимента. В группе 0,025 ЛДзо количество эритроцитов к 28-м суткам было снижено в меньшей степени, чем в группах 0,5 ЛДзо и 0,05 ЛДзо. Показатели ЦП, ССГ и СКГ были снижены в большей степени, то есть наблюдались более выраженные нарушения в системе крови, связанные с обменом железа и с процессами синтеза гемоглобина.

Таким образом, в результате воздействия ПХБ в дозах 0,5 ЛДзо, 0,05 ЛДзо и 0,025 ЛД50 у экспериментальных крыс в первые две недели опыта развивалась гемолитическая гипохромная анемия регенераторного типа. В последующие сроки наблюдения (21, 28-е сутки эксперимента) отмечалось компенсаторное увеличение количества эритроцитов с одновременным снижением содержания гемоглобина, ЦП, ССГ, СКГ, увеличением СОК и ретикулоцитозом. То есть, сохранялась гемолитическая гипохромная анемия, но уже гнпорегенераторного типа, Уменьшение количества эритроцитов на 1-е сутки эксперимента, видимо, связано с усиленным внутрисосудистым гемолизом эритроцитов.

Анализ полученных данных указывает на то, что изменения содержания сывороточного железа и свободного гемоглобина в сыворотке крови в опыте зависят от дозы введенного ПХБ и обусловлены характером и интенсивностью гемолиза эритроцитов в организме животных. Усиленный гемолиз эритроцитов увеличивает количество свободного железа и количество свободного гемоглобина в сыворотке крови, что в свою очередь приводит к повышению насыщения трансферрина железом и количества сывороточного ферритина.

В группе 0,5 ЛД50 на 1-е сутки опыта наблюдалось снижение количества сывороточного железа (Рис.1), ОЖСС, НЖСС и уровня насыщения трансферрина, кроме сывороточного ферритина. Однако в последующие сроки забора материала на 14-е и 28-е

сутки эксперимента наблюдался неуклонный рост всех показателей обмена железа. Возможно, данная доза ПХБ - 0,5 Л Дм оказывает более токсический эффект на эритроциты и вызывает усиление гемолиза, что характеризуется увеличением содержания продуктов обмена железа.

Анализ группы 0,05 ЛД5о показал, что содержание сывороточного железа, ОЖСС и НЖСС было статистически значимо высокими во все сроки забора материала. Уровень насыщения трансферрина и количество сывороточного ферритина на 1-е сутки были ниже контрольных данных, однако эти показатели возрастали в последующие сроки эксперимента.

60 50 40

л

§ 30 г

х

г

20 10 О

| —0,5 ЛД50 ШЩ 0,05 ЛД50 Е£30,025 ЛД50 —»—Контрольная группа

Рис.1. Динамика изменения количества ионов сывороточного железа у экспериментальных крыс при подострой интоксикации ПХБ в различных дозах.

В группе 0,025 ЛД50 показатели обмена железа изменялись волнообразно, снижаясь на 1-е сугки, повышаясь к 14-м суткам и вновь снижаясь к концу эксперимента. Данный эффект, видимо, связан с малой дозой введенного ПХБ. Показатели обмена железа при этом восстанавливаются быстрее, чем в группах 0,5 ЛД50 и 0,025 ЛД50.

Таким образом, при интоксикации крыс различными дозами ПХБ наблюдались изменения показателей обмена железа в подострый период эксперимента, выразившиеся в увеличении содержания сывороточного железа, ОЖСС, НЖСС, ферритина и свободного гемоглобина (Рис.2), а также снижением уровня насыщения трансферрина на 1-е сутки эксперимента с последующим увеличением данного показателя.

*

—*- - Т1

» ' I ж'_И1

1 14 28

сутки

4 3,2 2,4

5

u.

1.6

0,8 0

сутки

■Ш0.5 ЛД50 НЯИ0.05 ЛД50 Е23 0,025 ЛД50 —«—Контрольная группа

Рис.2. Динамика изменения количества свободного гемоглобина сыворотки крови у экспериментальных крыс при подострой интоксикации различными дозами Г1ХБ.

Исследование свободнорадикального окисления проводили в эритроцитах и сыворотке периферической крови, гомогенатах печени и костного мозга, поскольку именно эритроциты и гепатоциты играют важную роль в неспецифической резистентности организма, гю отношению к факторам, активирующим свободно-радикальное окисление (Волкова Е.С., 1997; Давыдова Н.С., 2001). Данные клетки в значительной степени прерывают развитие свободнорадикального окисления благодаря наличию мощной антиоксидантной системы. Анализ полученных данных позволяет заключить, что поступление совола в организм крыс приводит к усилению процессов ПОЛ в клеточных мембранах. В группе животных, получавших совол в дозе 0,5 ЛД5о, усиление процессов свободнорадикального окисления в печени была выше, чем в других опытных группах. Однако в костном мозге изменения носили иной характер: в группе 0,5 ЛДзоК концу эксперимента содержание промежуточных продуктов пероксидации было на одном уровне с группой 0,025 ЛД50. В группе 0,05 ЛД50 количество промежуточных и вторичных продуктов пероксидации в костном мозге снижалось ниже контрольного уровня к 28-м суткам опыта, тогда как первичные и конечные продукты пероксидации были выше контрольных значений. В группе с наименьшей дозой интоксикации - 0,025 ЛДзо содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ в костном мозге было выше,

чем в остальных группах на 14-е сутки опыта. Также на 28-е сутки эксперимента в этой же экспериментальной группе количество первичных, вторичных и конечных продуктов пероксидации было выше, чем в других группах. Возможно, малые дозы ПХБ оказывают более токсичный эффект на костный мозг, чем на печень. Видимо, такой эффект объясняется накопительными свойствами малых доз ПХБ (Муфазалова H.A., 2002; Мышкин В.А., 2004), что в результате привело к высокому содержанию продуктов ПОЛ в костном мозге. Накопление в печени и костном мозге продуктов липопероксидации непосредственно влияет на структурную и функциональную организацию клеточных мембран и их проницаемость (Лашнева Н.В., 1985; Каюмова А.Ф., 1996; Мышкин В.А., 2002, 2004, 2006; Муфазалова H.A., 2002; Курбанова 3.3., 2004). Активность СОД и каталазы в эритроцитах и плазме крови снижалась на 1-е сутки во всех экспериментальных группах. На 14-е сутки в группах 0,5 ЛД50 и 0,025 ЛД50 в эритроцитах наблюдается повышение активности СОД и каталазы. Однако к концу эксперимента отмечается снижение активности СОД и каталазы во всех экспериментальных группах, что, по-видимому, связано с истощением антиоксидантной системы в периферической крови. Для исследования ангиокислительной активности мы использовали гомогенат печени и сыворотку крови. На 1-е сутки эксперимента АО А печени была высока во всех экспериментальных группах по отношению к контролю, что можно связать с увеличением продуктов пероксидации на 1-е сутки опыта. Однако, на 14-е сутки опыта наблюдается спад АОА в печени, в то время как количество продуктов пероксидации заметно увеличивается. К концу эксперимента в группе 0,5 ЛД50 и 0,025 ЛД50 АОА печени достоверно снижается ниже контрольных показателей, что связано с истощением неферментативной части антиоксидантной защиты организма животных. В сыворотке крови наблюдается аналогичная картина; резкое увеличение АОА на 1-е и 14-е сутки и значительное сншкение на 28-е сугки эксперимента.

Таким образом, в первые сутки эксперимента наблюдается резкое увеличение АОА печени и плазмы крови, что, по-видимому, является ответной приспособительной реакцией организма экспериментальных животных на введение ПХБ. Однако через две недели на фоне продолжающегося поступления ПХБ наблюдается тенденция к снижению АОА печени и сыворотки крови и увеличению продуктов пероксидации. К 28-м суткам АОА печени и сыворотки периферической крови снижается ниже контрольных значений, что, вероятно, связано с усилением процессов ПОЛ.

Таким образом, введение в организм экспериментальных животных ПХБ в различных дозах усиливает процессы свободнорадикального окисления в клетках

костного мозга и печени во всех экспериментальных группах и вызывает в эритроцитах и сыворотке крови истощение компонентов антиоксидантной системы.

Анализ эритроцитов контрольных крыс выявил низкий уровень люминолзависимой хемшноминесценцин. Однако, результаты исследования выявили интенсификацию процессов СРО в эритроцитах и костном мозге группы крыс, получавших ПХБ и дозе 0,5 ЛД50 и 0,025 ЛД50, что выражается в увеличении светосуммы хемшноминесцепции и уменьшении латентного периода между быстрой и медленной вспышками.

Значительное сокращение продолжительности латентного периода между быстрой и медленной вспышками на хемшпоминограммах указывает на развитие дефицита антиоксидантов, снижение резервов физиологической антиоксидантной защиты в организме.

Методика регистрации хемилюминограмм показала интенсификацию процессов ПОЛ в исследуемых органах (эритроцитах и костном мозге) и снижение активности антиоксидантной системы в организме опытных крыс, не прибегая к дорогостоящим и длительным экспериментам.

Анализируя проведенные исследования порфиринового обмена можно отмстить, что содержание протопорфирина в эритроцитах увеличивается к 14-м суткам во всех группах животных и многократно возрастает на 28-е сутки эксперимента в группах 0,5 ЛД50 и 0,05 ЛД50. Тогда как, содержание копропорфирина к 14-м суткам незначительно повышается по сравнению с контрольными данными и на 28-е сутки эксперимента содержание копропорфирина в эритроцитах достигает высоких значений в группах 0,5 ЛД50 и 0,05 ЛД50. В группе 0,025 ЛДго на 28-е сутки эксперимента содержание копропорфирина не достигает контрольных данных. Однако при определении содержания копропорфирина в суточной моче наблюдается иная картина. В группе животных, получавших совол в дозе 0,5 ЛД50, идет интенсивный подъем показателя, начиная со второй недели опыта, и к концу эксперимента он составил 608,6 мг/г креатинина (р<0,001). В группе 0,05 ЛД50, наоборот, идет спад данного показателя уже с 1-х сугок эксперимента. В группе 0,025 ЛД50 содержание копропорфирина в моче изменяется волнообразно, повышаясь к 1-м суткам, далее снижаясь к середине опыта и вновь повышаясь к 28-м суткам. Одним из важнейших биохимических тестов при некоторых соматических заболеваниях, связанных с нарушением порфиринового обмена, а также при интоксикации свинцом, бензолом и другими фенолсодержащими веществами является определение й-аминолепулиновой кислоты в моче, степень увеличения которой свидетельствует о торможении на одном из ранних этапов биосинтеза порфиринов

(Сорокина Н.С., 1971; Бернат И., 1975; Павловская H.A., 1981). В группе 0,5 ЛД50 наблюдается рост количества AJTK в моче к 14-м и 28-м суткам. В группе 0,05 ЛД50, наоборот, наблюдается статистически значимое снижение содержания АЛК в моче к концу эксперимента. В группе крыс, получавших ПХБ в дозе 0,025 ЛД50, данный показатель изменялся волнообразно: повышаясь к 1-м суткам, снижаясь к 14-м суткам и резко возрастая к концу эксперимента.

Нормальное содержание свободных прото- и копропорфирина в эритроцитах колеблется в относительно узких пределах (Бернат И., 1975), а потому при определении величин, превышающих эти пределы, молено с относительно большей достоверностью делать заключение о нарушении синтеза тема. В данном конкретном случае наблюдается сверхнакопление протопорфирина и копропорфирина в эритроцитах в группах крыс, получавших совол в дозе 0,5 ЛД50 и 0,05 ЛДзо. Однако содержание в моче копропорфирина в группе 0,5 ЛД50 остается очень высоким, что, по-видимому, объясняется «вымыванием» излишнего количества копропорфирина мочой. В группе 0,025 ЛДзо содержание копропорфирина в эритроцитах не достигает контрольного значения. В то же время содержание копропорфирина в моче в группе 0,025 ЛД50 было высоким к концу эксперимента. Изменения содержания АЛК, а также копропорфирина в моче следует оценивать с большой осторожностью, поскольку эти предшественники тема, выделяющиеся с мочой, могут происходить не только из клеток крови, но и из любых тканей или клеток организма, и особенно из клеток печени, однако преобладающая часть названных промежуточных продуктов возникает именно в ходе биосинтеза гемоглобина.

Содержание общего билирубина в разных группах было разным. В группе 0,5 ЛД50 его количество изменялось волнообразно. В группе 0,05 Л Дм на 14-е и 28-е сутки его количество оставалось примерно одинаковым. В группе с наименьшей дозой ПХБ (0,025 ЛДзо) наблюдался постепенный спад показателя. Однако во всех трех экспериментальных группах содержание общего билирубина не опускалось ниже контрольного значения, что говорит об усиленной утилизации гемоглобина в СФМ.

Таким образом, анализируя полученные данные можно сделать заключение о том, что в группах экспериментальных животных, получавших совол в дозе 0,5 ЛД50 и 0,025 ЛД50, наблюдается большее нарушение порфнринового обмена, которое приводит к угнетению биосинтеза гемоглобина.

Проведенные исследования функциональной активности макрофагов селезенки, показали, что в группах 0,5 ЛД50 и 0,025 ЛД50 наблюдается интенсификация процесса

поглощения СФМ поврежденных эритроцитов в отличие от группы крыс, получавших ПХБ в дозе 0,05 ЛДзо.

Таким образом, исследования СФМ экспериментальных крыс, получавших ПХБ в различных дозах показали, что в группе животных 0,5 ЛДзо, происходит некоторое увеличение функциональной активности СФМ по сравнению с контрольной группой. В группе 0,025 ЛД50 функциональная активность СФМ резко возрастает, что, по-видимому, связано со стимулирующим воздействием данной дозы на систему мононуклеаров. В группе 0,05 ЛДзо показатели функциональной активности СФМ находились на уровне контрольных данных.

Изменения в центральном звене эритропа носили следующий характер: при интоксикации крыс ПХБ в дозе 0,5 ЛД50 в течение 28-ми дней наблюдалось замедление созревания ЭО, начиная с 1-х суток (Табл.). На 14-е сутки сохранялось снижение темпа перехода амплификации клеток «короны» островков от ЭО1 до ЭОш, о чем свидетельствует уменьшение процента содержания ЭОц и ЭОш. Равное же исходному количеству содержание ЭО„т и содержание ретикулоцитов в периферической крови указывает на их замедленное созревание. К концу эксперимента на 28-е сутки данное торможение амплификации ЭО продолжает сохраняться, приводя к более, чем трехкратному снижению содержания ЭОш по сравнению с контролем. Мало отличающееся от контрольного уровня содержание ЭОит на фоне слабого подъема содержания ретикулоцитов в периферической крови указывает на сохраняющееся торможение созревания эритроидной «короны» этих островков. Абсолютное количество ЭО в костном мозге в результате торможения амплификации эритроидных клеток на 14-28-е сутки было снижено. Также в этой группе наблюдается снижение УФА ЦМ ЭО всех классов зрелости к концу эксперимента. Видимо, данное нарушение фагоцитарной функции ЦМ ЭО и эритропоэза в ЭО в этой группе крыс связано с высокой дозой полученного ими токсиканта. Возможно, это связано как с усилением ПОЛ в костном мозге (так как содержание промежуточных, первичных и конечных продуктов пероксидации возрастает в несколько раз именно в этот период по сравнению с контрольной группой крыс), так и торможением синтеза гема, проявляющегося в нарушении порфиринового обмена у подопытных крыс.

В группе 0,05 ЛД50 на 1-е сутки после введения ПХБ наблюдается снижение вовлечения КОЕ-э в эритропоэз, однако, в последующие сроки на 14-е и 28-е сутки эксперимента процент содержания ЭО[ возрастает. Формирование ЭО^, из ЭО,1Н, было высоким на 1-е и 14-е сутки опыта. Однако, при интенсивном формировании ЭО1 и ЭОр« процент содержания ЭО10в оставался сниженным по сравнению с контрольными

данными, что указывает на замедленное созревание эритроидной «короны» ЭО. На 28-е сутки наблюдается резкое торможение формирования ЭОрск, но увеличивается процент содержания всех других пролиферирующих классов ЭО. Абсолютное количество ЭО в этой группе в первой неделе опыта оставалось на уровне контрольных значений и лишь к концу опыта наблюдалось их небольшое снижение. УФА ЦМ ЭО во всех классах зрелости в этой группе животных повышалась к концу эксперимента.

Таблица

Абсолютное количество ЭО (х103/бедро) костного мозга при подострой интоксикации

крыс различными дозами ПХБ

\Доза ПХБ 0,5 ЛД5о 0,05 ЛДзо 0,025 ЛДзо

Сроки (5) (5) (5)

исследованиях.

Контрольная

группа (5) 237,7±2,8

1 сутки 244,1±2,5 233,1±33,б 228,2±5,9

7 сутки 262,7± 1,73 224,5±5,1 182,5±4,6

(р<0,001) - (р<0,001)

14 сутки 180,5±3,6 232,2±10,6 145,5±3,75

(р<0,001) - (р<0,001)

21 сутки 181,7±3,6 227,7±18,5 241,4±4,9

(р<0,001) - -

28 сутки 191,7±б,4 215,9±1,03 235,5±9,б

(р<0,05) №<0,05) -

Примечание: р - достоверность в сравнении с показателями в контрольной группе, в скобках - количество животных в группе.

В группе 0,025 ЛДзо на 1-е сутки эксперимента наблюдается некоторое торможение вовлечения КОЕ-э в эритропоэз. Однако, процент содержания ЭО,Шв остается высоким по сравнению с контролем. К середине опыта, наоборот, наблюдается ускорение перехода КОЕ-э в ЭОи но процент содержания ЭОШш резко снижается, что говорит о замедлении созревания эритроидной «короны» ЭО. К концу эксперимента наблюдается замедленный переход ЭО) в ЭОш, однако, процент содержания ЭОшм и ЭОрск остается высоким по

сравнению с контрольными данными. Абсолютное количество ЭО в данной группе животных было низким во все сроки исследования, кроме 21-х суток. УФА ЦМ ЭО во всех классах зрелости в этой группе крыс оставалось выше контрольных значений во все сроки, кроме ЭО„т (14-е сутки) и ЭОц (28-е сутки).

Исследования ЭО костного мозга крыс, получавших ПХБ в дозах 0,05 ЛДщ и 0,025 ЛД50. выявило торможение созревания эритроидных клеток в ЭО. Можно полагать, что данным обстоятельством объясняется, отмечаемое нами замедленное восстановление количества эритроцитов в периферической крови в конце эксперимента и нерезко выраженный ретикулоцитоз, не покрывающий убыль эритроцитов. Одновременно качественные характеристики воспроизводимых эритроцитов остаются нарушенными к концу эксперимента во всех группах животных, что проявляется в низком содержании гемоглобина в эритроцитах на протяжении всего опыта.

Таким образам, ПХБ при подостром отравлении вызывают состояние подобное гематологическому стресс-синдрому, являющемуся неспецифичсским ответом системы крови на повреждение тканей (введение совола). Гематологический стресс характеризуется гипорегеиераторной анемией и нейтрофильным лейкоцитозом, который сочетается с характерным для этого состояния повышенным фоном колониестимулирующих факторов (цитокинов), ингибиторов гемопоэза в крови, миелоидной гиперплазией костного мозга, изменениями обмена железа, трансферрина, альбуминов, факторов коагуляции (Захаров Ю.М., 2000). Центральным звеном в генезе гематологического стресса является активация СФМ, приводящая к изменению других звеньев кроветворной ткани.

Характерная для гемопоэтического стрссс-синдрома стимуляция макрофагов является фактором, поддерживающим грануломоноцитопоэз, иммунологическую реактивность и воспалительный потенциал организма. Это достигается, в частности, повышением продукции макрофагами ИЛ-1, ИЛ-6, КСФг, КСФгм, приводящей к лейкоцитозу, увеличением продукции макрофагами ряда биологически активных веществ (ОНФ-а, интерфероны и др.) и усилением их фагоцитарной активности.

Рассматривая в целом изменения в системе эритрона у животных, подвергшихся воздействию ПХБ, можно сказать, что эти изменения носили фазный характер. В первую фазу изменений в эритроне отмечался усиленный гемолиз эритроцитов, который постепенно компенсировался воспроизводством эритроцитов. Вероятно, это происходит благодаря внутриклеточным компенсаторным перестройкам в системе эритрона. Одновременно развивается дисэритропоэз, связанный с нарушением клеточных механизмов взаимодействия при формировании ЭО, сопровождающееся нарушением

волны амплификации. В первую фазу наблюдалась гемолитическая нормохромная анемия регенераторного типа.

Во вторую фазу изменений при продолжающейся интоксикации ПХБ, наблюдался выход токсиканта из жирового депо в кровеносное русло и накопление более токсичных продуктов биотрансформации ПХБ (гидроксипированные фенолы) (Мышкин В.А., 2002) . Эта фаза характеризуется высоким уровнем эритрогкша в костном мозге, благодаря чему количество эритроцитов в периферической крови повышается. Однако, вследствие нарушения биосинтеза гемоглобина эритроциты производились неполноценными, то есть они были гипохромными. Таким образом, во второй фазе изменений наблюдается гемолитическая гипохромная анемия гипорегенераторного типа.

Таким образом, в результате воздействия ПХБ в дозах 0,5 ЛД50, 0,05 ЛД50 и 0,025 ЛДзо у экспериментальных крыс в начале опыта развивалась гемолитическая гипохромная анемия регенераторного типа. В последующие сроки наблюдения отмечалось компенсаторное увеличение количества эритроцитов с одновременным снижением содержания гемоглобина, ЦП, ССГ, СКГ, увеличением СОК и ретикулоцитозом. То есгь, развивалась гемолитическая гипохромная анемия гипорегенераторного типа. Неполное восстановление количества эритроцитов в группе 0,025 ЛД50 в нашем случае, возможно, связано с эритропоэтиновой стимуляцией оказываемой данной дозой на эритропоэз. Известно, что при подостром отравлении ПХБ экспериментальных животных подавляется глюконеогенез (Мышкин В.А., 2006) и развивается прогрессирующая гипоксемия, которая стимулирует экспрессию субъединицы а гипоксией индуцированного фактора-1 (ГИФ-1а), контролирующей ген эритропоэтина. При этом вторая субъединица - ГИФ-lß арилгвдрокарбонатный ядерный транслокатор вовлечен в ответ клетки не только на гипоксию, но и на ксенобиотики, в том числе и ПХБ, и реализуется сигналом диоксинового Ah-рецептора (Жученко H.A., 2006; Michiels С., 2004). Экспрессия ГИФ-1 приводит к активации отвечающих на гипоксию элементов участка «спираль-спираль» последовательностей ДНК, приводящих к транскрипции и-РНК и синтезу пептидов, повышающих устойчивость клетки и ткани к гипоксии.

На рисунке 3 представлена схема развития анемии при подострой интоксикации ПХБ в дозе 0,5 ЛД50, 0,05 ЛД50 и 0,025 ЛДзо-

Рис.3. Схема развития анемии при подострой интоксикации экспериментальных крыс ПХБ.

Выводы

1. При интоксикации ПХБ наблюдаются различные по выраженности, времени проявления и продолжительности гематологические нарушения, характеризующиеся ускоренным разрушением эритроцитов периферической крови и развитием в первые две недели после начала введения ПХБ гемолитической гипохромной анемии регенераторного типа, сменяющейся на 14-е сутки гемолитической гипохромной анемией гипорегенераторного типа.

2. В группе животных, получавших ПХБ в дозе 0,5 ЛД50, значительные нарушения в системе эритрона, проявляются преимущественно выраженным внутрисосудистым гемолизом эритроцитов, дисэритропоэзом в костном мозге, характеризующимся нарушением волны амплификации, торможением созревания ЭО, нарушением порфиринового обмена, усилением ПОЛ в костном мозге и печени, и истощением антиоксидантной системы в эритроцитах и сыворотке крови. Данные нарушения сохранялись в течение всего эксперимента.

3. В группе животных, получавших. ПХБ в дозе 0,05 ЛД50 нарушения в системе эритрона в первые две недели эксперимента характеризуются умеренным внутрисосудистым гемолизом эритроцитов, медленным созреванием ЭО в костном мозге, не выраженными нарушениями порфиринового обмена, усилением ПОЛ в костном мозге и печени, и истощением антиоксидантной системы в эритроцитах и сыворотки крови. К концу эксперимента изменения носили более выраженный характер.

4. У крыс, получавших ПХБ в дозе 0,025 ЛД50, развивался преимущественно внутриклеточный гемолиз, изменения носили двухфазный характер. В первые две недели показатели периферического звена эритрона, обмена железа, ПОЛ (в костном мозге и печени) и порфиринового обмена возрастали, и достигли максимума па 14-е сутки опыта, при этом также наблюдалось угнетение созревания ЭО в костном мозге и снижение АОА сыворотки крови. Во вторую фазу показатели периферического и центрального звеньев эритрона, обмена железа, порфиринового обмена и прооксидантно-аитиоксидантной системы имели тенденцию к восстановлению до контольного уровня.

Практические рекомендации.

При анемиях неясной этиологии, токсических гепатитах у лиц, связанных с химическим производством обязательным диагностическим критерием должно быть изучение показателей периферической крови, характер обмена железа и порфиринов, что позволит уточнить диагноз и назначи ть патогенетическое лечение.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Каримов, P.P. Оценка состояния центрального и периферического звена эритрона при воздействии различных доз полихлорированыых бифенилов в эксперименте / P.P. Каримов, А.Ф. Гайсина // Материалы 66-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ. - Уфа, 2001. - С.14.

2. Каримов, P.P. Анализ развития анемии у крыс при интоксикации полихлорированными бифенилами / P.P. Каримов // Материалы 68-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ. - Уфа, 2003. - С.14.

3. Каримов, P.P. Характер компенсаторных возможностей в центральном эритроне у экспериментальных животных на фоне интоксикации различными дозами полихлорированных бифенилов / P.P. Каримов, А.Ф, Гайсина, A.B. Богданова // Материалы Республиканской конференции молодых ученых РБ «Медицинская наука -2003».-Уфа, 2003.-С.30.

4. Каримов, P.P. Анализ воздействия полихлорированных бифенилов на хрупкость мембран эритроцитов / P.P. Каримов // Материалы 69-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ с международным участием. - Уфа, 2004. -• С.44.

5. Каримов, P.P. Исследование характера кроворазрушения по отложению железа в селезенке и печени крыс при интоксикации полихлорированными бифенилами / P.P. Каримов, А.Ф. Гайсина, A.B. Богданова // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2004. - С. 122.

6. Каримов, P.P. Анализ показателей периферической крови в восстановительном периоде после подострой интоксикации экспериментальных крыс полихлорированными бифенилами / P.P. Каримов, А.Ф. Гайсина, A.B. Богданова, А.Ф. Каюмова, В.А. Катаев // Материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Типовые патологические процессы». - Здравоохранение Башкортостана. -2005. - спецвыпуск №7. - С.42-44.

7. Каримов, P.P. Сравнительная характеристика показателей периферического звена эритрона при интоксикации экспериментальных крыс полихлорированными бифенилами в дозе 0,5 ЛД50 и 0,025 ЛД50 / P.P. Каримов, Р.Ф. Тазетдинов, А.Ф. Гайсина // Материалы 71-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ о международным участием. - Уфа, 2006. - С.264-265.

8. Каримов, P.P. Изучение функциональной активности макрофагов селезенки при интоксикации крыс различными дозами полихлорированных бифенилов / P.P. Каримов, С.Ю. Ковалевич, А.Ф. Гайсина, С.Х. Нафикова // Материалы 71-й Республиканской

научной конференции студентов и молодых ученых ЕГМУ с международным участием. -Уфа, 2006. - С.265-267.

9. Каримов, P.P. Исследование обмена железа в организме экспериментальных крыс при подострой интоксикации ПХБ и в восстановительном периоде / P.P. Каримов, А.Ф. Сулейманов, Ф.А. Субхангулов, Р.Д. Сабиров, А.Ф. Гайсина // Материалы 71-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ с международным участием. - Уфа, 2006. - С.272.-273.

10. Каримов, P.P. Динамика развития анемии при подострой интоксикации экспериментальных крыс полихлорированными бифенилами / P.P. Каримов, А.Ф. Гайсина, А.Ф. Каюмова // Международный научный симпозиум «Актуальные проблемы адаптации в условиях Севера». - Ханты-Мансийск, 2006. - С.42-43.

11. Каримов, P.P. Обмен железа при подострой интоксикации крыс полихлорированными бифенилами / P.P. Каримов, А.Ф. Гайсина // Республиканская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы современной медицины и здравоохранения». - Уфа, 2006. - С.47-49.

12. Каримов, P.P. Влияние полихлорированных бифенилов на обмел железа / P.P. Каримов, А.Ф. Гайсина, А.Ф. Каюмова // I Международная научная конференция «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды». - Челябинск, 2006. - С.346-348.

13. Каримов, P.P. Влияние полихлорированных бифенилов на фагоцитарную активность макрофагов селезенки у экспериментальных крыс / P.P. Каримов, А.Ф. Гайсина, А.Ф. Каюмова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006. - №3(2). -С.21-22.

14. Каримов, P.P. Влияние полихлорированных бифенилов на перскисное окисление липидов в костном мозге / P.P. Каримов, А.Ф. Гайсина, А.Ф. Каюмова // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2006. - №3(2). - С.28-29.

15. Каримов, P.P. Влияние полихлорированных бифенилов на метаболизм железа при подострой интоксикации и в восстановительный период P.P. Каримов, А.Ф. Гайсина, А.Ф. Каюмова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006. - №3(2). - С.Юб-107.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АО — антиоксидантная система

ИЛ-1, б, 10 - интерлейкины -1, 6,10

КОЕ-э - колониеобразующая единица эритроцитарная

КСФ — колониестимулирующий фактор

МОС — монооксидазная система

НЖСС - ненасыщенная железосвязывающая способность сыворотки

ОЖСС - общая железосвязывающая способность сыворотки

ОНФ-а - опухольнекротизирующий фактор-альфа

ОЦК - объем циркулирующей крови

ОЦЭ - объем циркулирующих эритроцитов

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПХБ - полихлорированные бифенилы

РЭС - ретикулоэндотелиальная система

СОД - супероксиддисмутаза

СОЗ - стойкие органические загрязнители

СОК - средний объем эритроцита

СКГ - средняя концентрация гемоглобина в эритроците

ССГ — среднее содержание гемоглобина в эритроците

СФМ - система фагоцитирующих мононуклеаров

ТФ - трансферрин

ТФР—трансферриновый рецептор

сТФР - сывороточный трансферрин

Фе — ферритин

ЦМ - центральный макрофаг

ЦП - цветовой показатель

ЭО - эритробластический островок

ЭЦМ - экстрацеллюлярный матрикс

на правах рукописи

КАРИМОВ РАВИЛЬ РАМИЛОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РАЗВИТИЯ АНЕМИИ ПРИ ПОДОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫМИ БИФЕНИЛАМИ

(экспериментальное исследование)

14.00.16 - «Патологическая физиология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано к печати 03.10.2007 г. Формат 60x84/16 Гарнитура Times New Roman. Бумага белая 80 г/м2 Усл.псч.л. 1,4. Уч.-изд.л. 1,3. Тираж 100. Заказ №34.

Отпечатано на ризографе. ИП Раянов В.Р. 450077, РБ, г. Уфа,ул. Мингажева, 100, ком. 105а. Тел. (3472)74-68-28.

2006134240

2006134240

Среди экологических опасностей, угрожающих человечеству в настоящее время, ведущая роль отводится антропогенному химическому загрязнению окружающей среды. В биосферу с продукцией или отходами поступает огромное число веществ, чужеродных живым организмам (ксенобиотиков). Особого внимания заслуживает группа стойких органических загрязнителей (СОЗ), обладающих рядом общих свойств. Все эти вещества относятся к классу хлорорганических соединений, стойки к разложению, длительно циркулируют в природной среде, накапливаются в живых тканях и могут быть обнаружены там, где вообще не существует промышленности (Бобовникова Ц.И., 1982; Гусаков А.Е., 1992; Каюмова А.Ф., 1996; Майстренко В.А., 1998; Воронов В.В., 1999; Клюев H.A., 2001; Dachs J., 2002).

Полихлорированные бифенилы (ПХБ) относят к хлорорганическим соединениям, которые являются суперэкотоксикантами, распространяющиеся далеко за пределы своего первоначального местонахождения и на уровне микропримесей, оказывающие негативное влияние, которое связано с повреждением мембраны клеток и нарушением всех видов обмена в организме человека и животных (Бенес В., 1980; Ревич Б.А., 2002, 2006; Singh А., 1997; Dachs J., 2002).

ПХБ широко применяются в производственной деятельности человека. Это черная металлургия, энергетика, лесная промышленность, сельское хозяйство. Накопившиеся «запасы» бифенилов в биосфере, даже при медленном приостановлении их производства, не позволяют ликвидировать возникшую проблему (J. Dachs, R. Lohmann, W.A. Ockenden et al., 2002), так как ПХБ очень устойчивы в окружающей среде. Они не подвергаются гидролизу, окислению, биораспаду. В окружающую среду ПХБ попадают, главным образом, за счет сброса промышленных вод в реки, где они накапливаются в иловых отложениях, которые затем могут j применяться в качестве удобрений. ПХБ поступают во внешнюю среду преимущественно в парообразном состоянии (Бенес В., 1980; Dachs J., 2002).

ПХБ кумулируют в пищевых продуктах, таких как молоко, крупы, зелень, также в организме животных и рыб, в основном в их жировой ткани (Крыжановская М.В., 1993). При подостром и хроническом воздействии ПХБ на организм человека и животных возникает комплекс патологических симптомов. Среди них - нарастающая печеночная недостаточность, гиперкератоз, пигментация кожи, поражения эндокринной, нервной, половой систем (Лашнева Н.В., 1989; Абдуллина Г.М., 1999; Галимов Ш.Н., 2000; Муфазалова H.A., 2004; Мышкин, В.А., 2006; Хабиров Р.Э., 2006). В экспериментальных работах доказано эмбриотоксичное, тератогенное, мутагенное, иммуносупрессивное воздействие ПХБ (Тутельян В.А., 1986; Волков B.C., 1998; Волкова Е.С., 2000; Басырова Н.К., 2001; Сабирова И.Р., 2004).

Таким образом, изучение ответной реакции организма человека и животных на интоксикацию ПХБ является одной из актуальных медико-биологических проблем современности, так как экологическая обстановка в стране и мире не изменяется к лучшему (Крыжановская М.Н., 1993; Тутельян В.А., Лашнева Н.В. и соавт., 1995; Майстренко В.Н., 1998; Воронов В.В., 1999).

Биологическое действие ПХБ отличается многогранностью токсических эффектов в различных тканях. В настоящее время доказано влияние бифенилов на перекисное окисление липидов мембран клеток, которое выражается в инициации и усилении ПОЛ (Тутельян В.А. и соавт., 1986; Волков B.C., 1998; Басырова Н.К., 2001; Шайхуллина Л.Р., 2004).

Гайсина А.Ф. (2000-2002) и Богданова A.B. (2004-2006) доказали, что ПХБ вызывают развитие гемолитической анемии у экспериментальных животных, сопровождающееся образованием эритроцитов с низким содержанием гемоглобина. Однако, механизмы возникновения гипохромной анемии при интоксикации экспериментальных крыс различными дозами ПХБ не были раскрыты — не исследованы процессы обмена железа, порфириновый обмен, функциональное состояние макрофагов селезенки и костного мозга при интоксикации экспериментальных крыс различными дозами ПХБ.

В связи с этим исследование природы анемии, сопровождающей интоксикацию ПХБ, осуществляли по системному принципу с использованием патофизиологических, биохимических и морфологических методов. Оценивали состояние прооксидантно-антиооксидантной системы, в частности, ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы, каталазы, продуктов ПОЛ в эритроцитах, костном мозге и печени, антиокислительной активности сыворотки крови и печени, а также люминолзависимую хемилюминесценцию в эритроцитах, сыворотке крови, костном мозге и печени, показатели обмена железа и порфиринового обмена, периферический и центральный отдел эритрона у экспериментальных крыс при введении ПХБ в дозе 0,5 ЛД5о, 0,05 ЛД50 и 0,025 ЛД50

Цель исследования

Изучить механизмы развития гемолитической гипохромной анемии, у крыс при интоксикации различными дозами ПХБ, путем исследования обмена железа и порфиринового обмена, эритропоэза в эритробластических островках костного мозга, функционального состояния макрофагов селезенки и костного мозга, характера изменений процессов ПОЛ, а также АОА в эритроцитах, сыворотке крови, костном мозге и печени.

Задачи исследования

1. Исследовать показатели периферической крови (содержание эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, индексы красной крови, гематокрит) при подострой интоксикации ПХБ в дозе 0,5 ЛД50, 0,05 ЛД50 и 0,025 ЛД50.

2. Исследовать характер обмена железа (количество ионов сывороточного железа, ОЖСС, НЖСС, процент насыщения трансферрина железом, уровень сывороточного ферритина, количество свободного гемоглобина в сыворотке крови, наличие гемосидерина в суточной моче, отложение гемосидерина в клетках селезенки и печени) в организме экспериментальных животных при подострой интоксикации ПХБ в дозе 0,5 ЛД50, 0,05 ЛД50 и 0,025 лд50.

3. Изучить состояние порфиринового обмена (количество копро- и протопорфирина в эритроцитах, количество копропорфирина и 8-аминолевулиновой кислоты в суточной моче, количество общего билирубина в сыворотке крови) при подострой интоксикации экспериментальных животных ПХБ в дозе 0,5 ЛД5о, 0,05 ЛД50 и 0,025

ЛД50

4. Оценить функциональное состояние системы фагоцитирующих мононуклеаров, в частности, макрофагов селезенки и центральных макрофагов костного мозга при интоксикации крыс ПХБ дозами 0,5 ЛД50, 0,05 ЛД50 и 0,025 ЛД50.

5. Исследовать состояние прооксидантно-антиоксидантной системы в сыворотке крови, мембране эритроцитов, костном мозге и печени экспериментальных животных в период введения ПХБ в дозе 0,5 ЛД50, 0,05 ЛД50 и 0,025 ЛД50.

6. Исследовать люминолзависимую хемилюминесценцию в сыворотке крови, эритроцитах и костном мозге крыс, получавших ПХБ в дозе 0,5 ЛД50, 0,05 ЛД50 и 0,025 ЛД50.

Новизна исследований

Полученные данные позволили установить характер нарушений обмена железа и порфиринового обмена, функциональное состояние макрофагов селезенки и центральных макрофагов костного мозга у экспериментальных крыс, получавших ПХБ в дозе 0,5 ЛД50, 0,05 ЛД50 и 0,025 ЛД50. Впервые проведены исследования перекисного окисления липидов и хемилюминесценция в костном мозге и состояние активности ферментов антиоксидантной защиты. Выявлено увеличение промежуточных и конечных продуктов ПОЛ, снижение активности анитиоксидантных ферментов в костном мозге и печени, а также общей антиокислительной активности сыворотки крови. Показано, что у животных, подвергнутых воздействию ПХБ, гематологические нарушения, характеризующиеся ускоренным разрушением эритроцитов, с последующим усилением их новообразования в костном мозге, зависят от дозы введенного ПХБ.

Полученные данные позволили оценить выраженность гематологического синдрома и выявить патогенез анемии при интоксикации ПХБ и возможность разработать методы профилактики гематологических проявлений при отравлении различными дозами ПХБ.

Практическая значимость

Экспериментально подтверждено развитие гипохромной анемии у крыс при интоксикации различными дозами ПХБ. Полученные данные создают возможность разработки алгоритмов диагностики и профилактики различных нарушений в системе красной крови и в печени (при развитии токсического гепатита) у лиц, непосредственно связанных с производством и применением ПХБ, а также у жителей экологически неблагоприятных районов.

Положения, выносимые на защиту

1. Интоксикация экспериментальных животных различными дозами ПХБ вызывает развитие гипохромной гемолитической анемии регенераторного типа, сменяющейся к концу эксперимента (28-й день) гемолитической гипохромной анемией гипорегенераторного типа.

2. У крыс, получавших ПХБ в дозах 0,5 ЛД50 и 0,05 ЛД50, наблюдается более интенсивный гемолиз эритроцитов, характеризующийся ростом количества ионов сывороточного железа, уровня насыщения трансферрина железом, увеличением количества сывороточного ферритина и свободного гемоглобина к концу эксперимента. В группе 0,025 ЛД50 гемолиз эритроцитов носил менее выраженный характер.

3. В группе крыс, получавших ПХБ в дозе 0,5 ЛД50 и 0,025 ЛД50) наблюдается более выраженное угнетение порфиринового обмена, заключающееся в увеличении копро- и протопорфирина в эритроцитах, а также в увеличении содержания 5-аминолевулиновой кислоты в суточной моче. В группе 0,05 ЛД50 данные изменения носили менее выраженный характер.

4. Исследование функциональной активности системы фагоцитирующих мононуклеаров выявило увеличение их активности в группах крыс, получавших токсикант в дозе 0,5 ЛД50 и 0,025 ЛД50, характеризующееся большим поглощением железа макрофагами селезенки, чем в группе 0,05 ЛД50.

5. Характер созревания эритроцитов в костном мозге во всех группах был неравномерным, что характеризовалось торможением созревания эритроидных клеток в эритробластических островках. Однако, наблюдаемое некоторое восстановление количества эритроцитов и ретикулоцитоз в конце эксперимента в группе 0,025 ЛД5о указывает на сохранность компенсаторных возможностей центрального звена эритрона у данной группы животных.

6. Во всех экспериментальных группах отмечается усиление перекисного окисления липидов в печени и костном мозге и угнетение антиоксидантной системы в эритроцитах и сыворотке крови.

7. Исследование люминолзависимой хеми люминесценции выявило усиление ПОЛ в костном мозге и в эритроцитах во всех группах экспериментальных животных, начиная уже с 1-х суток после начала эксперимента.

Апробация материалов работы

Материалы работы представлены на:

- 66-й Республиканской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ с международным участием. - Уфа, 2001;

- 68-й Республиканской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ с международным участием. - Уфа, 2003;

- Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука - 2003». — Уфа, 2003.

- Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Научный прорыв - 2003». - Уфа, 2003.

- 69-й Республиканской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ с международным участием. - Уфа, 2004;

- IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине - 2004». - Казань, 2004.

- Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Типовые патологические процессы». - Уфа, 2005.

- 71-й Республиканской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ с международным участием. - Уфа, 2006.

- Республиканской научно-практической юбилейной конференции «Актуальные вопросы современной медицины и здравоохранения», посвященная 70-летию кафедры общественного здоровья и организации здравоохранения БГМУ. - Уфа, 2006.

- Международном симпозиуме «Актуальные проблемы адаптации в условиях Севера». - Ханты-Мансийск, 2006.

- I Международной научной конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды».

- Челябинск, 2006.

- III съезде физиологов Урала. - Екатеринбург, 2006.

- X Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей. - СПб, 2007.

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ. Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии (зав. кафедрой

- д.м.н., профессор А.Ф. Каюмова) Башкирского государственного медицинского университета (ректор - член-корр. РАМН, д.м.н., профессор В.М. Тимербулатов).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», главы «Собственные данные», обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

143 Выводы

1. При интоксикации различными дозами ПХБ наблюдаются различные по выраженности, времени проявления и продолжительности гематологические нарушения, характеризующиеся ускоренным разрушением эритроцитов периферической крови и развитием в первые две недели после начала введения ПХБ гемолитической гипохромной анемии регенераторного типа, сменяющейся на 14-е сутки гемолитической гипохромной анемией гипорегенераторного типа.

2. В группе животных, получавших ПХБ в дозе 0,5 ЛД5о, значительные нарушения в системе эритрона, проявляются преимущественно выраженным внутрисосудистым гемолизом эритроцитов, дисэритропоэзом в костном мозге, характеризуемым нарушением волны амплификации, торможением созревания ЭО, нарушением порфиринового обмена, усилением ПОЛ в костном мозге и печени, и истощением антиоксидантной системы в эритроцитах и сыворотке крови. Данные нарушения сохранялись в течение всего эксперимента.

3. В группе животных, получавших ПХБ в дозе 0,05 ЛД50 нарушения в системе эритрона в первые две недели эксперимента характеризуются умеренным внутрисосудистым гемолизом эритроцитов, медленным созреванием ЭО в костном мозге, не выраженными нарушениями порфиринового обмена, усилением ПОЛ в костном мозге и печени, и истощением антиоксидантной системы в эритроцитах и сыворотки крови. К концу эксперимента изменения носили более выраженный характер.

4. У крыс, получавших ПХБ в дозе 0,025 ЛД50) развивался преимущественно внутриклеточный гемолиз, изменения носили двухфазный характер. В первые две недели показатели периферического звена эритрона, обмена железа, ПОЛ (в костном мозге и печени) и порфиринового обмена возрастали, и достигли максимума на 14-е сутки опыта, при этом также наблюдалось угнетение созревания ЭО в костном мозге и снижение АОА сыворотки крови. Во вторую фазу показатели периферического и центрального звеньев эритрона, обмена железа, порфиринового обмена и прооксидантно-антиоксидантной системы имели тенденцию к восстановлению до контольного уровня.

Практические рекомендации

При анемиях неясной этиологии, токсических гепатитах у лиц, связанных с химическим производством, обязательным диагностическим критерием должно быть изучение показателей периферической крови, характера обмена железа и порфиринов, что позволит уточнить диагноз и назначить патогенетическое лечение.

145