Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Производство жилых вакцин против сальмонеллеза животных на питательных средах из непищевого сырья

ЙЙНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РФ ^ ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

С"4»

Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

На правах рукописи

ЗАЕРКО ВИКТОР ИВАНОВИЧ

ПРОИЗВОДСТВО ЖИВЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ ИЗ НЕПИЩЕВОГО СЫРЬЯ

16.00.03 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва, 1996 г.

Работа выполнена на Государственном предприятии Ставропольская биофабрика и во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Научный руководитель -доктор ветеринарных наук,

Б.Ю.Шустер

Научный консультант

доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РСФСР Ю.А.Малахов

Официальные оппоненты

- доктор ветеринарных наук Л.С.Коврук

- кандидат биологических наук, доцент И.А.Логинов

Ведущее учреждение

- Государственный научный центр прикладной микробиологии

Зацжта диссертации состоится " / I " И^^У»/^Л 1996 г. в" 'I " часов на заседании Диссертационного советд/Д.120.85.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (123022, г.Москва, Звенигородское шоссе,5, ВГНКИ).

С диссертацией можно ознакомиться в {^блйр+еУе ВГНКИ. Автореферат разослан "_" (рД^- ^^1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Сальмонеллез относится к числу убиквитарных зоонозов, поражаю-щих сельскохозяйственных, диких животных и человека.

Рост заболеваемости животных сальмонеллезом в последние годы связан с высокой концентрацией поголовья в животноводческих комплексах, расширением международной торговли животными, мясопродуктами, кормами животного происхождения.

В основе борьбы с сальмонеллезом, помимо общих ветеринарно-санитарных мероприятий, лежит специфическая профилактика. В последние 10 лет широкое применение получили живые вакцины вместо инактивированных. Иммунитет, формирующийся в ответ на введение живых вакцин, наступает быстрее и характеризуется большей напряженностью и продолжительностью по сравнению с вакцинацией инактивированными вакцинами.

Производство живых вакцин против сальмонеллеза телят, поросят, водоплавающей птицы и молодняка начато на Ставропольской биофабрике в 1985 году. К началу наших исследований технология изготовления упомянутых вакцин была несовершенна. В качестве питательных сред для выращивания производственных штаммов использовали мясные перевары, процессы культивирования были мало производительны, они не контролировались и не регламентировались по большинству значимых физико-химических параметров. Не учитывалось физиологическое состояние популяции сальмонелл в зависимости от фазы роста и размножения.

Цель и задачи исследований

Целью исследований явилась оптимизация технологии промышленного производства живых сухих вакцин против сальмонеллеза телят, поросят и водоплавающей птицы, основанной на управлении

процессом периодического культивирования сальмонелл и эффективном методе их лиофилизации, а также удешевлении питательной среды для выращивания микробной массы за счет введения в ее состав гидролизаторов белковых субстрактов непищевого происхождения.

Для реализации цели исследований были поставлены следующие задачи:

- изыскать новые питательные среды из гидролизатов непищевого сырья, обеспечивающие необходимое накопление микробной массы сальмонелл;

- изучить стабильность генетических маркеров по остаточной вирулентности, иммуногенности и др. свойств производственных штаммов, выращиваемых на различных питательных средах;

- разработать оптимизированные процессы глубинного выращивания вакцинных штаммов сальмонелл по значимым технологическим параметрам роста и размножения в реакторах;

- изучить параметры динамики размножения и биологические свойства вакцинных штаммов в^урЫтипит №3, 8.сЬо1егае5ШБ №9, Э.сШЬНп №6 в условиях, управляемых по значимым физико-химическим показателям периодического процесса культивирования;

- оптимизировать защитную среду для лиофилизации живых сальмонеллезных вакцин;

• внедрить разработанную технологию изготовления живых сальмонеллезных вакцин в промышленное производство;

- испытать эффективность вакцин, изготовленных на средах из непищевого сырья, в производственных условиях.

Научная новизна

Обоснована возможность использования сред из непищевого сырья для культивирования вакцинных штаммов сальмонелл при изготовлении вакцин против сальмонеллеза телят, молодняка, поросят и водоплавающей птицы.

Биологические свойства вакцинных штаммов 8.1ур№типит №3, Э.с1иЫт №6, Э.сИо^гаеБШз №9 не изменяются после 10-кратных

пересевов на переварах по Хоттингеру и средах из непищевого сырья.

Метод получения питательных сред на основе переваров из куриных эмбрионов и кровяных сгустков заключается в последовательном воздействии на фарш из куриных эмбрионов 6%-ного водного раствора аммиака с последующим расщеплением ферментами поджелудочной железы.

Определены оптимальные параметры реакторного выращивания.

Оптимальной для съема бактериальной массы вакцинных штаммов сальмонелл является фаза отрицательного ускорения размножения. Накопление живых микробных клеток в этой фазе приближается к максимуму, а количество отмерших не превышает 8-10%, в то время, как в стационарной фазе роста при максимальном содержании живых бактерий количество мертвых клеток увеличивается до 30%.

Практическая значимость

Разработаны и внедрены на Ставропольской биофабрике питательные среды из непищевого сырья для культивирования вакцинных штаммов ЭЛурМтипит №3, Э.сЬо^гаезшБ №9, Э.сШЫш №6, используемых для изготовления живых вакцин против сальмо-неллеза телят, молодняка, свиней и водоплавающей птицы (Технические регламенты, утверждены Научно-техническим советом Ставропольской биофабрики 15 апреля 1990 года).

Оптимизирован процесс реакторного выращивания вакцинных штаммов сальмонелл, предусматривающий использование матровой расплодки в фазе экспоненциального роста из расчета 100-250 млн. микробных клеток на 1 см3 среды в реакторе ; подачу воздуха 2 л на литр среды в минуту, вращение мешалки со скоростью 120-180 об/мин, начальную концентрацию глюкозы 0,1% с последующим ее добавлением до поддержания рН на уровне 7,2-7,6, культивирования ЭЛурМтипит №3, Э^иЫш №6 до 10 часов, 8.сНо1егае8Ш5 №9 до 12 часов.

Использование сахарозо-желатиновой среды и бактериальной массы с исходной концентрацией 20-40 млрд/см3 микробных клеток обеспечивает после сублимационной сушки сохранение 60-68% живых сальмонелл.

Предложенный режим обеспечивает получение живых вакцин со сроком годности не менее 12 месяцев.

Апробация

Материалы диссертации доложены и получили положительную оценку:

- на научно-практических конференциях и НТС Ставропольской биофабрики (1986-1995);

- на конференциях молодых ученых Ставропольского Сельскохозяйственного института (1988, 1990, 1992);

- на конференции молодых ученых ВНИИТиБТ (1987);

- на конференции молодых ученых ВГНКИ ветпрепаратов (1988);

- на III Всесоюзной конференции "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биопрепаратов" (1987);

• на межлабораторном заседании сотрудников ВГНКИ ветпрепаратов Департамента ветеринарии РФ (1996).

Внедрение результатов в практику

Питательные среды из непищевого сырья для производства живых вакцин против сальмонеллеза телят, молодняка, свиней и водоплавающей птицы внедрены на Ставропольской биофабрике с 1990 года.

Оптимизированный процесс глубинного культивирования вакцинных штаммов S.typhimurium №3, S.dublin №6, S.choleraesuis №9 вошел в нормативную документацию на живые вакцины против сальмонеллеза животных.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 статьи и получено авторское свидетельство.

Основные положения, выносимые на защиту

Использование питательных сред из непищевого сырья для культивирования производственных штаммов сальмонелл при изготовлении живых вакцин против сальмонеллеза животных; оптимизация технологического процесса изготовления живых вакцин против сальмонеллеза животных.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах машинописи и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа содержит 24 таблицы и 5 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на Ставропольской биофабрике и в лаборатории контроля и стандартизации препаратов против сальмонеллеза, лептоспироза и эшерихиоза ВГНКИ.

В работе использовали вакцинные штаммы сальмонелл: ЭДурЫтипит №3, Э^иЫш №6, З.сЬокгаеэшБ №9 и контрольные высоковирулентные штаммы в^урЫтиНит №371, Э^иЫш №373 и 8.с11о1егае5Ш8 №370.

Питательные среды: бульон и агар Хоттингера, МПА, МПБ, среды Китт-Тароци, Сабуро, Гисса с индикатором Андреде (большой цветной ряд), Симонса, Клиглерва, Эндо.

Среды из непищевого сырья - гидролизаты из куриных эмбрионов - отходы производства эмбрионных вакцин (среда №1), кровяных сгустков (среда №2), глобулина (среда №3), фибрина

(среда №4), казеина (среда №5).

Оборудование лабораторное и производственное, необходимое для культивирования сальмонелл.

Животные: использовано в работе 2300 белых мышей массой 14-16 г, 710 морских свинок массой 300-400 г, 40 телят 15-30-дневного возраста и 30 поросят 20-30-дневного возраста.

Остаточную вирулентность вакцинных штаммов определяли на белых мышах и выражали в ЛД5а, иммуногенность характеризовали по величине 50-ной иммунизирующей дозы для лабораторных животных.

Динамику размножения вакцинных штаммов при реакторном культивировании выразили графически, для этой цели каждый час брали пробы и определяли в культуре общее количество и количество живых бактерий. Общее количество микробов определяли подсчетом в камере Тома-Цейса, количество живых микробных клеток - чашечным методом.

Безвредность и иммуногенность вакцин (против сальмо-неллеза телят, поросят, молодняка и водоплвающей птицы) изучали в соответствии с действующими ТУ на упомянутые вакцины.

Сохранность генетических маркеров у вакцинных штаммов оценивали по величине остаточной вирулентности для белых мышей, способности расти на средах со стрептомицином в концентрации 500 мкг/см1 (для ЭЛурМтипит N93 и Б.сШЫт №6), и высокой частоте выделения в^-с! клонов для в.сЬо^гаезшэ №9 (10 * против 10" для эпизоотических штаммов).

Промышленное изготовление и контроль вакцин проводили в соответствии с утвержденной НД.

Статическую обработку результатов исследований проводили по А.П.Ашмарину и А.А.Воробьеву (1962).

ОЦЕНКА ПРИГОДНОСТИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД РАЗЛИЧНОГО СОСТАВА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ САЛЬМОНЕЛЛ

Исследования начали со сравнительной оценки предложенных

нами пяти питательных сред из непищевого сырья в сравнении с бульоном Хоттингера для культивирования вакцинных штаммов. Оценку пригодности сред проводили по степени диссоциации культивируемых штаммов, динамике размножения, воспроизведению генетических маркеров и стабильности остаточной вирулентности.

Установлено, что перевар Хоттингера и среды из гидролизатов куриных эмбрионов и кровяных сгустков обеспечивают стабильность формы колоний сальмонелл после 10-кратных пересевов.

Не выявлены статистически достоверные различия в динамике размножения в зависимости от состава питательной среды (бульон Хоттингера, среды №1 и №2). Интенсивность размножения S.choleraesuis №9 была несколко снижена по сравнению с другими штаммами. Лаг-фаза у этого микроба увеличилась до 4 часов, срок культивирования для достижения М-концентрации на 20-30%. Статистически достоверных различий в показателях размножения штамма в бульоне Хоттингера и средах №1 и №2 не выявлено.

Штаммы, выращенные на опытных средах, сохраняли морфологические, культуральные, ферментативные свойства и антигенную структуру. ЛД50 вакцинных штаммов оставалась на 5-6 порядков ниже по сравнению с вирулентными штаммами. Генетические маркеры штаммов воспроизводились стабильно.

Совокупность полученных результатов свидетельствует о возможности использования питательных сред из непищевого сырья для производства вакцин.

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ

В данной главе мы изучали следующие вопросы:

- влияние объема посевной дозы и фазы роста метровой расплодки на накопление сальмонелл в реакторе;

- влияние аэрации и перемешивания питательной среды;

- состав микробной популяции в зависимости от фазы роста;

- накопление микробной массы на питательных средах из непищевого сырья в бульоне Хоттингера;

Результаты экспериментов показали, что процесс реакторного выращивания возможно оптимизировать, если использовать матровую расплодку в фазе экспоненциального роста из расчета 100-250 млн.микробных клеток на 1 см3 среды в реакторе, подачу воздуха 2 л на литр среды в минуту, вращение мешалки со скоростью 120-180 об/мин, культивирование Э^урЫтипит №3 и Э.йиЫш №6 до 10 часов, 8.с11о1егаез1М5 №9 до 12 часов.

Результаты реакторного выращивания вакцинных штаммов сальмонелл в оптимальных условиях на бульоне Хоттингера и средах из гидролизата куриных эмбрионов и кровяных сгустков показали, что интенсивность роста сальмонелл была примерно одинаковой. Ни одна из изученных сред не имела статистически значимых преимуществ в плане накопления числа живых микробных клеток и скорости их размножения.

Фаза отрицательного ускорения размножения, независимо от состава питательной среды, используемой для изготовления вакцины, оказалась наиболее оптимальной для съема бактериальной массы. В этой фазе количество живых сальмонелл приближалось к максимуму, а количество отмерших не превышало 10%. Такое количественное соотношение микробных клеток в популяции является наиболее приемлемым, обеспечивающим высокий процент живых бактерий в конечном продукте -лиофили-зированной вакцине.

Проведенные исследования показали, что питательные среды из непищевого сырья пригодны для промышленного культивирования вакцинных штаммов сальмонелл и по ростовым свойствам не уступают бульону Хоттингера.

СУБЛИМАЦИОННОЕ ВЫСУШИВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ВАКЦИН ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

В данной главе мы поставили следующие задачи:

- изыскать оптимальную защитную среду, обеспечивающую наибольшее выживание сальмонелл в процессе высушивания и

хранения;

- изучить возможность высушивания и хранения вакцин против сальмонеллеза во флаконах без вакуума;

- определить влияние температуры на выживаемость сальмонелл в процессе хранения.

В работе использованы следующие защитные среды: сахарозо-желатиновая (сахароза - 10%, желатин - 1,5%), сахарозо-желатиновая с агар-агаром (сахароза - 10%, желатин • 1,5%, агар-агар - 0,15%), среда Смита (декстрин • 2%, хлористый аммоний -0,5%, тиомочевина - 0,8%, аскорбиновая кислота - 0,5%, вода дистиллированная - до 100 мл), 10%-ный раствор пептона, обезжиренное молоко, 10%-ный раствор глюконата натрия. Бактериальную массу смешивали с защитной средой 1:1. Контролем служила вакцина, высушенная без защитной среды. Продолжительность сушки зависила от объема высушиваемой вакцины и колебалась от 24 до 72 часов. В процессе сушки прослежена выживаемость сальмонелл при замораживании с защитной средой, непосредственно после сушки и хранения вакцины.

Установлено, что каждая из процедур вызывала отмирание бактерий. Разбавление концентрационной культуры средой высушивания сопровождалось отмиранием 2-9% бактерий, причем наибольшее отмирание вызывала среда Смита. После замораживания отмирало от 6% (сахарозо-желатиновая среда с агар-агаром) до 25-30% (среда Смита, глюконат натрия). После сушки оставались жизнеспособными от 60-68% (сахарозо-желатиноая среда), до 44% (глюконат натрия) сальмонелл

Наибольшим защитным действием обладали сахарозо-желатиновая среда, сахарозо-желатиновая среда с агар-агаром и 10%-ный пептон.

Исходя из экономической целесообразности в дальнейшей работе мы использовали сахарозо-желатиновую среду. в^урЫтипит N93 обладает несколько большей устойчивостью в процессе высушивания по сравнению с З.сЬо^гаеэш'з №9, хотя эти различия статистически не значимы (Р<0,05).

При высоких концентрациях (80-100 млрд/см5 микробных клеток)

выживаемость сальмонелл послесушки была относительно невелика и составила 28-35% для штамма 8.сЬо1егае5Ш8 №9 и 30-40% для штамма БЛурЫтипит №3. В дальнейшем, ло мере снижения исходной концентрации, сохранность сальмонелл после сушки увеличилась и при 20-40 млрд/см' клеток она была наиболее высокой, для штамма вЛурЫтипит №3 65-68%, для штамма б.сЬо^гаевЫв №9 - 60-64%.

В дальнейших наших исследованиях количество живых сальмонелл до сушки составляло 20-40 млрд/см1 клеток.

Вакцины готовили с таким расчетом, чтобы количество иммунизирующих доз в ампуле составляло для вакцины против сальмонеллеза телят и против сальмонеллеза молодняка 20-30 доз, против сальмонеллеза свиней 50-60 доз, против сальмонеллеза овец до 100 доз и против сальмонеллеза водоплавающей птицы и сальмонеллеза кур 100 и более доз.

Далее мы исследовали эффективность трех защитных питательных сред, обеспечивающих наиболее полное выживание сальмонелл при лиофильной сушке, в процессе длительного хранения вакцин при различных температурах.

Для решения этой задачи были изготовлены опытно-производственные серии вакцин против сальмонеллеза свиней из штамма 8.сЬо1егае5Ш5 №9, против сальмонеллеза телят из штамма Б^иЬМп №6 и вакцины против сальмонеллеза водоплавающей птицы из штамма в^урЫтипит №3, в каждой их которых при изготовлении использовали три защитные среды: 10%-ный пептон, сахарозо-желатиновую среду и сахарозо-желатиновую среду с агаром.

Ампулы с каждой вакциной хранили при температуре бытового холодильника 2-6°С, комнатной температуре 18-22°С и термостате при температуре 36-38°С.

Установлено, что принципиально важное значение на выживаемость сальмонелл в вакцине в процессе хранения оказывает температура. Так, в вакцинах, хранившихся в холодильниках при температуре 2-6°С в течение 12 месяцев, отмирание сальмонелл не превышало 10%. При комнатной температуре через 4 месяца погибало 25-35%, через 8 месяцев -

70-75%, через 12 месяцев 82-92% сальмонелл. Вакцины, хранившиеся при комнатной температуре, были непригодны к применению через несколько месяцев, а при температуре 35-37°С - через 10-12 дней. При температуре минус 10-20°С количество живых сальмонелл в течение года практически не изменялось.

С целью определения возможности выпуска живых вакцин во флаконах использовали вакцины против сальмонеллеза телят, поросят, молодняка и водоплавающей птицы. Вакцины с сахарозо-желатиновой средой разливали во флаконы емкостью 20 см' по 4 см1, закрывали новыми пробками УЛ-1, обкатывали металлическими колпачками и хранили в холодильнике, при комнатной температуре и в термостате.

Во флаконах без вакуума сальмонеллы быстро отмирали независимо от температуры хранения. Даже при температуре 2-6°С в холодильнике гарантированный срок хранения не превышал 1,5-2 месяца.

Следовательно, для эффективной консервации живых сальмонеллезных вакцин метод сублимационной сушки во флаконах без вакуума не пригоден.

Сальмонеллы хорошо сохраняются в атмосфере очищенного азота, однако перейти к промышленному выпуску сальмонеллезных вакцин в этих условиях мы не смогли из-за нестандартных флаконов и пробок, которые не позволяли предотвратить утечку азота. В одной и той же серии вакцины в некоторых флаконах с азотом сальмонеллы сохранялись примерно также как и в ампулах под вакуумом, в других флаконах отмирали также быстро как в атмосфере воздуха.

Полученные данные позволили нам прийти к выводу, что живые, стандартизированные по количеству доз сальмонеллезлые вакцины можно получить только путем сублимационного высушивания в ампулах с последующей запайкой их под вакуумом.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИН, ИЗГОТОВЛЕННЫХ НА РАЗЛИЧНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

В заключительном разделе наших исследований мы провели сравнительное изучение свойств вакцин, изготовленных на средах из непищевого сырья и бульоне Хоттингера по следующим показателям:

• результатам производственного контроля на биофабрике;

- иммуногенности для лабораторных животных;

- результатам испытаний в животноводческих хозяйствах.

Вакцины, изготовленные на различных питательных средах,

контролировали в соответствии с техническими условиями, по 9 тестам: внешний вид, наличие вакуума, растворимость, массовая доля влаги, чистота и типичность роста, количество живых сальмонелл (млрд/см3), количество доз в ампуле, безвредность и иммуногенность.

Установлено, что проверенные серии вакцины, изготовленные на различных питательных средах, полностью соответствовали требованиям технических условий.

Иммуногенность вакцин для лабораторных животных была достаточно высока и не зависила от типа питательной среды, используемой для их изготовления.

Некоторый разброс показателей в опытах мы связываем с высокой чувствительностью белых мышей к сальмонеллезной инфекции. Различия в показателях средних величин ЕД50 были статистически незначимы (Р<0,05).

Испытуемые вакцины, независимо от вида использованной для их изготовления питательной среды, имели низкую остаточную вирулентность для лабораторных и сельскохозяйственных животных. Так, например, иммунизирующая доза вакцины против сальмонеллеза телят для белых мышей составляет 1,0x109, для телят 1,0x10* микробных клеток. Эти показатели свидетельствуют о высоком "запасе" безвредности живых вакцин против сальмонеллеза.

Производственные испытания вакцин

Оценка эффективности живых вакцин против сальмонеллеза животных, изготовленных на питательных средах из непищевого сырья, проведена в 1991-1995 г.г. в хозяйствах Ставропольского и Краснодарского краев. В качестве контроля использовали вакцины, изготовленные на бульоне Хоттингера. Оценку безвредности и иммуногенности вакцин проводили по следующим показателям:

- наличию поствакцинальных осложнений у вакцинированных животных;

- количеству заболевших животных с клиническими признаками сальмонеллеза;

- количеству вынужденно убитых и павших животных с клиническими и патологоанатомическими признаками сальмонеллеза, подтвержденными результатами экспертизы ветлаборатории.

Испытание вакцины против сальмонеллеза телят проведено в 14 хозяйствах на поголовье 28714 телят, вакцины против сальмонеллеза молодняка - в 8 хозяйствах на 5596 телятах, вакцины против сальмонеллеза свиней - в 18 хозяйствах на 51970 поросятах и вакцины против сальмонеллеза водоплавающей птицы - в 5 хозяйствах на 421670 водоплавающих птицах.

В результате испытаний установлено, что вакцины против сальмонеллеза телят вызывали поствакцинальные осложнения как в опытах, так и в контрольных группах лишь в одиночных случаях. Чаще всего это было связано с вакцинацией слабых, ранее переболевших диареей телят, которых иммунизировали до их полного выздоровления.

Из 14132 телят в контрольных группах поствакцинальные осложнения отмечены у 20 (0,14%), а в опытных группах из 14582 телят - у 18 (0,12%). Переболели с клиническими признаками сальмонеллеза в контрольной группе 78 (0,55%) телят, вынужденно убито от сальмонеллеза - 43 (0,3%). В опытных группах соответственно - 70 (0,48%) и 58 (0,4%) телят.

Вакцина против сальмонеллеза молодняка также вызывала поствакциональные осложнения в единичных случаях, у 0,2 и 0,34% телят в контрольных и опытных группах.

Из 3373 телят в контрольной группе переболело 20 (0,59%), пало и вынужденно убито 14 (0,41%). В опытной группе из 2623 телят заболело и пало соответственно 17 (0,64%0 и 9 (0,3%).

Вакцина против сальмонеллеза свиней не вызывала поствакциональных осложнений. В контрольной группе из 26180 поросят заболело 670 (2,55%), пало и вынужденно убито 411 (1,56%). В опытной группе из 25790 животных соответствующие показатели составили 561 (2,17%) и 372 (1,44%) поросят.

Вакцина против сальмонеллеза водоплавающей птицы также не вызывала поствакциональных осложнений. В контрольной группе из 184650 и опытной из 237020 птиц падеж от сальмонеллеза составил 450 (0,24%) и 965 (0,4%).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанные нами среды из непищевого сырья оказались вполне пригодными для промышленного культивирования вакцинных штаммов сальмонелл. По интенсивности размножения штаммов в условиях глубинного выращивания с аэрацией эти среды не уступали бульону Хоттингера, являющемуся наиболее полноценной средой для культивирования сальмонелл.

Вакцинные штаммы сальмонелл, выращенные на переварах из куриных эмбрионов и кровяных сгустках, приготовленных по разработанной нами технологии, по своим биологическим свойствам не отличаются от штаммов, выращиваемых на бульоне Хоттингера.

Нами определены оптимальные параметры матровых распло-док (концентрация и фазы роста микробов), подачи воздуха, оборотов мешалки, рН, количества глюкозы, продолжительности культивирования.

Результаты производственного контроля вакцин на Ставропольской биофабрике в 1991-1995 г.г. выявили полное соответствие вакцин, изготовленных на питательных средах из непищевого сырья, требованиям нормативной документации. Все серии вакцин были выпущены по результатам первого контроля.

Иммуногенность вакцин, оцененная по значению ЕД50 для лабораторных животных, независимо от состава питательной среды, использованной для изготовления вакцин, была достаточно высокой и составляла для белых мышей 5,8x10* - 6,7x10', для морских свинок 1,3-1,5х107 микробных клеток. Различия в показателях ЕД,0 в пределах каждой из 4 вакцин были статистически не достоверны (Р<0,05).

Производственные испытания вакцин, проведенных в 45 хозяйствах Ставропольского и Краснодарского краев показали, что живые вакцины против сальмонеллеза телят, молодняка, свиней, водоплавающей птицы, изготовленные на питательных средах из непищевого сырья, обладали низкой реактогенностью, высокой эффективностью и по этим показателям не отличались от вакцин, изготовленных на бульоне Хоттингера.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и внедрены для изготовления живых вакцин против сальмонеллеза телят, свиней, молодняка, водоплавающей птицы питательные среды из непищевого сырья (перевары из куриных эмбрионов и кровяных сгустков).

2. Вакцинные штаммы Э^урМтипит №3, в.йиЫт №6 и 8.с1ю1егае5Ш5 №9, выращенные на питательных средах из непищевого сырья, по морфологическим, культуральным, ферментативным свойствам, антигенной структуре, иммуногенности, динамики размножения не отличаются от штаммов, выращенных на традиционных мясных средах.

3. В стационарной фазе роста накопление бактериальной массы достигает максимума, однако количество отмерших клеток вакцинных штаммов сальмонелл увеличивается до 30%, что делает нецелесообразным использование бактериальной массы в этой фазе роста для производства вакцин.

4. Бактериальную массу для изготовления живых вакцин против сальмонеллеза целесообразно использовать в фазе отрицательного ускорения размножения. Накопление живых сальмонелл

в этой фазе приближается к максимуму, а количество отмерших не превышает 8-10%

5. Оптимизирован процесс культивирования вакцинных штаммов сальмонелл в реакторе, включающий:

- засев в реактор матровой расплодки в фазе экспоненциального роста из расчета не менее 100-250 млн/см3 микробных клеток;

- расход воздуха 2 л на литр среды в минуту;

- непрерывную работу механической мешалки со скоростью вращения 120-180 об/мин;

- исходную концентрацию глюкозы 1 г/л среды;

- поддержание рН питательной среды на уровне 7,2-7,7 в процессе культивирования штаммов путем добавления 40%-ной глюкозы;

- культивирование штаммов ЗДурМтипит №3 и Э^иЫт №6 до 10 часов, 8.сЬо1егаеБШ5 №9 до 12 часов.

6. Наибольшее количество живых сальмонелл (60-68%) после сублимационной сушки обеспечивается при использовании сахарозо-желатиновой среды и бактериальной массы с исходной концентрацией 20-40 млрд/см3 микробных клеток. Выживаемость сальмонелл в вакцинах, расфасованных в ампулы, запаянные под вакуумом, и хранившиеся при температуре 2-6°С в течение 12 месяцев, составляет не менее 90%.

7. Живые вакцины против сальмонеллеза животных, высушенные методом сублимации во флаконах без вакуума, пригодны к применению в течение не более двух месяцев, при условии их хранения при температуре 2-6°С.

Производство живых вакцин под инертным газом во флаконах может осуществляться при наличии стандартного оборудования, материалов и методов контроля.

8. Живые вакцины против сальмонеллеза телят, свиней, молодняка, водоплавающей птицы, изготовленные на питательных средах из непищевого сырья, соответствуют требованиям действующих технических условий по всем показателям.

9. В производственных условиях установлено, что живые вакцины против сальмонеллеза, изготовленные на средах из непищевого сырья, безвредны, не реактогенны и не уступают по эффективности вакцинам, изготовленных на мясных средах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Использовать среды из непищевого сырья для промышленного производства живых вакцин против сальмонеллеза телят, свиней, молодняка, водоплавающей птицы.

2. Оптимизировать процесс культивирования вакцинных штаммов ЭЛурЫтигшт №3, 8.с1иЫт №6, 8.сИо1егае5Ш5 №9 в реакторе, для чего использовать:

-засев в реактор матровой расплодки в фазе экспоненциального роста из расчета не менее 100-250 млн.микробных клеток на 1 см3 питательной среды в реакторе;

- подачу воздуха 2 литра на литр среды в минуту;

- непрерывную работу механической мешалки со скоростью вращения 120-180 об/мин;

- исходную концентрацию глюкозы 1 г/л среды;

- поддерживать рН питательной среды на уровне 7,2-7,6 в процессе культивирования вакцинных штаммов путем добавления 40%-ной глюкозы;

- съем бактериальной массы в фазе отрицательного ускорения размножения, для чего культивировать штаммы БЛурЫтипит №3, Б^иЬНп №6 до 10 часов, Э.сЬо^гаезт'з N99 до 12 часов

3. Использовать для сублимационной сушки сахарозо-желатиновую среду и бактериальную массу с исходнолй концентрацией 20-40 млрд/см' микробных клеток, что обеспечивает наибольшую (60-68%) выживаемость сальмонелл в процессе лиофилизации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Заерко В.И. Опыт промышленного изготовления вакцины для профилактики сальмонеллеза животных и птиц. Актуальные проблемы ветеринарии. II Международная конференция. г.Барнаул - 1995 г. - С-99.

2. Заерко В.И., Каменский Н.И. Определение количества живых сальмонелл в вакцине после сублимационной сушки. Состояние и перспектива развития научных исследований по профилактике и лечению болезней сельскохозяйственных животных и птиц. II Конференция Краснодарской НИВС - 1996 г. - С-58-59.

3. Шустер Б.Ю., Малахов Ю.А., Заерко В.И. Живые вакцины из супрессорных ревертантов сальмонелл. II Конференция Краснодарской НИВС - 1996 г. - С-117.

4. Ситьков В.И., Заерко В.И., Бибик Г.П., Тамбовцева В.В. Опыт промышленного производства вакцины для профилактики сальмонеллеза водоплавающей птицы. Диагностика, лечение и профилактика заболеваний сельскохозяйственных животных. II Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА - 1994 г. -С-47-49.