Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Профилактика сальмонеллеза телят путем пероральной иммунизации мутанным штаммом S. dublin-160

эстонская сельскохозяйственная академия

На правах рукописи ЛИНДЪЯРВ Райво Олевович

УДК 636.2 : 616.981.49 : 616.9—097 : 615.371

ПРОФИЛАКТИКА САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ТЕЛЯТ ПУТЕМ ПЕРОРАЛЬНОЙ ИММУНИЗАЦИИ МУТАНТНЫМ ШТАММОМ

йийНп-ШО

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ТАРТУ 1990

Работа выполнена в Эстонском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте животноводства и ветеринарии им. А. Мельдера.

Научный руководитель — доктор ветеринарных наук, заслуженный деятель науки ЭССР, профессор В. В. ТИЛГА

Официальные оппоненты — доктор ветеринарных наук, профессор А. К. НИЦМАНЕ (Лат. СХА)

— доктор ветеринарных наук, заслуженный деятель науки ЭССР, профессор К. А. ПЕТЕРСОН (Эст. СХА)

Ведущая организация: Латвийский научно-исследовательский институт животноводства и ветеринарии^ __

Защита состоится » ¿Ь^/А Я. 1990 г. в /И ' часов на

заседании специализированного совета^К 120.33.03 Эстонской сельскохозяйственной академии по адресу: 202400 ЭР, г. Тарту, ул. Рийа, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Эстонской сельскохозяйственной академии.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент

1990 г.

Я. В. АЛАОТС

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сальмонеллез телят является широкораспространенной болезнью и наносит значительный экономический ущерб животноводству. Он определяется высоким процентом гибели заболевших животных, большими затратами на лечение больных, отстающих в развитии животных и др. После перенесенного сальмонеллеза зачастую формируется долговременное бактерионосительство. К сальмонеллезу восприимчив также и человек (Schulz и. а., 1975; И. С. Загаевскнй, А. Л. Жорницкий, 1977; Tilga, 1978; Pietzsch, 1979; П. И. При-тулин и сотр., 1987).

Заболевание телят сальмонеллезом во многих странах мира вызывает в основном S. dublin (Amtsberg u- а., 1977; И. А. Ба-кулов и сотр., 1979; Leissner, 1981; Weise, 1981; X. Б. Роу, 1982; А. М. Ахмедов, 1983; В. К- Паракин, 1984; Б. Ю. Шустер, 1987; Becker и. а., 1988).

В борьбе с сальмонеллезом телят, наряду с общими санитарно-гигиеническими мерами, большое значение имеет специфическая профилактика. Для иммунопрофилактики сальмонеллеза телят применяется в основном инактивированная, в т. ч. концентрированная формолквасцовая вакцина. Проводимые в настоящее время мероприятия специфической иммунопрофилактики против сальмонеллеза телят, базирующиеся на парентеральных методах инъекции вакцин, не удовлетворяют нужды животноводства промышленного типа по эффективности, безвредности и ряду других показателей (Meyer, 1980; А. М. Ахмедов, 1983; В. П. Урбан, 1985; Ш. Р. Файзрахманов, В. М. Че-кишев, 1985; Я. Е. Коляков, 1986; И. К. Колесников, 1987; А. И. Теш, В. М. Чекишев, 1989).

Создание новых, более эффективных и повышение качества имеющихся профилактических препаратов, было и остается актуальной задачей. Особое внимание в некоторых странах при сальмонеллезе телят придается разработке методов перораль-ной иммунизации. Благодаря успехам, достигнутым в области бактериальной генетики и селекции мутантных штаммов стало возможным перейти от эмпирического поиска аттенуированных

штаммов к целенаправленным методам получения вакцинных штаммов со сниженной вирулентностью.

Число пероральных живых вакцин против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных, используемых в практике, относительно невелико. В этой связи весьма актуальна разработка препарата для профилактики сальмонеллеза телят.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось выяснить распространение сальмонеллеза телят в Эстонии и разработать высокоэффективный препарат для пероральной иммунизации телят. Для достижения указанного требовалось разрешить следующие задачи:

1. Выяснить распространение сальмонеллеза телят в Эстонии.

2. Изучить морфологические, культуральные и биохимические свойства штамма Б. (1иЬ1т-96 и его мутанта Э. с1иЬНп-160.

3. Изучить безвредность и иммуногенность мутантного штамма на лабораторных животных.

4. Исследовать стабильность мутантного штамма при перепассировании через организм мышей.

5. Изучить безвредность и иммуногенность мутантного штамма при пероральной иммунизации телят.

6. Испытать разработанный режим пероральной иммунизации телят в производственных условиях.

Научная новизна. Выяснено распространение сальмонеллеза телят и установлены серотипы сальмонелл, вызывающие заболевание телят в Эстонии. Впервые экспериментально изучена и практически доказана безвредность и высокая иммуногенность мутантного штамма Б. ёиЫш-160 при пероральной иммунизации телят- Определена оптимальная иммунизирующая доза выработанной нами живой пероральной вакцины из мутантных сальмонелл для специфической профилактики сальмонеллеза телят в производственных условиях.

Практическая ценность и реализация результатов исследования. На основании эксперименталных исследований дается рекомендация по использованию выработанного нами препарата в ветеринарной практике. Результаты работы использованы при разработке «Временного наставления по применению живой лиофилязированной пероральной вакцины против сальмонеллеза телят», утвержденного УВ МСХ Эстонии 7 апреля 1988 г.

На защиту выносятся: 1. Результаты изучения распространения и этиологии сальмонеллеза телят в Эстонской ССР. 2. Результаты исследования вирулентных и иммуногенных свойств микробов мутантного штамма Б. с!иЫт-160 на лабораторных животных. 3. Результаты изучения иммуногенностп микробов из мутантного штамма Б- с1иЫт-160 для специфической профилактики сальмонеллеза телят путем пероральной иммунизации.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: заседаниях уч. сов. ЭНИИЖВ (1985; 1988; 1990 гг.); Всес. конф. мол. уч. по акт. пробл. в промышл. животн. (Нарва-Йыесуу, 1983) (2 приз конкурса); республ. конф. мол. уч. по акт. пробл. сельск. хоз. (Тарту, 1984) (I приз конкурса); засед. вет. секции н.-техн. совета АПК ЭР, 1988.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы. Диссертация содержит 140 стр. машинописного текста, из них табл. 22, рис. 4 и приложений 3. Список литературы включает 121 источник, в т. ч. 80 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Работа выполнена в период 1982...1990 гг. в лаборатории микробиологии ЭНИИЖВ и в неблагополучных по сальмонел-лезу хозяйствах республики. Для получения обзора об эпизоотической ситуации по сальмонеллезу телят в Эстонии были обработаны статистические данные, полученные из Управления ветеринарии АПК ЭР и от главных ветврачей-эпизоотологов районных ветстанций.

В работе использовали два штамма сальмонелл. Б. (МэНп-96 — полевой штамм, изолирован сотрудниками ЭНИИЖВ из внутренних органов павшего от сальмонеллеза теленка. Б. с!иЬ-Нп-160 получен путем мутагенеза и селекции от вирулентного штамма Б. (1иЬНп-96. Мутагенез проведен сотрудниками 2 МОЛГМИ им. Н. Пирогова в рамках взаимного научного договора с ЭНИИЖВ.

Штамм в. (1иЫт-160 представляет собой, суа-супрессорный мутант с фенотипическим проявлением ц-АМФ-дефицитности. Количество ц-АМФ у мутантного штамма понижено в 2 раза, по сравнению с уровнем исходного, родительского штамма Б. (1иЬНп-96. Мутантный штамм депонирован в ГНИССК им. Л. А. Тарасевича под № 160.

В лаборатории микробиологии ЭНИИЖВ оба штамма хранятся в лиофильно высушенном состоянии. Микробные взвеси из штаммов Э. с!иЬПп-96 и Э. с1иЬНп-160 приготовляли из агаровых культур этих штаммов. Концентрацию микробных клеток в суспензии 18... 20-часовых агаровых культур определяли с помощью оптического стандарта мутности ГНИССК им. П. А. Тарасевича и по количеству колониеобразующих клеток методом посева на агар Эндо. В ряде опытов на телятах ис-тользовали готовую лиофилнзированную культуру штамма 5. <1иЬПп-160. В каждой ампуле содержалось 1X1011 м. к. Пе-эед применением культуру проверяли на чистоту методом микроскопии и посевом на общепринятый набор контрольных питательных сред, и проводили серотипизацию с помощью агглю-

тинирующих сывороток. Опыты проводили на 702 белых (беспородных) мышах (жив. массой 14... 16 г), 2 кроликах (жив. масса — 3,5 . . . 4,0 кг) и 180 телятах эстонской красной породы в возрасте от нескольких дней до 1 мес. Производственными опытами в 25 хозяйствах было охвачено 9186 телят в возрасте 2 .. • 6 нед. Период наблюдения — 6 мес.

Интрагастральное введение мутантных сальмонелл белым мышам проводили по методике А. Е. Поповой (1972) с помощью желудочного зонда. Пероральное введение мутантных сальмонелл телятам осуществляли естественным способом, т. е. приготовленные дозы добавляли во время кормления в молоко (отдельно каждому теленку).

Бактериологическое исследование кала и патологического материала от животных проводили общепринятыми методами с использованием сред обогащения Кауфмана и магниевой среды (М. О. Биргер, 1982). Из дифференциальных сред были использованы агар Эндо, висмутсульфит-агар и среда Клиглера. Бактериологическое исследование крови у телят проводили по методике М. О. Биргер (1982). Вирулентность мутантного штамма при интрагастральном и внутрибрюшинном методах введения белым мышам оценивали по значению ЦОбо- Иммуно-генность мутанта определяли по величине ЕО50, вычисленной по методу Кербера в модификации И. П. Ашмарина (1962). Стабильность мутанта исследовали путем проведения 5 пассажей через организм белых мышей.

Энтеротоксигенные свойства обоих штаммов определяли на лигированных петлях тонкой кишки кролика.

Кроликов за сутки до опыта не кормили. Наркоз давали эфиром после введения в краевую вену уха 1,0 см3 10% раствора тиопентала натрия. Подготовляли операционное поле. Разрез брюшной стенки делали по белой линии живота. На стерильную салфетку вынимали дистальную часть тонкого кишечника. Петли длиной 8 см лигировали хирургическим шелком. В образованные петли вводили бактериальные суспензии в объеме 1 см3 физиологического раствора. После репонирования кишечника поочередно зашивали брюшную стенку. Швы обрабатывали антибактериальным порошком. Через 18 ч животных умерщвляли (эфиром). Вскрывали брюшную полость, извлекали кишечник и учитывали реакцию в петлях.

Инвазивные свойства мутанта Б. с1иЬНп-160 и исходного штамма Б. с(иЫт-96 изучали по степени размножения микробов в селезнке мышей после интрагастрального и внутрибрю-шннного введения. Из смывов микробов указанных штаммов, давших рост на МПА (18 ч при 37 °С), по оптическому стандарту мутности приготовляли исходную концентрацию — 109 м. к. в физиологическом растворе, которую затем десятикратно последовательно разбавляли, — требуемая концентрация микробоз (при интрагастральном введении — 105 м. к.,

при внутрибрюшинном — 104 м. к.) достигала объема 0,5 см3, что являлось вводной дозой. На 2; 3; 4; 5; 7; 8; 9; 15; 21; 30 и 60 сутки мышей забивали (декапитация) стерильно извлекали селезенку, взвешивали на торзионпых весах, помещали в гомогенизатор и добавляли физиологический раствор из расчета — 1 см3 на 1 г органа. Гомогенаты, не разведенные и разведенные в 10; 100 и 1000 раз, высевали в объеме 0,1 см3 в чашки со средой Эндо. Через 24 ч инкубации подсчитывали число лактозонегативных колоний. Результаты выражали числом ко-лониеобразующих единиц (КОЕ) на орган. В каждый срок проводили посевы из материала от 3 мышей.

Исследования безвредности мутантных сальмонелл при пе-роральном введении телятам были проведены в опытных хозяйствах.

Напряженность иммунитета у телят проверяли в 6 опытах всего на 29 животных путем перорального заражения диким штаммом Б. с1иЭДт-96 в дозе 1ХЮ" м- к. (в виварии ЭНИИЖВ).

Иммунобиологическую реакцию организма изучали с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) по методике М. О. Биргер (1982) на полистироловых пластинках с сальмонеллезным эритроцитарным диагностикумом, полученным из МНИИВС им. И. И. Мечникова.

Реакцию спонтанного розеткообразования клеток (РС-РОК) для изучения динамики Т-лимфоцитов в крови телят при перо-ральной иммунизации с мутантным штаммом ставили по методике В. М. Суровас (1978). Для патологоанатомического и бактериологического исследования внутренних органов животных умерщвляли: мышей — декапитацией или ингаляцией эфира, кроликов — ингаляцией эфира; телят — вскрытием яремных вен после оглушения.

Цифровой материал подвегнут статистической обработке (И. П. Ашмарин, А. А. Воробьев, 1.962). Экономическую эффективность лиофилизированного препарата из мутантпого штамма Б. с1иЫт-160 для пероралыюй иммунизации телят вычисляли по методике, утвержденной ГУВ МСХ СССР (ж. Ветеринария, 1984, № 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу крупного рогатого скота в Эстонии в 1982 ... 1988 гг. Заболевание телят саль-монеллезом в 1982...1988 гг. регистрировали во всех районах эеспублики, однако болезнь встречалась спорадично. Ежегодно з списке сальмонеллезных числилось в ср. 67 хозяйств. Всего з республике насчитывалось 300 хозяйств. Телята заболевали 5 основном в нозрасте от 3 нед до 3 мес (на откормочных фермах) .

Возбудителем сальмонеллеза в основой являлся S. dublin, поскольку из сальмонелл, изолированных из патматериала от животных в 1844 случаях, 1676 (90,9%) относились к серотипу S. dublin и 168 (9,1%) — к серотипу S. typhimurium. Заболевание встречается в течение круглого года, хотя несколько чаще — в весенние и летние месяцы. За этот период вакцинацию стельных коров проводили в 193 ... 219 (60.-.70%) хозяйствах. Число вакцинированных взрослых животных в год составляло 69 768 .. . 86 229 и телят — 114 975 ... 141 241. Кроме того, в профилактических и лечебных целях ежегодно применяли довольно большое количество специфических антисальмонеллез-ных сывороток: в 1985... 1987 гг. — в 186... 221 хозяйствах.

Исследование морфологических, культуральных и биохимических свойств штамма S. dublin-96 и его мутанта S. dublin-160.

Нами выяснено,что колонии микробов штамма S. dublin-96 и мутанта S. dublin-160 давали рост на твердой среде через 18 ч-Колонии — средних размеров (1...2 мм), правильной округлой формы, гладкие, слегка выпуклые с ровными краями. На МПА колонии бесцветные, прозрачные, блестящие на среде Эндо — блестящие слабо-розовые, на висмут-сульфит агаре — колонии черные с характерным металлическим блеском; питательная среда под колониями окрашена в черный цвет. В жидкой среде (МПБ) — равномерная муть. Оба штамма — грам-отрицательны, палочки с закругленными краями; средние размеры — 2 ... 3,5 мкм в длину и 0,2... 0,6 мкм в ширину.

Изучение протеолитических свойств показало, что оба штамма имеют типичные для рода Salmonella характеристики, не образуют индола, продуцируют сероводород, не дезамини-руют фенилаланина, не декарбоксилируют аргинин, декарбок-силируют орнитин и лизин. Таким образом, протеолитические свойства мутанта такие же, как и у исходного штамма.

Выяснилось, что мутантный штамм обладает отличной от исходного сахаролитической активностью. Так, S. dublin-160 на среде Симмонса замедленно утилизирует цитрат, у него происходит замедленное кислотообразование при сбраживании мальтозы и рамнозы. Проявление признака наблюдали через 48 ч после инкубации при 37 °С. У исходного штамма эти признаки проявлялись уже через 24 ч.

Таким образом, при сравнении морфологических, культуральных и протеолитических свойств 2 рассматриваемых штаммов разницы не констатировали. Главным отличительным признаком мутантного штамма от исходного является замедленный рост на среде Симмонса и замедленная (через 48 ч) ферментация мальтозы и рамнозы.

Определение LDs0 для мышей при интрагастральном и внут-рибрюшинном введении S. dublin-160 и S. dublin-96. Для выяснения вирулентности рассматриваемых штаммов на каждую

дозу брали по 6 мышей- В конце опытов, на 30 день вычисляли 1Л)50.

Выяснилось, что 1Л>5о для мышей интрагастральном введении сальмонелл мутантного штамма составляла 1,48Х XIО9 м. к., при внутрибрюшинном введении — 6,9ХЮ6 м. к.

Испытание родительского штамма при интрагастральном введении показало, что ЬЭ50 составляла 1,0ХЮ4 м. к., при внутрибрюшинном введении — 1,48X10' м. к.

Таким образом установили, что ЬОб0 мутантного штамма для белых мышей, по сравнению с исходным, родительским штаммом, как при интрагастральном, так и при внутрибрюшинном введении примерно в 105 раз выше, т. е. вирулентность во столько же раз понижена.

Сравнительное изучение инвазивной активности штаммов в. с1иЫ!п-160 и 8. с!иЬПп-96 при интрагастральном и внутрибрюшинном введении мышам. Выяснилось, что микробы вирулентного штамма Б. с1иЫт-96 при интрагастральном введении в дозе 105 м. к. начинают высеваться из селезенки мышей в количестве 2,6ХЮ±0,8ХЮ КОЕ на 3 сутки, затем происходит интенсивное размножение микробов в органе и при концентрации бактерий, равной 1,7Х10б±2,0ХЮ3 КОЕ на 8 сутки наступает гибель животных. Мутант Б. с!иЬПп-160 также обладает способностью пенетрировать стенку тонкой кишки и размножаться в селезенке, однако — менее интенсивно, чем родительский штамм. Единичные бактерии изолированы из селезенки начиная с 5 суток; на 9 сутки они составляли 1,2ХЮ2±0,09Х ХЮ2 КОЕ и на 15 сутки при концентрации бактерий в селезенке 2,5ХЮ3±0,7Х102 КОЕ начиналась их элиминация из органа. На 21 сутки и позже микробы штамма Б. (1иЬНп-160 из селезенки мышей не высевались.

Внутрибрюшинное заражение мышей сальмонеллами штамма Б. с1иЬПп-96 в дозе 104 м. к. вызвало сильный рост числа возбудителей я селезенке- На 2 сутки обсемененность органа составляла 2,ЗХ103±0>7ХЮ2 КОЕ, на 7 сутки, при достижении концентрации бактерий 5,9Х 107±3,3х Ю4 КОЕ, наступала гибель всех мышей. Мутантные сальмонеллы на 2 сутки высевались в виде единичных колоний; к 7 дню концентрация их достигала 3,0ХЮ4±2,7ХЮ2 КОЕ; к 13 суткам она уменьшалась до 4,ЗХЮ2±0,ЗХЮ2 КОЕ; на 30 сутки — до 1.0ХЮ2±0,2ХЮ2 КОЕ. На 45 сутки микробов в селезенке не было.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о более низкой способности микробов мутантного штамма к размножению в селезенке по сравнению с родительским, т. к. введение равных доз микробов обеих штаммов интрагастрально или внутрибрюшинно сопровождалось интенсивным размножением вирулентных сальмонелл, что привело к гибели всех мышей. Высеваемость мутантных сальмонелл из селезенки была

значительно более низкой. Очищение органа наступало на 21 ... 45 сутки после введения микробов.

Определение энтеротоксигенных свойств штаммов Б. (1иЬ-Нп-160 и 8. (1иЬПп-96 на лигированной петле тонкой кишки кролика. С этой целью применяли экссудативный тест на лигированной петле тонкой кишки кролика. Выяснилось, что у штамма Б. <1иЫт-160 в результате мутагенеза заметно снизились энтеротоксигенные свойства, т. к. введение микробов му-тантного штамма в лигированные кишечные петли одного из кроликов в количестве 10' м. к. через 18 ч вызывало там умеренное скопление экссудата, без развития воспаления в слизистой оболочке. При введении такой же дозы микробов штамма Б. с1иЬНп-96объем выпота был таким же, как и вызванный мутангными микробами, однако сопровождался резковыражен-ным геморрагическим воспалением слизистой оболочки.

Аналогичные результаты были получены и в эксперименте на втором кролике, только с той разницей, что реакции от действия микробов Б. с1иЬ1т-160 и Б. с1иЬПп-96 различались друг от друга еще ярче, поскольку после введения мутантных сальмонелл в одной петле развивалась легкая ответная реакция, тогда как во второй петле выпота вообще не регистрировали. Зато введение микробов штамма Б- с1иЫт-96 вызывало обильное скопление экссудата с множественными кровоизлияниями кишечной стенки.

Определение иммуногенных свойств мутанта Б. с!иЬПп-160 в опытах активной защиты. Для этого было проведено три опыта на белых мышах, которых иммунизировали однократно двумя способами: интрагастрально вакцинировали дозой 102-..

___109 м. к.; внутрибрюшиино — 102... 106 м. к. В результате

внутрибрюшинного заражения на 21 день после иммунизации вирулентным штаммом Э. с1иЫт-96 дозой 104 м. к. (1000Х ХЬО50), выяснили, чго в этом случае так же как и при интра-гастралыюй иммунизации, у мышей сформировалась активная защита против заражения. Однако, если в последнем случае ЕБбо составляла 1,8ХЮ5 м. к., то при внутрибрюшинном введении — 7,3X103 м. к.

Для получения информации о возможном формировании бактерионосительства у выживших мышей мы провели бактериологические исследования внутренних органов особей, которые были иммунизированы меньшей дозой, обеспечивающей 100% выживаемость после заражения- Материал для посева брали из печени, селезенки, почек и кишечника после их отдельной гомогенизации.

Бактериологические исследования показали, что при интра-гастральной иммунизации из 10 выживших мышей, которых иммунизировали дозой 107 м. к. в 1 опыте, на 30-й день мутант-ные сальмонеллы выявили у одной мыши в селезенке и у вто-

рой — в кишечнике. Во II опыте в эти же сроки мутантный штамм персистировал в селезенке у 1 из 6 исследованных мышей, которые иммунизировали дозой 106 м. к. Однако в III опыте на 40 сутки после инфекции бактериологические исследования оказались негативными. Среди выживших мышей, иммунизированных дозой 107 м. к., бактерионосителей не было.

При внутрибрюшинной иммунизации дозой 105 м. к. несмотря на 100% выживаемость у большей части мышей констатировали персистенцию мутантных микробов в исследуемых органах в большем количестве. Даже на 40 сутки после заражения бактерионосительство было выявлено у 2 мышей из 6 исследованных.

Кроме того, на вскрытии у всех мышей обнаружили поражение печени (изменение цвета, очаговый некроз и дряблость паренхимы), чего не наблюдали у интрагастрально иммунизированных мышей.

Исследование стабильности штамма S. dublin-160 при перепассировании через организм белых мышей. Группу из 6 особей заражали внутрибрюшинно бактериальной взвесью в физиологическом растворе штамма S. dublin-160 в дозе 10б м. к. (максимально переносимой, при которой еще наблюдается 100% выживаемость мышей). На 7 сутки 1 мышь забили, из гомо-гената селезенки были произведены посевы на среду Эндо, которую инкубировали 18 ч при 37°С. Выбирали 5 колоний и пересевали их на МПА (условия инкубации те же) для получения большей массы микробов, что требовалось для биохимических исследованиях. После типизации — повторный пересев на МПА в тех же условиях- Выращенные колонии смывали физиологическим раствором и из объединенной суспензии приготовляли новую дозу заражения (106 м. к.).

Выяснилось, что в результате 5-кратного пассажа мутанта (в дозе 106 м. к.) через организм белых мышей путем внутри-брюшинного заражения реверсии штамма не произошло. Из посевов всех пассажей выделялась однородная популяция штамма S. dublin-160 со стабильно характерными биохимическими свойствами. Вирулентность штамма не повышалась, поскольку введение белым мышам после каждого пассажа максимальной переносимой дозы 106 м. к. не вызывало гибели животных.

Выяснение переносимости и иммуногенности штамма S. dublin-160 при пероральном введении телятам. Опыты проводились в 1982... 1983 гг. в 4 опытных хозяйствах ЭНИИЖВ (с/х «Тарту», «Лаэва», «Лаатре», «Вильянди»), Для опытов от автора мутантного штамма М. Н. Бойченко (2 МОЛГМИ) был получен штамм S. dublin-160 в лиофилизированном виде (1XЮп м. к. — в ампулах).

В 5 опытах использозали 63 телят (бычков) в возрасте 4 ... 7 дней. За животными наблюдали в течение 3 мес. В I и

во II опытах телят держали на привязи; в III ... IV и V — на привязи до 1-мес. возраста, затем переводили на откормочную ферму и содержали в больших клетках без привязи (по 30... ...35 голов). В клетках перорально иммунизированные телята находились вместе с телятами (58 голов), вакцинированными инактивированной формолвакциной подкожно (контр, группы).

Пероральное введение мутантных сальмонелл телятам осуществляли во время кормления, добавляя препарат в каждую порцию молока. При двукратном введении вторую дозу давали через 3 ... 4 дня.

У телят измеряли температуру тела в день выпаивания препарата и в последующие 3 дня, 2 раза в сутки. Бактериологическое исследование кала в 1; 2 и 5 опытах проводили в течение 2 недель после введения мутантных сальмонелл, ежедневно, во 2 и в 4 опыте — 2 раза в неделю в течение месяца.

Было установлено, что живая вакцина при двукратном пе-роральном введении в дозе 2X0X10й) м. к. с интервалом в 3... 4 дня не оказывала на телят токсического действия. У них не повышалось температуры, не отмечалось изменений в пищеварении и в общем состоянии. Из фекальных проб вакцинный штамм не высевался.

Доказано, что после перевода на откормочную ферму, в результате двукратной пероральной иммунизации телята приобрели стойкий иммунитет, поскольку при нахождении в течение 3 мес на инфицированной ферме они сальмонеллезом не заболевали. В то же время как из 58 телят, привитых подкожно инактивированной вакциной, сальмонеллезом заболело 12 животных.

Определение персистирования штамма Б. ёиЬИп-160 в организме телят при пероральном введении. Опыты с целью выяснения степени диссеминации и сроков персистенции мутанта Б. ёиЬНп-160 в организме телят после перорального введения проводились в течение 20 суток (1983 г.) на 6 телятах в возрасте 3 ... 4 нед (получены из с/х «Вильянди»), которым после недельного срока наблюдения вводили перорально (с молоком), двукратно с 3-дневным интервалом по 1ХЮ11 м. к. исследуемой культуры.

На 5 и 11 сутки (убивали по 3 теленка) проводили патоло-гоанатомические и бактериологические исследования внутренних органов.

Результаты бактериологических исследований проб крови показали, что в исследуемые сроки (через 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 24 ч и на 2 и 3 сутки) мутантный штамм из крови не высевался. Из проб кала сальмонелл не выявили. При патанатомиче-ском исследовании внутренних органов у всех телят констатировали увеличение регионарных мезентериальных лимфатических узлов подвздошной кишки. Устанавливали (при разрезе) сочность.

У телят № 6547 и № 6542, убитых через 5 суток после введения мутантных сальмонелл, бактериологически установлено, что мутантные микробы высевались в виде единичных колоний из подвздошной кишки и из регионарных мезентериальных лимфатических узлов. У теленка № 1203 мутантный штамм в малом количестве выявили в селезенке и подвздошной кишке. У телят, убитых на 11 день, показатели оказались негативными в отношении мутантного штамма.

Таким образом, в результате двукратного перорального введения телятам (6) мутантных сальмонелл в дозе IX Юп м. к. с 3-дневным интервалом освобождение организма от мутантных сальмонелл происходило в течение 5... 11 дней.

Определение иммуногенности мутантных сальмонелл штамма Б. с!иЬПп-160 в опытах (6) на телятах (29 гол.). Выяснилось, что заражение дозой 1ХЮ11 м. к. диким штаммом Б. с!иЬПп-96 выдержали только те телята, которых начали иммунизировать с 2—3-недельного возраста. При этом эффективная иммунизирующая доза находилась в диапазоне от 1ХЮ10 до IXЮ11 м. к., поскольку при введении животным двукратно, с 3... 6-дневным интервалом, по 1ХЮ10... 5Х1010 или 1ХЮ11 м. к. мутантных сальмонелл, мы не наблюдали четкой зависимости между вводимой дозой и тяжестью заболевания. Из 13 телят легко переболели 6. Из них 3 теленка были иммунизированы дозой 1ХЮ11 м. к., 2 гол. — 5ХЮ10 м. к. и 1 гол. — 1ХЮ10 м. к.

При легкой степени заболевания на следующий день после заражения у животных отмечали расстройства пищеварения, кал приобрел кашицеобразную консистенцию. Ухудшился аппетит. Температура тела была повышена, хотя за дни болезни не превышала 40,4 °С. Полевой штамм выделялся с калом в малом количестве в течение 2 ... 3 дней. Все эти изменения исчезли через 3..•4 дня.

Средней степени тяжести заболели 7 телят этой же возрастной группы. Из них 4 теленка были иммунизированы дозой 1ХЮ" м. к., 2 гол. — 5ХЮ10 м. к. и 1 гол. — 1ХЮ10 м. к. Болезнь протекала 5 ... 7 дней. У животных отмечали вялость, отсутствие жвачки и понос. Кал был жидким. Температура тела оказалась в пределах 40,4 ... 41,0 °С. Полевой штамм в кале выявляли до 5 дней.

Из 2 телят в возрасте 17 дней, иммунизированных однократно дозой 1ХЮИ м. к., у 1 заболевание было средней тяжести, второй заболел тяжело и погиб.

Иммунизация телят в первую неделю жизни (опыты III и V) дозой 2,5Х10Ш...5ХЮ10... 1ХЮИ м. к. оказалась неэффективной. После заражения все 8 телят тяжело заболели. У них отмечали угнетенное состояние и профузный понос; кал водянистый с примесыо крови. Температура тела в течение нескольких дней удерживалась выше 41,0° С. Животные в ос-

новном лежали, не могли вставать. Микробы полевого штамма, выделялись с калом постоянно, вплоть до гибели животных, а в первые дни — в виде почти чистой культуры-

Телята погибли через 5 ... 7 дней.

Неиммунизированные, контрольные телята (в каждом опыте по одному после инфекции также тяжело заболели. Из 6 животных за короткий срок пало 5. Лишь у 1 теленка болезнь затянулась и перешла в хроническую форму. После убоя у него выявили сальмонеллы штамма Б. с1иЫт-96 в легких и печени.

При патанатомическом исследовании внутренних органов у выживших телят, убитых в течение 2 ... 4 недель после заражения, обнаружили умеренное набухание печени и гиперплазию мезентериальных лимфатических узлов в регионе подвздошной кишки. В случае средней тяжести заболевания увеличение мезентериальных лимфатических узлов выражалось ярче. Бактериологические исследования внутренних органов и суставов конечностей оказались отрицательными. Животные были полностью свободны от сальмонелл.

У всех павших телят выявлено обильное обсеменение всех внутренних органов микробами штамма Б. с1иЬНп-96.

Результаты изучения образования сывороточных антител показали, что если иммунизацию телят начинали в 2 .. . 3-недель-ном возрасте, то специфических анти-О-гемагглютининов у них в сыворотке не оказалось, однако если иммунизация была начата в возрасте 1 нед (опыты III и V) в крови телят оказались антитела титров 1 : 10. Через 2 нед, непосредственно перед заражением, титр антител у иммунизированных животных поднялся незначительно — до 1 : 19,6+16,0. Через 2 нед после заражения титр антител достиг уровня 1 : 68,6+44,8. Исследования выживших животных через 4 нед после заражения (опыты IV и VI) показали снижение титра до уровня 1 : 35+20,7.

Отсутствие образования иммунитета у телят при вакцинации в первую неделю жизни мы связываем с колостральным иммунитетом, о котором свидетельствовало наличие антител в сыворотке (получить для опытов телят от неиммунных матерей нам не удалось, т. к. в большинстве хозяйств республики введена обязательная вакцинация стельных коров против сальмо-неллеза).

Изучение динамики Т-лимфоцитов при пероральной иммунизации телят. Полученные нами данные показали, что до иммунизации у 24 телят 3-недельного возраста уровень Т-лимфоцитов в крови телят составлял 31,0+1,82%. Через 8 суток после введения мутантных сальмонелл в дозе 1ХЮ11 м. к. количество Т-лимфоцитов увеличилось до 45,0±2,3%, тогда как в контрольной группе — 33,0±2,2°/о. На 8 сутки после второй иммунизации количество Т-лимфоцитов равнялось 50,0+1,4%, а у контрольных животных — 33,0+1,9 %• На 60 сутки после

второй иммунизации уровень Т-лимфоцитов в опытной группе составлял 48,0±2,9%, а в контрольной — 36,0±2,1%.

Таким образом, пероральное введение телятам препарата из мутантных сальмонелл вызывало увеличение популяции Т-лимфоцитов в крови телят, сохранявшееся также и на 60 сутки.

Изучение безвредности препарата из живых мутантных сальмонелл при пероральной иммунизации телят проведенные в производственных опытах. Для изучения безвредности препарата на большом поголовье животных было получено разрешение от Управления ветеринарии АПК Эстонии.

Вакцину приготовляли в лаборатории инфекционных болезней ЭНИИЖВ. Она представляла собой смыв 18...24-ч агаровой культуры штамма Б. с1иЫш-160 (в физиологическом р-ре). До разлива в 250 см3 флаконы смыв культуры хранили в холодильнике — 18 ч при 4-4 °С. Это время требовалось для установления концентрации бактерий в смыве, чтобы приготовить взвесь с содержанием 5ХЮ9 м. к. в 1 см3. После разлива флаконы закупоривали стерильными резиновыми пробками и металлическими колпачками. Вакцина подлежала к употреблению в течение нескольких дней при хранении в холодильнике при 4-4 °С. Препарат в объеме 1 см3 или 2 см3 добавляли во время кормления в порцию молока.

Проведенная нами 1 серия производственных опытов в 1987 ... 1988 гг. в 15 хозяйствах Тартуского р-на на 4470 телятах показала безвредность и хорошую иммуногенность перо-рально задаваемой вакцины. Животных иммунизировали в 2 ... 6-неделыюм возрасте, однократно или двукратно с недельным интервалом в дозах 5Х Ю9 ... 1X Ю10 м. к. В течение 6 мес среди иммунизированных телят заболеваний сальмонел-лезом не наблюдалось.

Однако выяснилось одно обстоятельство, что при проведении иммунизации важно исключить больных животных. Непереносимость вакцины мы констатировали в тех случаях, когда вакцину давали латентно инфицированным пастереллами или сальмонеллами телятам- Побочные явления в виде поноса и повышения температуры тела зарегистрированы в 5 хозяйствах, всего у 130 телят, после повторного введения вакцины в дозе 1ХЮ10 м. к.

Для проведения II серии производственных опытов (1989 г.) была приготовлена такая же вакцина в лиофилнзированном виде, по 5ХЮ9 м. к. в каждом флаконе. После разбавления 5 см3 физиологического раствора вакцину добавляли в молоко, индивидуально каждому теленку (во время кормления).

Вакцину испытывали в 10 хозяйствах Выруского р-на на 4716 телятах. Выяснилось, что иммунизация телят 2 . . . 6-не-дельного возраста однократно дозой 5X109 м. к. протекала без побочных явлений. В течение 6 мес наблюдения среди имму-

низированных животных случаев заболевания сальмонеллезом не зарегистрировано.

Таким образом, на основании этих опытов мы считаем достаточным использовать в практике однократное введение дозы 5X109 м. к.

Проведенные экономические расчеты показали, что при использовании данной вакцины для иммунизации телят 1 руб затрат возвращает 9,2 руб.

ВЫВОДЫ

1. Сальмонеллез телят в республике встречается спорадично. Возбудителем болезни является Э. (1иЬ1т. За период 1982...1988 гг. из материала сальмонеллы изолированы в 1844 случаях, из них 1676 (90,9%) относились к серотипу Б. (ЗиЬНп и 168 (9,1%) — к Б- 1урЫтипит. Ежегодно список сальмонеллезных хозяйств включал в среднем 67 хозяйств.

2. Главным отличительным признаком мутанта Б. с!пЬ-Пп-160 от его исходного штамма является замедленный рост на среде Симмонса и замедленная (через 48 ч) ферментация мальтозы и рамнозы.

3. ЬО50 мутантного штамма для белых мышей при интра-гастральном введении составляет 1,48X109 м. к. При введении этим же способом мышам, исходного, родительского штамма Б. ёиЬНп-96 ЬОбо составляет 1ХЮ4 м. к. При внутрибрюшин-ном введении мутанта белым мышам ЬО50 — 6,9X10® м. к., родительского штамма Б. с!иЬ,Нп-96 — 1,48ХЮ м. к.

4. Инвазивные способности мутантного штамма как при интрагастральном, так и при внутрибрюшинном введении белым мышам сильно понижены, по сравнению с родительским штаммом.

5. Исходный штамм Б. с1иЫт-96 обладает выраженными энтеротоксическими свойствами, поскольку при энтеральном введении в дозе 107 м. к. в лигированные петли тонкой кишки кролика вызывает в течение 18 ч геморрагическое воспаление с обильным скоплением в просвете кишки кровянистого экссудата. В аналогичных опытах с мутантным штаммом Б. ёиЬ-Нп-160 в просвете кишки отмечается лишь умеренное скопление выпота, без воспалительных признаков.

6. При иммунизации белых мышей мутантными сальмонеллами лучший протективный эффект достигается при интрагастральном способе иммунизации, поскольку в результате экспериментальной инфекции поражение паренхиматозных органов выражается слабее, чем у иммунизированных внутрибрюшин-ным методом. Организм интрагастрально иммунизированных мышей освобождается от сальмонелл быстрее, чем у иммунизированных внутрибрюшинно.

7. 5-кратное проведение мутанта в дозе IX Ю6 м. к. через организм белых мышей путем внутрибрюшинного заражения не вызывало реверсии штамма. Вирулентность штамма не повышалась.

8. Мутантный штамм Б. с!иЬ1ш-160 при пероральном введении телятам (63 гол.) недельного возраста в дозе 1ХЮ11 м. к. является безопасным. При данной дозировке микробы мутант-ного штамма с калом не выделяются. За 3-мес. срок наблюдения перорально иммунизированные телята сальмонеллезом не болели, хотя и содержались на инфицированной ферме.

9. При дозировке IX Юп м. к. бактерии способны временно персистировать в селезенке и мезентериальных лимфатических узлах кишечника. Элиминация микробов происходит в сроки с 5 до 10 суток.

10. Мутантные сальмонеллы при двукратной иммунизации телят (29 гол.) 2...3 нед. возраста дозой от 1ХЮ10 до IX ХЮ" м. к. обладают высокой иммуногенностью против инфекции микробами штамма Б. (1иЬПп-96 в дозе 1ХЮ" м. к.

11. При пероральной иммунизации телят мутантом Э. (1иЬ-Пп-160 ответная реакция в виде появления специфических анти-О-гемагглютининов в крови выражена слабо.

12. Пероральное введение телятам мутантных сальмонелл вызывает увеличение количества популяции Т-лимфоцитов в крови, сохранившееся до 60 суток-

13. Живая вакцина из мутантных сальмонелл при пероральном введении телятам в дозе 5ХЮ9 м. к. обладает высокой иммуногенностью и пригодна для специфической профилактики сальмонеллеза телят.

14. Экономический эффект при использовании выработанной нами вакцины — 1 руб затрат возвращает 9,2 руб.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработаны «Технические условия по изготовлению лио-филизированной живой вакцины из мутантного штамма с1иЫт-160 (выработанной нами) для пероральной иммунизации телят против сальмонеллеза», утвержденные Мин. СХ ЭР и Упр. Вет. Мин. СХ ЭР (7 апреля 1988 г.).

СПИСОК ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тилга В., Юхкам А., Линдъярв Р. О лечении и профилактике колиин-фекции и сальмонеллеза телят в Эстонской ССР // Инфекционные болезни крупного рогатого скота и меры борьбы с ними. — Минск, 1982. — С. 95 ... 99.

2. Линдъярв Р. Пероральная иммунизация телят живой вакциной против сальмонеллеза // Теорет. и практ. вопр. ветеринарии. — Т. 11.: Заразные болезни: Ветеринарные проблемы индустриального животноводства. — Тарту, 1983. — С. 129... 134.

3. Тилга В., Линдъярв Р. О некоторых вопросах эпизоотологии сальмонеллеза телят // Акт. пробл. эпизоотол.: Тез. н. конф. — Казань, 1983. —• С. 75.

4. Линдъярв Р. Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу телят в Эстонской ССР и возможные пути его ликвидации // Акт. пробл. вет. в промышл. животноводстве: Тез. докл. Вссс. школы мол. уч. и спец. — М., 1983. — С. 96.

5. Линдъярв Р. Пероральная иммунизация телят живой вакциной из му-тантного штамма Б. <1иЬНп // Достижения науки и передовой опыт в сельском хозяйстве. — Таллинн, 1983. — № 14. — С. 19 ... 22.

6. Тилга В., Линдъярв Р. Борьба с сальмонеллезом телят // Рекомендации ученых ЭНИИЖВ производству. — Таллинн, 1983. — С. 3... 7.

7. Тилга В., Линдъярв Р., Войченко М. Пероральная иммунизация телят против экспериментального сальмонеллеза // Болезни молодняка с/ж животных и их профилактика в комплексах: Тез. докл. н. конф. — Тарту, — 27 сеит. 1984 г. — Таллинн, 1984. — С. 48... 49.

8. Линдъярв Р. Иммунопрофилактика сальмонеллеза телят. Изучение поствакцинального иммунитета после применения пероральнон живой вакцины // Достижения науки и передовой опыт в сельском хозяйстве, — Таллинн, 1986. — № 19. — С. 8 ... 13.

9. Тилга В., Линдъярв Р., Иыгисаар X. О сальмонеллезе животных // Рекомендации ученых ЭНИИЖВ производству. — Таллинн, 1989. — С. 3...9.