Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Применение серологических реакций для выявления свиней, инфицированных Haemophilus (Actinobacillus) Pleuropneumoniae

Г I и V

2 3 МЛР 199'»

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 619:616.981.459

СИЛЛА ФАСИНЕ

ПРИМЕНЕНИЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СВИНЕЙ, ИНФИЦИРОВАННЫХ НАЕМОРНИиЭ [АСПМОВАСтиЭ] Р1ЕШЮР№11МОтАЕ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва 1994

Работа выполнена на кафедре микробиологии и биотехнологии Московской государственной академии прикладной биотехнологии в соответствии с темой 7-3-86, номер госрегистрации 01870079083 в период с 1989 по 1993 гг.

Научные руководители — доктор ветеринарных наук,

профессор СИДОРОВ М.А.

— кандидат ветеринарных наук, доцент СКОРОДУМОВ Д Л

Официальные оппоненты — доктор ветеринарных наук,

профессор БУРЛАКОВ В.А (МВА)

доктор биологических наук профессор ЕЖОВ ГЛ. (УДН]

Ведущее учреждение — ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. ЯР .Коваленко (гМосква)

Защита состоится ". » (XufJbJA 1994 г. в час. на заседании специализированного Совета К 063.46.03 Московской государственной академии прикладной биотехнологии (МГАПБ) по адресу: 109818 г.Москва, ул.Талалихина, 33.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАПБ.

Автореферат разослан " ^ " 1994 г.

Ученый секретарь специализированного Совета И.АЛОГИНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среда инфекционных болезней свиней в пос-цние десятилетия все большую экономическую значимость приобре-эт гемофилезная плевропневмония, вызываемая специфический мик-эрганизмом из семейства Pasteurellacae рода Haemophilus ца Haemophilus pleu го pneumoniae.

Эта болезнь зарегистрирована во многих странах Европы, в Капе, Америке и др. (М.А.Сидоров, Д.И.Скородумов, 1986), а изуче-о ее посвящены работы многих исследователей ( H.oiandar ,1963; .Shope ,1964; J.Wicolet jii.bxmig ,1966; K.ZixuiemaniL/.Bibersteii^, 74; М.А.Сидоров, Д.И.Скородумов, 1980; 1986; Н.ИЛаврентьев, 31; Ш.М.Мицаев, 1982; А.И.Юдин, 1985; В.В.Суббогин, 1987; Л.Я. юнова, 1990 и др.).

В нашей стране (Российская Федерация) гемофилезная плевро-эемония впервые зарегистрирована в 1978 г. в круяных свиноводче-а. комплексах. Были изучены многие вопросы биологии и экологии 1будителя, разработаны методы лабораторной диагностики болезни фвдетва специфической профилактики-(И.А.Сидоров, Д.И.Скороду-I, 1986).

Однако до сих пор не имеется данных о широте распространения езни и особенно о широте циркуляции возбудителя в популяциях вей разных регионов.

В настоящее время выявлено 12 серологических вариантов Н. еuro pneumoniae , причем в разных регионах мира среди свиней кулируют разные сероварианты, однако наибольшее эдизоотологиче-е значение имеют 1,2,3,4 сероварн.

Контроль за циркуляцией сероваров можно осуществлять исследо-яем сывороток крови на наличие антител. Для этих целей исполь-анн PA, РСК, Elisa -тест. Показано, что среди свиней разных гонов циркулируют практически все известные сероварианты Н.

р1еигорпеавоп1ае > но вспышки болезни чаше обуславливаются пер-вкми-четырьмя (к..Мгсга1 еь о1. ,1984; М.^агЬагу еъ а1. ,1985; ¿..аатапю-со ^.^¿аса ,1968; ь.МиНег ей а1. ,1988).

Данных о 'лироте циркуляции разных сероваров Н. р1еигорпеигпо-и1ае среди свиней неблагополучных и благополучных по гемофилезной плевропневмонии хозяйств Российской Федерации не имеется.

Пели и задачи исследований. В связи с изложенным и учитывая актуальность Еопроса о эиротёЦиркуляции возбудителя среди свиней, перед нами были поставлены следующие задачи:

- изучить основные биологические свойства Н. р1еигорпеито-яхае, отработать методику приготовления корпускулярных и растворимых антигенов из всех известных серовариантов,

- в реакции агглютинации, ?СК и РИГА изучить их активность, видовую и вариантную специфичность,

- изучить динамику антителогенеза у инфицированных парентерально кроликов и интраназально - поросят,

- используя приготовленные антигены, в реакции агглютинации изучить частоту обнаружения серопозитивных свиней в неблагополучном и благополучных по гакофилезной плевропневмонии хозяйствах.

Научная новизна. Получены новые данные о формах феногипичес-кой изменчивости типовых культур Н. р1еигорпеигвдп1ае на основании чего дано научное обоснование методики изготовления корпускулярных антигенов, пригодных для обнаружения агглютининов в крови животных к разным сероварам возбудителя. Впервые в Российской Федерации дан ретроспективный анализ широты распространения разных сероваров Н. р1еигодаеитоп1ае среди свиней разных возрастных групп в неблагополучном и благополучных хозяйствах.

Практическая ценность -работы. Реакция агглютинации с антигенами из М- и б -вариантов Н. pieuropneu.mon.iae рекомендуется для эпизоотологического контроля за широтой и интенсивностью цир-

уляции в свинохозяйствах разных серовариантов возбудителя, па сноеэнии чего представляется возможность прогнозирования Еспылек олезни и организовывать общие и специфические мероприятия по рофилакгике заболевания.

Материалы диссертации по селекции t/!- и s -вариантов и тех-;ике культивирования штаммов Н. pielurupafcu'timiae для получения ачественных специфических антигенов включены в Методические ука-1ания по изготовлению и применению коагглютинирушего антительно-'0 диагностикума для экспресс-идентификации Н. pieuropaea ¡oniae t индикации возбудителя в патологическим материале (п.2.2, 2.5), твержденные отделением ветеринарнол медицины РАСХН 15 февраля ."993 года;

Апробация мбогы. Результаты исследования доложены на заседаниях Ученого совета ветеринарно-санигарного факультета .'.ТАПБ в [930, I9SI и I9S2 г,г., а также на научно-практической конферен-ош "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодика животных" (Москва, В'ЛЭВ, 1993 г.).

Основное положения диссертационной работы, выдвигаемые для защиты. Экспериментальное обоснование методики приготовления корпускулярных антигенов из различных серовариангов Н. pleuropneumonias изучение их активности и специфичности, а также результаты их применения для ретроспективного анализа широты и интенсивности циркуляции К. pleuropneumonias в неблагополучном и благополучных по гемофилезной плевропневмонии свиноводческих хозяйствах.

Объем и структура работы. Работа изложена на Е,6 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,* описания собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка литературы. Диссертационная работа иллюстрирована 23 таблицами, 8 рисунками. Список литературы включает 201 наименование, из них 150 кност-

ранних.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и метощ. При проведении исследований были использованы типовые штаммы Haemophilus («-ctynobacillus J pleuropaeumoai CCM 5859 (серовар I), COM.5870 (серовар 2), CCM 5871 (серовар 3), Ы62 (Серовар 4), KI7 (серовар 5), К98 (серовар 5), Фемо (серовар 6), Н-404 (серовар 7), Н-405 (серовар 8), Н-407 (серовар 10), Н-408 (серовар 12), № 202 (штамм так называемой "малой группы") и № 204 (штат, рост которого не зависит or v -фактора).

Все перечисленные штаммы получены из коллекции кафедры микро биологии и биотехнологии МГАПБ в лиофилизщюванном виде, в запаянных ампулах. На кафедру штаммы поступили из коллекции доктора Хаагсма (Центральный ветеринарный институт, депортамент бактериологии, Роттердам) и доктора Савадина (Чехословакия). На кафедре поступившие штаммы прошли 2 пассака на специальных средах, селекционированы и лиофилизированы (наполнитель - обезвдфеннов молоко коров).

Яри изложении материалов в диссертации мы пользовались одним наименованием штаммов - Haemophilus pleuropaeumoniae.

Питательные среды. Для культивирования штаммов, изучения их свойств и для получения антигенов использовали сыворогочно-дрожхевой бульон и агар из перевара Хоттингера (рБ 7,4-7,6; содер жание аминного азота 200-220 мг$). В бульон или агар Хоттингера перед засевом штаммов добавляли стерильную неинактивированную наконсервированную сыворотку крови 1фупного рогатого скота Ъ% к объему и 10% (объем/объем) стерильного дрожжевого экстракта (источник У-факгрра роста).

Дрожжевой экстракт, готовили из прессованных хлебных дрожжей. В I л дистиллированной воды суспендировали 250 г дрожжей, кипяти-

и 4-5 мин, суспензию центрифугировали при 5000 об/мин 20-30 мин, адосадочную жвдкость, содержащую У-факгор роста стерилизовали ¡гтем Фильтрации через .стерилизующие пластинки фильтра Зейтца. герильннй дрожжевой экстракт хранили при 4-8 °С не более 10 сут.

В некоторых опытах по селекции культур в качестве источника -фактора роста применяли вместо дрожжевого экстракта дагосфопири-шнуклеотид (ДПН) фирмы Реанал в дозе 10 мкг/мл.

В отдельных опытах использовали "шоколадный" агар, который >товили по общепринятой методике, используя дефлбришфованнуга ювь барана {10% к объему среды).

Для выявления зависимости роста лташов от наличия- в среде ■ростового фактора применяли общепринятые мясопептонный бульон и юопептонный агар (2-2,5^-ный). Культуры штаммов высевали в ЬШБ на МПА (сплояннм газоном) и на поверхность агара наносили стельную полоску сТяльгроЕальнол бумаги, пропитанной дрожжевым экст-1Ктом. Зависимые от У-ростового фактора штамкн ке давали роста в Б, а на МПА формировали колонии- только под и Еокруг полоски фи-тровальной бумаги (сателлитний рост).

Культурально-морфологические и биохимические с вол с те а гатам-в изучали общепринятыми методами применительно к гемофильнкм ктериям (М.А.Сидоров, Д.И.Скородумов, 1986).

Серологический вариант лтамка подтверждали в реакции коагглкь нации с ангителышми диагностлкумами, изготовленными Д.П.Скоро-мовым и аспирантом Е. Елему в соответствии с методическими указании по применению данной реакции.

Приготовление антигенов тая реакции агглютинации. Антигена я РА готовили из агаровых культур всех штаммов, взращенных на вороточно-дрокжевом агаре Хоттингера (особенности методики описав разделе "Собственных исследований").

Сыворотки крови животных. Гипериммунные сыворотки кроеи про-

тив различных серовариактов Н. плевропневмоние готовили совместно с Е.Блему путем гипериммунизации кроликов породы линшиляа живой кассой 2-2,5 кг. Всего в этих опытах использовано 36 кроликов (схема гипериммунизацга описана в разделе "Собственных исследований"). Эти сыворотки использовали дня изучения активности корпускулярных антигенов и их серовариантной специфичности.

При изменил Еидоспеципичнос ти корпускулярных антигенов использовали гилериммунные сыворотки крови против сальмонеллеза (набор 0 и Н-агглютикируюпшх сывороток) .против пастерелл серовари-ангов А, Е и Д (пасгереллезные сыворотки были любезно представлены к.в.н. В.Б.Федотовым и д.в.н. Э.А.И-егвдевичем, Москва, ВИЭВ), против энтерококков и бордетелла бронхнсептика (получено из ВШИ ил. Мечникова).

Сыворотки 1фови от свиней для исследования в РА получали из диагностической лаборатории (г.Люберцы, Московской обл.), а танке через ветеринарную службу свинокомплекса "Горноуральский" Свердловской области. Всего в РА с 12 антигенами разных серовариантоэ исследовано НО сывороток яроЕИ от свиноматок, 210 сывороток 1фо-ви от ремонтного молодняка (Еозраст 100 и более дней), 10 сывороток крови от поросят 30-днеЕного возраста и 10 сывороток от поросят 60-дневного возраста.

Кроме того, в РА со Есемл антигенами исследовали сыворотки крон и от 12 кроликов, инфицированных парентерально штаммами разных сероваров (48 проб), а таксе сыворотки крови поросят живой массой 25-30 кг, инфицированных датраназально сублетальной дозой Н.плевропневконие серовар 2. Эти сыворотки хранились е лиофилизи-роЕанном надо с 1988 года при температуре 4-8 °С.

Реакцию агглютинации ставили в агглютинационных пробирках в объеме I мл (0,5 их разведенкой снЕоротки и 0,5 мл корпускулярного антигена). Сыворотки 1фови разводили 1:5, 1:10, 1:20 и т.д.

!0йны9 разведения), добавляли ангиген, смесь ставили в термостат [ 37-39 °С на 3-4 ч, выдерживали 16-20 ч при комнатной темпера-19 и затем учитывали. За положительную реакцию принимали агглю-[ациго корпускулярного антигена, оцененного в 2 балла (++).

Реакцию связывания комплемента ставили по общепринятой мето-:е. Для подавления лрокомплемент'арной активности сыворотки 1фО-экспериментально зараженных свиней в бактериологическую снсте-добавляли сыворотку крови 1фупного рогатого скота.

Реакцию непрямой гемагглютинапии использовали в отдельных пах. В этой реакции Формалкнизироеанные и обработанные танни-I эритррцитн оарана (готовили по общепринятой методике) конън>-|овали с кспсульныыи антигенами разных серовариантов Г. плеЕро-шионие. Капсульные антигены получали по методике Картера, опи-еой для пасгерелл.

Для этого 18-часовую агаровую культуру концентрацией 20 я/мл прогревали в течение 30 Мин в водяной бане при темперагу-56-58 °С, суспензию центрифугировали. Надосадочную- жидкость ;ользоеэли как капсульный антиген.

- Показатели титров антител а серологичерк*х тзеаквдях выражали [агуральннх величинах - в предельных ра^вВДФпыРс сывороток кров которых интенсивность видимой реакции, оценивалась в два бал-(++). При необходимости цифровые, данный вырабатывали по мето-;е Урбаха (1963 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ДОСЛЕДОВАНИЯ

Основнне/Виологичбские свойства штаммов бактерий, исдользо-иых в работе, Куль тур альные характеристики Н. р1еигорчеи п0~ в подробно освешены в разделе 2.2.2. Следует отметить, что :ьтуры ДПН-зависимого и ДПН-независимого биоваров имели сход-г тш роста на жидкой и плотных средах, хотя ДПН-независимый

:птамм -/¡эрмироЕал более крайне колонки. Все лтамш вида образова-еали бага -гемолизин, бега-галактозвдазу, уреазу, непостоянно каталазу, оксидазу, не синтезировали кетагиназу, индол, лизин, орнитиндекарбоксилазу, аргинингидролазу, не утилизировали малонат и цитрат натрия, фенилаланин, расщепляли с образованием кислоты без газа глюкозу, ксилйзу, сахарозу, маннозу, мальтозу, непостоянно лактозу, арабинозу, галактозу, были инертны по отношению к инозиту, адониту, инулину, сорбиту, дульциту, рамнозэ.

Ктакм "малой группы" не обладал гемолитической способностью, не иг.;ел бета-галактозидазы, не ферментировал маннит, ксилозу.

По морфологическим и тинкториальнык свойствам А. suis был сходен с Н. pieuropaeumuniae , Этот вид не требует для роста

на питательных средах ДПН, на плотных средах формирует |фуглые,

*

выпуклые, матовые, непрозрачные колонии с ровными 1фаяыи и гладкой поверхностью. Консистенция колоний резянояодобная, диаметр колоний через 3 дня выращивания достигает 4-5 мм и они слегка желтеют. Иногда в популяции обнаруживаются более мелкие колонии (диаметр 2-2,5 мм), полупрозрачные, слизистые. В бульоне Хоттингера культуры, формирующие колонии s типа росли интенсивно с одновременным заметным увеличением вязкости среды и формированием пристеночного кольца. Культура А. suis, не требовала ростовых факторов, имела во многом совпадающие биохимические признаки с Н. pleuxopneumoniae , Но постоянно расщепляла салицин, рамнозу, галактозу. По основным биологическим признакам использованные ятаммы соответствовали описанию этих еидов в руководстве по систематике бактерий Берги (1984) и оригинальных работах ( Mannheim et al, 1980t edelstem *.et а1Д981; Kilian M. ,1978; Скородумов Д.Л., Сидоров М.А., Прусак-ГлогоЕ B.3.,IS92).

Селекция ктаьгто а испытание антигенов из различных культу-ральных вариантов Г.плевропневмоние. Согласно данным Ш.М.Мицаева

'.1933), и.А.СидороЕа, ДЛ.Скородумова (1986) и налим собственным --иблюдениям при поддержании культур Н. р1еы.гораеилоп1ае в лабораторных условиях нередко отмечается явление диссоциации. Этот тип вменчивости наиболее часто наблюдали при смене питательной среды, ^пользовании не оптимальных питательных сред. '

Исследованию были подвергнута пять типовых ятаммов, представ-:яюпих веровары 1,2,3,4,5(а), хранившихся в лиофилизированном сос-'оянии. В результате неоднократных пассажей культур типовых зтам-юв отмечено формирование на агаровой среде колоний нескольких ти-:ов. Колонии.первого типа наблюдали, как правило, 1олько на сыво-оточно-дрожжевом агаре, они имели диаметр 1,5-2,5 мм, правильную руглую форму, ровные 1фая, гладкую поверхность, выпуклый рельеф, лязистую консистенцию,( были серо-белого цвета, слегка мутноватые.

косопроходящем пучке света колонии интенсивно флуоресцировали ри наблюдении невооруженным глазом, а под бинокулярной лупой име-и медно-красный цвет с зеленым изумрудным оттенком ( э -форма), детки в мазках из этих колоний имели форму коротких коккобакте-ий размером 0,2-0,3x0,3-0,5 мкм, располагающихся одиночно, пара-и, иногда короткими цепочками,очень редко в виде коротких нитей, препаратах, окрашенных по методу Гинса, обнаруживали хороло вы-эженную капсулу. При постановке пробы Бернгофа суспензии из куль-ур такого типа оставались стабильными. В сыворогочно-дрожжевом уяьоне эти культуры растут с равномерным помутнением среды и о6-азованием через 48-72 часа небольшого серо-белого слизистого задка.

Колонии, второго типа, также имели э -форму, но были несколь) мельче (1-2 мм), полупрозрачные, флуоресцировали в косопадаю-5м свете, в бинокулярной лупе имели ярко-зеленое свечение с врас->ватым оттенком. Морфология клеток в колониях первого и второго ша была одинаковой, суспензия бактерий не проявляла склонности

к спонтанно", агглютинация в пробе Вернгофа. В сывороточно-дрок-жевом бульоне культуры этого типа растут с равномерным помутнением среда, стабильны, осадок незначительный.

Колоний третьего типа имели диаметр 0,1-0,4 мм, полупрозрачные, с шероховатыми 1фаями, в косопроходящек свете не флуоресцирует, лрл изучения под бинокулярной лупой демонстрируют тусклое свечение серовато-зеленого цвета. Бактериальные клетки, как правило, удлиненной палочковидной формы, чаше изогнутые, вплоть до кольцевидных структур, встречаются утолщенные бочкообразные клетки. В препаратах, окраленных по Гансу, у клетках развитой капсулы не выявляется, в пробе Вернгофа основная масса бактериальных меток выпадает в осадок. .В жидкой питательно"; среде рост культур наблюдается в веде хлопьев в прозрачном или слегка мутном бульоне с формированием массивного хлопьевидного осадка.

3 соответствии с представленными характеристиками оипсанные вняе три типа колоний к окно охарактеризовать как э -форму С 1-й тип), .'/г-фзрку (2-1! тип) и к -форму (3-2 т:ш).

При анализе культур, выращенных на питательных средах различного состава, установили, что явление диссоциации более часто регистрировалось на агаре с д&фэсфоп!говдиннуклеотидо»< источник 7-роста), несколько реже на дрожжевом агаре, в наименьшей степени на снвороточно-дрохЕ-.евог. агаре. Это позволяет рассматривать из числа сравниваемых питательных сред как наиболее оптимальную и способствующую селекции недиссоциированных клонов К. р1еигорави-тоихае- снвороточно-дрскжевой агар Хоттингера. Включение е состав среды сыворотки крови крупного рогатого скота к дрожкевого экстракта,как источника Д1Ш и группы витаминов, уменьшает вероятность куль тральной изменчивости К. рхвигориеияоа1ае.

С целью оценки качества антигенов, приготовленных■ из- различных культуральннх вариантов нами были селекционированы культуры

2-го и 5-го сероваров в б М- и К -форме. Из 18-часоЕых агаровых культур каждого типа били приготовлены корпускулярные, фсгрма-линизированные антигены и испытаны в пробирочной РА и реакции ко-~~ агглютинации на стекле. Агглгатянабильность антигенов в РА испытывали с гомологичными кроличьими сыворотками, полученными от различных животных-продуцентов и отличающихся по серологической активности. Специфичность антигенов определяли в РА и РКА с кроличьими гипериммунными сыворотками против типовых штаг-ялов II. р1еиго-рпеигаопхаеПолученные результаты позволяют констатировать, что анализ поцуляцди культуры, взятой для изготовления антигена, является обязательным условием. Наличке в популяции колония с признаками диссоциации е сторону и -форм требует селекции культуры. Оптимальной питательной средой для ^елей селекция культур является сывороточко-дролжевой агар (рН 7,2-7,4). Лиофилизированнуга культуру бактерий первоначально следует подращинеть в сввороточно-дрожжевом бульоне Хоггингера.

Проверка агглютшабильносги М- и э -антигенов в проб прочно.'} РА показивает, что эта характеристика близка у М- и 3 -антигенов, различия у антигенов 2-го серовара в принципе находятся в пределах ояибкя метода. Серовариангная специплчность несколько вше по данным РА у '.'-антигенов, сходная закономерность отмечается при исследовании и э -антигенов в реакции коагглвткнация.

Таким обрззоч, при изготовлении антигенов .для целей серологической диагностики (в том числе и для РА) необходимо селекционировать культуры Н. р1еигорпеи^оп1ае со св0:-1ствами присущими Мили 3 -форме, а для вкращиЕания культур с целью получения биомассы использовать сыворотэчно-дрокпевой агар Хоттингера.

Приготовление и оценка активности а специфичности корпус ¡солярных антигенов для реакция агглютинации. У.звестно, что культу-рн Г.плевропневмоние различного возраста отличаются по вярулентно-

сти (м. л.Сидоров, ЕЛ.Скородумов, 1536) и антигена из них имеют некоторые различия р серологических реакциях (I.Елему,1993). Поэтому нами быш пркготоЕлены и изучены, корпускулярные антигены агаровых культур в !.!- и 3 -форме различного срока культивирования.

При изготоелешш антигенов ш: использовали два способа инактивации бактериальных суспензий - формалином и путем прогревания. По данным лит чел и соавт. (1987) умеренное прогревание бактериальных суспензии Н. р1еигорпеигаоп1ае ведаг к повышению их активности в серологических реакциях. Исходя из перечисленных посылок нами были изготовлены антигены трех типов: из 8- и 18-часовых культур ипактиЕнроЕанных формальдегидом и 18-часовых культур инактиЕи-роганных прогреванием.

Серовариангнуга специфичность антигенов изучали в РА с кроличьими гипериммунннми сыворотками против типовых итакков Н. р1еигор-пей 1оп1ае.Видовую специфичность антигенов исслеюЕали с иммунными си.Еоротками против гетерологичнкх вадов бактерий, относящихся как к семейству i-asteurellaceae > так и к другим таксонам.

Титрация корпускулярных антигенов е пробирочной ?А по иахмат-ноГ: схеме показала, что максимальные тигрн сяЕороток с оценкой, на два креста (++) были получены при использовании суспензий, содержащих порядка 2 гард м.к. в I см3.Следовательно, при изучении сывороток кроЕИ в пробирочной РА в объеме I см3 необходимо стандартизовать антиген в объеме 20 ед. по оптическому стацдарту мутности ГЛСК ж. Тарасевяча, что соответствует конценорации 2 гард микробных клеток в 1-см3.

Антигены из 18-часовнх культ.ур отличаются болыей агглютина-бильносгью, чек о-часовые (серовару 1,3,3,10), но лря использования таких антигенов в болыеЗ степени проявляются перекрестные реакции с гегерологпчппмя в серовариантном отношении сыворотками. Нелогичное соотношение наблюдается при сравнении йормалинизиро-

шых и гретых антлгенов из 13-часэЕКх культу. Грегке ннтягенн 1адагат более ексокой серологической активностью, но меньше"; се-гшшспецлфичнэстыо при использования одних и тех ке гммуянтзс короток. Применение Ееществ, инакпшгруюших серологическую ак-эность иммуноглобулинов класса 'I (2-меркаптоэтанола) поругает рэвариавтнута спецк^ячность типовых нжуннкх сиеороток при испо-зовании одних и тех же корпускулярных антигенон.

Результаты испытания антигпнов таю;:е пэказаял, что незавкся-от типа антигена и характера сыворотки обнаруживаются четттае усторонние антигенние связи у сероЕаров I и 12, а таюхе серова-в 3,6 к 8. Обработка антясывороток протиЕ серогароЕ 1,3,6,8,12 мерхсаптоэтанойом качественно на антигенние взажосвязи этих ое-варов не повлияла.

Установлена двусторонняя антигенная связь таксоног.ическп я ^логически близкого вида - A. suis .Как водно, Л. Euis и се-isapu Н. pleuropneumoniae имеют общие антигены, выявляемые в |ОбирочноГх РА.Обттает внимание,что некоторые серонарк Н. pieuropnb oniae проявляют в пределах гида е РА большую серологическую 1особленность, чем A. suis .Зозмсшю, что при таком знтигеи-к родстве, наличие антител к A. suis е крови исследуемых сеи-,>3 макет в определенной сменена сказквагься на спод.'л:лносш се-иогических реакций.

Резшяруя данные по испытания различных гсорпуспулярнкх антя-зное И. pleuro pneumoniae е пробирочной РА г.жно консгакрорагь, го дня обеспечения наибольшей свросаряагноЯ специфичности пока-аний РА целесообразно использоЕагь антигены из 18-часогшс куль-fp. Постановка РА с 2-меркапт'оэганолок не отзывает еущестеенно-э елияния на повышение специфичноети антигенов. Антигенные езаи-эевязи A. sai3 и И. pleuronneuaoniae заслуживает дальнейшего зучения с анализом антигенного родства не только на уровне повер-

хностннх антигенов. Н. р1еигорпецшоп1ае в РА проявляет антигенную обособленность по соматическим антигенам от наиболее распрос раненных сероваров сальмонелл и О-груцл эяерихи'г. Не обнаружено антлгенного родства этого вода б акт ери!; с сероЕароми?. тиП;ос1аа ''.рагави^в к Б. ЬгоисМзер!;1са и некоторыми патогенными стрептококками, что свидетельствует о высокой специфичности антигенов из 1с-часовых к;'ль тур.

Приготовление и оценка корпускулярных антигенов Н. р!еигира цШоа3-ае в реакции связывания комплемента. 3 реакции связывания комплемента испытывали корпускулярные антигены из 18-часовых кул: тур, находящихся в :.?-Форме, йнактивированных формалином. РСК ставили е объеме I см3в разЕедения 1:8-1:1024. За титр сыворотки пр: някали максимальное ее разведение, где отмечали задеряку геколи» КЗ И"2 1ф?ста и ваше,

На первое этапе была проведена титрация антигенов (серовары 2 и £) по шахкетнэ" схеме с .гоэдояогичними иммунными кроличьими с: воронами. Показано, что оптимальная концентрация антигена, обеспечивающая максимальный тигр сывороток, составила около 0,1 млрд микробных клеток в I см3. В последующих опытах мы использовгли в качестве антигена бактериальные суспензии указанной концентрации Наряду с моновалеитными антигенами нами был изготовлен комплексны", антиген, содержащий каждый из антигенов (серовары 1,2,3,4,5, 6,7,8,10,12) е установленной оптимальной концентрации.

Согласно полученным е РСК результатам, комплексный антиген обеспечивает выявление антител в моновалентных сыворотках против р.г:элччных серовароЕ, причем в титрах близких к титрам с гомологи ними антигенами. Следовательно, комплексный антиген подобного ти па макет быть использован для целей серодиагностики на видовом уровне.

О'еровариантная специфичность моноантигенов подтЕерядает в це

характер анткгеннух связей, обнаруживает« в РА. Отмечены пе-рестные реакции сероваров 3,6,8, а такке сероваров 4,3,7. Обра-d вникание довольно облирные антигенные сеязи сероЕароЕ внутри э, в частности, антиген серовара 3 с гетерологичной сывороткой de ара 8 давал более высокие титры, чем с гомологичной. Отмече-иерекрестные реакции в низких титрах (1:2 - 1:4) с иммунными эротками Р. matocida (сероварБ), энтерококковой онворот-л иммунной сывороткой Н. parasuis серовара Б, более обшир-перенресгные реакции в титрах 1:4 - 1:16 обнаружены с спвоцот-А. suis.

Результаты проведенных опытов свидетельствуют, что корцуску-нне антигены из .итаммов Н. pleuropneusouiae , приготовленные 18-часовых агаровых культу, могут быть использованы для целей истрации серологического ответа. Применение комплексного анти-;а позволяет делать оценки а наличии антител к II. pieuropaeimo-.ае на урЭЕне вида.

Приготовление и испытание эритроцитарных антигенных диагностов для РИГА. С целью изготовления эритроцитарных дизгностику-I селекционированные культуры таловых лтзммов е '."-Форме выращя-;и в течение 16 час на снп оро гочно-дра 'л е во" агаре Хоттингера. стериальнуто массу смывали фосФатно-солевым буферным раствором [ 7,2), однократно отмывали центрифугированием в аналогичном ра-;оре и устанавливали концентрацию 500 ед. по оптическому стан->ту мутности Г.'СК. Из данной суспензии готовили растворимые кап-1ьнне антигены по методу Картера и диагностиками, согласно реко-здациям Агаевой ЭЛ. (1981).

Яз откетнх центрифугированием в '"осФатно-солевок буферном ра-еоре эритроцитов барана готовили 10!?-ную (объем/объем) Езвесь ртроцитоэ. Равные объемы I0fr-nö¥: взвеси эритроцитов и 5,01 Фор-дина скеиинали и выдергивали при 37 °С 20 ч с периодическим

Естрпхиванкем суспензии. На следующем этапе суспензш эритроцитов 3-кратно отмывали буферным раствором (рН 7,2) и добавляли 0,5$ нейтрального формалина в качестве консерванта и вновь устанавливали концентрацию 101. Затем формалинизированные эритроциты подвергали ганнизации. Перед сенсибилизацией эритроциты контролярова ли на спонтанную агглютинацию.

В предварительных опытах определяли оптимальную концентрацию антигена для сенсибилизации эритроцитов. С этой целью смеиивали равные объемы формалинизированных и ганнизированных эритроцитов и антиген в разведениях 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10. Разведения антигена готовили на забуференном физрастворе с рН 6,4. Компоненты перемешивали и выдерживали при 37 °С 2,5 ч, с периодическим встряхиванием взвеси эритроцитов.

На следушем этапе эритроциты трижды отмывали ФБР (рН 7,2). Добавляли к осадку первоначальный объем этого же раствора и хранили суспензию при 4 °С.

РЯГА ставили в лунках пластмассовых пластин. Сыворотки крови перед исследованием адсорбировали ^ормалинизированными эритроцитами. С этой же целью к I мл сыворотки добавляли 0,1 мл взвеси эритроцитов, выдерживали I ч при 20 °С. центрифугировали и надо-садочную жидкость (адсорбированную сыворотку) исследовали в РНГА после инактивации в водяной бане при 56-57 °С в течение 30 мин. Сыворотки разводили Ш> с 1:10 до 1:50960 е объеме 0,5 см3 и добавляли к каждому разведению 0,05 см3 эригроцитарного диагности-кума. Планзшты с компонентами выд'ержиЕали при 20-22 °С 18 ч и затем учитывали результат. При постановке РНГА с 2-меркаптоэтано-лом сыворотки крови разводили на ФБР с 2-меркадтоэтанолом (0,1 М) Одновременно ставили соответствующие контроли на неспецифическую агглютинацию.

По описанной выше схеме были изготовлены эригроцигарные ан-

генные диагностикумы каждого серовара и поливалентные. Усганов-но, что приготовленные эритроцитарные диагностику») оказались статочно активными. в РИГА с гомологичными иммунными сыворотками игры РИГА в зависимости от сероварианта колебались в пределах 1:2560 до 1:20480). Серовариантная специфичность моноЕалентных агностикумов бкла выше при использования РНГА с 2-меркаптоэтано-м. Были обнаружены двусторонние антигенные связи сероваров I и , 3,6,8, 2 и 3, 4 и 7, односторонние связи сероЕаров 5 я 8, I 10. При значительных перекрестных реакциях титр РНГА с гомологична сывороткой, как правило, был на несколько порядков выше, чем гетерологичной. Видовая специфичность дяагносгикумоэ оказалась статочно высокой, но выявляется существенная антигенная односто-нняя связь с A. suis.

Поливалентные эритроцитарные диагностику*® сероваров 1-5, 12, I-I2 не показали-достаточно высокой активности по отношению ' есем гомологичным сывороткам соответствующим использоезнным тигенам, особенно это проявилось при испытании диагностикума 12. С гомологичными сыворотками в высоких титрах реагировал ди-■ностикум-3,6,8, составленный из родственных антигенов.

Консольное испытание активности диагностикумов в процессе юнения показало,"что они сохраняют свою активность в течение ■4 недоль р момента изготовления.

Испытание РА. РСК и РНГА для регистрации серологических от-îtob у кроликов, зараженных культурами Н. pleuropneu ..oniae _ . за-жение кроликов проводили 8-часовыми агаровыми культурами H. pieu-ßueumoaiae сероваров 1,2,5а,7 и 12 (по 2-3 кролика на штамм,до-I 5 млрд м.к.). Через 10,15,25,35 и 45 дней после инъекции у юликов брали кровь для серологических исследований. У животных [инических симптомов, кроме воспалительного отека на месте вве-

даняя культуры, не отмечали. Через-10 дней после заражения появление антител в низких тиграх (1:20 - 1:80) отмечали при исследовании сывороток крови в РИГА, у части кроликов отмечали слабые пояснительные результаты РА и РС1С. 7 большинства кроликов серологический ответ достигал максимума на 15-25 сутки, титры антител при этом в РА достигали 1:10 - 1:80, РСК - 1:5 - 1:20, РНГА -1:40 - 1:320. Максимальную чувствительность продемонстрировала РНГА, меньзую РА и РСК, причем появление комплементсвязывающих антител несколько запаздывало по сравнению с антителами выявляемыми в РА и РНГА.

Сыворотци крови, взятые у кроликов на 15 сутки кроме того были исследованы на сороваркантную специфичность в РА, РСК и РНГА с антигенами гетерэлогических сероваров. Характер выявленных при этом антигенннх связей в основном соответствовал данным полученным при изучении гипериммунннх кроличьих сывороток, но в целом специфичность сывороток (серовариантная) была выле, чем у гиперим-Л!унннх сывороток крови.

Динамика синтеза антител у свиней, зараженных инграназально культурой Н. р1вигорц.еи.-эдп1ае , Опыт был проведен на трех сйинь-ях 2-2,5-месячного возраста1^. Для заражения использовали 8-часовую агаровую культуру Н. р1еигориеитап1ае серовара 2 (шт. ССМ 5370). Суспензию бактерий в дозе 500 млн микробных клеток в объеме 5 см3 вводили по каплям каждому из животных интраназально на стадии вдоха. 7 свиней брали пробы крови для серологического исс*-ледования до заражения, через 8,12,16 и 20 дней после заражения. У всех трех подсвинков в первые сутки после заражения развились острив симптомы поражения органов дыхания. Один из подсвинков пал через 3 суток, на вс£фыгии у него были обнаружены массивные очаги

I) Опыты по заражению свиней проведены к.в.н. Скородумовым Д.И.

&ибринозно-геморрагического воспаления в диафрагмальних и верху- . зечных долях легких. При бакисследоЕании из пораженных участков югких выделили исходную культуру. Два остальных подсвинка имели ¡импгомы поражения органов дыхания на протяжении всего периода 1аблюдения. При убое у них обнаружили в диайрагмальннх, сердечно!; I Еерхушечных долях-различного размера очаги фибринозно-некроти-)ируотей пневмонии. У обоих подсвинков из пораненных ткане'Д легких гдалось выделить культуру зарачаюшего 'лтамма.

Как показали исследования, один из подопытных подсвинков пз-¡ачально имел антитела к серогару 2 в титре 1:10 (РА), у второго - они отсутствовали. Через 8 дней после заракеняя у животного В 2 ; пробирочной РА серологически;: ответ зарегистрирован не был, у юдсвинка й I уровень антител возрос.на 16-,0 сутки титры РА составляли 1:40 - 1:£0.

У обоих подсвинков к 16-20 суткам тптр кокшлшентсвязываюшдх штител достиг 1:10 - 1:40. Еользую чувствительность продемонстри-ювала РИГА, к 20 суткам тптр антител в РЫТА достиг 1:160 - 1:320.

Как видно все три испытанных серологических теста пригодны ¡ля регистрации серологического отгега у свине!: при развитии инфекции, обусловленной Н. pl.euroj.jueu иаи1ае , а диагностическим литром в РА можно считать разведение сывороток 1:20 и вшш.

Частота -обнаружения агглютининов е сыворотках крови св:ще1х геблагоподучного по гемоФдлезной плевропневмония свинокомплекса. [риготовленные нами антигены из различных серологических вариантов И. р1еагорпеитоп1ае дспользовсли в пробкрочно;: РА для обнаруке-шя агглютининов э сыворотках крови свине.'; разных Бозрастных трупп, полученных из неблагополучного по гемофилезной плевропнев-!0нии свинокомплекса "Горноуральскии" Свердловска,': области. Всего «¡следовали сыворотки от 10 свиноматок 2-4-го опороса, а также от

Т9

поросят 30-, 60- и 100—дневного Еозраста (по 10 сывороток 1фови каждого Еозрастного периода).

В снвэротках крови всех свиноматок обнаруживались агглютинина тиграх от 20 до 160 к антигенам первого и второго серовари-.¡нт и. Причем у 6 и 7 (по сероЕарам) свиноматок тигры агглютининов были равны 40, по одной свиноматки - 80 и 2 и I свиноматки -160. Линь у дЕух свиноматок титры были раЕны 20 (по одноЗ сепно-атки ш какдаЁ сароЕаряант).

У всех поросят 30-днэеного Еозраста (100«; случаев) в снео-ротках 1фови обнаружены агглютинины к антигенам 1-го и 2-го серо-вариантов е титрах 20, что вероятно связано с приобретением их с молозивом. Аналогичная картина наблюдалась и в сыворотках ирови поросят 60- и Ю'О-днеЕного возраста, однако титры^по сравнению с ';.,-Ш1эеными поросятами были выдш на 1-2 разиадения (.40 - 80) .

/ о из 10 исследованных сеиномэток обнаружены агглютинины в титре 20-80 к антигену.из 4-го и е титре 20-40 к антигену 6-го о зроЕарианта. 3 сыворотках щюви 9 свиноматок из 10 исследованных обнаружены агглютинины к 5-му сероварианту в титрах ог-20~до 40. Агглютинины к антигенам других сероЕариантов (7,8,10 и 12) обнаружены в сыворотках крови отдельных свиноматок.

Анализ полученных данных показывает, что среди свиноматок данного хозяйства циркулируют практически вй1Г>зЕестнне в настоящее Ерз.мя серологические: варианты Н. р1еигориеи эда1ае . Однако, из всех преобладают сероварианты I и 2 (100 ), серовар 5 (90 %), серовары 4 и 6 (по 50 О. Остальные по частоте не щревылали 10-30) от всех случаев.

В сеязи с преобладанием 1-го и 2-го сероеаров среди свиноматок эта закономерность сохраняется и для поросят послеотъомного ?озраста (е 100,£ случаев обнаружены агглютинины в высоких титрах

• 60- и 100-дневных поросят).

В результате циркуляции в популяции свиней возбудитель раз-:ых серовариантов проникает в организм поросят (наиболее верояг-о с воздухом) и инфекция у них протекает по типу иммунизирующей.

Нали данные свидетельствуют, что пробирочная РА с ангигена-и из разных серовариантов Н. pleu.ro pn.euian.iae может быть исполь-ована дня серологического контроля эпизоотической ситуации по емофилезной плевропневмонии.

Частота обнаружения агглютининов в сыворотках крови свиней лагополучных по гемосбилезной плевропневмонии хозяйствах. Всего сследовано 100 сывороток крови от свиноматок и 200 сывороток рови от ремонтного молодняка. Установлено, что с антигеном из -го сероварианта положительно реагировало 3% свиноматок, из 2-го еровара - 21%. У больного количества свиноматок обнаружены агг-ютинины к антигенам 5-го серовара (8($), 4-го сероЕара (86/5) и -го (74$). К антигенам 8-го и 12-го сероваров агглютинины обна-уаены у 57 и 59$ свиноматок, соответственно. На другие серовары риходилось от 13 до 34Я ("малая группа") до 30-425? (7-й и 10-й еровар).

В связи с тем, что используемые в РА антигены обладают ввдо-ой специфичностью, а возбудители разных сероваров циркулируя в эпуляциях свиней вызывают инфекционный процесс, сопровождающийся аработкой антител, в том числе и агглютининов, то можно полагать ю в благополучных по гемофилезной плевропневмонии хозяйствах эсковской области преобладает циркуляция 4,5,6,8 и 12 серовари-лов Н. р1еигораеитоп1авСерологические варианты 2 и, особенно , в этих хозяйствах практически не представлены, так как обнару-эние у некоторых свиноматок агглютининов к ним в низких тиграх гражают реакцию организма на общие ввдовые антигены других серо-

вариантов. Примерно такие же результаты получены и при исследовании сывороток крови ремонтного молодняка,, получанного от этих свиноматок. Лишь у 15$ животных этой возрастной группы обнаружены агглютинины в титре не выше 1:20 к антигенам 1-го и 2-го серова-

ряангов H. pleuropneu^oniae.

Наши данные показывают, что циркуляция штаммов 1-го и 2-го серонароЕ в благополучных хозяйствах очень ограничена и на общем фоне сероконверсии по другим серовариантам они вероятно не в состояния вызывать острую вспышку болезни. Полученные нами сведения о циркуляции различных сероваров H. pieuropueu.noniae Е свиноводческих хозяйствах по результатам серологических реакций весьма сходны с данными '¡uller ь, et al. (1987, 1988) ; Bau.ngerther w. (IS89), которые использоеэли PCK.

ВЫВОДЫ

1. Типовые штаммы H. pieuгораeumoniae различных серодогиче ских вариантов, полученные из лабораторий Голландии и Чехословакии при пересевах на питательных средах в лабораторных условиях подвержены диссоциации и при работе с ними нуждаются в постоянно? селекции типичных а- и s -форм. По морфологическим, культураль-кым и биохимическим свойствам они соответствуют признакам вида lïaemoptiilus (Actynotacillus ; pleuropneumoniae , а ПО капсульню антигенам - соответствующей маршировке серовариантам.

2. Яри изготовлении корпускулярных антигенов из штаммов Есех сероваров для реакции агглютинации необходимо:

- кулыиЕироЕать штаммы только на сквороточаб-дрсияевом агаре и сывороточно-дронжевом бульоне Хоттингера (рН 7,2-7,4, амин-ныйазот 200-220 мг,2),

- селекционировать колонии, которые в пучке косопадающего СЕега обладают флуоресценцией, а под лупой тлеют медно-краснова-

I цвет с зеленоватым отливом (М- и з-форма),

- биомассу из селекционированных колоний получать на сыворо-; шо-дрожхевом агаре Хогтингера путем выращивания при температу-37-38 °С в течение 18 ч, не допуская более 2-х пассам:; на эдах во избежании диссоциации,

- инактивацию отмытых 0,9^-ным раствора хлорида натрия бак-эий осуществлять добавлением 0,2$ формальдегида,

- концентрация бактериальных клеток в антигенах должна быть 3,5 млрд/мл.

3. Приготовленные антигены из дтаммов Н. рКзигораеи-пацДае 1адают высокой активностью и специфичностью. Среди сероваров е акции агглютинации отмечаются антигенные связи, однако титры глютининов е гомологичных сыворотках с гомологичным антигеном звылают на 3-4 порядка.

4. Реакция агглютинации по чувствительности и специфичности уступает реакции связывания. комплемента и непрямой гемагглюти-

ции, однако по технике исполнения она более проста и менее тру-емка.

5. У инфицированных в условиях эксперимента кроликов и сви-й в крови появляются агглютинины к 10-му дню в тиграх выше

20, что позволяет считать это разведение сывороток за полояите-ннй титр.

6. В неблагополучном по гемофилезной плевропневмонии хозяй-ве, в котором постоянно наблюдаются острые вспьшки болезни, сре-

клинически здоровых свиноматок и поросят разного возраста пре-падает циркуляция 1-го, 2-го и 4-го сероваров возбудителя.

7. В благополучных хозяйствах Московской области обнаружены аь отдельные серопозитивные к 1-му и 2-му серовару Н. р1еигорпе-й-ае свиноматки и ремонтный молодняк. Антитела к другим серо-

варам обнаруживаются в 40-80% случаев.

8. Благодаря циркуляции разных сероваров возбудителя, кроме 1-го и 2-го, происходит инфицирование свинопогодовья, а инфекционный процесс у них протекает по типу иммунизирующей инфекции. Наличие агглютининов на разные сероварн вероятно препятствует вспышке болезни.

9. Реакция агглютинации с антигенами из разных сероваров Н. Р1ецгорпеитош-ае > приготовленными в соответствии с выводом 2 может быть использована для контроля эпизоотической ситуации по гемофилезной плевропневмонии и позволит прогнозировать острые вспышки и применять оптимальные по набору серовариантов вакцины для профилактики болезни.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Реакция агглютинации с антигенами из разных сероваров Н. р1е-игорпешпоп1аа , приготовленными по разработанной нами методике, рекомендуется использовать для выяснения эпизоотической ситуации по гемофилезной плевропневмонии свиней в хозяйствах и вносить коррективы в принцип подбора штатов (по серовараы) при изготовлении вакцины с целью профилактики болезни.

Заказ * 33 Форма* 60x90/16 - 1,5 печл. Тира* 100

Предприятие "Подиграфсервис" 109316, г.Москва, ул.Талалихина, 26