Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Применение хемилюминесценции иммунокомпетентных клеток крови для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота

На правах рукописи

ДЮСЕНОВА ГУЛЬЗАЙРА МУХАМЕДЖАНОВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ДЛЯ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск-2006

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте бруцеллеза и туберкулеза животных СО РАСХН

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Ошепков Владимир Григорьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Сидоров Геннадий Николаевич

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Донченко Николай Александрович

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт пантового оленеводства (ВНИИПО)

Зашита состоится «_»_________2006 г. в «_» часов на заседании диссертационного совета Д. 006.045.01 в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, п. Краснообск, СО РАСХН, ИЭВСиДВ

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН

Автореферат разослан «__»_____2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Логинов С.И.

jjwfjt

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В системе противотуберкулезных мероприятий решающая роль отводится диагностике, так как успех борьбы с этой антропо-зоонозной инфекцией во многом зависит от полного и своевременного выявления источников возбудителя болезни. Между тем, многолетний опыт использования традиционных методов диагностики туберкулеза выявил ряд свойственных им недостатков. Основной метод массовых исследований - туберкулиновая проба, не выявляет в стаде всех больных туберкулезом животных. Это вынуждает проводить многократные повторные исследования, что значительно затягивает сроки оздоровления неблагополучных стад (М.К.Юсковец, 1965; В.П.Урбан, 1982, 1991, 1998; Н.П.Овдиенко, 1980, 2001; А.С.Донченко, 1980, 1994, 2001; Л.М.Ходун, 1985, 1987, 1988; А.Х.Найманов, 1991, 1993; Н.А.Шкиль 1991, 1995; Ю.И.Смолянинов, 1994, 1995; Ю.А.Макаров, 1997; В.Н.Кисленко, 1998 и др.).

При исследовании животных в хозяйствах, считающихся благополучными по туберкулезу, в случае выявления реагирующих на ПДД-туберкулин животных требуются дополнительные уточняющие исследования.

Несовершенство методов дифференциальной диагностики этого заболевания приводит к тому, что ежегодно на мясокомбинаты сдаются тысячи голов крупного рогатого скота, реагирующих на ППД-туберкулин, подозреваемых в заражении, но во многих случаях не являющихся больными туберкулезом, а это неизбежно увеличивает прямые и косвенные потери животноводства.

Современные достижения зарубежной и отечественной науки в области мо-лекулярно-клеточной биологии и медицины открывают возможности в создании нового поколения средств и методов диагностики туберкулеза с высокой чувствительностью и специфичностью.

В этом плане перспективны биофизические методы, позволяющие разработать эффективные способы прижизненной диагностики туберкулеза, одним из которых является биохемилюминесцентный анализ (А.И.Журавлев, 1961, 1968, 1975; Ю.А.Владимиров с соавт., 1966, Г.М. Баренбойм с соавт., 1966; Е.И.Шуцкая, 1979; П.К.Куликов, В.Ю.Куликов, 1985 и др.).

Биолюминесценция - свечение живых организмов и биосубстратов, превышающее их равновесное тепловое излучение за счет энергии экзотермических биохимических или химических процессов, протекающих в целостном организме, его тканях и органах (А.И.Журавлев, 1974).

Это объективно существующее явление, свойственное всем живым организмам, и может быть использовано для изучения клеточно-молекулярных механизмов, происходящих как в норме, так и при различных патологиях, в том числе и инфекционного происхождения (Ганелина И.Е., 1965; Левицкий О.Н., 1970; Гаспарян С.А., 1970 и др.).

Главные энергетические преобразования, обусловливающие возникновение и колебания сверхслабого свечения (ССО, как одно! о из видов биохе-

милюминесценции (БХЛ), происходят в б: [СйОСиМЛЛИйН/ЫМв^АЙЯх - важней-

РИБЛИОТЕКЛ j GfltT«f*fl>r 09 M»jb»«Tflfc>^

ших супрамолекулярных структурах, являющихся субстратом основных жизненных процессов.

Сверхслабое свечение обладает некоторыми особенностями: оно универсально, свойственно всем тканям животных и растительных организмов; энергию для сверхслабого свечения поставляет процесс неферментативного свободнорадикального окисления тканевых липидов: интенсивность ею в норме очень низка, так как свободнорадикальное окисление в живых тканях тормозится системой тканевых антиокислителей; основным энергетическим субстратом являются жиры и липиды. Белки, аминокислоты, а также их водные растворы практически не хемилюминесцируют; сверхслабое свечение не оказывает прямого воздействия на интенсивность клеточного деления; спектр ССС захватывает область длин волн 360-800 нм; его можно измерить объективным физическим методом с помощью чувствительных фотоэлектронных установок (Журавлев А.И., Журавлева А.И., 1975).

Характер хемилюминесценции (XJI) в норме и при функциональных сдвигах, возникающих под действием бактерий, качественно отличается. Под действием патогенных бактерий и их метаболитов фагоцитирующие клетки крови взрывообразно продуцируют высокоактивные частицы кислорода, имеющие целью убить и подготовить к полноценному фагоцитозу микробы (Ю.А.Владимиров, О.А.Азизова, А.И.Деев, 1991).

В зависимости от типа и длительности вирусного и бактериального стимула продукция свободных радикалов ® может быть различной по интенсивности и объему. В острой фазе бактериальной инфекции тканевые фагоциты и лейкоциты продуцируют, как правило, максимальное количество радикалов (Е.В.Рябиченко, В.М.Бондаренко, В.В.Рябиченко, 2000). Массированный выброс свободных радикалов из клеток приводит к необратимому повреждению не только микробов, но и клеток и тканей организма-хозяина (В. И. Петухов, 2000; А.Г.Шахов с соавт., 2003 и др.).

С тем, чтобы предотвратить опосредованную активными короткожи-вущими радикалами самодеструкцию клеток-фагоцитов и воспалительное повреждение окружающих тканей, в организме происходит выброс ферментов антирадикальной защиты. Антиокислители уменьшают количество продуктов свободнорадикального окисления и тем самым регулируют интенсивность ХЛ живых организмов и биосубстратов (А.И Журавлев, 1959, 1975; Б.Н.Тарусов, 1962; З.Бак, 1963).

Высокая эффективность применения этого биофизического теста в биологии и медицине, актуальность проблемы дифференциальной диагностики губеркулеза предопределили направленность наших исследований.

Работа является самостоятельным разделом комплексной гемы 02.01.09 «Разработать теоретические и практические основы молекулярно-генетической диагностики туберкулеза животных, индикации микобактерий из различных объектов)/, выполняемой во ВНИИБТЖ.

Цель и задачи исследований. Цель - изучить хемилюминесценцию им-мунокомпетентных клеток крови лабораторных и сельскохозяйственных жи-

вотных, и ее применение для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

- разработать методику выделения иммунокомпетснтных клеток периферической крови для хемилюминесцентных исследований;

- определить уровень сверхслабого свечения (ХЛ) лейкоцитов лабораторных животных, экспериментально зараженных M.bovís;

- определить уровень сверхслабого свечения лейкоцитов телят, экспериментально зараженных М.bovis;

- определить уровень сверхслабого свечения клеток крови коров, экспериментально зараженных М.bovis, и установить влияние 1111Д- туберкулина для млекопитающих на их хемилюминесценцию;

- испытать специфичность и чувствительность иммунохемилюминес-центного способа диагностики туберкулеза в производственных условиях.

Научная новизна. Разработан способ прижизненной диагностики туберкулеза, включающий выделение полиморфноядерных лейкоцитов, сохранение их в стабилизирующем растворе, сравнительную оценку спонтанной и индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции; в качестве индуктора «дыхательного взрыва» используют опсонизированный зимозан; отличающийся тем, что в качестве специфического индуктора используют туберкулезный антиген; дезинтеграцию микобактерий проводят ультразвуком.

Получен патент РФ и две положительные формальные экспертизы

ФИПС.

Практическая ценность. Применение способа прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, основанного на хемилюминесценции клеток крови, индуцированных антигеном микобактерий туберкулеза, сократит сроки дифференциальной диагностики и предупредит значительный экономический ущерб за счет необоснованной сдачи на убой здоровых животных, реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих.

Составлены методические рекомендации для прижизненной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с использованием иммунохемилю-минесцентного метода (2005 г.).

Результаты научно-исследовательской работы используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии, иммунологии, эпизоотологии и инфекционных болезней сельскохозяйственных животных ИВМ Ом-ГАУ.

Апробация полученных результатов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ВНИИБТЖ (1996-2005), выездных заседаниях Президиума Сибирского отделения Россель^ хозакадемии (1998, 2000), Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций (Омск, 2001); годичных собраниях Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (1999, 2002), на межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 175-летию аграрной науки Сибири (2001); заседании Бюро отделения ветеринарной медицины Россельхоза-

кадемии (2003), lV-межрегиональной научно-практической конференции по проблемам ветеринарной медицины (2005), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина-2005».

Материалы диссертации, выводы и практические предложения доложены, обсуждены и рекомендованы к защите на межлабораторном заседании сотрудников ВНИИБТЖ (2005).

Публикация материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 127 страницах компьютерного набора и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Список литературы включает 213 источников, в т.ч. 29 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами, 31 рисунком.

На защиту выносится:

1. Экспериментальные основы выделения, сохранения и применения для хемилюминесцентных исследований иммунокомпетентных клеток крови лабораторных и сельскохозяйственных животных.

2. Результаты применения хемилюминесценции иммунокомпетентных клеток крови лабораторных животных и крупного рогатого скота для прижизненной диагностики туберкулеза в экспериментальных и производственных условиях.

Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам лабораторий диагностики и микробиологии туберкулеза, клеточной биотехнологии ВНИИБТЖ за участие и помощь при выполнении данной работы.

2.СОБСТВЕНПЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Настоящая работа выполнена в лаборатории диагностики и микробиологии туберкулеза и лаборатории клеточной биотехнологии ВНИИБТЖ

Материалом для ХЛ исследований служили пробы крови лабораторных животных (морские свинки и кролики), молодняка крупного рогатого скота и коров, находящихся в эксперименте, и в хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу.

Пробы крови у крупного рогатого скота брали общепринятым методом из яремной вены с трилоном Б в силиконизированные пробирки. У кроликов кровь брали из ушной вены, у морских свинок под неглубоким наркозом - из сердца Стандартизировали концентрацию лейкоцитов путем подсчета клепок в камере Горяева.

Антигенный комплекс, использованный при постановке хемилюминесценции, получен из M.bovis шт.8 и М. tuberculosis H37Rv путем дифференци-

альной дезинтеграции бактериальной массы ультразвуком и биохимического фракционирования клеточных оболочек (Л.М Ходун, Н.И.Цунская и др., 1989).

Специфичность и активность полученных антигенов проверяли в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) и реакции связывания комплемента (РСК) с нормальной сывороткой здорового кролика, положительной туберкулезной сывороткой от кролика, гипериммунизированного убитой культурой микобактерий туберкулеза бычьего вида (М.Ьоу1^), и с положительной бруцеллезной сывороткой Антигены считали пригодными, если РНГА и РСК с туберкулезной сывороткой бьпи положительными, а с нормальной и положительной бруцеллезной сывороткой - отрицательными

Остальные компоненты для ХЛ исследований готовили по методикам, разработанным во ВНИИБТЖ в 1995-2002 гг.

Приготовление лгоминола. Люминол (люминол-гидразид-3-фталевой кислоты) растворяли горячим раствором ЫаОН на дезинтеграторе УЗДН-2. Устанавливали рН 7,2.

Приготовление зимозана опсонизированного для определения функциональной (фагоцитирующей) активности клеток. Взвешивали необходимое количество зимозана на аналитических весах, заливали концентратом раствора Хэнкса, кипятили. Затем его опсонизировали пулом сыворотки от здоровых коров из благополучных по туберкулезу хозяйств.

Приготовление стабилизирующего раствора. В стандартной питательной среде Хэнкса без фенолового красною последовательно растворяли бычий сывороточный альбумин и глюкозу на магнитной мешалке с подогревом до 50°С.

Постановка реакции. В сухие полистироловые кюветы термостатируе-мого барабана хемилюминометра разливали компоненты реакции, регистрировали по соответствующей программе спонтанную и индуцированную ХЛ. Контролем служили образцы клеток крови здоровых животных, не реагирующих на ППД-туберкулин, с добавлением стабилизирующего раствора.

Для регистрации сверхслабого свечения компонентов крови использовали хемилюминометр серии С1.3604 (Россия), выполненный в виде единого конструктива и работающий под управлением ПЭВМ типа 1ВМ ХТ/АТ, предназначенный для исследования кинетики хемилюминесценции биологически активных объектов.

Результаты регистрировали в абсолютных значениях - число импульсов в секунду. Сопоставление полученных данных проводили в относительных показателях превышения уровня хемилюминесценции опытных и контрольных проб.

Цифровые данные обрабатывали методом математической статистики с использованием коэффициента достоверности по таблице Стьюдента (А.Т.Усович, П.Т.Лебедев, 1970).

Методики экспериментов и научно-производственных опытов изложены в соответствующих разделах диссертации и автореферата.

2.2. Выделение клеток крови и определение их максимальной хемилюминесценции

На первом этапе изучения хемилюминесценции необходимо было провести оптимизацию способов выделения популяции лейкоцитов, определения их жизнеспособности и функциональной активности в зависимости от концентрации этих клеток, чистоты их субпопуляций, условий и времени хранения.

При изоляции субпопуляциий лейкоцитов сравнивали три способа-дифференциальное центрифугирование в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографина, осаждение лейкоцитов в растворе декстрана Т-500; центрифугирование с предварительным гипотоническим лизисом эритроцитов и максимальным удалением гемоглобина.

В результате установлено, что наиболее подходящим для практического применения является 3-й способ, так как он более прост, не требует дорогостоящих реактивов и в то же время позволяет повысить выход жизнеспособных лейкоцитов на 30-35% по сравнению с известными способами и предотвращает их склеивание.

В многочисленных лабораторных опытах также установлено, что число жизнеспособных лейкоцитов, необходимых для получения приемлемых результатов, должно колебаться в пределах 90-95% от их общей субпопуляции.

Выяснено, что для получения сопоставимых результатов следует имеет их концентрацию в исследуемом образце, равную 2 хЮ6 кл/мл.

Эксперименты также показали, что субпопуляция полученных лейкоцитов лучше сохраняется, если их суспендировать в стабилизирующей буферной среде, содержащей наряду с оптимальным солевым раствором питательной среды Хэнкса глюкозу и бычий сывороточный альбумин.

Определено важное значение для проявления хемилюминесценции чистоты субпопуляций лейкоцитов. Присутствие в их взвеси гемоглобина и элементарных нерастворимых микроструктур клеток негативно влияет на уровень сверхслабого свечения.

При изучении влияния температуры и времени хранения лейкоцитов на интенсивность и продолжительность их свечения установлено, что при хранении образцов крови до измерения XJI при температуре +37°С свечение клеток крови почти полностью угасает через 2 паса, а при температуре +4°С снижение интенсивности их свечения на 60 % происходит в течение 8 час. Оптимальным с момента взятия крови до исследования ХЛ является время, не превышающее 4-х час.

2.3. Хемилюминесценции иммунокомпетенгных клеток крови лабораторных животных, экспериментально зараженных М. bovis

Для сравнительного изучения ХЛ у интактных животных и животных, больных туберкулезом, первоначально было проведено заражение патогенными микобактериями морских свинок и кроликов.

Заражение лабораторных животных проводили в 5 повторностях по 2 морские свинки M.bovis шт 14 в дозе 0,01 мг в I мл растворителя, по 2 кролика - в дозе 0,5 мг в 1 мл растворителя. Контролем служили здоровые морские свинки и кролики.

При выполнении исследований на лабораторных животных основное внимание было уделено соотношению уровня свечения интактных клеток с уровнем свечения фагоцитирующих клеток после добавления зимозана; оптимизации концентрации и активности антигена для специфической индукции свечения; сопоставлению интенсивности хемилюминесценции клеток крови после взаимодействия с зимозаном и туберкулезным аншгеном.

В результате было установлено, что антигены M.bovis и М.tuberculosis проявляют оптимальную специфическую активность в разведении 1:100. При добавлении антигена в разведениях 1:50 или 1:200 мы регистрировали сравнительно низкий уровень свечения клеток крови.

В ходе исследований было выяснено, что для оценки жизнеспособно-С1и и потенциальной функциональной активности лейкоцитов целесообразно использовать дрожжевой фермент зимозан, способный индуцировать in vitro 520-кратное увеличение неспецифической хемилюминесценции клеток крови. При этом определено, что лучшие результаты дает опсонизированный зимозан, то ест ь предварительно обработанный пулом нативной сыворотки крупного рогатого скота. Если сопоставляв индуцирующую активность опсонизированно-го зимозана и туберкулезных антигенов, то следует признать, что у дрожжевого фермента она оказалась значительно выше. Эти различия связаны с потенциальным объемом поверхностных клеточных структур, участвующих в квантовом свечении.

В конечном итоге в опытах на морских свинках и кроликах было установлено, что уровень хемилюминесценции лейкоцитов у интактных и экспериментально зараженных возбудителем M.bovis, хотя и различается, но менее выражено - всего лишь в 1,9-2,7 раза, чем у лабораторных животных, зараженных М. tuberculosis (соответственно в 2,1- 4,9 раза) (табл.1).

Таблица 1 - Уровень ХЛ лейкоцитов лабораторных животных, экспериментально зараженных М.Ымз и М.шЬегсЫоБ!^, имп./сек.

Исследуемые животные Антиген M.bovis шт. 14 Антиген М. tuberculosis H37Rv

Морские свинки

Заражен. M.bovis 4532±19,6* 1800±5,7

Заражен. M.tuberculosis 1572-Ll 9,6 8712±39,7*

Контрольная группа 1623+3,7 | 1754±75,3

Кролики

Заражен. M.bovis I 1941±23,1* 716+8,8

Заражен. M.tuberculosis | 96К35,2 1440±6,0*

Контрольная группа j 1020±25,4 684±8,6

Примечание: *Р<0,001 уровень достоверно значимых различий между

подопытными и контрольными группами.

Такие различия в активности хемилюминесценции клеток крови морских свинок и кроликов связаны, по нашему мнению, либо с отличиями в вирулентности шт.14 М Bovis и H37RV М. Tuberculosis, либо, что более вероятно, с физиологическими особенностями этих видов животных.

2.4. Хемилюминесценция лейкоцитов крови телят, экспериментально

зараженных \1. bovis

В эксперименте использовали 4-х телят четырехмесячного возраста, содержащихся в условиях изолятора ОПХ ВИИИБТЖ. Три из них были заражены дробно в два дня M.bovis шт. 8 в дозе 0,15 мг/кг живой массы. Опытным телятам культура задавалась per os в болюсе из мучно! о теста. Четвертый здоровый теленок был взят в качестве контроля. Пробы крови брали из яремной вены общепринятым способом непосредственно перед заражением, в последующие 3 месяца после заражения - с интервалом в 3-4 дня.

Наблюдение за динамикой проявления аллергических реакций вели путем постановки внутрикожной туберкулиновой пробы в течение 4-х месяцев с 60-дневным интервалом. В аллергической пробе использовали ПЛД-тубер-кулин для млекопитающих производства Курской биофабрики. Реакцию учитывали через 72 часа.

Динамика развития туберкулезного процесса в организме телят по срокам исследования представлена в табл.2.

Таблица 2 - Уровень хемилюминесценции лейкоцитов телят, экспериментально зараженных М. bovis, имп./сек.

Сроки исследования

Подопытная группа

До заражения После заражения:

7-й день

18-й день

28-й день

60-й день

Контрольная группа

Уровень хемилюминесценции

30,3±4,63

111,6±7,88* 122,315^69*

204,6-t 10,52*

39,3±10,17

26, 83±2,6

Примечание: *РОДЮ1 уровень достоверно значимых различий между подопытной и контрольной группами.

заражения

По оси абсцисс время в мин.

По оси ординат - ХЛ в импульсах за 1 сек.

3 - воздействие на лейкоциты зимозаном

Аг - воздействие на лейкоциты антигеном М.Ькпчв

К -- спонтанная ХЛ лейкоцитов

Установлено, что у опытных животных на 7-й день после заражения уровень хемилюминесцентного ответа при индуцировании специфическим туберкулезным антигеном вырос в 5,1 - 6,5 раза, на 18-й день после заражения - в 5,0-5,8 раза; к 28-у дню активность стимулированных нейтрофилов и лимфоцитов достигла пика: у 1-го опытного теленка она возросла в 8,8 раза.; у 2-ого - в 7,4 раза; у 3-его - в 8,3 раза (рис.2).

Рисунок 2 - Хемилюминесценция лейкоцитов крови опытного теленка №1 на 28-й день после заражения

В последующем отмечено снижение хемилюминесценции лейкоцитов, чго свидетельствовало о снижении активности туберкулезного процесса и частичной элиминации возбудителя из организма телят (рис.3).

Рисунок 3 - Хемилюминесцснция лейкоцитов крови опытно! о теленка №1 на 60-й день после заражения

Диагностический убой зараженных животных провели на санбойне мясокомбината «Омский». При патологоанатомической экспертизе внутренних органов у экспериментальных телят в заглоточных лимфоузлах обнаружен туберкулезный лимфаденит. Биоматериал (подчелюстные, ¡аглоточные, бронхиальные. средостенные, портальные, мезентериальные лимфоузлы, кусочки легких) исследовали бактериологически от каждого животного в отдельности Диагноз на туберкулез в опытной группе телят был подтвержден выделением исходной заражающей культуры.

2.5. Хемилюминесцснция иммунокомпетентных клеток крови коров, экспериментально зараженных М. bovis, и влияние ШТД-туберкулина для млекопитающих на ее уровень

Разрабатываемый нами способ XJl-аналиэа предполагается в основном использовать на фоне применение aruiepi ической пробы. Поэтому необходимо было выяснить влияние ППД-туберкудина на уровень хемилюминесценции лейкоцитов исследуемых животных. С этой целью был проведен специальный CïïblT,

В опыт был подобрано по принципу аналогов use группы коров. В каждой группе было по 3 корезы черно-пестрой породы, с массой по 400-450 Ki. Тип кормления смешанный. Коров опытной группы заразили подкожно взвесью музейного штамма 14 М. bovis в дозе I мг/кг массы тела. Контрольных животных не заражали и содержали на ферме ОПХ ВНИИБТЖ.

Таблица 3 - Результат ы исследования ХЛ лейкоцитов у адоровых и экспериментально зараженных коров до и после тубгркулинизации (внутрикожная проба ППД-туберкулином в дозе 10 тыс.МЕ), имп./сек.

Инд.№№ и к'лнчка коров

Исследование до заражения__

Уровень ХЛ после туберкули низации

Уровень ХЛ до туберку линиза ции

Увеличе

ние кожной складки (мм)

22-й день

Исследования после заражения

Уровень ХЛ I Увели до ' чение 1уберкули- | кож низации | ной | склад ки

; (мм)

Уровень ХЛ

после туберкулини зации

60-й день

Уро вень ХЛ до тубер кулиниз ации

Увеличе

ние кожной складки (мм)

Опытная группа

Земляника1 16 0 21 220 8 224 47 5 31

8220 23 19 254 7 252 54 3 46

8218 26 0 25 179 9 198 25 2 35

М ±м 21,6±2,96 | 21.fcfcl.76 217,6±21,68* 224,6± 15,59* 42±8,73 1 37,3±4,48

Контрольная группа

8243 17 0 21 27 0 24 28 0 25

8240 23 0 19 23 и 0 25 26 0 26

8234 22 0 20 21 о 22 20 0 19

М±м 20.t5il.85 | 20±0,57 23,6±1,76 ! 23,6±0,88 24,6±2,4 1 23,3±2,1

Примечание: *Р<0,005 по сравнению с контрольной группой

Аллергические исследования коров ППД-туберкулином для млекопитающих производства Курской биофабрики провели до заражения, через 22 и 60 дней после заражения.

Влияние туберкулина на ХЛ полиморфноядерных лейкоцитов подопытных животных изучали путем сопоставления уровня их свечения у опытных (3 гол.) и контрольных (3 гол.) животных до и после туберкулинизации. Повышения числа регистрируемых импульсов в секунду не отмечалось как до введения туберкулина, так и через 72 час. после туберкулинизации.

Обобщая результаты этого опыта (табл.3), можно отметить, что введение коровам ППД-туберкулина в стандартной дозе 10 тыс. МЕ не влияет на уровень ХЛ лейкоцитов крови крупного рогатого скота.

Для изучения динамики ХЛ были подобраны 10 здоровых коров черно-пестрой породы. Пять из них заразили бактериальной массой культуры М.bovis шт. 14 по 1 мг/кг живой массы. Заражение проводили дробно 2 раза в равном количестве через день. Контролем были пять здоровых коров-аналогов. Пробы крови брали от всех животных общепринятым способом из яремной вены до заражения и после заражения - с интервалом в 3-4 дня. Основные компоненты для проведения хемилюминесцентного анализа готовили, как всегда, заранее. Туберкулезный антиген использовали в разведении 1:100. Оценку результатов хемилюминесценции клеток крови проводили по данным, записанным и обработанным ЭВМ, по максимуму свечения. Показатели теста считали достоверными, если максимум ХЛ свечения клеток крови у подопытного животного после стимуляции опсонизированным зимозаном («3») превышал контроль в 5 и более раз. Туберкулинизацию проводили по общепринятой методике дозара-жения, на 14-й день после заражения, затем - ежемесячно.

Полученные данные показали, что у двух из пяти зараженных животных (инв_№№ 3875, 3715) уже на 8-й день после заражения зарегистрировано увеличение уровня свечения лейкоцитов в 3,7-5,7 раза К 21-му дню у первой коровы (инв.№ 3875) интенсивность ХЛ превышала исходный уровень до заражения в 2,3 раза, затем к 45-му дню она несколько снизилась и до конца опыта держалась на уровне, превышающем контроль в 1,5-1,8 раза. У второй коровы (инв.№ 3715) повышенный уровень свечения лейкоцитов стал заметно снижаться с 8-ого дня (3,7 раза) и к концу 1-ого месяца (28-й день) превышал исходное состояние лишь в в 2,3 раза, а с 60-го и до конца опыта держался на уровне контроля. У коровы (инв.№ 3580) увеличение в 4,5 раза наблюдали на 8-й день после заражения, затем наступил некоторый спад, но к 29-му дню зарегистрировано повторное увеличение в 9 раз, затем до конца опыта мы наблюдали плавный спад ХЛ, который держался на уровне в 3 раза, превышающем контроль.

У коровы (инв.№ 3301) туберкулезный процесс развивался волнообразно-вначале на 8-й день зарегистрировано резкое увеличение в 10 и более раз, затем наступил некоторый спад, но в течение трех месяцев превышение свечения лейкоцитов колебалось в пределах 8,6-5,5 раза, и только к концу опыта уровень ХЛ лейкоцитов снизился до исходного уровня до заражения. Столь

резкий всплеск и длительное превышение свечения можно объяснить особенностями развития инфекционного процесса у отдельно взятого животного. У 5-ой коровы (инв. № 3940), такое же резкое увеличение наступило несколько позже - на 21-й день после заражения, затем уровень свечения лейкоцитов несколько снизился и до конца опыта (119 дней после заражения) стойко держался на уровне в 3,9-5 раз превышающем показатели здоровых животных в контрольной группе.

Важно отметить, что все опытные животные ко 2-му исследованию (через 15 дней после заражения) стали реагировать на ППД- туберкулин.

По окончании опыта зараженные животные были убиты на мясокомбинате. При патологоанатомическом исследовании установлен туберкулез с поражением подчелюстных, заглоточных и бронхиальных лимфоузлов. При бактериологическом исследовании с использованием твердых питательных сред Гельберга, Левенштейна-Йенсена, Фаст-ЗЛ из биоматериала выделена исходная заражающая культура \1.bovis.

2.6. Результаты испытания диагностической эффективности иммунохемилюминесцентного метода в производственных условиях

Изучение диагностической эффективности ИХЛ метода провели в 3-х хозяйствах Омской области с разной эпизоотической ситуацией.

Первоначально этот метод испытали в АО Конезавод «Омский» Марья-новского района. Хозяйство более 10 лет благополучно по туберкулезу. Противотуберкулезные мероприятия планируются и проводятся в соответствии с действующими ветеринарными и санитарными правилами, включающими организационно-хозяйственные, общие ветеринарно-санитарные мероприятия и специальные ветеринарно-диагностичсские мероприятия. При убое скота на мясокомбинате и последующем осмотре туш характерных дм туберкулеза изменений не обнаружено. При внутрихозяйственных контрольных убоях взрослого поголовья туберкулез также исключен.. При бактериологическом исследовании районной ветлабораторией патогенных микобактерий не выделено. Молодняк исследуется дважды в год ППД-туберкулином, реагирующих не выявлено. Но при аллергических исследованиях взрослого поголовья крупного рогатого скота и нетелей в этом хозяйстве систематически выявляются реагирующие на ПДЦ-туберкулин (в 1997г.- 112 животных, в 1999 г. - 264, в 2001 г.- 143, в 2003 г.-91).

Поэтому нами для уточнения диагноза были взяты и исследованы им-мунохемилюминесцентным методом 45 проб крови от реагирующих на ППД-туберкулин коров и нетелей. Иммунокомпетентные клетки крови выделяли и исследовали по ранее разработанной методике, включающей взятие крови с трилоном Б, затем гипотонический лизис эритроцитов с последующим центрифугированием и ресуспендированием отмытых лейкоцитов в стабилизирующем растворе. Жизнеспособность и функциональную активность выделенных лейкоцитов определяли опсонизированным зимозаном. В качестве специфиче-

ского индуктора использовали антиген из клеточных стенок М.bovis шт.8. Контролем служили пробы крови здоровых животных, не реагирующих на ППД-туберкулин.

Установлено, что увеличения свечения исследованных проб крови при взаимодействии с туберкулезным антшеном не происходило. Уровни исследуемых и контрольных проб находились в пределах 124-126 имп./сек. Для подтверждения благополучия (неблагополучия) наблюдаемого стада крупного ро-iaioro слада по туберкулезу был также проведен контрольно-диа| ностичсский убой всех 45 животных с последующим бактериологическим исследованием взятого от них биоматсриала. При патологоанагомической экспертизе лимфатических узлов и внутренних opi анов туберкулезных изменений не обнаружено. При бактериологическом исследовании культур возбудителей туберкулеза бычьего, человеческого и птичьего видов не выделено.

Но были выделены 20 культур атипичных микобактерий 3-4 групп. Из их числа 7 культур (35%) отнесены к 3-й группе нефотохромогенных микобактерий по классификации Раньона и 13 (65%) идентифицированы как 4-я группа. Выделенные атипичные микобактерии, вероятно, и послужили причиной проявления неспецифических реакций у коров и нетелей этого хозяйства.

Оставшиеся реагирующие животные (67 гол.) были повторно исследованы симультанной пробой. У 25 животных реакции на ППД-туберкулин «выпали», 42 животных npopeai ировали с преимуществом на KAM.

По согласованию с Управлением ветеринарии эти животные были допущены в общее стадо без ограничений.

Таким образом, туберкулез в АО Конезавод «Омский» был исключен и предотвращен необоснованный убой коров и нетелей, получен экономический эффект в размере более 200 тыс. руб. Результаты комплексных" исследований представлены в табл.4.

Такая же работа по контролю бла! ополучия по туберкулезу была проведена и в АО «Знамя» Марьяновского района. При аллергическом исследовании 450 коров и нетелей было выявлено 21 животное, реагирующее на ППД-туберкулин. От них были взяты пробы крови и исследованы ИХЛ методом. Превышения уровня свечения исследуемых проб в сравнении с контролем не наблюдалось. При контрольно-диагностическом убое и патологоанатомической экспертизе туберкулезных изменений в органах и тканях этих животных не обнаружено. При бактериологическом исследовании биоматериала микобактерий бычьего, человеческого и птичьего видов не выделено.

Работа по определению чувствительности ИХЛ-мет ода также проводилась в СПК "Иконниковский" I орьковского района.

В этом хозяйстве при контрольно-диагностическом убое реагирующих на ППД-туберкулин в марте 2005 г. у 3-х коров выявлены туберкулезные изменения в заглоточных и бронхиальных лимфоузлах, в связи с чем повторно были проведены аллергические исследования коров, нетелей и молодняка.

Таблица 4 - Данные комплексных исследований коров из хозяйств с разной эпизоотической ситуацией по туберкулезу

Хозяйство (АО, СПК) Эпизоот. ситуация Исслед. коров (гол.) Реагиров. на ППД-туберку лин (гол.) Убито с диаг ноет, целью Результат патолого анатомич. экспертиз Выделены культуры Исслед. коров ХЛ- методом (гол.) Уровень свечения лейкоцито висследов. коров (имп/сек.) Уровень свечения лейкоцит, к онтрольны х коров (имп/сек.)

М±ш М±т

Конезавод «Омский» Благопол. 1952 116 45 Отриц. Атипич. Микобакт 3-4 гр. по Раньону 45 126,3±1,4 130±4,05

Иконни-ковское Неблагоп. 650 55 55 Туберкул, лимфаденит и гепатит М. bovis 30 191±2,72 74,3±2,02

Примечание: * Благополучное хозяйство - Р > 0,1 по сравнению с контролем

** Неблагополучное хозяйство - Р < 0,001 по сравнению с контролем

Положительная реакция на ППД-губеркулин отмечена у 55 животных. Из них от 30 были взяты пробы крови для исследования ИХЛ-методом Кон-■ ролем служили пробы крови здоровых животных, не реагирующих на ППД-губеркулин.

В результате исследований установлено превышение уровня свечения крови у 12 (40%) из 30 животных в 1,5 - 6,9 раза по сравнению с контролем при индуцировании туберкулезным антигеном.

Затем был проведен комиссионный диагностический убой всех 55 реагирующих животных, из них у 13 (23,6%) выявлены туберкулезные изменения в заглоточных, бронхиальных, средостенных лимфоузлах. У одной коровы (инв.№ 9809) выявлен туберкулезный гепатит, соответственно увеличение в ХЛ исследуемой пробы в 6,9 раза по сравнению с контролем.

Положительный результат ИХЛ метода совпал с патологоанатомиче-скими изменениями, характерными для туберкулеза, в 8 спучаях (66, 6%), у 4-х животных (13,3%) зарегистрировано увеличение свечения без видимых пато-логоанатомических изменен!!?, в органах и тканях.

При бактерг.оло! ическом исследовании биоматериала выделены куль-¡уры M.bovis. Данные представлены в табл. 4.

Таким образом, испытание ИХЛ-метода в пгюизесдстзенных условиях показало, что этот метод обладает специфичностью и определенной чувствительностью, и может быть использован в качестве дополнительного теста дифференциальной диагностики туберкулеза.

3. ВЫВОДЫ

1. Разработан L/t и оптимизированы методики взятия. трйнспортировки, хранения проб крови и выделения лейкоцитов, предназначенных цдя хемилю-минс^центных (ХЛ) исследований в динамике инфекционных болезней животных.

2. Для получения объектизких показаний при ХЛ исследованиях кон-ценграция иммунекомпетентных клеток крови должна составлять не менее 2 млн./1 мл, их жизнеспособность V, потенциальная функциональная активность достигается контролем опсонизированным зимозаном.

3. Надежность ХЛ исследований существенно повышается за счег увеличения числа жизнеспособных лейкоцитов (до 95-96%) от всей популяции, изолируемой из крови, и использования при peí истраиии их хемилюминесцен-ции физиологически адекватного стабилизирующего раствора. На активность проявления хсмилюминесценции лейкоцитов в исследуемом субстрате ингиби-рующее влияние оказывают гемоглобин и элементы разрушенных клеток.

4. Антигенный комплекс, полученный и* клеточных оболочек M.bovis шт.8, можно использовать in vitro в качестве специфическою индуктора хеми-люмипесценции иммунокомпетентмых клеток крови крупного рогатого скота.

5 Введение ППД-туберкулина для млекопитающих крупному рогатому скоту в диагностической дозе 10 тыс. МЕ не оказывает влияния на показатели хемилюминесценции лейкоиитов

6. Уровень хемилюминесценции иммунокомпетентных клеток крови телят и коров, экспериментально зараженных М. bovis, превышает уровень хемилюминесценции клеток крови здоровых животных в 1, 5 2 и более раз

7. Иммунохемилюминесцентный метод, основанный на регистрации сверхслабого свечения иммунокомпетентных клеток крови, индуцированных антигеном из клеточных оболочек М.bovis, обладает необходимой специфичностью и рекомендуется в качестве дополнительного прижизненного метода индивидуальной и групповой дифференциальной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации «Хемилюминесцентный метод прижизненной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота». Предназначены для научных лабораторий, преподавателей и студентов ветеринарных факультетов. Методические рекомендации утверждены на заседании методической комиссии ВНИИБТЖ (протокол № 3 от 14 мая 2005 г.), подсекции «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 5 от 21 июня 2005 г.)

2. Способ выделения лейкоцитов крови для хемилюминесцентного анализа (патент РФ № 2232395 от 10.07.2004 г.)

3. Способ сохранения иммунокомпетентных клеток в стабилизирующем растворе (положительный результат формальной экспертизы ФИПС № 2004113929/13 (014817) от 05.05.2004 г.)

4. Способ прижизненной диагностики туберкулеза (положительный результат формальной экспертизы ФИПС № 2004124989/15(026935) от 16.08.2004 г.).

СПИСОК

опубликованных работ по теме диссертации

1. Использование хемилюминесцентного метода для диагностики туберкулеза в условиях эксперимента на крупном рогатом скоте / Соавт.: Л.А.Таллер / Материалы Всероссийской науч. конф. по проблемам хронических инфекций: Сб. науч. тр. ВНИИБТЖ. - Омск, 2001. С. 176-178.

2. Использование хемилюминесцентного метода для диагностики туберкулеза в условиях эксперимента на лабораторных животных / Соавт.: Л.А Таллер, Л.Т.Аппельганц / Инфекционная патология животных: Сб. науч. тр. ВНИИБТЖ. - Омск, 2001. С. 218-221.

3 Динамика возможного проявления неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота в хозяйствах, благополучных по туберкулезу / Соавт.: Г.Ошепков, Л Л. Тал л ер / Инфекционная патология животных: Сб. науч. тр. ВНИИБТЖ. - Омск, 2001С.211 -215.

4. О значении симультанной аллергической пробы при диагностических исследованиях крупного рогатого скота на туберкулез / Соавт.: В.Г.Ощепков, Л.А. Таллер, II.И. Овсянов // Эпизоотология, диагностика и профилактика хронических инфекционных болезней животных: Сб. науч. тр. (Матер, междунар. науч. конф., посвященной 175-летию аграрной науки Сибири, Омск, 24-26 июня 2003 г.) / СО РАСХН. ВНИИБТЖ. - Омск, 2003. С.153-158.

5. Способы предпосевной обработки биоматериалов для изоляции Ь-форм микобактерий / Соавт.: Е.Ю.Секин, Л.А.Таллер, В.Г.Ощепков // Матер, междунар. науч.-конф., посвященной 175-летию аграрной науки Сибири: Сб. науч. тр. ВНИИБТЖ. - Омск, 2003. С. 29-31.

6. Способ выделения лейкоцитов крови для хемилюминесцентного анализа / Соавт : В.Г. Ошепков // Патент РФ № 2232395 на изобретение. Приоритет от 10.07.2004 г.

7 Использование биохемилюминесценции в диагностике туберкулеза у крупною рогатого скота / Соавт.: В Г.Ощепков, Л.А.Таллер / Ветеринарна медицина: Межв1д. темат. наук. зб1рник. - Харюв, 2005. - Т.2. - С. 866-871.

ДЮСЕНОВА ГУЛЬЗАЙРА МУХАМЕДЖАНОВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ХЕМНЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ДЛЯ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Автореферат

Подписано к печати 15.01.2006. Формат бумаги 60x84 1/16. Печать оперативная. Гарнитура Times New Roman Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз.

Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных

Отпечатано с оригинал-макета в типографии ООО «Вариант-Омск» 644034, г. Омск, ул. Коммунистическая, 45. Тел./факс: 251-434

® - "8 77

Актуальность темы. В системе противотуберкулезных мероприятий решающая роль отводится диагностике, так как успех борьбы с этой антропозоонозной инфекцией во многом зависит от полного и своевременного выявления источников возбудителя болезни. Между тем, многолетний опыт использования традиционных методов диагностики туберкулеза выявил ряд свойственных им недостатков. Основной метод массовых аллергических исследований, туберкулиновая проба, не выявляет в стаде всех больных туберкулезом животных. Это вынуждает проводить многократные повторные исследования, что значительно затягивает сроки оздоровления неблагополучных стад (М.К.Юсковец, 1948, 1965, В.П.Урбан, 1982, 1998; Л.М. Ходун, 1985, 1987, 1988; А.С.Донченко, 1994, 2004; Н.П.Овдиенко, 1997).

В то же время туберкулиновая проба нередко проявляется неспецифически у животных в заведомо благополучных хозяйствах. При исследовании животных в благополучных по туберкулезу пунктах в случае выявления реагирующих на ППД-туберкулин животных значительная их часть подлежит диагностическому убою и последующему исследованию в условиях ветлабораторий. Для дифференциальной диагностики в этих случаях применяют громоздкую, длительную по времени и дорогостоящую схему исследований: симультанную пробу с туберкулином для птиц или КАМ, с последующим убоем и патологоанатомической экспертизой, бактериологическим и биологическим исследованиями биоматериала от убитых с диагностической целью животных (Л.М.Ходун, 1984; 1988; 1990; А.Х.Найманов, 1992; А.С.Донченко, 2000; В.Г.Ощепков, 2001, 2003).

В соответствии с действующими ветеринарными и санитарными правилами (1996 г.) при туберкулезе биоматериал от каждого убитого с диагностической целью животного высевают на твердые яичные питательные среды, заражают морских свинок и кроликов для определения видовой принадлежности выделенных культур микобактерий и их вирулентности. Кроме того, для дифференциальной диагностики в ряде случаев используют гистологические исследования и серологические реакции: связывания комплемента (Э.Д.Лакман, И.В.Шлыгин, 1976; Ю.Я.Кассич, 1979; Л.М.Ходун, 1983); диффузной преципитации в агаровом геле (РДПА), непрямой гемагглютинации (РНГА), бласттрансформации лейкоцитов (РБТЛ), торможения миграции лейкоцитов (Е.А.Суворов, 1968; Н.П.Овдиенко и др., 1980; М.В.Харитонов, 1983; Г.Г.Попова, 1985; Е.И.Буряк, 1987; А.П.Лысенко, 1987; F.Griffin,1988).

Но значительная трудоемкость, недостаточная информативность, длительность исследований (3-6 мес.), большое число животных, необходимых для диагностического убоя, являются существенными недостатками указанных методов и делают их малопригодными для массовых исследований. Несовершенство методов дифференциальной прижизненной диагностики этого заболевания приводит к тому, что ежегодно на мясокомбинаты сдаются тысячи голов крупного рогатого скота, реагирующих на ППД-туберкулин и подозреваемых в заражении, но во многих случаях не являющихся истинными больными туберкулезом, а это неизбежно увеличивает прямые и косвенные потери животноводства. Возрастают они и за счет сокращения срока эксплуатации продуктивных коров и преждевременного убоя молодняка, не достигшего товарных кондиций (А.Н.Шаров, 1982; А.С.Найманов, 1990, 1993; А.С.Донченко, Ю.А.Макаров, 1997; А.И.Кузин, 1982).

Современные достижения зарубежной и отечественной науки в области биологии и медицины открывают возможности в создании нового поколения средств и методов диагностики туберкулеза с высокой чувствительностью и специфичностью.

В этом плане перспективны биофизические и иммунохимические методы, позволяющие разработать эффективные способы прижизненной диагностики туберкулеза. Наибольшее признание получили метод иммуноферментного анализа - ИФА, общий принцип которого состоит в том, что антигены или антитела фиксируются на твердой фазе, а затем выявляются с помощью соответствующих антител или антигенов, меченых пероксидазой хрена или другим ферментом путем определения ферментной активности в субстратах смеси по уровню окрашивания фермента (Y.Morris,C.Thorm,1985; Р.А.Хамзин и др., 1985; А.А.Нуррулин, 1986; Е.Маслов с соавт., 1986; T.M.Daniel, 1987; М.В.Андросова, 1987, 1989; Л.М.Ходун, 1989; Л.М.Ходун с соавт., 1990; Н.И.Цунская с соавт., 1991; Н.П.Овдиенко с соавт., 2001; О.А.Верховский с соавт., 2001; М.Ф.Губкина с соавт., 2002); полимеразная цепная реакция - ПЦР, которая дает возможность экспрессно выявлять ДНК микобактерий туберкулеза в клиническом материале (A.J.Hance,1988; B.Boddinghaus, 1999; Kaneko S. et al., 1995; Cheong.H.I. et al.,1996; А.Н.Шаров и др., 2002; M.B Чеснокова. и др. 2001, 2003; М.А.Владимирский и др., 2003; А.Х.Найманов и др., 2004), а также биохемилюминесцентный анализ (А.И Журавлев, 1961, 1968, 1974, 1975; Э.А. Бурнштейн, 1964; А.А.Аревшатян, 1965, 1966; Н.А.Клипсон, Т.Г.Мамедов, 1965; Журавлев А.И., В.Н.Тростников, 1966; У.М.Авакян, 1967; Ю.А.Владимиров, С.Ф.Львова, З.П.Черемисина, 1966; Г.М. Баренбойм с соавт., 1966; ВА.Веселовский с соавт., 1963; Г.И. Лихштейн с соавт., 1966; Е.И Шуцкая., 1979; Н.К.Куликов, В.Ю.Куликов, 1985 и др.).

Высокая эффективность применения последнего биофизического теста в биологии и медицине, актуальность проблемы дифференциальной диагностики туберкулеза предопределили направленность наших исследований.

Цель исследований: Изучить хемилюминесценцию иммунокомпетентных клеток крови лабораторных и сельскохозяйственных животных, и ее применение для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

Задачи исследований:

1. Разработать методику выделения иммунокомпетентных клеток периферической крови для хемилюминесцентных исследований.

2. Определить уровень сверхслабого свечения (XJ1) лейкоцитов лабораторных животных, экспериментально зараженных M.bovis.

3. Определить уровень сверхслабого свечения клеток крови телят, экспериментально зараженных M.bovis.

4. Определить уровень сверхслабого свечения клеток крови коров, экспериментально зараженных M.bovis, и установить влияние ППД-туберкулина для млекопитающих на их хемилюминесценцию.

5. Испытать специфичность и чувствительность иммунохемилюминесцентного способа диагностики туберкулеза в производственных условиях.

Научная новизна полученных результатов: . Разработан способ прижизненной диагностики туберкулеза, включающий выделение полиморфноядерных лейкоцитов, сохранение их в стабилизирующем растворе, сравнительную оценку спонтанной и индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции; в качестве индуктора «дыхательного взрыва» используют опсонизированный зимозан; отличающийся тем, что в качестве специфического индуктора используют туберкулезный антиген; дезинтеграцию микобактерий проводят ультразвуком.

Получен патент РФ и две положительные формальные экспертизы ФИПС.

Теоретическая значимость и практическая ценность результатов исследований

Выявленные особенности хемилюминесценции лейкоцитов крови у интактных и зараженных M.bovis лабораторных и сельскохозяйственных животных позволяют, с одной стороны, глубже познать молекулярно-клеточные механизмы развития инфекционного процесса туберкулеза и, с другой — использовать некоторые аспекты этих механизмов в диагностике болезни.

Применение способа прижизненной диагностики туберкулеза, основанного на хемилюминесценции клеток крови, индуцированных антигеном микобактерий туберкулеза, сократит сроки дифференциальной диагностики и предупредит значительный экономический ущерб за счет необоснованной сдачи на убой здоровых животных, реагирующих на ППД-туберкулин.

Составлены методические рекомендации для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота с использованием иммунохемилюминесцентного метода (2005 г.).

Результаты научно-исследовательской работы используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии, иммунологии, эпизоотологии и инфекционных болезней сельскохозяйственных животных ИВМ ОмГАУ.

Апробация работы: Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВНИИБТЖ (1996-2004), выездных заседаниях Президиума Сибирского отделения Россельхозакадемии (1998, 2000), Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций (Омск, 2001); годичных собраниях Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (1999, 2002), на межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 175-летию аграрной науки Сибири (2003); заседании Бюро отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (2003), IV-межрегиональной научно-практической конференции по проблемам ветеринарной медицины (2005).

Материалы диссертации, выводы и практические предложения доложены, обсуждены и рекомендованы к защите на межлабораторном заседании сотрудников ВНИИБТЖ (2005).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментальные основы выделения, сохранения и использования иммунокомпетентных клеток крови лабораторных и сельскохозяйственных животных для хемилюминесцентных исследований.

2. Результаты применения хемилюминесценции иммунокомпетентных клеток крови лабораторных животных и крупного рогатого скота для прижизненной диагностики туберкулеза в экспериментальных и производственных условиях.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах компьютерного набора и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложение. Работа иллюстрирована 9 таблицами, 31 рисунком. Список литературы включает 203 источника, в т.ч. 29 иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и оптимизированы методики взятия, транспортировки, хранения проб крови и выделения лейкоцитов, предназначенных для хемилюминесцентных (ХЛ) исследований в динамике инфекционных болезней животных.

2. Для получения объективных показаний при ХЛ-исследованиях концентрация иммунокомпетентных клеток крови должна составлять не менее 2 млн./1 мл, их жизнеспособность и потенциальная функциональная активность достигается контролем воздействия опсонизированным зимозаном.

3. Надежность ХЛ-исследований существенно повышается за счет увеличения числа жизнеспособных лейкоцитов (до 95-96%) от всей популяции, изолируемой из крови, и использования при регистрации их хемилюминесценции физиологически адекватного стабилизирующего раствора. На активность проявления хемилюминесценции лейкоцитов в исследуемом субстрате ингибирующее влияние оказывают гемоглобин и элементы разрушенных клеток.

4. Антигенный комплекс, полученный из клеточных оболочек M.bovis шт. 8, можно использовать in vitro в качестве специфического индуктора хемилюминесценции иммунокомпетентных клеток крови крупного рогатого скота.

5. Введение ППД-туберкулина для млекопитающих крупному рогатому скоту в диагностической дозе 10 тыс. ME не оказывает влияния на показатели хемилюминесценции лейкоцитов.

6. Уровень хемилюминесценции иммунокомпетентных клеток крови телят и коров, экспериментально и спонтанно зараженных возбудителем туберкулеза M.bovis, превышает уровень хемилюминесценции аналогичных клеток крови здоровых животных в 1,5-2 и более раз.

7. Иммунохемилюминесцентный метод, основанный на регистрации сверхслабого свечения иммунокомпетентных клеток крови, индуцированных антигенным комплексом вирулентных микобактерий, обладает специфичностью и необходимой чувствительностью, и рекомендуется в качестве дополнительного прижизненного метода индивидуальной и групповой дифференциальной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации «Хемилюминесцентный метод прижизненной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота». Предназначены для научных лабораторий, преподавателей и студентов ветеринарных факультетов. Методические рекомендации утверждены на заседании методической комиссии ВНИИБТЖ (протокол № 3 от 14 мая 2005 г.), подсекции «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 5 от 21 июня 2005 г.).

2. Способ выделения лейкоцитов крови для хемилюминесцентного анализа (патент РФ № 2232395 от 10.07.2004 г.)

3. Способ сохранения иммунокомпетентных клеток в стабилизирующем растворе (положительный результат формальной экспертизы ФИПС № 2004113929/13 (014817) от 05.05.2004 г.)

4. Способ прижизненной диагностики туберкулеза (положительный результат формальной экспертизы ФИПС № 2004124989/15 (026935) от 16.08.2004 г.

100

1.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

Анализ отечественной и зарубежной научной литературы показывает, что при туберкулезе профилактика и организация противотуберкулезных мероприятий во многом зависят от правильной и своевременной диагностики, как прижизненной, так и послеубойной.

В настоящее время основным методом прижизненной диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных является внутрикожная туберкулиновая проба. С целью дифференциальной диагностики туберкулеза в ряде случаев используют пальпебральную, внутривенную, глазную туберкулиновые пробы, а также различные серологические и клеточные (РСК, ИФА, РБТЛ, РИМЛ и др.) реакции.

По мнению многих исследователей (В.П.Шишков, 1986; В.П.Урбан; А.С.Донченко, 2004), в настоящее время в диагностике туберкулеза существуют две основные проблемы: туберкулеза, как такового, и дифференциации неспецифических реакций на туберкулин. В связи с этим чрезвычайно важным является разработка надежных, доступных и быстрых методов прижизненной диагностики и дифференциации туберкулеза.

За последние годы зарубежные и отечественные ученые добились значительных успехов в изучении эпизоотологии и иммунологии туберкулеза. Предложены различные модификации и дополнения к аллергическому, патологоанатомическому, бактериологическому, биологическому методам диагностики болезни, разрабатываются и проходят производственные испытания ИФА и ПЦР. На этой основе постоянно совершенствуются меры профилактики и борьбы с туберкулезом.

Использование новых современных методов, основанных на изучении нуклеиновых кислот, безусловно, открыло новое направление в микробиологии, однако их применение пока ограничено недостатком специфических зондов, праймеров, ферментов, других реактивов и приборов.

При всем многообразии предложенных методов остается открытым вопрос прижизненной диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных.

Одним из подходов к решению данного вопроса может стать хемилюминесцентный анализ иммунокомпетентных клеток крови. Исследованиями, проведенными во ВНИИБТЖ, показано, что разработанная методика постановки и учета хемилюминесценции иммунокомпетентных клеток крови лабораторных животных и крупного рогатого скота, индуцированных специфическим туберкулезным антигеном, позволяет оценить специфическую активность полиморфоноядерных лейкоцитов и дать оценку инфекционного статуса исследованных животных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Данная работа выполнена в лаборатории диагностики и микробиологии туберкулеза животных и лаборатории клеточной биотехнологии ГНУ ВНИИБТЖ СО РАСХН.

При проведении экспериментов были использованы 15 морских свинок, 15 кроликов, 4 теленка четырехмесячного возраста, 16 коров. При испытании диагностической эффективности хемилюминесцентного метода в производственных условиях были обследованы 96 коров, в т.ч. 66 коров из благополучных по туберкулезу хозяйств и 30 - из неблагополучных по туберкулезу хозяйств.

Для аллергических реакций использовали ППД-туберкулин для млекопитающих производства Курской биофабрики: серия 56, контроль 56, срок годности до 9.10.1995 г.; серия 23, контроль 23, срок годности до 5.08.1997 г.; серия 17, контроль 17, срок годности до 30.10. 2002 г.; серия 1, контроль 1, срок годности до 23.01.2006 г.

Для определения хемилюминесценции (ХЛ) клеток крови лабораторных животных, телят и коров использовали люминометр серии CL3604, выполненный в виде единого конструктива и работающий под управлением ПЭВМ типа IBM XT/AT.

Люминометр предназначен для исследования кинетики хемилюминесценции биологически активных объектов. Допускает параллельное измерение до 36 образцов, загружаемых в термостатируемый юоветный барабан, имеет систему термостатирования в заданном диапазоне, систему промывки магистралей, сервисное программное обеспечение (программное обеспечение рассчитано на работу с EGAYVGA мониторами).

Электропитание монитора осуществляется от однофазной сети переменного тока напряжением 220 В с частотой 50 (+1/- 1) Гц с заземлением. Охлаждение термостатируемого барабана осуществляется водой, а ФЭУ - с помощью полупроводникового микроохладителя типа ТЭМО - 4, с отводом тепла из зоны нагрева проточной водой от вакуумного насоса. Возможна подача воды из буферной емкости водяного столба не более 1,5 м. Прибор нельзя подключать к водопроводной магистрали напрямую во избежание обрыва трубопроводов внутри прибора из-за большого напора и возможных пульсаций питающей сети.

Блок управления прибором собран на отдельной плате и включает в себя функциональные узлы.

Программное обеспечение. Дискета с программным управлением идет в комплекте с прибором. В первую ячейку кюветного барабана устанавливается кювета с эталоном яркости.

Разработка твердотельных радиолюминесцентных эталонов яркости ЭЯ-1 и подобных ему аналогов, а также современных фотонносчетных устройств позволяет подойти к фотометрии хемилюминесцентного излучения на единой метрологической основе. Эталон яркости ЭЯ - 1 представляет собой радиолюминесцентный источник на основе светосостава постоянного действия и возбудителя - изотопа С14. Диапазон интенсивности излучения: 1x1015 - 3x1010 квантов за секунду с 1 см2, спектр излучения: 400 - 600 нм. Величина погрешности относительных изменений интенсивности светового потока составляет 2-10 % в зависимости от номинального значения интенсивности эталона. Наличие ФЭУ и эталонов яркости со спектральной характеристикой, близкой к спектру хемилюминесценции биологических сред, в сочетании с одноэлектронным режимом ФЭУ, термостабилизацией ФЭУ и проб, а также компенсацией фона ставит измерение хемилюминесценции на объективную метрологическую основу, обеспечивая контроль стабильности аппаратуры и воспроизводимость результатов измерений.

Следует отметить, что аналогичный хемилюминесцентный эталон яркости ЭЯ - 1 был использован биологами и медиками при количественной оценке ряда хемилюминесцентных реакций («АТФ-люциферин-люцифераза» и «люцегинин-перекись водорода-каталаза») (И.М. Карнаух, Е.П Сидорик, М.И. Данко, Е.В. Гордиенко, Е.А. Баглей, И.Ф. Пельтек, 1976).

Благодаря нормированию одноэлектронных характеристик ФЭУ типа «Квантакон» (таких как плотность темновой эмиссии в одноэлектронном пике, одноэлектронное разрешение и коэффициент усиления первого динода), а также разработке средств метрологического обеспечения измерений сверхслабых потоков излучения появилась возможность перехода от качественных сравнительных оценок уровня свечения биологических объектов к количественным измерениям свечения в единицах квант в секунду на единицу объема или поверхности светящегося биологического объекта.

Удобство и даже в некотором смысле неизбежность применения единицы квант в секунду связаны с тем, что в заданном объеме реагента биохемилюминесцентные реакции излучают макроскопически однородно. Это излучение имеет характер некоррелированных явлений, при которых с поверхности источника излучаются отдельные кванты света, моменты вылета которых между собой не связаны, поскольку каждая молекула реагирует независимо от других подобных ей молекул. Таким образом, явление биохемилюминесцентного излучения в целом есть результат несвязанных между собой световых реакций отдельных молекул при отсутствии какого-либо управляющего механизма в этих реакциях (И.Х.Костюченко и др., 1978; И.М.Карнаух, Б.В.Урысан, 1983).

Программное меню состоит из 10 полей, включающего поле 1 -помощь, подсказка. При работе с меню в это поле выводится краткая информация о функциональных возможностях нажатой (выделенной) клавиши меню: поле 2 - свободная память, содержит информацию о величине свободной памяти (справочная информация для пользователя): поле 3 - меню пользователя, позволяет реализовать различные режимы работы с программой, включая последующую обработку полученной информации: поле 4 - графическая информация, в это поле выводится вся графическая информация и комментарии: поле 5 - индексация графиков, это поле выполнено в виде кнопок и разделено на 36 частей, по числу кювет на барабане. Каждая кнопка имеет двойное обозначение, справа - номер кюветы, совпадающий с номером кривой на графике в поле 4, слева - код клавиши, которую надо нажать, для того, чтобы включить или выключить выбранную кривую на графике в поле 4. Выбор числа кювет задается через главное меню: поле 6 - информация о программе для внешних дозаторов, в это поле выводится информация о номере работающего дозатора и объеме дозы вводимого реагента: поле 7 — информация о юоветном барабане, в этом поле схематично изображен кюветный барабан. Цветовой маркировкой выделены загруженные кюветы, номер измеряемой кюветы указан в центре барабана. При проведении эксперимента в этом поле можно наблюдать в динамике расположение кювет относительно датчика начала отсчета: поле 8 - температура в термостате, в это поле выводится информация о заданной температуре, если происходит нагрев термостата, то маркер перемещается вправо от центра в красную зону, если охлаждение, то маркер уходит влево от центра в зеленую зону. Процесс достижения заданной температуры считается законченным, если маркер достаточно стабильно находится в центре шкалы: поле 9 — время эксперимента, в это поле выводится информация о длительности эксперимента в минутах. Выбор режима начала эксперимента производится после достижения режима стабилизации заданной температуры термостата, при закрытой крышке кюветного барабана. Запрещается открывать крышку, менять пробы во время эксперимента, т.к. это ведет к потере работоспособности прибора. Можно уменьшить время эксперимента при условии, что новое время превышает время, прошедшее с момента начала эксперимента: поле 10 - текущее значение сигнала. В это поле выводится информация о текущем значении сигнала на хемилюминесцентной кривой для кюветы, которая в данный момент находится в зоне измерения.

Во время эксперимента можно включать (выключать) изображение любой кривой в поле 4 (графическое информация), изменять масштаб в поле 4 (графическая информация): вернуться в режим «Авто» (автомасштаб).

Конец эксперимента - возврат в основное меню, при этом сохраняется вся информация о режиме работы в файле «CL 3604, ini».

Режим «Данные» предназначен для обработки данных эксперимента: меню обработки графической информации: считывание данных из ранее записанного файла: фильтрация выбросов, по различным критериям обработки данных, на выбранных для обработки кривых: отмена режима «Фильтр» и переход к исходному значению выбранных кривых.

При выполнении данной работы мы придерживались следующих основных требований:

1. Исследовать изменения XJI крови в процессе развития туберкулезного процесса в организме животного.

2. Результаты измерений ХЛ крови должны иметь численные значения их собственного свечения в относительных единицах.

3.Чувствительность установки должна проверяться по стандартному эталону яркости ЭЯ - 1.

4. Относительная погрешность определения ХЛ - не более 30%.

5. До внесения раствора люминола все манипуляции проводить при Т не выше +4°С.

6. Результаты измерений ХЛ биосред здоровых и больных туберкулезом животных должны оцениваться по общепринятым статистическим критериям достоверности.

7. В реакции не используют биологически опасные компоненты.

8. Использовать реактивы марки «хч».

Для проведения хемилюминесцентных исследований проводили работу по подготовке посуды и взятию крови, готовили компоненты реакции.

Кровь у крупного рогатого скота для ХЛ-анализа брали общепринятым методом из яремной вены с трилоном Б в силиконизированные пробирки. Соотношение консерванта и крови 1:9. Антигенный комплекс, использованный при постановке хемилюминесценции, получен из M.bovis шт.8 и M.tuberculosis H37Rv по методике Л.М.Ходуна и Н.И.Цунской (1989). Бактериальную массу 2-месячной культуры, выращенную на синтетической среде ВКЛ, осаждали центрифугированием и промывали дистиллированной водой. Суспензию бактериальных клеток бакмассы подвергали ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1, фракции отделяли центрифугированием, осадок ресуспендировали и вновь воздействовали УЗДН-1. Осадок отделяли центрифугированием, а из надосадочной жидкости осаждали протеиновую фракцию. Осадок растворяли в минимальном количестве 0,5%-го раствора фенола и доводили концентрацию белка до 0,60,7 мг/мл. Активность и специфичность полученного антигена проверяли в реакции непрямой гемагглютинации с нормальной сывороткой здорового кролика, положительной туберкулезной ' сывороткой от кролика, гипериммунизированного убитой культурой микобактерий туберкулеза, и с положительной бруцеллезной сывороткой. Антиген испытывали с разведения 1:10, сыворотки - в возрастающих разведениях с 1:5. Антиген считался пригодным, если с положительной туберкулезной сывороткой РНГА была положительной, а с нормальной и положительной бруцеллезной сывороткой - отрицательной.

Ориентируясь на результаты титрации полученного антигена и в РСК, мы предположительно выбрали для индукции ХЛ клеток крови разведения 1:50, 1:100, 1:200.

РОССИЙСКАЯ лл ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА

Результаты индукции антигеном XJI у клеток крови представлены в таблице 1.