Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Получение моноклоиальных антител и разработка на их основе средств и методов дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней

\ I и -

1 з да

/ДК 619:616.988.7:578.833.21-085.371

На правах рукописи

Аспирант Стрижакова Ольга Михайловна

Получение моноклональных антител и разработка на их основе средств и методов дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени * кандидата ветеринарных наук

Покров - 1996 г

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологиии и Киевском Институте ветеринарной медицины

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: ^

Заведующий лабораторией "Молекулярной биологии и генетики вирусов" КИВМ, кандидат ветеринарных наук КРАСНОБАЕВ Е.А.

Член-корреспондент РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор ВИШНЯКОВ И.Ф.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: -

доктор ветеринарных наук МИЩЕНКО В.А. (ВИЗЖ).

< '

кандидат биологических наук ЩЕТНИКОВА Л.А. (ВНИИВВиМ).

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский I \ технологический институт биологической промышленности.

^ Защита состоится С 1996 г. в ^"^часов на заседанш

специализированного совета Д-120.61.01 во Всероссийском научнс исследова-тельском институте ветеринарной вирусологии и микробиолс .. гиии по адресу 601120, г. Покров Владимирской области, ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан ^^ 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

/ФЕДОРОВ Г.П./

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Возбудитель трансмиссивного гастроэнтери-. свиней (ТГС) вызывает высоко контагиозное заболевание свиней всех >зрастов, однако наиболее восприимчивыми являются поросята до 2-х ¡дельного возраста. Заболевание характеризуется рвотой, изнуряющей шрееи и дегидратацией организма. Уровень летальности среди поросят 1 10 суточного возраста может достигать 100% (Matishec et al., 1982). Бо-:знь регистрируют во многих странах мира, в первую очередь в странах с itchciibho развитым свиноводством - США, Канаде, Японии. Болезнь шосит большой экономический ущерб в связи с отсутствием эффектных средств профилактики. Данные статистики показывают, что в ША ущерб, причиняемый вирусом ТГС, превосходит убытки от всех, лесте взятых инфекционных болезней свиней. Особую угрозу инфекция эсдставляет для крупных животноводческих комплексов, где на относи-:лыю небольших площадях сконцентрировано большое количество вос-риимчивых животных (Pensaert, 1984).

Вирус ТГС входит в состав рода Coronavirus семейства Coronaviridae. роме него в этот род входят антигенно родственные вирус эпнзооти-гской диарреи свиней и гемагглютинирующий коронавирус свиней. Био-эгпя этих возбудителей изучена достаточно хорошо. В последние годы в зиноводческих хозяйствах некоторых стран Западной Европы обнаружи-[I необычное явление - в отсутствие специфической вакцинопрофилактики без клинического проявления ТГС резко возросло количество серопози-[щного поголовья (Callebaut, 1988). Двумя независимыми группами иссле-ователей, из респираторного тракта здоровых свиней, был выделен ранее еизвестный коронавирус, с такими характерными свойствами, как пнев-оропность, авирулентность для естественного хозяина и тесное антигенов родство с вирусом ТГС. Выделенный возбудитель получил название еспнраторный коронавирус свиней (РКС или РКВС). Проникновение казанного вируса в популяцию свиней, по-видимому, способствовало

формированию иммунного фона, достаточной напряженности (Broun et al, 1988; Pensaert et al., 1979). В связи с обнаружением новой нозоединицы возникла необходимость разработки средств и методов лабораторной диагностики, которые позволили бы обнаруживать и дифференцировать указанные коронавпрусы.

Для лабораторной диагностики ТГС в настоящее время разработан-ны следующие методы: биопроба на поросятах, выделение вируса на культуре клеток, метод флюоресцирующих антител (МФА), реакция диффузионной преципитации (РДП), реакция нейтрализации и твердофазный им-мунофсрментный анализ на основе поликлональных сывороточных антител для обнаружения антигенов возбудителя; а также реакция нейтрализации на культуре клеток (РН) и непрямой МФА для обнаружения антител к антигенам возбудителя в сыворотке крови иммунных животных. В виду чрезвычайно тесного антигенного родства возбудителей ТГС и РКВС (Correa at al., 1990; Pensaert at al., 1989) ни один из вышеперечисленных методов не позволяет дифференцировать антигены этих двух возбудителей между собой и дифференцировать иммунный ответ при инфицировании животных вирусом ТГС от иммунного ответа при инфицировании РКВС, т.е. ретроспективно дифференцировать ТГС от респираторной коронави-русной инфекции свиней.

Представляется целесообразным проведение работы по получению МА к консервативным и вариабельным участкам антигенов вируса ТГС для разработки на их основе средств и методов дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной корона-вирусной инфекции свиней.

Цель работы. Получение линий гибридных клеток, стабильно секретирующих МА, обладающие специфичностью к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, и совершенствование на их основе средств и методов дифференциальной диагностики

трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

Задачи исследования 1. Получить моноклональные антитела к некоторым консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, для чего разработать схему получения таких моноклональных антител, включающую:

- изучение эффективности различных схем иммунизации мышей - доноров иммунных спленонитов;

- адаптацию некоторых методов лабораторной диагностики для скрининга моноклональных антител нужной специфичности;

- стандартизацию моноклональных иммунореагентов.

2. Экспериментально определить, какие методы лабораторной диагностики позволяют использовать и максимально эффективно реализовать

I

свойства моноклональных антител для обнаружения и дифференцирования антигенов вируса трансмиссивного гастроэнтерита и респираторного ко-ронавируса свиней, а также, для обнаружения и дифференцирования антител, специфичных к указанным возбудителям в сыворотках крови инфицированных животных.

3. Определить пригодность разработанных методов для дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

Научная новизна Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:

- получены девятнадцать клонов гибридных клеток, секретирующие МА к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС и консервативным антигенным детерминантам РКВС;

установлено, что антигенные детерминанты нуклеопротеина (молекулярная масса 47 кД) вируса ТГС, распознаваемые моноклональ-ными антителами клонов ТЮ4.2 и Т404.1, а также антигенные детерминанты пепломерного гликопротеина (молекулярная масса 200 кД) вируса

ТГС, распознаваемые моноклональными антителами клонов ТЗА6.2 и Т1С12.2, присутствуют на соответствующих белках всех изученных референтных и вакцинных штаммов вируса ТГС и его полевых изолятов. Антигенные детерминанты, распознаваемые перечисленными моноклональными антителами, присутствуют также на соответствующих белках респираторного коронавируса свиней. Таким образом, указанные моноклональ-ные антитела пригодны для обнаружения консервативных антигеных детерминант вируса ТГС и РКВС, а также обнаружения антител, специфичных к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС;

- установлено, что антигенные детерминанты, расположенные на пепломерном гликопротенне 8 (молекулярная масса 200 кД) вируса ТГС, распознаваемые моноклональными антителами клона Т4В11.1 присутствуют на соответствующем белке у всех изученных референтных и вак-

í

цинных штаммов и полевых изолятов вируса ТГС. На пепломерном гликопротенне респираторного коронавируса свиней антигенные детерминанты, распознаваемые указанными моноклональными антителами, отсутствуют;

- прямой вариант ГХ ИФА, прямой вариант МФА и сэндвич вариант ТФ ИФА, разработанные на основе моноклональных антител клонов ТЮ4.1 и Т1С12.2 позволяют обнаруживать консервативные антигены вируса ТГС и РКВС;

- прямой вариант ГХ ИФА, прямой вариант МФА и сэндвич вариант ТФ ИФА, разработанные на основе моноклональных антител клона Т4В11.1 позволяют обнаружить вариабельные антигенные детерминанты вируса ТГС и дифференцировать их от антигенов РКВС;

- метод ингибирования ТФ ИФА, разработанный на основе моноклональных антител клонов ТЮ4.2, Т1С12.2 и Т404.1, позволяет обнаружить в сыворотке крови свиней антитела к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС и РКВС;

- метод ингибирования ТФ ИФА, разработанный на основе моно-клональных антител клонов Т4В11.1, позволяет обнаружить в сыворотке крови свиней антитела к вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, которые отсутствуют у РКВС и пригоден для ретроспективной дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

Практическая значимость На основании экспериментальных исследований разработаны и рекомендованы для включения в схему дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней чувствительные, специфичные, производительные и экспрессные методы ТФ ИФА, ГХ ИФА и МФА на основе моноклональных антител. Разработанные методы позволяют выявлять консервативные антигенные детерминанты вируса транс-

I

миссивного гастроэнтерита свиней и респираторного коронавируса свиней, а также вариабельные антигенные детерминанты вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, что позволяет дифференцировать вирус ТГС от РКВС в вируссодержащих культуральных материалах, пробах органов и содержимого кишечника инфицированных животных. При ретроспективной дифференциальной диагностике трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней данные методы позволяют обнаружить антитела, специфичные к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС и РКВС, и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС в сыворотках крови инфицированных животных, что позволяет дифференцировать иммунный ответ при инфицировании животных вирусом ТГС от иммунного ответа при инфицировании животных РКВС.

Разработана нормативно-техническая документация на "Набор препаратов для дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней гистохимическим иммуноферментным анализом на основе моноклональных анти-

тел" и "Набор препаратов для диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител". (Временные инструкции по изготовлению и контролю, Технические условия, Наставления по применению "Наборов..." и Методические указания по постановке ТФ и ГХ ИФА), утвержденные директором ВНИИВВиМ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях ВНИИВВиМ (г. Покров 1993, 1994 гг), научно-практической конференции УНИИКЭВМ (г. Харьков 1995 г) и на заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ (г Покров, 1993-1995гг).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Основные положения диссертационной работы.выдвигаемые на защиту:

1. Результаты экспериментов по определению оптимальных условий получения моноклональных антител к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС.

2. Результаты исследований по разработке на основе полученных моноклональных антител вариантов ТФ ИФА, МФА и ГХ ИФА для дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

3. Результаты апробации методов ТФ ИФА и ГХ ИФА, разработанных на основе полученных моноклональных антител, на практике.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы ( 133 источника, в том числе 19 отечественных). Работа иллюстрирована 16 таблицами, 5 доаграмми, 5 фотографиями и дополнена приложениями.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы.

Вирусы и антигены: В качестве специфических антигенов для ТФ 1ФА использовали лизаты клеточных культур, инфицированных штам-юм "Д-52", вакцинным штаммом "1лпс111о1т", вакцинным штаммом №462 ируса ТГС; штаммом "ЛУК" респираторного коронавируса свиней. Ис-ользовали также препараты, приготовленные из органов и содержимого ишечника поросят 1-5 дневного возраста, зараженных вирусом ТГС.

Для контроля специфичности разработанных методов служили анти-ены, приготовленные из незаражённых культур клеток, а также антигены етерологичных вирусов: классической чумы свиней (КЧС), репродуктив-о-респираторного синдрома свиней (РРСС), ротавируса свиней, болезни ешена, болезни Ауески. Для контроля специфичности ГХ ИФА и МФА спользовали инфекционные материалы вышеперечисленных возбудите-ей, адаптированных к росту на монослойных перевиваемых культурах

леток почки сибирского горного козерога, линия ПСГК-60, монослойный

/ \ >

рофоварнант; почки поросенка ^(РК-15); тестикулов поросенка (ПТП);

!

очки эмбриона свиньи (СПЭВ) или Макрофагах легких.

/ \

Животные. Для клинического /воспроизведения трансмиссивного астроэнтерита свиней и получения вируссодержащего материала в экспе-иментах были использованы клинически здоровые поросята в возрасте 1-суток. Для получения специфических и нормальных сывороток крови ис-

ользовали клинически здоровых свиней в возрасте 2-6 месяцев; кроликов

{

возрасте до 1 года. В качестве доноров иммунных лимфоцитов для поучения гибридных клеток и асцитических жидкостей, содержащих моно-

1

лональные антитела, использовали клинически здоровых мышеи линии АЬВ/с 3-4 недельного возраста массой 10-15 г; и взрослых рожавших са-ок мышей линии ВАЬВ/с массой 25-30 г, соответственно. Для получения еритонеальных макрофагов использовали мышей белых нелинейных, ассой 20-30 г. Животных получали из научно-экспериментальной базы

лабораторных животных, питомников "Светлые горы" и "Столбовая' АМН СССР, а также из хозяйств Владимирской области. До начала экс перимента животных выдерживали под наблюдением в течение 10-14 дней Кормление осуществляли в соответствии с рационами.

Культуры клеток. Для выделения, культивирования и титроваши вируса ТГС использовали двухсуточные культуры клеток: ПТП, СПЭВ ПСГК, PK-15. Культуры клеток получали в лаборатории "Биологии i культивирования вирусов" и в лаборатории "Культуры клеток с музе ем клеточных штаммов" ВНПИВВиМ. В качестве партнера для слияшн при получении гибридом использовали дефектную по гипоксантин гуаннп-фосфорибозил трансферазе миеломиую линию клеток Sp 2/û-At 14.1 (Sp 2/0), полученную из Н1ШБТ МЗ СССР.

Получение гибридом, наработка и изучее свойств MA. Для получения гибридом мышеи линии BALB/c - доноров спленоцитов иммунизировали препаратами полуочищенного вируса ТГС штамм "Д-52". Введения антигена осуществляли подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно и внутриселезёночно в определенные сроки с использованием полного и неполного адьюванта Фрейнда и без адыовантов, сочетя сроки и способы введения по различным схемам. Слияние клеток проводили по методу Kohler & Milstein (1975), используя в качестве партнеров для слияния миеломную линию клеток SP 2/0 Agl4 и B-лимфоциты селезенки мыши, иммунной к вирусу ТГС штамм ;"Д-52". Гибридизацию проводили при соотношении спленоцитов с миеломными клетками 5:! в присутствии 40%-ного раствора ПЭГ-4000. Гибридные клетки культивировали в селективной среде ГАТ в течение 21 суток, затем переводили на ростовую среду ДМЕМ с 15% ФС, 2 мМ глутамина; 1 мМ пирувата натрия, 1 г/л глюкозы, 1 мг/л амфотерицина, 50 мг/л гентамицина. Исследование культуральных жидкостей гибридных клонов (скрининг) на присутствие антител к вирус-специфическим антигенам проводили через 7-10 дней после начала клоно-образования три раза с трехдневными интервалами. Скрининг проводили

непрямым вариантом ТФ ИФА, вариантом ингибирования ТФ ИФА, экспресс-микровариантом РН. Клонирование гибридных клеток проводили в полужидком агаре (Gooding et а)., 1980).

Получение препаративных количеств МА в виде асцитических препаратов проводили по стандартной методике. Конъюгирование монокло-нальных антител с пероксидазой хрена проводили по методу периодат-ного окисления (Tjissen, 1985). Изотип секретируемых гибридомными клонами моноклональпых антител определяли методом ТФ ИФА с использованием набора "Calbiochem Hybridoma Sub-lsotyping Kit Mouse" в соответствии с рекомендациями поставщика.

Полппептидную специфичность МА определяли методом иммуноблот-тинга. Иммуноэлектроосмофорез проводили как описано Miyake et all (1980).

«

Результаты исследований

Получение гибридом При иммунизации мышей-доноров лимфоци-

г

тов для получения моноклональных антител к вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, расположенным на гликопротеине Е2 (S), бы-

I

ло необходимо вызвать максимальный антительный иммунный ответ на этот белок. При изучении в реакции нейтрализации иммунного ответа мышеи-доноров лимфоцитов на гликопротеин вируса ТГС оказалось, что важную роль играет способ введения антигена. В ходе отработки различных схем иммунизации наивысшие титры вируснейтрализующих антител выявляли в сыворотках крови мышей после четырехкратного введения антигена. Мы обнаружили, что если после введения бустер-дозы антигена внутривенно титр антител в реакции нейтрализации увеличивается вдвое, Kaii и в непрямом ТФ ИФА и МФА, то введение бустер-дозы антигена внутрь селезенки вызывало увеличение титра нейтрализующих антител в 10 раз при увеличении титра антител в непрямом ТФ ИФА и МФА только вдвое. Учитывая то, что основные антигенные детерминанты, обусловливающие нейтрализацию вируса ТГС, расположены на поверхностном по-

и

липептиде 5, можно сделать вывод, что последняя схема иммунизации является оптимальной при необходимости получения максимального иммунного ответа на антигенные детерминанты наружного пспломерного гликопротеина Е2 (8) вируса ТГС. Этот факт имеет важное значение при получении МА на такие эпнтопы вируса ТГС, которые отсутствуют на 5 протеине респираторного коронавируса свиней.

Результаты скрининга МА. Для скрининга гибридом, секрети-рующих МА нужной специфичности, адаптировали некоторые методы лабораторной диагностики. Эти методы позволили, во-первых, обнаружить в малых обьемах (100-200 мкл) культуральной жидкости минимальные количества МА, обладающие специфичностью к антигенным детерминантам вируса ТГС, имеющим дифференциально-диагностическое значение, н во-вторых, при первичном скрининге отобрать клоны гибридом, секрети-рующие МА пригодные для применения в диагностике заболевания темп методами, которые в перспективе должны быть разработанны на основе полученных антител.

Непрямым методом ТФ ИФА выявили 19 клонов гибридных клеток, которые секретировали МА, реагирующие с антигенами штамма Д-52 вируса ТГС и не реагировали с антигеном незараженной культуры клеток используемой для наработки вируса. Процент специфического клонооб-разования, в данном случае, составил 62%. Вторичная проверка этих девятнадцати клонов, обладающих вирусспецифнческой секрецией, показала, что восемнадцать из них секретировали МА, реагирующие в непрямом ТФ ИФА с антигенами штамма Д-52 вируса ТГС, вакцинного штамма "1лпс1Ьо1т" вируса ТГС, штамма "ЛУК" респираторного коронавнрусг свиней, т.е. обладающие специфичностью к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС. Гибридомы одного клона продуцировали МА, которые реагировали с антигенами всех вышеперечисленных штаммов вируса ТГС и не реагировали с антигенами респираторного корона-

пруса свиней штамм "ЛУК", т.е. обладали специфичностью к варпабель-ой антигенной детерминанте вируса ТГС.

При скрининге вируснейтрализующих МА микровариантом экс-ресс-метода РН обнаружили восемь клопов гибридом, секретирующих 1А, способные нейтрализовать инфекционную активность вируса ТГС :тамма Д-52 для культуры клеток ПТП. Скрининг МА непрямым вариан-ом МФА обнаружил четырнадцать клонов гибридом, секретирующих 4А, проявляющие активность в данном методе. Непрямым методом цитирования ТФ ИФА обнаружили восемь клонов гибридом, которые сек-етировали МА, способные конкурировать со специфическими к антиге-ам вируса ТГС антителами сыворотки крови свиней за связывание с ан-игенами вируса ТГС.

Клетки гибридом, секретирующие МА нужной специфичности, кло-ировали в полужидком агаре. Результаты клонирования считали удовлет-орительными, если после клонирования 90-100% клонов сохраняли специфическую секрецию МА, которые давали положительную реакцию в оответствующем методе скрининга. В большинстве случаев было доста-очно двух клонирований. Клонированные клетки гибридом наращи-али до концентрации 100 тыс клеток в мл для закладки на хранение и для ведения мышам с целью получения асцитических жидкостей.

Препаративные количества МА получали из асцитических жидкостей [ышей. Для этого взрослым рожавшим самкам мышей линии ВАЬВ/с вво-или внутрибрюшинно по 0,5 мл НАФ, и через 3-7 суток вводили внутри-рюшинно по 1-2 млн гибридных клеток в 2 мл бессывороточной среды [МЭМ. Максимальное количество накопления асцитической жидкости аблюдали на 7-14 сутки. Асциты отбирали в количестве 3-10 мл от одного :ивотного. МА из асцитов выделяли стандартным методом. Определяли онцентрацию белка и активность выделенных ^ в РДП, РН, непрямом арианте ТФ ИФА, непрямом МФА.

Результаты изучения свойств МА. Для определения МА, конкурирующих за связывание с одной и тон же антигенной детермииантой вируса ТГС, использовали метод ннгнбнрования ТФ ИФА. Каждый вид МА проверили на способность конкурировать с остальными восемнадцатью видами МА за связывание с определенными эпитопамн вируса ТГС штамм Д-52.

Все МА объединили в восемь групп по способности конкурировать за связывание с антигенными детерминантами вируса ТГС. В дальнейшей работе использовали восемь видов МА - по одному из каждой группы (в таб. I шифры этих МА выделены курсивом).

Таблица !

Полипептидная специфичность МА, конкурирующих за связывание с антигенными детерминантами вируса ТГС штамм Д-52.

п=3

Группа клонов гибридом Полипептидная специфичность МА

T4EI2.1-, T2D7.1. Е2 (S)

T4Bll.l\ Т2В10.1; Т4А9.1. Е2 (S)

' ч ТЗЛ6.1-, ТЗН11.1; Т1С8.3. Е2 (S)

' T1G4.2; Т5Н9.1; Т5С11.1. N

"-77С/22; T1 Fl2.1. Е2 (S)

T4D4.1\ T1G8.2; ТЗВ9.1. N

TiC ] 1.1. не установлена

ТЗЕ5.1', T1D9.1. не установлена

Выбор МА определялся максимальной их удельной активностью в непрямом варианте ТФ ИФА и изотипом антител. Предпочтение было отдано антителам с изотипом IgG2 в связи с относительной простотой очистки таких МА и большей их пригодностью для конъюгировання с пе-роксидазой хрена.;

Полипептидную специфичность МА определяли в иммуноблоттннге. Электрофорез в ДСН-ПААГ в восстанавливающей системе проводили в вертикальных пластинах (120x95x1 мм) в 10% ПААГ, по методу Laemmli. Использовали по одному виду МА из каждой группы (в таб. 1

шифры этих MA выделены курсивом). Определили, что два вида МА связывались с антигенными детерминантами, расположенными на нуклеопро-тепне N вируса ТГС штамма Д-52. Четыре вида МА связывались с антигенными детерминантами, расположенными на пепло.мерном глпкопро-теине Е2 вируса ТГС штамма Д-52. МА двух клонов не реагировали с антигенами вируса ТГС в иммуноблотпнге. Предположили, что эти МА специфичны к конформационно-зависнмым антигенным детерминантам, которые разрушаются в процессе подготовки антигенов для электрофорети-ческого фракционирования (антигены подвергали кипячению и воздействию доденилсульфата натрия.

Для определения прецнпитируюшей активности МА в иммуноэлек-фоосмофорезе (ИЭОФ) и реакции диффузионной преципитации (РДП) использовали культуральный антиген вируса ТГС штамм Д-52. ИЭОФ проводили, как описано Miyake et all. РДП проводили как описано Pearson et. al. Обнаружили, что МА клона T1G4.2 реагируют с антигенами вируса ТГС и РКВС в титрах: в ИЭОФ 1:40 и в РДП 1:20. Сопоставив полученные результаты с данным]! по определению полипептидной специфичности МА, установили, что антигенные детерминанты вируса ТГС, проявляющие активность в реакции диффузионной преципитации (РДП) и иммуноэлектроосмофорезе (ИЭОФ), расположены на нуклеопрошше вируса ТГС. По-видимому, именно эти антигенные участки определяют перекрестное реагирование вируса ТГС и РКВС в РДП.

При изучении нейтрализующих свойств полученных МА установили, что такими свойствами обладают МА, специфичные к антигенным детерминантам, расположенным на пепломерном гликопротепне Е2 вируса ТГС ¡1 РКВС. Интересно, что МА клона Т4В11.1, специфичные к антигенным детерминантам белка Е2 вируса ТГС, которые отсутствуют на соответ-:твующем белке РКВС, не обладают вируснейтрализующей активностью. Эти данные подтверждают вывод Callebaut и соавт. о невозможности дифференцирования вируса ТГС и РКВС в реакции нейтрализации.

Разработка методов лабораторной дифференциальной диагностики ТГС и респираторной коронавирусной инфекции свиней. Отбор МА, пригодных для использования в диагностике ТГС и его дифференцировании от респираторной коронавирусной инфекции свиней проводили одновременно с разработкой соответствующих методов лабораторной диагностики. Работу проводили в двух направлениях:

- поиск МА, пригодных для использования в диагностических реакциях, по обнаружению консервативных и вариабельных антигенных детерминант коронавирусов;

- поиск МА, пригодных для использования в диагностических реакциях, с целью обнаружения антител к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС в сыворотках крови инфицированных животных.

I

Для выполнения первой задачи разработали прямой вариант гистохимического ИФА и МФА, прямой и сэндвич-варианты ТФ ИФА; для вы-

I

полнения второй - вариант ингибирования ТФ ИФА. Для использования в ТФ ИФА некоторые МА нужной специфичности конъюгировали с пе-роксидазой хрена по-модифицированному методу периодатного окисления (Тузэеп, 1985). ; ,

При разработке прямого варианта ТФ ИФА и сэндвич-варианта ТФ

(

ИФА для обнаружения антигенов вируса ТГС в культуральных вируссо-держащих материалах и' содержимом тонкого отдела кишечника инфицированных животных, изучали:

- пригодность МА клонов Т1С12.2. и ТЮ4.2 для выявления консервативных детерминант коронавирусов;

- пригодность МА клона Т4В11.1 для выявления вариабельных антигенных детерминант вируса ТГС, отсутствующих у респираторного коро-навнруса свиней.

Установили, что при обнаружении антигенов вируса ТГС в содержимом кишечника прямым вариантом ТФ ИФА имеют место высокие фоно-

вые показатели для нормальных и гетерологичных антигенов (1:2-1:8). Это делает реакцию менее наглядной, кроме того, затрудняет обнаружение минимальных количеств вирусспецифическпх антигенов в низких разведениях вируссодержащих препаратов (1:2-1:8) при необходимости исследования материалов с небольшим уровнем накопления антигенов возбудителя.

При разработке сэндвич варианта ТФ ИФА для обнаружения консервативных и вариабельных антигенов вируса ТГС в вируссодержащих материалах определили оптимальные сочетания МА для сенсибилизации твердой фазы и для выявления связавшегося антигена.

В дальнейшей работе по изучению специфичности сэндвич варианта ТФ ИФА использовали пары МА клонов Т4В11.1 и Т1С12.2, как специфичные к двум различным детерминантам пспломерного гликопротеииа Е2 (Б) вируса ТГС, а так же МА клонов ТЮ4.2 и Т4Э4.1, как специфич-

I

ные к двум различным детерминантам нуклеопротеина вируса ТГС.

В результате проверки чувствительности и специфичности разработанного сэндвич варианта ТФ ИФА установили, что при сенсибилизации твердой фазы моноклональными антителами клона Т404.1 и использовании для выявления связавшегося антигена пероксидазного конъюгата МА клона ТЮ4.2 метод позволяет обнаружить консервативные антигенные детерминанты всех исследованных штаммов вируса ТГС в 10%-ной суспензии содержимого тонкого отдела кишечника зараженных поросят и в куль-туральных антигенах в титре до 1:160, а также обнаружить консервативные

антигенные детерминанты РКВС штамм "ЛУК" в культуральных антиге-

(

нах в титре до 1:160. При этом метод позволяет дифференцировать данные антигены от антигенов других возбудителей болезней свиней. При сенсибилизации твердой фазы моноклональными антителами клона Т1С12.2 и использовании для выявления связавшегося антигена пероксидазного конъюгата МА клона Т4В11.1 метод позволяет обнаружить вариабельные антигенные детерминанты всех исследованных штаммов вируса ТГС в 10%-ной суспензии содержимого тонкого отдела кишечника зараженных

поросят и в культуральных антигенах в титре до 1:320. При этом метод позволяет дифференцировать данные антигены от антигенов респираторного коронавируса свиней, а также от антигенов других возбудителей болезней свиней.

Для обнаружения антител к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС в сыворотках крови инфицированных животных разрабатывали вариант пнгибирования ТФ ИФА. Изучилили пригодность МА клонов TIC 12.2 и T1G4.2 для выявления антител к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС; а так же пригодность МА клонов Т4В11.1 для выявления антител к вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС.

Установили, что в методе ингпбпровашш ТФ ИФА, способностью ингибировать взаимодействие специфического антигена, сорбированного на ТФ, с пероксидазным конъюгатом МА клона T1G4.2, обладают сыворотки крови свиней, иммунных к всем изученным штаммам вируса ТГС и РКВС в титре до 1:2430. Нормальные и гетерологичные сыворотки дают отрицательный результат, начиная с разведения 1:10. Способностью ингибировать взаимодействие специфического антигена вируса ТГС штамм Д-52, сорбированного на ТФ, с пероксидазным конъюгатом МА клона Т4В11.1, обладают сыворотки крови свиней, иммунных ко всем исследованным нами штаммам вируса ТГС в титре до 1:810. Специфичные к РКВС штамм "ЛУК", нормальные и гетерологичные сыворотки крови свиней дают отрицательный результат начиная с разведения 1:10. На основании этих данных можно сделать заключение, что метод ингибирования ТФ ИФА с применением МА обладает необходимой специфичностью и чувствительностью для ретроспективной дифференциальной диагностики ТГС и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

При разработке гистохимического иммуноферментного анализа для обнаружения антигенов вируса ТГС и РКВС в клетках, инокулированных вируссодержащим материалом изучили пригодность пероксидазных

коныогатов МА клонов ТЗА6.1, T1G4.2, Т4В11.1 и TIC 12.2 для выявления консервативных и вариабельных антигенных детерминант указанных возбудителей в клетках, зараженных вирусом ТГС или РКВС. В результате проверки чувствительности и специфичности разработанного варианта ГХ ИФА определили, что при использовании для выявления вирусспецифиче-ских антигенов пероксидазных коныогатов МА клонов T1G4.2, ТЗА6.1 и

TIC 12.2 метод позволяет обнаружить внутри зараженных клеток консерва- i

i

-ппзныс антигенные детерминанты всех исследованных штаммов вируса j ТГС и респираторного коронавпруса свиней при разведении материалов j

I

до 1:10", соответственно. При этом метод позволяет дифференцировать данные антигены от антигенов вирусов других семейств. При использовании для выявления вирусспецпфических антигенов перокспдазного конъ-югата МА клона Т4В11.1 метод позволяет обнаружить внутри зараженных клеток вариабельные антигенные детерминанты всех исследованных' штаммов вируса ТГС при разведении вируссодержащего материала до 1:105 и дифференцировать их от антигенов респираторного коронавируса свиней, а также от антигенов вирусов других семейств.

Разработали МФА для обнаружения антигенов вируса ТГС и РКВС в клетках, пнокулированных вируссодержащим материалом. При разработке указанного варианта ИФА изучили пригодность ФИТЦ-конъюгатов МА клонов T1G4.2 и Т4В11.1 для выявления, соответственно, консервативных и вариабельных антигенных детерминант указанных возбудителей в клетках, зараженных вирусом ТГС или РКВС. В результате проверки чувствительности и специфичности прямого варианта МФА определили, что при использовании для выявления вирусспецифических антигенов ФИТЦ-конъюгата МА клона T1G4.2 метод позволяет обнаружить внутри зараженных клеток консервативные антигенные детерминанты всех исследованных штаммов вируса ТГС и респираторного коронавируса свиней при разведении материалов до 1:106, соответственно. При этом метод позволяет дифференцировать данные антигены от антигенов вирусов других

семейств. При использовании для выявления вирусспецифических антигенов ФИТЦ-конъюгата МА клона Т4В11.1 метод позволяет обнаружить внутри зараженных клеток вариабельные антигенные детерминанты всех исследованных штаммов вируса ТГС при разведении вируссодержащего материала до 1:10е и дифференцировать их от антигенов респираторного коронавируса свиней, а также от антигенов вирусов других семейств.

Применение разработанных методов лабораторной диагностики для экспертизных исследований В течение 1994 и 1995 годов во ВНИИВВиМ для экспертизных исследований поступал патологический материал от больных свиней, подозреваемых на заражение вирусом ТГС. Предварительный диагноз основывался на результах клинического и эпи-зоотологического обследования и результатах патологоанатомического вскрытия.

Разработанные нами методы применили для идентификации возбудителя заболевания, а также для обнаружения вирусспецифических антител в сыворотках крови свиней.

Для проведения экспертизных исследований поступали следующие материалы: пробы органов, от погибших поросят или полученные при убое больных поросят (селезенка, л/узлы, печень, кишечник с содержимым, легкие и почки); сыворотки крови взрослых свиней из хозяйств, в которых возникло подозрение на ТГС. Все материалы доставляли в институт в замороженном или охлажденном виде. Из проб органов и содержимого кишечника готовили 10%-ные суспензии на ФБР с добавлением 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 25 ед/мл амфотеррицина В. Сыворотки крови инактивировали прогреванием при 56 °С в течение 30 минут.

Прямое обнаружение антигена вируса в пробах органов и содержимого кишечника проводили сэндвич вариантом ТФ ИФА на основе МА клона Т4В11.1, специфичных к антигенным детерминантам, расположенным на пепломерном гликопротеине Е2 (Б) вируса ТГС. Вариабельные антигенные детерминанты вируса ТГС обнаруживали в пробах содержи-

эго тонкого отдела кишечника зараженных поросят в титре до 1:128. Для

»дтвсрждения результатов, полученных при исследовании проб органов

содержимого тонкого отдела кишечника сэндвич вариантом ТФ И ФА,

льнейшую работу проводили по выделению вируса ТГС и его пденти-

1кашш. Выделение вируса проводили путем инокуляции 2-3-х суточной

льтуры клеток ПТП 10%-ной суспензией слизистой и содержимого тон-

то отдела кишечника. Ииокулированпую культуру клеток культивиро-

лн в течение 3-4-х суток (длительность одного пассажа). Цитопатические

менения культуры клеток наблюдали, начиная с 3-5 пассажа. Параллель-

| с этим определяли накопление антигенов вируса ТГС внутри зара-

¡нных клеток прямым ГХ ИФА, разработанным на основе МА клона

С4.2, специфичным к консервативным эпптопам нуклеопротеина вируса

'С и МА клона Т4В11.1, специфичным к вариабельным эпитопам пепло-!

рного гликопротеина Е2 (Б) вируса ТГС. Данные по результатам экспер-зного исследования патологического материала от погибших поросят з "Губкинский") представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты выделения и обнаружения вируса ТГС в культуре клеток ПТП

п=3

Соличество пассажей Наличие ЦПД Титр вируса в прямом ГХ ИФА на основе МА: ТЮ4.2 | Т4В11.1

1 пасс. — 1 1.2 018

2 пасс. — 21 .а 1,5

3 пасс. 31к 2,5 \ш

4 пасс. + 4,5 1я 3,5 ^

5 пасс. + 51й 5

6 пасс. + 61е 6 1,2

(--) - отсутствие цитопатических изменений;

(+) - наличие цитопатогенных изменений.

Сыворотки крови свиней, отобранных в хозяйствах различных ре-энов РФ, исследовали в реакции нейтрализации, а также вариантом ин-эирования ТФ ИФА на основе МА клонов ТЮ4.2 и Т4В11.1, обла-

дающих специфичностью, соответственно, к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС. Результаты исследований представлены в таблице 3. При сравнении результатов, полученных при исследовании сывороток вариантом ингибировання ТФ ИФА и в реакции нейтрализации, установили совпадение результатов двух реакций в 89 % случаев.

Таблица 3

Результаты исследования сывороток крови свиней в РН и методе нпгибирования ТФ ИФА на основе МА

Исследуемый материал Иссле- Положительные в ТФ ИФА Положит.

довано на основе МА клонов в РН

ТЮ4.2 Т4В11.1

Совхоз "Лазаревский" 20 14 14 9

Совхоз "Губкинский" 12 11 11 11

Оп. хоз. ТНИСХИ 10 0 0 0

Таким образом, методы ТФ ИФА, разработанные нами на основе полученных МА, позволяют в короткий срок обнаружить антигены вируса ТГС в пробах содержимого тонкого отдела кишечника и антитела к таким антигенам в пробах сывороток крови животных. Одновременно данные методы позволяют дифференцировать трансмиссивный гастроэнтерит свиней от респираторной коронавирусной инфекции свиней.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны схемы получения МА к вариабельным и консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС. Получено 19 линий гибридных клеток мышиного происхождения, стабильно продуцирующие МА к антигенным детерминантам, расположенным на гликопротеине Е2 (8) и на нуклеопротеине (И) вируса ТГС.

2. Установлено, что антигенные детерминанты пепломерного глико-протеина Е2 (Б) вируса ТГС (молекулярная масса 200 кД), выявляемые МА клонов ТЗА6.1 и Т1С12.2, а также антигенные детерминанты нуклеопро-теина N вируса ТГС (молекулярная масса 47 кД), выявляемые МА клонов

1G4.2 u T4D4.1 являются высококонсервативными и присутствуют у всех зученных референтных, вакцинных и полевых штаммов вируса ТГС и у еспираторного коронавируса свиней, что позволяет использовать специ-нческне к этим детерминантам МА в диагностике ТГС н респираторной оронавирусной инфекции свиней.

3. Установлено, что антигенные детерминанты пепломерного глико-ротеина Е2 (S) вируса ТГС (молекулярная масса 200 кД), выявляемые МА лона Т4В11.1, присутствуют у всех изученных референтных вакцинных и олевых штаммов вируса ТГС. Такие антигенные детерминанты отсут-гвуют на соответствующем гликопротеине РКВС, что позволяет исполь-эвать специфические к этим детерминантам МА для дифференциальной иагностикн ТГС и РКВ-ннфекции свиней.

4. Разработаны сэндвич вариант ТФ ИФА, прямой вариант ГХ ИФА прямой вариант МФА на основе МА клонов T1D4.2, TIC 12.2 и Т4В11.1 ля обнаружения антигенов вирусов ТГС и РКВС и их дифференциации. 1етод позволяет выявлять специфические антигены вирусов ТГС и РКВС суспензиях проб органов и содержимого тонкого отдела кишечника за-аженных поросят (ТФ ИФА) в титре до 1:360, а так же в зараженных летках (ГХ ИФА и МФА), инокулированных вируссодержащими культу-альными материалами в титре до 1:106.

5. Разработан метод ингибирования ТФ ИФА на основе МА клонов 1D4.2, Т1С12.2 т Т4В11.1 для обнаружения антител к консервативным и эриабельным антигенным вариантам вируса ТГС. Метод позволяет обна-ужить такие антитела в сыворотках крови животных в титре до 1:1280 и ифференцировать иммунный ответ на инфицирование свиней вирусом ГС или РКВС.

6. Варианты ИФ ИФА и ГХ ИФА, разработанные на основе полу-енных МА, апробированы на практике и показали свою пригодность для рименения в лабораторной диагностике ТГС и респираторной коронави-усной инфекции свиней.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В результате проведения экспериментальных исследований получены данные, позволяющие рекомендовать для применения в лабораторной диагностике ТГС и дифференциальной диагностике ТГС и РКВ-ннфекции свиней чувствительные, специфичные, высокопроизводительные и экспрессные методы ГХ ИФА и ТФ ИФА на основе МА.

2. Разработаны и предложены для применения в практике ветеринарных лабораторных исследований "Набор препаратов для дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней н респираторной коронавирусной инфекции свиней гистохимическим иммунофермент-ным анализом на основе моноклональных антител" и "Набор препаратог для диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней твердофазные иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител". Разработана соответствующая нормативно-техническая документации (Временные инструкции по изготовлению и контролю "Наборов...", Технические условия, Наставления по применению "Наборов..." и Методические указания по постановке гистохимического и твердофазного иммуно-ферментного анализа на основе МА), утвержденная директором института.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1) Бузун А.И., Мусукаева Ф.Б., Коломыцев A.A., Семенихин А.Л., Князев В.П., Стрижакова О.М. Сравнительное клинико-эппзоотоло-гичеекое изучение коронавируеной болезни уток и трансмиссивного гастроэнтерита свиней // Материалы научно-практической конференции, -ВНИИВВиМ, - Покров, -1994, -стр 163.

2) Вишняков И.Ф., Краснобаев Е.А., Стрижакова О.М., Получение гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела к антигенам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней // Материалы научно-практической конференции ВНИИВВиМ, -Покров. -1994. -стр 141.

3) Лагуткин H.A., Князев В.П., Середа А.Д., Смирнов В.Н., Стрижаков A.A., Стрижакова О.М. Мусукаева Ф.Б. Коронавнрусная болезнь уток: антигенная и физико-химическая характеристика возбудителя// Материалы Республиканской научно-практической конференции по животноводству и ветеринарной медицине, -Витебск, -1994, -стр. 71.

4) Стрижакова О.М., Краснобаев Е.А., Дерябин О.В. Скрининг моно-клональных антител к антигенам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней // Материалы научно-практической конференции, -ВНИИВВиМ, - Покров, -1994, -стр 142.

5) Стрижакова О.М., Краснобаев Е.А., Дерябин О.В., Стрижаков A.A. Сравнительная оценка способов иммунизации мышей линии BALB/c при получении моноклональных антител к антигенам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней //Материалы международной научной конференции ИЭиКВМ, -Харьков, -1995, -стр. 127.

3) Стрижакова О.М.,Вишняков И.Ф., Стрижаков A.A. Дифференцирование вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторного коронавируса свиней сэндвич вариантом ТФ ИФА на основе моноклональных антител // Материалы Всероссийской Научно-практическая конференция, ВНИИЗЖ, -Владимир, -1995, стр. 58.