Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ПЕРВИЧНЫЕ И ДИПЛОИДНЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЛЕГКОГО ПЛОДА КОРОВЫ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВСЕСОВЗШЙ ОРДЕНА ШМНА НЛ^Ю^ССЛВДОВАХВЛЬСКИЙ ИНСПТГУТ 8КСПВРИ МЕНТАЛЬНОЙ 8БГБРИ1ЦРИИ имени Я.Р.КСВАИЕНКО (ВИЭВ)

всйююзной срдша лэмна и (рдд1а трудового красного знаний

ШДЭЛИ СЕЯЬСКОХОЗЯЙСТБаШХ НАУК имени ЛЕНИНА (ВАСХЖЛ)

АСПАНйДЭе Вабучго Погаев 1«

уда 6Х2.4Э8+61Е.4П-0.85.23

ЩРЕИЧН11В И ДИПЛСИДНЫЕ КУЛЬТУРЫ НЛЕТСК ЛЕГКОГО ПЛОДА КОРОВЫ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

16,00,03 - ветеринарная микробиология, вирусологии, епиэоо*ологня и шкология

Автореферат диссертации на пшсмше учено* отвпани

На правах рукописи

Дня служебного пользования Эяа.» ОО0115

кандидата ветеринарных наук

Мое*»* - 1987

Работа выполнена в лаборатории технология клеточных культур х питательных сред Всесоюзного ордена Ленпна научно-исследовательского внотжтута »ксперииентальной ветеряв»ржи имени Я, Р. Коваленко ж Ре сиубликанояой лаборатории по особо спвсшш зарвэяам заболеваниям жввотяыс Гооагропрома Груэянокой ССР.

Научный руководитель:

доктор бяолопгсееюпс ааук, професоор Л.П.Дьяхонов

Офтаальтге оппоненты:

1. Доктор 6ИОЛОГ. наук, щрофоссор В.Б.Гукекков {ИЯКИК "

2. Кандидат биологических наук Н.Л.Соколова (ШЭВ).

Ведущее учреждение - Уооковская ордена Трудового Краевого Знамени ветеринарная авадешя внаем К.Н.Скрябине (ИВА).

Защита дщееврташи состогтся * 16 « 1987 г.

в 14 часов на заседании спевдалиаировааього совета Д 060.2CI.CliI по а ани се диооертагогй на соисканме утвяо! степени доктор* мук яря Всесоюзном ордена Лендна научно-исачедокат«дьск<ж гастнту-те вксперииентадьной ветеринарии ям. Я.Р.Коваяешю (105472, Москва» Кузыашки, ВДЭВ).

' С диссертацией можно ознакоштьел в библиотеке Рсвсоявтого ордена Ленина нау чзо-нссдвдоватвльского иноштута аксавря* жнтахьноК ветеринария им. Я.Р.Коваленко.

Автореферат разослан "12 - ma^i 1987 г.

Ученый секретарь спвциалиэированного совете, кандидат ветерннарнше наук

Ф.Г.Тервшаэв

2. ОНШШ ХАРАКТЕРНОÎMKA РАБОТЫ

Айтуятьнрйть теми. В современных условиях успехи в развития биологической науки (молекулярной биология, вирусологии к др.) н биотехнологии неразрывно связаны « использованием клеточных культур.

Культуры клеток ¡тавотных я человека стали одними из вйд-нейлшх объектов дня проведения научных исследований в области инфекционной патологии, разработки методов диагностики и специфической профилактики вирусных болезней, в производстве противовирусных препаратов я других сферах биотехнологии.

Методы я способы культивирования клеток животных я человека применительно х наиболее распространенным культурам клеток из ткани почек, тевтякулов я др. органов к настоящему времени достаточно хорошо разработаны (Ы.И.Леви, 1957; О.Г.Анджапаридзе, В.И.Гаврилов, Т.Ф.Семенов, Д.Г.Степанова, 1962; Дд. Пол, 196Э; В.И.ГавриЛов. 1964; Д.Ф.Осидэе, 1975; В.А.Сергеев, 1966; 1976; Д.Б.Голубев, А.А.Ссшнина, М.Н. Медведева, 1976; Д^.Уосли, 1976; Г.Е.Шккова, 1976; А.С.Нэвохатский, 1979; А.Я.Курносое, 1980; Ю.М. Васильев к И.И.Гельфаид, 1961; Р.Адамо, 1988; Л.П.Дьяконов, В.Ф.Гнухов, А.А.Поздняков в др., 1980, 1966; 7.ТЛ1ГШ*, H.K.Tatt«Taon (ред.), 1973; a.P.Hdtber, 1904; H.3.Spi«r, Qrlffiths, * 1985 и др.).

Наряду с наиболее распространенными культурами клеток из ткани почек животных разработаны методы культивирования клеток из ткани щитовидной железы свиней,репродуктивных органов коровы, кишечника плодов коровы я свиньи (Л.П.Дьяконов, 1983; М.Т.Гололобова, Д.В.Лобугооаа и др., I9B3; СД.Хаертннов и др., 1986; В.Н.Бахарев, IS83; Л.Д.Дьяконов, Г.Х.Субаев, Т.В.Гальнбек в др., 1965 я др.). Однако остается актуальней необходимость разработка новых методов получения я культивяро-вания клеток, позволяших обеспечить стабильность культурно-морфологиче ских свойств штампов и линий илеток и их высокую чувствительность к вируса».

Д.Б.Голуйез о соавт. (2976), С.Ыебус с соавт. (1978), Т. П.Лисок (IS83) соойййлт о чувствительности первичной культуры клеток легкого вдоха коровы я эмбриона человека для изуче- ' ния респираторных вирусов.

РГАУ-МСХЛ

имени К.А. Тимирязева ЦНБ имени Н.И. Железноча

л

Культура клеток легкого эмбриона человека используется для производства противовирусных вакцин я интерферона (А.С.Во-вохвтский, 1979).

В патологии животных значительна роль рота-, коронавирусов, вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) в парагриппа-З (ПГ-З) крупного рогатого скота, рянопневмонии лошадей (РПЯ), для изоляции и изучения которое культуры клеток из ткани легкого могут быть перспективными, что в послужило основанием для проведения наших исследований, поскольку метода культивирования клеток легкого плода коровы недостаточно разработаны-

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлась разработка методов получения первичны! культур, субкультур и выведение шпиоидноЗ культуры клеток легкого плодя коровы, облацаотих повышенной ил» избирательной чувствительностью к вирусам, поражающим респираторные органы сельскохозяйственных животных,

В.связи с этим перед нами были поставлены.слецуадив задачи;

1. Разработать методы выделения» первичного выращивания и субкультивироваяпя культуры клеток из ткани легкого плоха крупного рогатого скота.

2. Изучить культурально-морфологические сэсйствя этих культур клеток и отработать ражим криогенизании их в жидкой азота,

3. Вывести диплоидную линии клеток вютеляопэдобного типа легкого плода коровы (ДЯЭК).

4. Изучить чувствительность первичных культур клеток, субкультур а диплоидной культуры легкого плода коровы к вирусам ИРТ, ПГ-Э, рота-вирусу телят и вирусу РШ.

5. Провести исследования по распространению респираторных болезней и ретроспективной диагностике парагршша-3 крупного рогатого скота в хозяйствах различных природно-климатических зон Грузинской ССР,

Научная новизна;

- разработаны метода получения пврвичща культур клеток

и субкультур с преобладанием, клеток эпителиоподобного типа лз> ткани легкого плода коровы; ■=',■■■.■.■.

- изучены некоторые культурально-ыорфологические свойст-

ва первичных культур клеток легкого плода корона,*

- впервые' получена диплоидная культура теток легкого плода коровы епителиоподобного тана и изучены ее культурально-дар£ологические свойства и проведена криогенизация в жидкой -аэоте;

- установлена высокая чувствительность первично тряпсини-эироаанншс-культур, субкультур я диплоидной культуры легкого плеща коровы х ДНК-геномшм вирусам-возбудителям инфекционного ринотрахевта крупного рогатого скота и рянопневштга лошадей и РНК-геношым влруевм-возбудителям парагригаа-З крупного рогатого скота в рота вирусной инфекция телят. Выявлены некоторые особенности да топа тогенного действия вирусов на эгштелиопокоб-ную культуру ЛЭК;

- эгшзоотологнческв и ретроспективно изучено распространение парагриппа-3 у крупного рогатого скота в хозяйствах различных щяроадо-клиштических зон Грузинской ССР.

. Птактяческад значимость;

I* Разработанные методы получения первичных культур и субкультур из тканей легкого плода норовы, вошли в "Методические рекомендация по культивированию первичных культур клеток и субкультур из ткана легкого плода крупного рогатого окота". М., 1565. 8о,-

2. Получено новоти тельное решение БЯИИПИ по заявке

* S963II8/2S-I3 (123039) 25,02.66 Г. на ЧВтвш культивируемы* меток легкого плода коровы для культивирования вирусов".

3. Первично трипсиниэироваяные культуры, субкультуры в диплоидный штамм клеток ЛЗД*рекомендуются для научных исследований и диагностики вирусных инфекций.

4. Выявленные особенности цитопатогенного действия вирусов ИРТ, ПГ-З и рота-вируса телят на диплоидную культуру ЛЭК могу; быть попользованы в качестве дополнительного критерия диагностики, вирусных болезней крупного рогатого скота.

¿2Е2й2£03* По материалам диссертации сделаны соойцения:

- на УП конференции молодых ученмг БГНШ1, вегереиаратов (Носква, 1985);

- на конференции молодых ученых ВИЭ8, посвященной 40-летию Победы советского народа в Великой Отечественной войне 1941-1945 гг. tМосква, 1985);

. РГАУ-МСХА

нмеян К.А. Тимирязева j ЦНБ имени Н.И. Железном Фонд научный литература

на Учерси сочогэ ВИЗ.В, август IS85 г.

По теме диссеутоцяи опуЛлмкоазны 2 район:.

' Диссертация иэлоаэка на Í60 стрлнгце* машщюлдсного галете и состоит из и»Е.еш1я, обзора литературы, ьсЗственннх яо-одедоьакиЗ, ойсумэгтг, выводов, приложений. Работа пллжстриро-ьанэ 18 таЗлщдамк в 20 рисунками. Список литературы агогочает 262 источников, кз них - Ю6 иностранных. Приложения 1,2 иа стрсаяшх, ■

г. oocfjtbskhus кссушюеатзк

¡¡.I. Материалы и методы

Гайота внполнвнв в лаборатории экапартшнтальиой технолога клеточных культур и питательных сред ШЗВ и Распуйлвкзно-коб леборатории по осоЗо олаендо заразным гadодеваниям сэльоко-лоеяЗстзчшшх живопик Госагропроза rpysmiCKoif ССР в IS7S-8ßrr,

Проведано ЬС отитов по подутеяиг« тшрвичнше культур е суй-^ультур 'меток легкого пло^а коровы; 25 опытов по выведении цетшгкцгюй культуры легкого клока коровы (Д1ЭК); 10 опытов по крзэгонлэ«ц1Гй культур- Дм цатологиедокях исследований приготовлено 250 датодэгвчос галс препаратов; поставлено 15 опытов по спракелэняю чуЕОТвлтелыюста порвичной г дитлошдас.Й куль тури ■ ЛЭК к вирусом HPT, ПГ-З крупного рогатого скот», риногвдвнопки лошадей в рэтаьируской инфекдга толяг; гсследсвавс 1997 njwi крови от круглого рогатого скот« на содержание антягомаггли-твышоа х вжруоу ПГ-З в хозяйствах Грузинской ССР.

Для :<риготовяенЕя культур клеток аз ткакп легкого плоха коровы пледн З-У-мясячього рмавитня доставляй! о Московского той Тбилисского цлсояонСзнатоБ в стериьзоЁ посуде в течение 2-3 часов после уйоя животного. Культура клеток из ткакеЁ легкого гзтозвдк штоп.ом ферментативной дезагрегации к методом екешлэняровакия тканевьс* фрагментов.

Первичное ху льтивлрованив и суокультивировали« куяьтур щеток из тканя лэгкого плода коровы провозили с пеполъзовашт-esí питательных сред и растворов: 0,5^-гс^ v . гидролиз еталак-тальОушка иа растворе Хенкса,' среды1Э9р Игла, среды на ос- ■ дозе ФШ-С (производства Покровского Йаоэавода) на раствора 5рла, 0,02? раствора вереввэ (натриевой соли «тяеюдеадантот-рэупсусяоЗ иислотн), 0,25£ раствора трглсЕка на растворе Хонд- ■

оа в сыворотвз щюш крупного рогатое скота ьлл теленка производства Московского мясокомбината. Для цнтоморфологячоохого Контроля за ростом и разыножеияом культуры клеток из тксней логкого иода хорош, клетки шсовалъ в пробирки ига пешадга-линовке флакони о жжрсвьымн стехлада. Чераз 24, 48,72,96 часов покровные стоила Еэздазали, промывали, поксуаиваш я фиксировали, с последующей окраской dji го логические препаратов го штоксилли-эозином, Исследование к и1Пфофотсграфировачч& окра зонных ере на рай» а проводил» о поммльи микроскопоз Ehxjsw-S, 1ЛБК-6 и фотокамеры "Ктев". .

Коженч-рсщрю, жизнеспособность клоток, штотаадскай индекс я простое ративную активность определяли ставдарттам ш-тодаш (Л.П.Двлконоз и др., 1980, 1986).

Препараты хромосом клегок легкого плода корозы готовили по мв*?оду 7фрхода с соавт. (IS60).

С ц&ль» цшпельтюго хранения суйкулыур л диплоидной рул тури легкого плода коровы проводили заморажевавие клеток на 15, 25, 45-х пассбла* а йигцком азотз при -196°С.

Состав кряозшггиты среды: димотилсулгфодсед (ЮКО) - ТС£, питательная средя - 50{£, сыворотка крупного рогато1,о окота -403.

Зиру сологитэскве асследованмя проводили на ^азе отдела зи русоиЕОгии ШЭВ (заа.отд." я.вет.н. Н.Н.Крюков) о учэотеэч ¡гзк-дидатоз ьагеряяарных najic Ы.М.Гогомева, З.О.Зудшгансй, А.Ф.Оу ляк, к .С .Ве^ркеяа 11 осшграята К.Л,Бу Дулова.

Для заражения культур клеток, вырвщзиши а п^эйирках, пс пользовали ввр/о ЙРТ-ИПБ. ктаим "Йааово", вирус ПГ-З крупного рогатого скота, ытамк "1ГГК-45", вирус ринотшешониэ жл&^еа (ИИ) - агтажщ "KB-I", "ЫКЗ-J", "Т-2" я ротавкр?0 тал«*, итада "ИГ.

Ин$окпиоитг4 титр шрусоь ИГТ, ПИ» рота£>русэ телат определяя» по цэтопатогекноуу действию в аробихютос: культурах клеток. Тигр вируса ПГ-З уотакаалхвали ло феномену гсиядссрй-щгз путем,экесегам в зарехешше рн яльток ае 5-7 сутки

0,2-0,1 мл го веся omnux эргтроцктоь шрсу-oft CK/lül. "Гнтр вирусов В1гшслядп по («тсду Ряпа я »энча <!&?€) * хцра-«ади в TiftjHOBiö. аэтолбтогрпаьд доза* (ТЦи^^Ду,)^ Цолучвдвса рвэ улетал; oepeda гыралз в^рвэйюлно-^татас лчесягм шгодок СЛекав Г.«., ШО).

2.2. Результат» исследований

2.2.1. Разработка методов получения первичных культур из тканей легкого плода корова ШЮ я их длительное субкультиварование

Одной иэ основных задач нашей работы 0ало получение клеточной суспензии и последующего выращивания культур с преобладанием клеток эпителиопокобного типа.

В первых опытах использовали ткань легкого, взятую стерильно от плодов коровы 3-7-месячного развития. Для дезагрегации ткани в качеств© диспергируиаего вещества брали 0,25% раствор трипсина фирмы "Ферак* с активность» 1:350. Поставлено пять опытов. Продолжительность воздействия трипсина составляла 10, 20 и 30 кен, в каждом из пяти цвклов дезагрегации при температуре 32-33°С. При этом было отмечено, что с' увеличением времени воздействия на измельченную ткань от 10 со 30 минут пи-ход жизнеспособных клеток значительно уменьшается. Так, если в опытах по 10-минутно^ воздействию число жизнеспособных клеток составляло в среднем 48,3?, при 20 минутах - 43,6?, то при действии трипсина в течение 30 минут жизнеспособными оставались только 21,3? клеток.

Результаты проведенных опытов ясасаэоли, что не обходи мопо-добрать методы щадяцего воздействия на ткань легкого.плода коровы с целы) увеличения как общего количества диспергируемых клотон, так и повышения процента их жизнеспособности;

Было испытано несколько вариантов соотношения трипсина с' другими дисттергиру паями веществвш, либо с питательными средами, либо раствором Хенкса. Лучше результаты были получены при использовании в качества дисоергирушего раствора состава, состоящего из 0,25$ раствора трипсина и раствора Хеккоа в соотношения 1:1. При этом в эацаннкх условиях дезагрегации получали от 28,4 до 48,6 тнс.кл/мл в суспензии аиспергента. Жизнеспособность достигала 69,0-78,5?.

Культивирование хлеток, полученных после трипсинизации в первых опытах, проводили с использованием питательной среды 0,5? ГЛА на растворе Хеккса с добавлением 10£ саворотки крупного рогатого скота. Б зависимости от времени дезагрегации,. при использовании 0,25? раствора .трипсина, сроки формирования._ монослоя составляли 4-5,суток при Х0-:^шутдых циклах; 5-6 су--1--ток при 20-минутных, а приЗО-минутных через этот срок моно-

слой ив был сформирован, Клетки монослоя преимущественно бшш фибробластоподобного типа. Выращивание клеток после диспергирования ткаки щадящим методом (трипсин : р-р Хенкса) оказалось более эффективным:, данослой формировался на 3-5 сутки. Отмечали рост клеток как фиброблартоподобного, так а эпителвоподоб-ного типа.

Взяв за основу результаты опыта по дезагрегации ткани легкого плода коровы .щадящий методом, ш проверили влияние температуры на выход клеток и их жизнеспособность после деаагрега-йрн ткани. В пяти последовательных опытах было показано, что оптимальной температурой дезагрегации щадящим методом при 10-шнутяой продолжительности одного цикла является В2-33°С. В этих условиях получено наибольшее количество жизнеспособных клеток - 79(Культивирование клеток до стандартной методика при посадочной ковдвнтраща 250-300 тыс.кл/ш а сшна среды через 24-48 часов позволило подучить формирование кмфшэнтно-го иокослоя клеток через 3-5 суток от начала культивирования. Культура клеток представлена клетками фибройластоподобного и эрителиопоцобного типа.

В результате проведенных вкспериментов был найден оптимальный вариант режима дезагрегации ткани легкого плода коровы (концентрация.дисвергирупцих растворов, температура и время дезагрегации,при рН - 7,2-7,4). Суспензию первого цикла дезагрегации следует отбрасывать, так как оаа содерклт 70-60? мертвых клеток.

' ■ Вами были поставлены эксперименты по подбору наиболее эффективное питательной среды для культивирования с преобладанием клеток втгтелиоподобшго типа. Для этих целей использовали питательные .среды: X) 0,5j ГЛА в растворе Хенкса; 2) 0,5£ ISA со средой 199 в соотношении 1:1 я 3) готовую среду на основе ферментативного гядролязата мышечных белков (сухого)' - 4Ш-С (производства Покровского биозавода). К питательным средам добавляли 10-20? сыворотки крупного рогатого скота.

При изучении культурально-моЕфологнчасквх свойств культуры клеток ДЭК установлено, что культура, выращенная в срэде на основе ФПЛ-С, была представлена клетками смешанного типа (фибробластоподобные и зпптелиоподобные) с преобладанием яа . 70-Щ£ эпитедиододобных клеток ври дальнейшем субкультеплрл-

вании. В среде 199 с добавлением среди на основе 0,5£ ГЛА (1:1) монослой был представлен также клетками смешанного типа, но число клеток эпителиоподобного типа в процессе субкультивирова-ния нефевышало 60-65Î, а на среде о 0,5? ША вырастала культу -ре с преобладанием фибробластоподобных клеток.

Выведение культур клеток легкого плода коровы методом культивирования эксплантатов

Проводенные нами исследования но разработке методов получения первичных культур и субкультур клеток ткани легкого плода коровы с преобладанием клеток эпителиоподобного типа, позволили выявить преимущество для этих целей метода щадящей трип си-низании и последующего культивирования на среде ФГЫ-С, либо . среде 199 со средой QtS% ГЙА 1:1. Однако разработанные приемы не позволяли получать культуры с однородным составом клеток эпителиоподобного типа, т.к. в исходной ткани имелись клетки различной морфологической характеристика,

Из литературных данных известно, что однородные до клеточному составу культуры могут бить получены методом эксплантатов и клонирования. Ыы провели ряд опытов с целью отработка метода выведения клеточных штампов и линий клеток эпителиоподобного типа из эксплантатов легкого шода коровы. Клетки в первичных Культурах, полученных этим методом, обладали рядом особенностей в сравнении с клетками культур, полученных методом трппсн-киэации. Они имели полигональную фор«у. округлое ядро и по своим морфологическим признакам могли Сыть отнесены к клеткам аантели»подобного типа.

Пос^е того, как во флаконе появляются очаги роста эиите-лиоподобных клеток (на 6-8 день), механически удаляли эксплантаты, на клетки из очагов роста действовали 0,25? раствором трипсина с 0,02$ раствором вереена (I;S),а затем отсасывали отслоившиеся клетки пипеткой, переносили их в новый флакон и получали однородную культуру, состоящую из клеток эпителиоподобного типа,и такую культуру использовали в дальнейших экспериментах по выращиванию субкультур или диплоиднше культур того же типа.

Выведение диплоидной культуры легкого плода коровы

Начиная о работ Л.Хайфлизта < ПоуШек 1961), в большинстве случаев диплоидные культуры" описаны как клеточные штаммы, представленные клетками фябробластоподобного типа. Перед нами же стояла задача выведения диплоидной культуры клеток ели-телиоподобного типа из ткани легкого плода коровы.

Для выведения штамма брали первичные культуры и субкультуры ЛЗК с преобладанием (70-60Í) клеток эпителиоподобного типа, В. дальнейшем либо длительно культивировали клетки без пересева, либо в процессе пересева проводили отбор и селекгода на увеличение числа клеток эттелиоподобного типа.

В первом случае в течение трех недель через каждые 4-5 суток проводили смену среды на 30-50^ с добавлением 3^-ного глу-таыина (5 ма на 500 мл среды) и I0-30JE телячьей сыворотки.

В результате длительного культивирования без пересева на-бледали постепенное отмирание клеток фибробласзоподобного типа, которые формировали колония однородных клеток. Размножение кле-.ток в колониях происходило медленно и только через 4-5 недель от начала культивирования накопление клеток было достаточным для пересева в том же флаконе 1:1. Последующие пересевы делали в соотношении 1:2, концентрация клеток при пересеве составляла 150-800 тыс.кл/ыл.

Первые 3-4 пассажа монослой в культуре формировался в течение 2-3 недель. В это время каждые 5-6 дней проводили частичную смену среды на 30-50Í. Культура стабилизировалась на 5-6 пассаже, а к 3-10 паосахам получали культуру с преобладанием до &е-10С# клеток эпителиоподобного типа.

Дальнейшие пассажи, по существу, не вносят изменений в состав клеточной популяции, и культура сохраняет характерные для эпителиоподобных кдвтех культу рально-морфологически е свойства.

Описанный метод позволяя надежно выводить диаловдные культуры легкого плода коровы с характеристикой клеток эпителиооо-добного типа.

Метод длительной селекции эпителиоподобвшс клеток, вира-ценных вз эксплантатов, -также оказался пригодным для выведения штамма диплоидных меток.

На окрашенных гематоковлин-еозином препаратах культур® клеток на уровне Б, 10, 20, 25, 45 паосажей была представлена преицущеотаенно однородными крупными клетками полигональное формы. Яцро клеток крупное, округлой фор*м, о 3-5 ядрдакаиж,

С учетом литературных дртшт ( Bradley K.H.a.ooll. 1980; Stone* L.J)., 1980; Douglas V.H.L.,Sendera К.Ь. .Hitchcock K.B., I960), можно считать, что выведенная ваш новая диплоидная культура легкого плода коровы представлена в основной легочными клетками 2-ГО типа { Pulmonary Type II С«11»).

Ииготическую активнооть изучали на уровне 5, 10, 15, 35, 45 паосажей. Для определения диаиш размножения клеток их высевали в равном кодичеотве 100 тыо.хл/мл в пеницплджновые флаконы оо стеклышками. Через каждые 24, 48, 72, % часов культивирования отекла о выросшей культурой из 3-х флаконов фиксировали и окрашивали геиатоксялжн-еоэняоы. Результат подсчета митотичеокого индекса отражены в тайл.1.

Таблица X

Изменение митотичеокого индекса а культуре ЛЗК в процессе длительного субкультквирования

Пассам i........Bw.№ ксдадэдари.^ась!-----------------

í_£á_I_42_I_72 1 96_

Миютичеокнй индекс °/оо tmmnupri

Г

5 пассаж 4-5 8-10 10-12 7-6

10 паооаа 5-6 9-10 11-12 7-6

15 пассаж 7-8 11-12 12-13 8-9

35 васоаж 7-6 11-12 13-15 Э-Ю

45 пассаж 7-6 22-13 15-17 &-Ю

I I

На табл.1 видно, что наиболее высокая штотическая активность {пик) отмечается х 48-72 часам кухьтивировашш. На 5-10 пасоажа ыитотичеояая активность составила 8-12°/оо на 2-3 сутки культивирования, а на 15-45 пассажах, когда культура стабилизировалась, датоткческая активность была наибольшей ж составила 15-17°/оо ва третьи сутки культивирования.

При кариологдческом анализе определили модальное число хромосом в клетках культур. Распределение числа хромосом в .клетках диплоидной культуры легкого плода коровы колебалось от

46 до 61 хромосомы о модальным классом хромосом - 2» а 60 до

72-76^ Hs уровне 45 пвссажа,

В процессе дальне Йие го пассирования культури ЛДЗК в пределах 70-86 пассажей культура сталэ гиподипловдной и превратилась в постоянную клеточную линию с модальным классом хромосом - 55-56 до 55.3Ü.

Проведено пять опытов по роллерноку культивированию диплоидной культуры легкого плода коровы. Для внращквакия культуры использовали пробирки и культуральные флаконы объемом 250 н 500 ш. Посевную концентрацию клеток брали для флаконов 150 в 250 тысяч клеток в I ш питательной среды, для пробирок 250350 тыс.кл/мл.

Пробирки и флаконы о суспензией до размещения в роллерноы аппарате выдерживали в стационарных условиях 30 кинут, а затем включали роллер и проводили культивирование при скорости вращения X оборот за 5 минут. Для внралщвания использовали роллор-ный аппарат шел враиогаихся пробирок, которой для культивирования »»флаконах бил специально переоборудован.

Объем питательной среды составил для пробирок 4-5 мл, в 250 мл флаконе - 20-25 кл, в 500 мл флаконе - 45-50 мя. В качестве питательной среды использовали среду яв основе ФТЫ-С, среду 0,5% ГЛА на растворе Хеккса со средой 199 в равных объ-■ емах в IO-ISi сквороткя крупного рогатого скота.

Монослой в пробирках д флаконах яри родлерном ^льтквиро-вании сформировывался ва 3-4-е сутки культивирования.

При посевной концентрации 250-350 тыс. клеток в I мл сре-дч монослой в пробирках формировался ня 3-4 сутки, коэффициент пролиферации составлял 2-2,5.

Во флаконах объемом 250 и 500 мл при посевной концентрации 250 или 150 тыс. клеток в I мл среды пролвферативвая активность составляла 2,6-5,1.

При этом копечные прирост клеток через 96 часов во флаконах с 150 и 350 тыс.кл/ь-л бил примерно одинаковым, но при посевной концентрации клеток 250 тыс.кл/мл ионойяой формировался раньше-на S сутки.

Получешше данные позволяют сделать вывод о том, что культивирование щшлогтцной культуры клеток легкого плода корова в роллерной установке являются веське перспективными но Сравнению со стационарным культивированием.

С далью длительного сохранения культур Í3K в жидком аво» ■те проведена криогенжэвдо! культура на 15, 25, 35, 45 пассажах. .Состав криозащитной ореда: ДДСО - 10?, среда на основе ФШ-С -50?, сыворотка крупного рогатого окота - 40?. lepes 14-90 дней хранения в жид ком азоте (-196°С) проводка размораживание ж рекультивирование культуры соотавтствувдвх-о паооажа (табл.2). Через 24 часа от начала культивирования размороженной культуры Проводили смену вреда.

Таблица 2

.! Результаты доследований по хр&огенвз&шга культуры ДйЭК

Ш 'Коншнт-'Срок 'Жизне- 'Посевная'Срок *

nao- (рация Iхраве-1одоооб-1ковдант-!форми- 1Морфологичеокая

сажа .клеток в.вия •ность, ¡^ация Ьц^мл) .роввния .характеристика 'мовоолоя' t(сутки) 1

15 2,806 14 ЛИ. 56,3 300-350 4-5 ЦовоолоЙ пред-

15 2,808 30 да. 58,0 300-350 4-5 ставлен клетками впителдоводобно-

25 2,86 30 да. 62,0 300-350 3-4 го типа

25 2,66 3 ыео. 62,8 300-350 3-4

35 3,12 30 да. 64,0 300-350 3-4 - " —

36 3,12 3 иео. 63,7 300-350 . 3-4 — —

45 3,14 30 да. 67,0 300-350 3-4 • " -

45 3,14 3 мео. 67,0 300-350 3-4

Из табл.2 видно, что по мере паоагроваяия увеличивается процент жизнеопоообных клеток оооде размораживания. Ионоолой формируется на одни сутки раньше. Так, на паооахе после размораживания было 56-58? жизнеспособных клеток я моноолой формировался на 4-5 сутки, а па 45 пассаже число жизнеспособных жхеток возросло до 67? к моноолой формировался па 3-4 оуткж. Кроме того, определенное влияние могла оказать .концентрация клеток в I мд криоэащатной среды,

Кулыгура сохраняла свои свойства ж была представлена клетками »питаджоподобного тгаш, т.е. морфологически ве отличалась

от доходной культуры.

Следовательно, диплоидную культуру легкого плода коровы можно сохранять в жиднч азоте* Криогенизация при жопольвова-яжх среда указанного состава ве оказывала отрицательного вла-

Чувствительность первичных культур и диплоидной культуры легкого плода коровы к вирусам ИРТГ ПГ-3

Ш иного рогатого скота, ротавирусной инфекции телят, лошадей и их цитопатогеиное действие

Взаимодействие вирусов с клеткой носит различный характер и может проявляться патогенными изменениям« в клетках различных ткйнеВ, которые свойственны каждому из изучаемых вирусов в зависимости от чувствительности тех или иша клеточных культур,' используемых в эксперименте.

Проведено изучение цвтопатогеиного действия следуадях виру сов- воз будит елей болезней крупного рогатого скота: вируса ИРГ (штамм "Шалово"), вируса ПГ-3 (штамм QTK-45) и ротавярус-вой шфекции (штамм "РИ") на первичные культуры, субкультуры и диплоидную культуру легкого плода коровы (30 пассажа), В качестве контрольных брали чувствительные к вирусам ИРХ ПГ-3 и ГШ культуры ПЭК.СПТ, а к ротавирусу - культуры ГОК.

Культуры клеток легкого плода коровы высокочувствительны к указанным вирусам d проявлением характерного цитопатогеиного действия. Результаты сравнительного титрования вирусов даны в табл.3.

Таблица 3

Результаты сравнительного титрования вирусов на культурах

ml а^у'сы 1Ътр вируса Гит

nij ^ Оитающ)^ СПТ__1 СПЭК I ДЛЭК I _

1.~ИРТ~{Щапово7 ~ ~ 6,06*0,39 6,3?ХоТз9 6,692o7l9 ~24-AS

2. ПГ-3 (ТА) 6,06±Р,1в 5,94jP,I6 5,81^0,19 48-72

3. FiUI (КБ-1) 5,81*0,21 - 6,37jfl,I6 24^36

(№3-1)' 7,12*0,16 - 6,62_tO,I6 24-36

(T-2) 6,6*0,10 - 6,69+0,06 24-36

4. Ротазпрус (PM) стационарно - 4,5+5,0 6,0-6,5 24-48

В роллере -6,0-6,5 7,0-7,25 24-36

Из гдбл.З. видно, что вирус ИРТ и ПГ-3 накапливается в диплоидной культуре легкого плода коровы в том же титре, как и в контрольных культурах. Титр вируса РПЛ был сходным или несколько превышал показателя в контрольной культуре. Титр рота-

>ируса а стационарной я "роллерной культу^В" Д5ЭК был на 1,0-1,5 вша, чей а контрольной субкультура НЭК,

Лдя изучения ци то патогенного действия вирусов использовали монослой клоточных культур, выращенный ва стеклах в пеницил-диновых флаконах. Вирусы ИРТ и ПГ-3 вносили во флаконы посла удаления ростовой среды я замены ее на поддерживащую в дозе 1-2 'ШЗЦ^Дд, а ротавирусной инфекции в разведении 1:10 в присутствии 0,35% трипсина - 15 ыкгЛи. Через каждые 6, 9, 12, 18, 30, 5С, 48, 72 я 96 чаоов культивирования клеток после внесения вируса из флаконов извлекали по 3-4 стеклышка, фиксировали и окрашивали гематоксилиноы-эоэином по методике, описанной в учебно-методическом пособия (Л.П.Дьяхонов, В.в.Глухов, А.А.Поздкяков и др., 1980).

Исследования по цитопаталогии проведены на диплоидной культуре ЛЭК 28 я 39-го пассажей культивирования, зараженной вирусом ИРТ или ПГ-3 крупного рогатого скота, и на 8-м пассаже субкуяьтивироваяия культуры ЛЭК, зараженной ротавирусощ.

Время проведения исследований зараженной культуры выбирали в учетом данных по действию указанных вирусов на другие культуры; почки теленка, почки змйриона коровы и др. (З.Ф.Зу-двлина, 1970; А.Н.Белкина, 1972; Н,Н. Крюков, 1978; С.Ф.повелев, 1973; Д.А.ДаяишевогаЙ, 1978; В.С.Авилов, М.М.Гоголев, Н.И.Соколова, 1983). ■ . ,

В результате изучения динамики патологических процессов в культуре клеток ЛЭК, зараженной вирусами ИРТ, ПГ-3 и ротавирусной инфекцией, обнаружен ряд характерных изменений, которые дозволяют морфологически различать действие того юга иного вируса на различных стадиях инфекции в культуре.

Длл И1Р - это крупные внутриядерные включения и разрушение монослоя в период.18-36 чаоов, а также ядерный клазматоэ на 12 часов; для ПГ-3 - виутрицитохиазштичаские включения на 21-36-72 часов, появление наряду о этим мелких внутриядерных включений на 72-96 часов и разрушение ыонослол,' сишластнооб-, ргаоваше выражено слабоI для ротавирусной янфещии - появле-тао через 8-10 часов окодоядерних и вскругядаряых вакуолей, шкноэ ядер ж клеток, яа протяжении всей инфекция - вакуолизация цитоплазмы. Довольно характерными являются наличие пнк-нотизировашгах клеток на поверхности неразрушеятс: участков

клеточного монослоя, в также двуягерных клеток, где лира плотно прилегают друг к другу. Полная дегенерация монослоя при ротави-русной инфекция, сопровождающаяся симпластообраэ оэони ем, наблюдается через 36-48 часов.

Изучение распространения респираторных заболеваний с^дл »юлодняка крупного рогатого скота в Грузинской

Анализ статистических из териалов по заОолеванто респираторными инфекциями молодняка крупного рогатого скота 2-8-месячного возраста s хозяйствах Грузинской ССР за после дате пять лет показнвалт, что в разных районах республики, в осенне-звмне-ве-сеншгй периоды заболевает 30-45? животных. НаиОольвео число случаев диагностируется зимой и ранней весной, однако заболевание устанавливают я летом, особенно в хозяйствах при большой концентрации животных.

Ретроспехтиглша исследования парных сывороток в рял.9 хозяйств Грузинской ССР с цельс выяснения причин респираторных забслев81Яй позволили серологически установить заболеваемость молодняка крупного рогатого скота парагрштои-З. Результаты исследований паны в табл.4.

Таблица 4

Результаты серологического исследования проб сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота на парагрипп-Э в хозяйствах Грузинской ССР

Я»!

па! Районы i Í I

!К-во1Выявле-!хо- (но не-!жяа-1Слаго-!.ств ¡получн. !хоэяй-

i

(ств

К-во IПоло-Tí с иво-! и- | поло-роток ¡тель-J *ит, !но !реак-1реа- !ций

IÍ-Z1-IZ + -гг "5"

X. Адмотский 4 4 XX 4

2. Лагодехски2 2 X 80

S; Гардабакский 2 2 72

4, Цхакаевский ■■ г X ' 196

5. 'Горийскдй , " i ' I ' 108

6. ¡.¡цхетскай ■ i . I 106

7." ХаедjcKiií' i I ■ '■.46

S." Еолнисскпй V 2 - ■ '"' г ■ 158'

1X2 64 70 ' 54 72 ; 86

!Титр гемаг-!глотиюгаов I (в PITA) ! !

L--C--

98,2 60 97,2

27.5

66.6 81,1

22 .47,8 76 ■ 48.Х .

10-1:640

10-1:640

10-1:640

10-1:160

10-1:640

10-1:320

10-1:80

10-1:1280

Окончание табл.4

___з___а» - 2 _ ____а____

10. Карельский I 1 SS 37 37,7 1:10-1:1280

II. ЬЬлковский I X 85 54 62,8 1:10 -1:80

12, Самтредский 2 2 202 184 SI.O ■ I:1'0-I:I280

13. Тианетский I I 38 33 100 IÍ10-1:1280

14. Зугшщскнй . I I 34 26 76,5 T:I0-I:I2C0

15, Сигнагский I I 30 28 93,3 1:10-1:«О

16, ХоСский I I 64 . 42 77,8 1--10-1:160

1?. Цителцтшройс- 10 100 t

кий X 1 10 1:10-1:80

IS. Ахалзмгский I t 24 22 SI,7 1:10-1:30

19. Чюроцкуйский I. - 70 55 78, £ 1:^0-1:320

20. С&чкерский I ■ - 12 - ■ . - - .

1Я. Кили си I I 331 327 93,9 1:10-1:1280

2**» Гбилеси I - ¿2 62 100 1:10-1:2S6C

всего: 32 25 1Э97 1461

Результата исследований, отраженные в табл.4, свидетельствуют о том. -ети в боднинотоэ обследованных хозяйств различит районов вителепч животные, идежи» антитела к вирусу ПГ-3, что свидетельствует о шроной циркуляции вируса пара гриппа-5 среди-догслозья крупного рогатого скота в республике.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны метода щадящей тридсинизацяя и культивирования эксгхаятагоз, возводящие получать п«рявчкне клето^эше Кужътуры и клетотсшэ литая из ткали легкого плода ксровн 1СТК) « преобладанием клеток эпитвлпопсдобного типа. Определены опта-ыалкшя услогия зырыцгвония лерричштс культур н субкультур «литок ."?К.

2. .Лтояои отбора и селекция выведена ди1иодвй2Я культура клепк легкого л?.ода корова (ДПЭК) эпнтелвоподобного дала со сщбплысд» гулвтурнс-могфлюгйчесязми егойетватя; шдздышй члисс хроио^ом - 2а - 30 - ка Прович SC-4S пассажей составил

инотичасыС ягаоис ЭТ 3 сука жультинировлнкя -

t игаффидаен? прелкрерадал - 2-3.

5. Щниогкая ау.кмгт» csitok легкого плода короэи втяте-

лноподобкого тина в процессе посл&дуюпцл аересевов превращается в клеточную лишю с гяподиплояднш кариотппом (модальный класс хромссом Е5-56 на уровне 70-ító пассадэй составляет до

4. Клетки дислогикой рультурн легкого плода коровы активно раотут при роллернои культивировании во флаконах и в пробирках. Монослой формируется нг 3-4 сутки. Прирост клеточной мэо-сы составляет 2,5-5,6 в зависимости от концентрации клеток при посеве (250-150 тыс/мп).

ь. Первичные культуры я клеточные линии ЛЭК (субкультуры, дилловдиые культуры, постоянная клеточная линия.) выращивается на питательной среде, изготавливаемой на основе отечественного армюра та - ферментатявиого гядролгаата гшяечннх белков Покровскпм Сиозаводом.

5. Субкультуры- к диплоидная кдэточнан линия ЛЭХ с.схрадянт ;чеходаке биологические свойства после глубокого зоюредования в жидком азотч (-Ig6°C).

7. Гшрыгагав культура, субкультура и дзгак^идцые культура клеток легкого тллока коровы чувствительны к вирусам Енфеют-оиного ринотрахеита a naj)erpwnta-3 KpyitHoro рогатого скота, рогавегрусу телят в рггнепнезмогак лелгэдей. Титр.вируса в диплоидной культуре ЛЭК достигал идя КРТ - 10б' С-Ю '^Ш^о; ПГ-5 - Ю5'°-105'55ТШ16с/ш; ИИ - 105' 2-Ю' уВДйоДга• Р°та" вяруса в роллерной культуре 8-го па с carta - 10 * '"'™Т1Д!д0д|д.

'Дяшомдоая культура ЛЭК пригодна для первичного выделе-ни.ч вируса ринопаезяиии логаадей и вяруса ИРТ из патологического материала и диагностики рот ааиру оной Екфогаоги телят.

О. Быомзны некоторца особенности гдатопатогеиного действия вирусов ИТ, ПГ-З и рота пиру со теля? на диплоидную культуру ЛЭК:

а) вирус ИРТ вызывает влаэкатоз ядер клеток через 12 часов тгафицлроаания культуры, наряду с образованием крупных внутриядерных включений и дегенерацией ыонослоя через 24-48 часов;

■ ' 6} в культура, ич$трровзгоюй »прусом Ш'-З, далкяо вкут-рицатоютаэ'^тичетаме нкттякм' обнаруяяшются уже чорез 21 час, а вкутси.чдйрнае включения наряду с круяшасг щичтлазга-тачвсюп.21, яклггеюиасг, -. чзрез 72-96 часов. Симпдастообразова-нио выролэно,слабо;-

в) ротавирусная инфекция в кухзтуре ЛЯК сопровождается появлением околояаеркых 2 вокругядерншс вакуолей через 6-10 часов, наличием двуядерных щеток, пикноэа ядер в клеток на 12-36 часов, вакуолизацией цитоплазмы. Дегенерация моносдоя наступает через 24-46 часов. По краям дегенерированных участков клеточного пласта видны так .называемые "серповидные клот-. ки".

9, Проведенные исследования по распространению респираторных болезней и ретроспективной диагностике на парагрипп-3 .молодняка крупного рогатого скота в возрасте 2-8 месяцев в 32-х хозяйствах 21 районе Грузинской ССР указывает на широкое распространение втого заболевания в различных природно-климатических зонах республики.

ПРАКШЧЕСКИЕ ЛРВДОШШ I. Получено положительное решение вниш1э К 3963II6/28-Х3 (123009) от 25.02.S6 г, на "Штамм культивируема клеток легкого плода коровы для культивирования вирусов", (Шташ Д/1ЭК К XI депонирован в Коллекции клеточных культур сельскохозяйственных я прсшсловых животных - ВИЭВ, ВАСХ2Ш, ВСКК, CXI).' :' 2. Первичные культуре и клеточные линии ЛЭК рекомендуются для научных исследований н диагностики вирусных инфекций. *. ■

3. Выявленные особенности цитопатогенного действия вирусов UFT, ПГ-З и ротавируса телят на диплоидную культуру ЛЭК могут быть использованы в качестве дополнительного критерия диагностики вирусных болезней крупного рогатого скота.

список работ, адуЕюдазвАнных по так диссертации

1. Аспавидзе Б.П. Культуры клеток тканей легкого и кишечника плода коровы, - Ветеринария, * 10, 1986. - С.95-37.

2. Дьяконов Л.П., Лобуицрва Д.В., Аспанидзе Б.П., Плешакова Г.Ю., Гоголев U.U., Матьюгина H.H., Еудудов Н.Р. Методические рекомендация по культивированию первичных культур клеток н субкультур из ткани легкого плодов крупного рогатого скота. 11., 1965. - 8 с.

Пол/исвмо е печать 5.05.1997г. Заыи МЙ Тгр*ж 100 Форыт в0и84/Ю Мсквва, ,Тшх>гря(и» ВАСлНИЛ