Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Патоморфогенез сальмонеллеза поросят, вызванного разными сероварами

На правах рукописи

ЛАКОВНИКОВ ЕВГЕНИЙ АЛЬФРЕДОВИЧ

ПАТОМОРФОГЕНЕЗ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ПОРОСЯТ, ВЫЗВАННОГО РАЗНЫМИ СЕРОВАРАМИ

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Санкт-Петербург 2006

• ¿Г.

Работа выполнена на кафедре патологической анатомии и судебной ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Научный консультант - доктор ветеринарных наук, профессор

Буянов Анатолий Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Повзун Сергей Андреевич, доктор ветеринарных наук, профессор Жаров Александр Васильевич, доктор ветеринарных наук, профессор Сулейманов Сулейман Мухитдинович

Ведущая организация - ФГОУ ВПО «Вятская государственная сельскохозяйственная академия».

Защита состоится ¿2 '?АХу{*/ 2006 г. в 13.00 на заседании

диссертационного совета Д 226.059.0l при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, Черниговская ул.,5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Автореферат разослан « — 2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета доцент

Никишина И.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Заболеваемость и гибель животных на фермах обусловлены широким распространением патогенной и условно-патогенной микрофлоры, среди которых одно из первых мест принадлежит сальмонеллам. Огромное количество серовариантов сальмонелл (род Salmonella Lignieres 1900) является патогенным для многих видов животных, а также для человека. Повсеместное распространение во внешней среде, заболеваемость сальмонеллезами сельскохозяйственных животных и птицы, восприимчивость людей всех возрастов делает проблему весомой для ветеринарии и медицины, а сальмонеллезы остаются опасными болезнями в эпизоотоло-гическом и эпидемиологическом отношениях. За многие годы накоплен значительный объем информации по всем сторонам этой проблемы, однако сложные аспекты морфофункциональных особенностей и взаимосвязей систем организма, некоторые вопросы патогенеза, морфологической диагностики еще недостаточно широко освещены. Совершенствование пато-морфологической диагностики остается по-прежнему неотъемлемой частью изучения этой распространенной инфекции.

Исследования, проводившиеся сотрудниками кафедры патологической анатомии Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины с 1989 года совместно с кафедрой эпизоотологии и лабораторией сальмонеллезов ВНИИ им. Л.Пастера, дают основание считать в настоящее время данную инфекцию в хозяйствах Ленинградской области актуальной проблемой. Обстоятельные фактические сведения о структурно-функциональных нарушениях при развитии инфекционного процесса приобретают особое значение при расшифровке патогенеза и прогнозирования исхода болезни, в разработке более эффективных способов диагностики и терапевтических воздействий.

Изучение патоморфогенеза сальмонеллеза у свиней является важнейшим вопросом в исследовании этой болезни. Несмотря на то, что патомор-фологические изменения «классического» проявления этой болезни давно известны, остается весьма затруднительной верификация диагноза. Течение болезни со стертыми проявлениями и при сочетании с другими патологическими процессами, а также инициация «нестандартными» для свиней серо-варами делает проблему актуальной в раскрытии иммунологической компетенции организма. Остаются не вполне уточненными патологоанатомические изменения при некоторых формах течения сальмонеллеза поросят, вопросы танатогенеза этой болезни и посмертная экспресс-диагностика.

Цель работы. Изучить морфофункциональные особенности изменений иммунокомпетентных и других органов при сальмонеллезе, вызванном различными сероварами сальмонелл, на основе патологоанатомических гистологических, электронно-микроскопических и иммунологических методов.

Задачи исследования:

1. Дать морфологическую оценку изменениям в иммунокомпетент-ных органах, печени, легких и надпочечниках поросят при сальмонеллезе, вызванном разными сероварами сальмонелл у свиней, выяснить морфоге-нетические элементы возникновения их.

2. Воспроизвести моделирование острого сальмонеллеза у поросят и лабораторных белых мышей с использованием выделенных от свиней се-роваров сальмонелл.

3. Определить ультраструктурные изменения в иммунокомпетентных органах, печени, легких и кишечнике у экспериментальных животных при заражении видоспецифичным и невидоспецифичным сероварами сальмонелл через 1 сутки после заражения.

4. Выявить специфичность морфологических изменений в иммунных органах в зависимости от серовара.

5. Исследовать морфологическое проявление геморрагического синдрома при остром сальмонеллезе у поросят.

6. Изучить возможность применения реакции иммунофлюоресценции для диагностики сальмонеллеза свиней.

Научная новизна заключается в системном подходе к решению поставленных задач, позволивших более подробно изучить последовательность специфических иммуноморфологических изменений в органах иммунитета поросят в зависимости от серовара возбудителя сальмонеллеза. Впервые проведено комплексное патоморфологическое, бактериологическое, иммунологическое и электронно-микроскопическое исследование сальмонеллеза поросят с использованием биологической модели. Выяснена роль клеточных и гуморальных факторов иммунитета у поросят 2-4 месячного возраста в специфической защите организма при экспериментальном заражении видоспецифичным и невидоспецифичным сероварами сальмонелл. Использование в качестве экспериментальной модели белых мышей для воспроизведения острого сальмонеллеза выделенными от павших поросят сероварами Salmonella typhimurium и Salmonella typhi suis с учетом видоспецифичности применено впервые. Проведен подробный ультраструктурный анализ состояния органов иммуногенеза, тонкой кишки, печени и легких при экспериментальной сальмонеллезной инфекции у поросят и белых мышей в первые сутки после заражения патогенными сероварами возбудителя. Морфологические признаки, характеризующие развитие при остром сальмонеллезе геморрагического синдрома изучены впервые. Определены гистологические изменения в печени, легких и надпочечниках у поросят в зависимости от серовара возбудителя. Разработана и впервые практически применена методика прямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) для выявления сальмонеллезного антигена в мазках-отпечатках из внутренних органов павших свиней.

Теоретическая и практическая ценность. Результаты проведенных исследований уточняют и дополняют сведения о патоморфогенезе сальмо-неллеза поросят, что способствует совершенствованию диагностики этой болезни. Изучение морфологического проявления геморрагического синдрома при остром сальмонеллезе помогает определить его участие в тана-тогенезе. Использование для воспроизведения сальмонеллезной инфекции белых мышей и поросят позволяет выявить начальные патологические процессы в органах и проследить судьбу сальмонелл разных сероваров в первые сутки после заражения при применении электронной микроскопии. Определение иммунного статуса у экспериментально зараженных разными сероварами сальмонелл поросят послеотьемного периода выявляет функционирование некоторых звеньев иммунитета в начальные этапы болезни, что может быть использовано при разработке превентивных мер борьбы с сальмонеллезной инфекцией. Применение прямой реакции иммунофлюо-ресценции (РИФ) с использованием диагностического флюоресцирующего сальмонеллезного иммуноглобулина к антигенам А, В, Д НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН может быть использовано в качестве средства экспресс-диагностики сальмонеллеза при посмертном исследовании органов свиней. Полученные данные применимы в практической деятельности ветеринарных врачей и лабораторных специалистов при посмертной диагностике сальмонеллеза поросят, позволяют глубже осмыслить суть происходящих патологических процессов.

Результаты исследований по патоморфогенезу сальмонеллеза вносят вклад в развитие ветеринарной патологии, могут быть использованы в учебном процессе на морфологических и клинических кафедрах ветеринарных факультетов, а также их можно рекомендовать для включения в учебные руководства по патологической анатомии животных.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на: Международном семинаре «Проблемы моделирования патологических процессов у человека и животных и испытание биологически активных препаратов» (Санкт-Петербург, 1992); Международном семинаре «Проблемы моделирования патологических процессов у человека и животных: иммуно-дефициты, их диагностика и коррекция» (Санкт-Петербург, 1994); Межвузовской учебно-методической конференции «Применение современных образовательных технологий в учебном процессе» (Кострома, 2000); Всероссийской научно-методической конференции патологоанатомов ветеринарной медицины (Омск, 2000); научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2003, 2005); Всероссийской научно-методической конференции патологоанатомов ветеринарной медицины (Уфа, 2003); Международной научно-производственной конференции «Актуальные вопросы эпизоотологии на современном этапе» (Санкт-Петербург, 2004).

Внедрение результатов исследований. Материалы диссертации используются в учебном процессе и при проведении научно-исследовательских работ в сельскохозяйственных высших учебных заведениях и ветеринарных лабораториях России, что подтверждено соответствующими справками и заверено.

Методическое пособие для ветеринарных врачей «Обнаружение саль-монеллезного антигена в мазках-отпечатках методом РИФ» (Лаковпиков Е.А., Сидоров В.Л., 2000) рекомендовано к использованию в практике ветеринарной медицины Северо-Западного района РФ научным Координационным Советом по животноводству и ветеринарии СЗНЦ Россельхозакадемии (протокол №4 от 14 июля 2000 г.) и рекомендовано Коллегией Комитета Правительства Республики Дагестан (протокол от 11 марта 2005 года № 1).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сальмонеллы вызывают деструктивные изменения в центральных и периферических органах иммуногенеза.

2. Патоморфологические изменения в иммунокомпетентных органах зависят как серовара возбудителя, так и от реактивности организма поросят.

3. Незавершенный фагоцитоз макрофагами приводит к внутриклеточному паразигированию сальмонелл в макрофагах внутренних органов.

4. Существенную роль в танатогенезе болезни имеет геморрагический синдром.

5. Обнаружение возбудителя в органах возможно при использовании прямой реакции иммунофлюоресценции со стандартными диагностическими иммуноглобулинами.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 23 научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 410 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 34 таблицами, 202 рисунками и 1 диаграммой. Включает введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения. Список использованной литературы включает 327 источников, в том числе 55 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований.

Исследования были проведены на материале, полученном от трупов и вынужденно убитых свиней из хозяйств Ленинградской и Архангельской областей. Патологоанатомически исследовано 114 голов в возрасте до 4 месяцев больных сальмонеллезом. Для уточнения диагноза и определения серовара возбудителя в большинстве случаев отбирали материал для бактериологического исследования и от всех вскрытых для гистологического, гистохимического и морфометрического исследований.

Патологоанатомическое вскрытие трупов проводилось с полной эвис-церацией органокомплекса по методу Г.В. Шора, органы и ткани подвергались визуальной оценке, особенно органы пищеварения, лимфоидная ткань кишечника, мезентериальные лимфоузлы и селезенка, тимус, миндалины, легкие, надпочечники, почки, головной мозг.

Бактериологические исследования выполнялись на базе кафедры эпизоотологии Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, в Санкт-Петербургской городской ветеринарной лаборатории, а также в отделе сальмонеллезов лаборатории кишечных инфекций ВНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л.Пастера. Образцы органов (кусочки печени и селезенки с регионарными лимфоузлами, брыжеечные лимфоузлы тонкой и толстой кишки, легкого, средостенных и бронхиальных лимфоузлов) подвергали бактериологическому исследованию с целью обнаружения сальмонелл. Посевы делали на мясопептонный агар (МПА), среды Эндо, Олькеницкого, для изучения серологических свойств сальмонелл проводили типирование в пластинчатой реакции агглютинации с применением поливалентной (ABCDE) адсорбированной О-сыворотки, с отдельной групповой и далее с монорецепторами Н-агглютинирующими сальмонеллезными сыворотками. Помимо этого, при отсутствии агглютинации с поливалентной ABCDE О-сывороткой и положительной реакции с поливалентной сывороткой редких групп проводили дополнительные биохимические тесты с целью определения принадлежности к подродам сальмонелл, а далее исследовали штамм с помощью моновалентных О-сывороток редких групп и Н-сывороток.

Моделирование инфекции производили на белых нелинейных мышах весом 14-16 граммов в количестве 24 голов. В качестве возбудителей использовались серовары S. cholerae suis, S. typhi suis, S. typhimurium. Заражение проводили интраназально и перорально живыми бульонными культурами в дозе 2-6 миллиардов микробных тел по стандарту мутности. Через 1-7 суток после заражения мышей усыпляли хлороформом и декапитировали.

Гистологическое исследование. Для гистологического исследования отбирали образцы внутренних органов от трупов и вынужденно убитых поросят и мышей. Кусочки из печени, селезенки, лимфатических узлов, кишечника, легких, почек, надпочечников, головного мозга, миокарда, тимуса фиксировали в 70 % спирте, 10% формалине, жидкостях Карнуа и Буэна. Проводку и заливку в парафин и парафин-целлоидин делали по общепринятым методикам. Из блоков приготовляли срезы толщиной 6-8 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином, азур-П-эозином по Ро-маиовскому-Гимза, методом Мак-Мануса на гликоген и гликозаминглика-ны. Гемосидерин в срезах определяли реакцией на берлинскую лазурь по Перлсу и реакцией на турнбулеву синь по Тирману-Шмельцеру. Жировые включения в клетках замороженных срезов выявляли насыщенным

раствором Судана III. ДНК и РНК в плазматических и тучных клетках определяли с помощью метода Браше метиловым зеленым-пиронином, лейкоциты изучали с помощью окраски по Гольдману. Состояние иммунокомпе-теитных органов оценивали морфометрическими способами с использованием окуляр-микрометра и сетки Глаголева A.A. Количественные данные обрабатывали статистическим методом Монцевичуте-Эрингене Е.В, (1964). Фотографирование объектов проводили при помощи цифровой микрофотокамеры.

Электронно-микроскопическое исследование. С целью выяснения первичных изменений в легких, печени, тонкой кишке, тимусе, брыжеечных лимфоузлах, пейеровых бляшках и селезенке поросят и белых мышей при экспериментальном иптраназальном заражении сероварами S. typhi suis и S. typhimurium была использована электронная микроскопия.

Трансмиссионное электронно-микроскопическое исследование проводили на материале от 6 поросят и 12 белых мышей. Сразу после убоя животных кусочки органов фиксировали в фиксаторе Колфилда на веронал -ацетатном буфере при pH 7,2-7,4 и температуре +4°С, а затем проводили поэтапную заливку в эпон Fluka. Ультратонкие срезы толщиной 560-600 А контрастировали в растворе уранил-ацетата свинца. Срезы для трансмиссионной электронной микроскопии готовили на ультрамикротоме LKB-880 (Швеция), исследования проводили на электронном микроскопе JEM-100СХ (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кв.

Автор выражает искреннюю благодарность за помощь в выполнении данного раздела исследований заведующему лабораторией электронной микроскопии НИИ Гриппа Минздрава России к.м.н. В.П.Сухинину и с.н.с. Института медицинской микологии им. Кашкина к.б.н. В.В. Семенову.

Обнаружение сальмонелл методом РИФ. В качестве экспресс-диагностики сальмопеллеза использовалась прямая реакция иммунофлюо-ресценции, проводившаяся на мазках - отпечатках из внутренних органов и тканей павших поросят с использованием диагностического флюоресцирующего сальмонеллезного иммуноглобулина к антигенам А, В, Д, производимого предприятием по производству биопрепаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Москва). Мазки микроскопировали с водной иммерсией, либо с иммерсией в фосфатном буфере на микроскопе-спектрофлюори-метре «ЛЮМАМ-И5М» при следующих параметрах: объектив водной иммерсии х60 /Д = 0/, окуляр х10, возбуждающий фильтр СС 15-2, запирающий фильтр ЖС - 18 + ЖЗС - 19 (зелёная пластина). Результаты иммуноф-люоресцентного исследования учитывались по интенсивности специфического зеленого свечения антигена.

Иммунологические исследования. Исследования морфологического состава периферической крови проводили в лаборатории кафедры физиологии СПбГАВМ. Для оценки иммунного статуса у поросят, зараженных

Salmonella typhi suis и Salmonella typhimurium, исследовали кровь по основным иммунным показателям и проводили гистологическую оценку органов иммунной системы. Количество эритроцитов, лейкоцитов определяли общепринятым методом, используя камеру Горяева (Предтеченский В.Е., 1960), лейкограмму составляли при микроскопическом исследовании мазков крови, окрашенных по методу Филлипсона; гемоглобин определяли гемоглобин-цианидным методом с помощью фотоэлектроколориметра «КФК-3». Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом дискретного осаждения по Костиной М.А. (1983). Функциональное состояние Т-системы оценивали реакцией торможения миграции лейкоцитов (PTMJI). В качестве митогена использовали фитогемагглютинин (ФГА) в концентрации 50 мкг/мл. С помощью НСТ-теста определяли ки-слородзависимые антиинфекционные системы фагоцитов. Использовали цитохимический вариант НСТ-теста (Виксман М.Е., Маянский А.Н., 1979). При этом постановку теста осуществляли в двух вариантах — базальный и стимулир ов анный.

С помощью лизосомально-катионного теста (ЛКТ) (Пигаревский и со-авт., 1987) определяли степень активности микробицидных систем фагоцитов. Высушенные мазки крови окрашивали спиртовым раствором прочного зеленого, а затем докрашивали 0,25% водным раствором Азур-П. Определение количества иммуноглобулинов в сыворотке крови проводили экспресс-методом с использованием ZnS04 и ФЭК с использованием калибровочных таблиц на кафедре биохимии СПбГАВМ (профессор Карпенко Л.Ю.).

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Основные причины надежа свиней по данным патологоана-томического мониторинга и результаты бактериологического исследования органов поросят, павших от сальмоиеллеза. За последние годы сотрудниками кафедры патологической анатомии СПбГАВМ было проведено около 1600 патологоанатомических вскрытий трупов свиней разного возраста. Всего было подвергнуто исследованию трупов поросят в возрастной группе 0-26 суток - 462 головы, в группе 27-106 суток — 995 голов, свиней старше 106 суток — 145 голов. Анализ результатов аутопсий показал, что основной причиной падежа свинопоголовья является определенный набор инфекционных болезней: сальмонеллез, гемофилезиый полисерозит, колибактериоз, дизентерия, пастереллез (69%). Заболеваемость свинопоголовья сальмонеллезом в определенной мере зависела от возрастной группы и сезона года и колебалась в пределах от 2,2% до 8,4 % (5,1% в среднем) из числа павших от инфекционных болезней.

Бактериологическому исследованию (использовали аутопсийный материал печени, легких, средостенных лимфатических узлов и брыжейки, селезенки, миндалин) был подвергнут материал от 55 трупов поросят разного возраста (от 30-дневных до 4-месячных) для

подтверждения диагноза. От 31 трупа выделяли патогенный возбудитель Salmonella typhy suis, а также Salmonella typhimurium (19 случаев), и Salmonella cholerae suis (5 случаев).

2.2.2. Разработка методики обнаружения сальмонеллезного антигена в мазках-отпечатках методом РИФ. Для обнаружения сальмонелл в мазках-отпечатках из внутренних органов павших и вынужденно убитых животных проводилась реакция прямой иммунофлюоресценции с использованием диагностического флюоресцирующего сальмонеллезного иммуноглобулина к антигенам А, В, Д. Положительное свечение иммуноглобулина происходило практически во всех исследуемых органах, а наилучшие результаты были получены в препаратах из печени, легких и мезентериаль-ных лимфоузлов, даже если антиген присутствовал в них в ничтожных количествах. Результаты оказались сопоставимыми с результатами бактериологического исследования. Препараты могли сохранять иммунофлюорес-ценцию при хранении при Т° +4 - +5°С до двух недель, но интенсивность флюоресценции в процессе хранения постепенно снижалась.

2.2.3. Патологоанатомическне изменения у поросят при сальмо-неллезе. Статистическая обработка данных аутопсий позволила отобразить в процентном соотношении наиболее часто встречаемые изменения в виде диагнозов.

Патологоанатомическне изменения у поросят, павших от заражения Salmonella typhi suis: эксикоз и истощение (100%), цианоз кожи и подкожной клетчатки (100%), оспоподобная сыпь на животе и конечностях (29%), акцидептальная трансформация тимуса (100%), серозный лимфаденит подчелюстных узлов (100%), катаралыю-гнойный с ареактивными некрозами (80%) и некротический тонзиллит (19%), лимфаденит средостенных и бронхиальных узлов с некрозами (96%), некрозы селезенки (3%), портальный лимфаденит селезенки (100%), портальный лимфаденит печени (97%), некротический лимфаденит тонкой (98%) и толстой кишки (75%), двусторонняя лобарная катарально-гнойная и некротизирующая пневмония (45%) и фибринозная и гнойно-некротизирующая пневмония (43%), фибринозный плеврит (87%), белково-жировой гепатоз с милиарными некрозами (95%), острый катаральный и крупозно-дифтеритический илео-тифлит (100%), фибринозный перитонит (80%).

Патологоанатомическне изменения у поросят, павших от заражения Salmonella typhimurium: истощение (100%), отек подкожной клетчатки шеи (22%), акцидентальная трансформация тимуса (93%), острый серозный лимфаденит подчелюстных, шейных, околоушных лимфоузлов (100%), острый катаральный тонзиллит с милиарными некрозами (60%), отек и гиперемия тимуса (7%), острый лимфаденит брыжеечных и средостенных л.у. (100%), увеличение лимфофолликулов кишечника (79%) и лимфоузлов толстой кишки (100%), двусторонняя лобарная катарально-гнойная

бронхопневмония (64%), кровоизлияния под эпикардом, на реберной плевре (35%), острый катаральный гастрит (100%), отек брыжейки толстой кишки (80%), мелкоочаговый дифтеритический тифлоколит (21%), острый катаральный и катарально-дифтеритический тифлоколит с набуханием лимфофолликулов (79%).

Анализ результатов аутопсий трупов поросят свидетельствует об определенном патологическом воздействии с некоторыми специфическими особенностями для каждого серовара на органы разных систем организма, особенно иммуногенеза, пищеварения, дыхания, кровообращения.

2.2.4. Морфологическая характеристика изменений в печени и в печеночных (портальных) лимфоузлах поросят при сальмонеллезе, вызванном Salmonella typhi suis и Salmonella typhimurium. Основные патогистологические изменения в печени, обнаруженные у различных особей

с сальмонеллезом представлены в таблице 1.

Таблица 1

Основные патогистологические изменения в печени поросят

№ п.п. Патогистологаческий диагноз % случаев Доминирующий серовар (%)

1. Множественные цептролобулярные некрозы 18,3 S.typhi suis (69,2%)

2. Гранулематозный гепатит 18,3 S. cholerae suis (30,7%)

3. Острый гепатит 15,5 S. typhi suis (27,2%)

4. Токсическая дистрофия печени 29,6 S. typhi suis (42,8%)

5. Без патологии 18,3 S. typhimurium (46,1%)

Таким образом, кроме характерных для сальмонеллеза гранулематоз-ных и некротических выявляются другие формы поражений с преобладанием токсической дистрофии.

Макроскопический осмотр портальных лимфатических узлов у зараженных S. typhi suis позволил обнаружить незначительное увеличение их в размерах. Гистологически выявлено уменьшение числа лимфоцитов в корковой зоне и мозговых тяжах за счет некроза, обнаруживали эозинофильные и нейтрофильные гранулоциты во всех зонах лимфоузлов. При заражении S. typhimurium концентрация клеток, особенно лимфоцитов снижена в Т- и B-зонах. Макрофагальная реакция выражена слабо. Некрозу подвергались, в основном, лимфоциты, а ретикулярные клетки проявляли тенденцию к пролиферации. Отмечали скопления нейтрофильных лейкоцитов в

корковой зоне. Установлена острая фолликулярная гиперплазия с преобладанием фолликулов со светлыми центрами и некроза центров фолликулов, которая возникает при массивном антигенном раздражении лимфатических узлов, воздействующим, преимущественно на гуморальное звено иммунитета (Белянин В.Л., Цыплаков Д.Э, 1999).

2.2.5. Патоморфологические изменения в легких и бронхиальных лимфоузлах поросят при сальмоиеллезе. При остром сальмонеллезе были зарегестрированы пневмонии лобулярного, реже лобарного характера, передних и средних долей преимущественно катаральные с деструктивными изменениями. При исследовании ткани пневмонических участков долек отмечены яркие инфильтративные процессы. В цитоплазме макрофагов находились фагоцитированные микроорганизмы. Экссудат в бронхиолах разного калибра был богат нейтрофилами. В некоторых сосудах, особенно рядом с бронхиолами отмечались тромбы.

При подостром сальмонеллезе имелись обширные очаги катаралыю-гнойной бронхопневмонии с очагами деструкции в результате гнойно-некротического расплавления ткани легких. Тяжесть поражения легочной ткани отражалась в изменениях бронхиальных лимфоузлов, в которых лейкоцитарная реакция соответствовала острому неспецифическому лимфадениту с острейшей реактивной гиперплазией преимущественно фолликулярного типа и некрозом центра фолликулов.

Гистологические изменения свидетельствовали об угнетении лимфо-цитарно-плазмоцитарного компонента регионарной лимфоидной ткани и активности макрофагальной и нейтрофилыюй реакции, что соответствовало реализации гуморального звена иммунной реакции.

2.2.6. Морфологическая характеристика изменении в тимусе, брыжеечных лимфоузлах и селезенке поросят при сальмонеллезе, вызванном Salmonella typhi suis и Salmonella typhimurium. В тимусе в павших поросят отмечали выраженную гиперемию, а также уменьшение (истончение) коркового вещества долек при одновременном увеличении мозгового вещества. Отмечали сдвиги в клеточном составе мозгового вещества за счет резкого увеличения крупных тимоцитов. Наблюдались дистрофические изменения с явлениями последующего лизиса и эозинофильной инфильтрацией стромы.

Краниальные брыжеечные лимфатические узлы и лимфатические узлы тощей кишки при заражении S. typhi suis были увеличены, серо-белого цвета и сочные на разрезе. Лимфоузлы толстой кишки были также увеличены, серо-белого цвета, но суховатые на разрезе с некротическими фокусами до 5 мм в диаметре. Лимфоузлы у поросят, павших от сальмонеллеза, вызванного S. typhimurium, были резко увеличены и сочные на разрезе. Гистологически в лимфоузлах при заражении сероваром S. typhi suis отмечалась картина разряжения клеток лимфатических узелков и мозговых тяжей,

а отличительной особенностью было увеличение концентрации нейтрофиль-ных гранулоцитов в корковой зоне. Также, отмечали резкое снижение концентрации клеток в центрах, мозговых тяжах и периферии узелков, пролиферацию ретикулярных клеток и макрофагов. При сальмонеллезе, вызванном S. typhimurium происходило снижение концентрации клеток в лимфатических узелках коркового плато и мозговых тяжей, причем наблюдали уменьшение количества лимфоцитов лишь в герминативных центрах узелков, а скопления нейтрофильных гранулоцитов отмечали в корковой зоне.

Лимфатические узлы дистальных участков брыжейки толстой кишки поросят, павших от сальмонеллеза, вызванного заражением сероварами S. typhi suis и S. typhimurium имели признаки гиперплазии и воспаления. Отмечено увеличение количества макрофагальных и рекикулярных элементов, а концентрация лимфоцитов была снижена за счет некротических процессов в узелках и корковой зоне. Для сальмонеллеза, вызванного заражением S. typhi suis, было характерно наличие эозинофильных лейкоцитов в корковом плато и мозговых тяжах, а нейтрофильные гранулоциты обнаруживали только в корковом плато, где формировались микронекрозы в результате массовой гибели лимфоцитов.

При массивном антигенном раздражении лимфатических узлов патологическое воздействие оказывалось преимущественно на гуморальное звено иммунитета и возникала острая фолликуллярная гиперплазия с некрозом центров фолликулов, наблюдаемая в основном у зараженных S. typhi suis. У поросят, зараженных S. typhimurium, развивался острый лимфаденит, приобретающий характер гнойного. В целом изменения, произошедшие в лимфатических узлах брыжейки поросят, зараженных S. typhimurium и S. typhi suis, относятся к острым реактивным гиперплазиям, развивающимся в течение нескольких дней, максимум четырех-пяти недель (Беля-нин В.Л., Цыплаков Д.Э., 1999). Морфологические формы этих гиперпла-зий зависят от активации либо преимущественно клеточного (S. typhimurium), либо преимущественно гуморального (S. typhi suis) звена с неполноценным осуществлением механизмов иммунитета.

Результаты морфометрических и гистологических исследований показали, что в В- и Т-зонах селезенки, селезеночных тяжах и красной пульпе у зараженных сероварами S. typhi suis и S. typhimurium поросят в терминальной стадии болезни уменьшалось количество клеток лимфоидного ряда в 2 раза и более. При этом повышалась концентрация ретикулярных клеток и макрофагов, которые выполняли роль сидерофагов при заражении S. typhi suis. Характерным для инфицирования сероваром S. typhimurium было увеличение количества нейтрофильных гранулоцитов в красной пульпе почти в 7 раз и отсутствие эозинофильных гранулоцитов, а у поросят, зараженных S. typhi suis концентрация эозинофильных гранулоцитов в сравнении со здоровыми повышалась.

Лимфоузлы селезенки у поросят, павших от сальмонеллеза, вызванного заражением S. typhi suis, были увеличены и воспалены, имели очажки казеозного некроза. Гистологическая картина соответствовала развитию острой фолликуллярной гиперплазии с некрозом центров узелков и неспецифического лимфаденита. При заражении S. typhimurium гистологически выявлялся гнойный лимфаденит.

2.2.7. АТорфология геморрагического синдрома при сальмонеллезе у поросят. При исследовании 39 случаев проявления геморрагического синдрома при сальмонеллезе у поросят разного возраста было выявлено инфицирование S. typhi suis (18 случаев), S. typhimurium (13 случаев) и S. Cholerae suis (8 случаев). Также был исследован 31 случай без бактериологического подтверждения. При макроскопическом и микроскопическом исследованиях были выявлены гемодинамические расстройства, наиболее выраженные в легких, печени, селезенки, головном мозге, кишечнике, заключавшиеся в расширении венул и капилляров, гиперемии, стазе, сладже, частичной агглютинации эритроцитов.

Таблица 2

Характер нарушений в микроциркуляторном русле некоторых органов поросят при сальмонеллезе

Орган Количество случаев % Характер изменений

Кишечник 56 80,0 Кровоизлияния, сладж, тромбы

Лимфоузлы 47 67,1 Кровоизлияния, сладж, тромбы

Легкие 46 65,7 Кровоизлияния, сладж, Тромбы, фибрин

Печень 45 64,3 Кровоизлияния, сладж, Тромбы, фибрин

Сердце 22 31,4 Сладж, тромб

Почки 22 34,4 Кровоизлияния, сладж

Тимус 22 34,4 Сладж

Селезенка 19 27,1 Сладж, тромбы

Надпочечники 14 20,0 Сладж, кровоизлияния

Головной мозг 12 17,1 Кровоизлияния, тромбы, сладж

Анализ морфологических данных показал, что наибольшее число органов (5-9) с признаками расстройств в микроциркуляторном русле было затронуто при сальмонеллезе, вызванном Б. 1урЫтигшт (возр. группа 25-42

дня). Меньшее число органов (4-5) с данными изменениями было отмечено при заражении S. typhi suis и S. cholerae suis. Наиболее подверженными изменениям оказались богатые ретикулогистиоцитарными элементами лимфоузлы, легкие, печень и кишечник, блокада микроциркуляторного русла которых играет важную роль в развитии патологического процесса.

2.2.8. Результаты экспериментального заражения поросят сальмонеллами с еров аров Salmonella typhi suis и Salmonella typhimurium.

Некоторые показатели иммунитета поросят, экспериментально зараженных ссроварами Salmonella typhi suis и Salmonella typhimurium. Опыты проводили в условиях вивария на 6 поросятах 30-40 дневного возраста крупной белой породы. Исследования показали, что S. typhimurium более имму-ногенна и менее патогенна для поросят при пероралыюм заражении. Все звенья иммунитета у поросят, зараженных видоспецифичным сероваром (S. typhi suis) и невидоспецифичным сероваром (S. typhimurium), вовлечены в процесс элиминации антигена. Но при заражении S. typhimurium они реагируют раньше и адекватнее, что говорит о ее большей иммуногенности. По количественным изменениям при заражении S.typhi suis нейтрофилов и моноцитов в крови остается больше, чем при заражении S. typhimurium, а фагоцитарная емкость меньше, т.е. страдает звено неспецифической защиты.

При заражении S. typhi suis увеличение уровня IgA происходило лишь на 3-сутки, в первые же сутки после заражение происходило отчетливое его снижение. Возрастание уровней IgM и IgG отмечалось только на третьи сутки, а увеличение ЦИК происходило волнообразно, достигая подъема на 1-е и далее на 7-е и 10-е сутки. При заражении сероваром S. typhimurium первичный иммунный ответ развивался быстрее. Серовар S. typhi suis наиболее типичен для этого вида животных и при повторном иммунном ответе синтез IgM и IgG начинался почти одновременно, причем IgG синтезируется более активно. Низкий уровень IgM способствовал нарастанию тяжести инфекционного процесса у поросят, зараженных S.typhi suis.

Электронно-микроскопическое исследование легких, печени, тонкой кишки и иммунокомпетентных органов поросят при экспериментальном сальмонеллезе, вызванном Salmonella typhi suis и Salmonella typhimurium. Однократное интраназалыюе введение поросятам доз сальмонелл в количестве 6-8 млрд. микробных (серовары S. typhi suis и S. typhimurium) вызывало развитие острой экссудативной реакции. В течение первых суток происходил активный фагоцитоз альвеолярными макрофагами бактериальных клеток. Он имел завершенный характер при заражении возбудителем S. typhimurium. После заражения сероваром S. typhi suis фагоцитоз имел признаки незавершенности и происходило размножение возбудителя. По истечению первых суток после заражения сероварами S. typhi suis и S. typhimurium возникали первичные изменения в печени. Наиболее сильно выражены изменения при заражении S. typhi suis,

имеющие характер некроза гепатоцитов. Одновременно появлялись признаки гранулематозной реакции. Более массивная и длительная персистен-ция сальмонелл серовара S. typhi suis связана с незавершенным фагоцитозом макрофагами, а дистрофические и некротические изменения в гепато-цитах создают условия для размножения возбудителей.

После заражения сероварами S. typhimuriuin и S. typhi suis через 24 часа были отмечены в тонкой кишке: умеренная лимфоидно-плазмоцитарная и тучноклеточная инфильтрация собственной пластинки, резкий отек стро-мы и расширение венозных сосудов. Была заметна адгезия на эпителиоци-тах микроорганизмов и их проникновение. Измененные энтероциты деск-вамировались от базальной мембраны целыми пластами. В единичных плазмоцитах собственной пластинки и стромы ворсинок отмечали расширение цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГрЭР) и его дегрануляцию. Плазмолемма лимфоцитов образовывала многочисленные, различной формы и величины отростки с инвагинацией цитоплазмы.

В тимоцитах отмечали выраженную вакуолизацию цитоплазмы и части митохондрий. В некоторых клетках происходил разрыв мембран и деструкция. Макрофаги утилизировали остатки тимоцитов. Особенностью изменений тимуса поросят при заражении S. typhi suis было наличие макро-фагальных элементов с фагоцитированными бактериями. Бактериальные клетки в фагоцитах практически не имели признаков разрушения мембран, но сами макрофаги были деструированы. Перикапиллярные участки и ретикулярная строма были отечными или разреженными, наблюдались признаки миграции клеток. Отмечались среди разрушенных тимоцитов дегра-нулирующие эозинофилы и нейтрофилы. Комплекс данных изменений свидетельствовал в пользу развивающегося тимита. В тимусе поросят, зараженных интраназалыю сероваром S. typhimurium, не было отмечено присутствие бактериальных клеток. Появление в корковом веществе долек деформированных и погибающих тимоцитов, липидсодержащих клеток, фагоцитоз, разряжение тимоцитов, являлись морфологическим проявлением развивающейся акцидентальной трансформации.

В лимфатических узлах брыжейки поросят, зараженных сероваром S. typhi suis, наблюдались яркие проявления фагоцитарной реакции. Появлялось значительное количество макрофагов с фагосомами, в которых были заметны микроколонии сальмонелл. Большинство макрофагов кроме бактерий содержало фрагменты погибших лимфоцитов. Некоторые макрофаги с сальмонеллами подвергались разрушению.

В лимфатических узлах поросят при заражении S. typhimurium происходил фагоцитоз макрофагами бактерий, но в них бактериальные клетки были представлены целостными формами. Наблюдался лизис макрофагов и лимфоцитов, в межклеточное вещество попадали фрагменты клеток и сальмонеллы. При ультраструктурном анализе лимфоидных образований

(пейеровых бляшек) тонкой кишки поросят, зараженных интраназально S. typhi suis, были отмечены реактивные изменения. Были обнаружены сальмонеллы в макрофагах, ретикулоцитах и лимфоцитах бляшек. Накапливались нейтрофильные гранулоциты и всегда обнаруживались плазматические клетки среди лимфоцитов. То же регистрировалось при заражении сероваром S. typhimurium. Большинство обнаруженных макрофагов были разрушенными, а в их цитоплазме были заметны мелкие формы бактерий. Лимфоциты имели признаки плазматизации. Межэпителиальные лимфоциты (МЭЛ) встречались среди энтероцитов в непосредственной близи от куполов фолликулов пейеровых бляшек и оказывались в окружении сальмонелл. Была выявлена инвазия бактерий в кишечный эпителий и через него в собственную пластинку слизистой оболочки кишечника и пейеровы бляшки.

Таким образом, видоспецифичный для поросят серовар S. typhi suis вызывал недостаточность фагоцитарной функции макрофагов тимуса и периферических органов иммуногенеза. Функциональная неполноценность макрофагов легких, тимуса, селезенки, лимфоузлов в отношении этого се-ровара сопровождалась развитием острого тимита. Подавление макрофа-гального звена клеточного иммунитета в первые сутки после заражения является важным патогенетическим механизмом инициального процесса развития и течения сальмонеллезной инфекции.

2.2.9. Экспериментальное заряжение белых мышей возбудителями сальмонеллеза. Результаты бактериологических исследований показали, что при пероралыюм заражении мышей S. Cholerae suis и S. Typhi suis через 24 часа после заражения данные возбудители в органах не обнаруживаются. При заражении мышей S. typhimurium возбудитель через 24 часа выделяли из печени, селезёнки, легких, лимфоузлов брыжейки и слизистой оболочки тонкой и толстой кишки, что свидетельствовало о размножении и накоплении возбудителей и развитии заболевания. Интраназальное заражение мышей S. typhimurium вызывало их гибель через 24-32 часа после заражения из-за развития лобарной двусторонней пневмонии. При этом гистологически отмечали активную макрофагальную реакцию и многочисленные лимфоидные инфильтраты, а также незначительное количество эози-нофилов. В бронхиальных и средостенных лимфатических узлах регистрировали серозное и серозно-геморрагическое воспаление с явлениями отёка и делимфатизации коркового слоя. На плевре и эпикарде обнаруживали точечные кровоизлияния.

2.2.10. Электронно-микроскопическое исследование органов пищеварения, легких и лимфоидных органов мышей\ зараженных возбудителями сальмонеллеза. При интраназальном заражении белых мышей сероваром S. typhimurium через сутки происходил активный фагоцитоз бактериальных клеток, многие из которых находились в просветах альвеол.

В альвеолах находились нейтрофильные лейкоциты, эритроциты и эритроциты, поглощенные макрофагами (эритроцитокластоз). В легочной паренхиме мышей, зараженных S. typhi suis не было отмечено обилия сальмонелл в легких, тем более в свободном состоянии, но многие альвеолоциты были с вакуолизированными митохондриями, наблюдался отек межклеточного вещества, в котором определялись единичные лимфоциты и нейтрофильные гранулоциты.

Было установлено, что однократное интраназальное ввведение доз в количестве 2-6 млрд. микробных тел культур сальмонелл сероваров S. typhimurium и S. typhi suis вызывало развитие у мышей острой пневмонии. В течение первых суток происходил активный фагоцитоз бактерий, имеющий завершенный характер при заражении невидоспецифичным для мышей возбудителем (S. typhi suis) и практически его полная элиминация. После заражения S. typhimurium (видоспецифичным сероваром для мышей) продолжался фагоцитоз, имеющий признаки незавершенности и размножения возбудителя в первичном очаге. Незавершенный фагоцитоз свидетельствовал о недостаточности клеточного звена иммунной реакции, а повреждение аэрогематического барьера способствовало развитию не только эндотоксинэмии, но и бактериемии с поражением других органов.

У мышей, зараженных интраназально сероварами S. typhi suis и S. typhimurium, через 24 часа были обнаружены дистрофические и некротич еские изменения в гепатоцитах и других клеточных элементах печеночной паренхимы из-за гематогенного заноса бактерий и высвобождения эндотоксина. При заражении видоспецифичным сероваром S. Typhimurium также обнаруживались преимущественно альтеративные изменения со стороны большинства клеточных элементов паренхимы, финалом которых являлся некроз. В ткани печени мышей, зараженных S. typhi suis не было обнаружено бактерий или их фрагментов. В сосудистом русле отмечались активация и десквамация эндотелия, сопряженные со стазом и агглютинацией эритроцитов, эритроцитокластозом. Также отмечались признаки гра-нулематозной реакции, возникающей в межклеточных пространствах и соединительно-тканных формированиях при наличии сальмонелл.

У мышей, зараженных сероварами S. typhimurium и S. typhi suis, через 24 часа были отмечены в тонкой кишке умеренная лимфоидно-плазмоцитарная, тучноклеточная инфильтрация и нарушения микроциркуляции крови. Встречались единичные лимфоциты и эозинофильные лейкоциты, располагавшиеся вокруг капилляров, эндотелий которых был набухший и частично десквамированный. В криптах была хорошо заметна адгезия микроорганизмов в виде коротких палочек и кокков на эпителиоцитах. Патологически измененные энтероциты отторгались от базалыюй мембраны, в них появлялось много свободных полисом и рибосом, а бокаловидные клетки находились в активном состоянии. В эндотелиальных клетках кровеносных

капилляров, артериол и веиул собственной пластинки обнаруживались изменения альтеративного характера: малое количество свободных рибосом, вакуолизация и дегрануляция ГрЭР, митохондрии имели темный матрикс и расширенные интракристные промежутки. Базальная мембрана была набухшая, просветле!шая, в ней появлялись очаги деструкции. Соединительная ткань ворсинок и подслизистого слоя имела признаки набухания коллагено-вых волокон и была инфильтрирована активизированными лимфоцитами и гранулоцитами, среди которых попадались эозинофилы.

Особенностью изменений в тимусе мышей, зараженных сероваром S. typhimurium, было наличие макрофагальных и ретикулярных клеточных элементов с фагоцитированными и свободными бактериями в виде микроколоний, не имевших признаков разрушения. Макрофаги и тимоциты претерпевали деструктивные изменения литического характера. В капиллярах выявлялись агглютинированные эритроциты, нейтрофильные гранулоциты, макрофаги с сальмонеллами и лимфоциты, отмечались массовая миграция лимфоцитов в капилляры, некроз тимоцитов и фагоцитоз их фрагментов. Среди тимоцитов коркового слоя обнаруживалась эозинофильная инфильтрация. Обнаруженные изменения в ультра структурной организации тимуса в индуктивную фазу иммунного ответа свидетельствовали не только об акцидентальной трансформации, но и о развитии воспалительной реакции, приводящей к формированию острого тимита.

В тимусе мышей, зараженных сероваром S. typhi suis, через 24 часа большинство тимоцитов оказывалось в активном состоянии, а также появлялись в корковом веществе погибающие клетки, их фагоцитоз, разряжение сети ретикулоэпителия и расположения тимоцитов, появление липоцитов, миграция лимфоцитов, что являлось морфологическим проявлением развивающейся акцидентальной трансформации.

В лимфатических узлах брыжейки мышей, зараженных сероварами S. typhimurium и S. typhi suis были обнаружены яркие проявления реакции макрофагов, в которых содержались отдельные бактериальные клетки или микроколонии как в свободном состоянии, так и в составе фагосом и фаго-лизосом. Некоторые макрофаги с сальмонеллами вне фагосом разрушались, а высвободившиеся бактерии попадали в межклеточное вещество.

При ультраструктурном анализе пейеровых бляшек тонкой кишки мышей, зараженных интраназально S. typhimurium и S. typhi suis была обнаружена первичная реакция на попадание в них антигена, но значительная часть макрофагов разрушалась. Сальмонеллы в свободном состоянии обнаруживались в макрофагах, ретикулоцитах и лимфоцитах лимфоидных образований и собственной пластинки слизистой оболочки. Часть лимфоцитов имела признаки активизации, происходила их миграция к капиллярам. В местах расположения бляшек и собственной пластинки слизистой

оболочки накапливались нейтрофильные гранулоциты в непосредственной близи от сальмонелл и капилляров.

Ультраструктурные процессы в селезенке мышей при заражении серо-варами S. typhimurium и S. typhi suis характеризовались повреждением практически всех клеточных элементов паренхимы, несколько слабее выраженного при заражении последним сероваром. Отмечался активный фагоцитоз макрофагами и ретикулярными клетками сальмонелл с последующим распадом многих фагоцитов. Активно функционирующими оказались нейтрофильные и эозинофильные гранулоциты. В синусах нейтрофилы были частично дегранулированы и содержали в цитоплазме включения бактерий кокковидной и палочковидной формы. У лимфоцитов происходило исчезновение цитоплазмы, оставались лишь ядра округлой формы со сконденсированным хроматином. Среди эритроцитарных масс имелись признаки разрушения и агрегации.

Таким образом, в первые сутки после интраназального заражения культурами сероваров S. typhimurium и S. typhi suis у поросят и белых мышей развивался патологический процесс, имевший отчетливые признаки поражения иммунокомпетентных органов. Видоспецифичные серовары для мышей S. typhimurium и поросят S. typhi suis обладали способностью вызывать недостаточность фагощ!тарной функции макрофагов тимуса и периферических органов иммуногенеза, чем создавали условие для развития бактериемии. Этот процесс усугублялся развитием острого тимита, возникновение которого служило важным патогенетическим звеном в развитии вторичного иммунодефицитного состояния.

3. ВЫВОДЫ

1. Наиболее подвержены заражению сальмонеллезом поросята в возрастной категории 27-106 суток, у которых болезнь вызывается сероварами Salmonella typhi suis, Salmonella typhimurium и Salmonella cholerae suis.

2. Прямая реакция иммунофлюоресценции, проводимая на мазках-отпечатках из внутренних органов трупов свиней с использованием диагностического флюоресцирующего сальмонеллезного иммуноглобулина к антигенам А, В, Д, может быть использована в качестве вспомогательного теста в диагностике сальмонеллеза.

3. Патоморфологические изменения у поросят, павших от сальмонеллеза, свидетельствуют о развитии иммунодепрессивного состояния с наличием определенных отличительных особенностей в морфологическом составе иммунокомпетентных органов при заражении разными сероварами сальмонелл.

4. У поросят при заражении Salmonella typhi suis происходит острая фолликулярная гиперплазия с некрозом центров фолликулов брыжеечных лимфоузлов, свидетельствующая о воздействии на гуморальное звено иммунитета.

5. При заражении Salmonella typhimurium в лимфатических узлах поросят развивается острый лимфаденит с выраженным экссудативным компонентом, свидетельствующим об активизации клеточного звена иммунитета.

6. В селезенке поросят при сальмонеллезе происходит делимфатиза-ция, сопровождающаяся в случаях заражения сероваром Salmonella typhimurium нейтрофильной реакцией, а в случаях заражения Salmonella typhi suis эозинофильной реакцией в красной пульпе.

7. При остром течении сальмонеллеза у поросят происходят изменения в микроциркуляторном русле органов, имеющие характер геморрагического синдрома, который принимает участие в танатогенезе болезни.

8. В первичном иммунном ответе при экспериментальном заражении Salmonella typhimurium и Salmonella typhi suis имеются отличия, выражающиеся более ранней и адекватной реакции клеточного и гуморального звеньев при заражении S. typhimurium. При заражении S. typhi suis страдает звено неспецифической защиты, связанное со снижением фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов крови.

9. В течение первых суток после заражения в первичном очаге происходит элиминация возбудителей за счет фагоцитоза макрофагами, имеющего незавершенный характер при заражении патогенным (видоспецифич-ным) сероваром. Разрушение сальмонелл сопровождается выделением эндотоксина, вызывающего альтерацию клеток.

10. В печени поросят и белых мышей, экспериментально зараженных сероварами Salmonella typhi suis и Salmonella typhi murium, в первые сутки

развиваются альтеративиые изменения, финалом которых является некроз гепатоцитов. Происходит формирование гранулематозной реакции, стимулированной наличием сальмонелл среди клеточных элементов печени.

11. Гематогенное проникновение сальмонелл в тимус поросят и белых мышей происходит в первые сутки после экспериментального заражения и вызывает разрушение тимоцитов с развитием акциденталыюй трансформации, острого тимита, приводящего к недостаточности органа при формировании адекватного иммунного ответа.

12. В периферических иммунокомпетентных органах поросят и белых мышей в первые сутки после экспериментального заражения иммуноморфо-логическая реакция проявляется в основном со стороны макрофагов и грану-лоцитов с признаками незавершенного фагоцитоза и активизации лимфоцитов. Незавершенный фагоцитоз и наличие свободных сальмонелл является ведущим фактором в происходящей персистенции возбудителя в органах.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Применение прямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) с использованием диагностического флюоресцирующего сальмонеллезного иммуноглобулина к антигенам А, В, Д НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН может быть использовано в качестве средства экспресс-диагностики саль-монеллеза при посмертном исследовании органов свиней.

2. Полученные данные применимы в практической деятельности ветеринарных врачей и лабораторных специалистов при посмертной диагностике сальмонеллеза поросят, позволяют выяснить происхождение патоло-гоанатомических изменений.

3. Результаты исследований по патоморфогенезу сальмонеллеза могут быть использованы в учебном процессе на морфологических и клинических кафедрах ветеринарных факультетов ВУЗов, а также их можно рекомендовать для включения в учебные руководства по патологической анатомии животных.

5. СПИСОК ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ IIO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Буянов A.A. Моделирование сальмонеллезной инфекции поросят па белых мышах / Буянов A.A., Лаковников Е.А., Парфенов А.Ф., Кафтырева JI.A., Закардонец B.C., Конторин В.И., Орехов А.Н. // Материалы Международ. семинара «Проблемы моделирования патологических процессов у человека и животных и испытание биологически активных препаратов».-СПб.: Нурма, 1992. -С.8.

2. Буянов A.A. Влияние тимогена на выживаемость белых мышей и локализацию возбудителей при экспериментальном заражении сальмонеллами / Буянов A.A., Нифантов В.Д., Лаковников Е.А., Парфенов А.Ф., Закардонец B.C. // Материалы Междунар. симп. «Проблемы моделирования патологических процессов у человека и животных: иммунодефициты, их диагностика и коррекция».- СПб. : Нурма СОК «Восточный», 1994.- С.10.

3. Буянов A.A. Анализ причин гибели свиней, поступающих на мясокомбинат / Буянов A.A., Тарасов С.А., Лаковников Е.А., Папанов А.П., Шемаров Н.Г., Орехов А.Н., Парфенов А.Ф. // Сб. науч. тр. / СПбГАВМ.-СПб., 1995. - №124.- С.11-13.

4. Лаковников Е.А. Патоморфология органов пищеварения у животных: лекция для студентов очного и заочного фак-тов / Лаковников Е.А. -СПб., 1995.-29 с.

5. Лаковников Е.А. Патоморфология экспериментального сальмонел-лезного шока у белых мышей / Лаковников Е.А., Парфенов А.Ф., Кафтырева Л.А. // Сб. науч. тр. / СПбГАВМ. - СПб., 1995.- №124. - С. 20-21.

6. Иванова Т.А. Биохимия и морфология крови поросят при сальмо-неллезе / Иванова Т.А., Лаковников Е.А. // Сб. науч. тр. / СПбГАВМ. -СПб., 1996. - №125.-С.38.

7. Буянов A.A. Сезонная и возрастная динамика причин падежа свиней и распространение иммунодефицитных состояний / Буянов A.A., Лаковников Е.А., Парфенов А.Ф., Соколова Т.Б., Шемаров Н.Г., Орехов А.Н. // Материалы Всерос. науч.-метод. конф. патологоанатомов ветеринарной медицины : сб. науч. тр. - Омск, 2000. - С.55-56.

8. Лаковников Е.А. Моделирование сальмонеллеза у белых мышей / Лаковников Е.А., Парфенов А.Ф. // Материалы межвузов, учеб.-метод. конф. «Применение современных образовательных технологий в учебном процессе». - Кострома: изд-во КГСХА, 2000. - С. 111-112.

9. Лаковников Е.А. Обнаружение сальмопеллезного антигена в мазках-отпечатках методом РИФ : метод, пособие для ветеринарных врачей / Лаковников Е.А., Сидоров В.Л.- СПб., 2000. - 13 с.

10. Парфенов А.Ф. Гистологические изменения в легких поросят при сальмонеллезе / Парфенов А.Ф., Лаковников Е.А. // Инфекционные и инвазионные болезни: материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 70-летию образования зооинженерного фак-та. - Казань, 2000.- С. 109.

11. Буянов A.A. Патологоанатомическая характеристика органов у поросят при сальмонеллезе, вызванном Salmonella typhimurium / Буянов A.A., Лаковников Е.А., Парфенов А.Ф. // Сб. науч. тр. / СПбГАВМ. - СПб., 2002. -№134.-С.33-35.

12. Лаковников ЕА. Особенности клеточной реакции в селезенке при сальмонеллезе поросят / Лаковников Е.А., Парфенов А.Ф. // Сб. науч. тр. / СПбГАВМ. - СПб., 2002. - №134. - С.61-63.

13. Буянов A.A. Основные причины падежа и распространенность им-мунодефицитных состояний у свиней по данным патологоанатомического мониторинга / Буянов A.A., Лаковников Е.А. // Материалы Всерос. науч.-метод. конф. патологоанатомов ветеринарной медицины (Уфа, 17-19 сентября 2003 г.).- М., 2003.- С. 27-29.

14. Лаковников Е.А. Морфологические изменения в печени поросят при некротических поражениях сальмонеллезной этиологии / Лаковников Е.А. // Сб. науч. тр. / СПбГАВМ. -СПб., 2003.- №135.- С. 68-69.

15. Лаковников Е.А. Патологическая анатомия органов пищеварения у животных: лекция для студентов очного и заочного фак-тов, фак-та заочного обучения / Лаковников Е.А. - СПб., 2003.- 19 с.

16. Лаковников Е.А. Патоморфологическая характеристика изменений лимфоидных органов у поросят при сальмонеллезе, вызванном Salmonella typhi suis / Лаковников Е.А., Буянов A.A. // Материалы науч. конф. профессорско-преподавательского состава, науч. сотрудников и аспирантов СПбГАВМ.- СПб., 2003.- С.62-63.

17. Лаковников Е.А. Выделение сальмонелл из органов поросят / Лаковников Е.А., Парфенов А.Ф. // Ветеринария.- 2004.- № 6.- С.25-27.

18. Лаковников Е.А. Патоморфологические изменения в лимфоидных органах при сальмонеллезе поросят, вызванном Salmonella typhi suis / Лаковников Е.А. // Материалы междунар. науч.-производ. конф. «Актуарные проблемы эпизоотологии на современном этапе» / СПбГАВМ. - СПб., 2004.- С.70-71.

19. Лаковников Е.А. Ультраструктурные поражения печени белых мышей при экспериментальном сальмонеллезе / Лаковников Е.А. // Международный вестник ветеринарии.- СПб., 2004. -№1.- С.109-111.

20. Лаковников Е.А. Патологоанатомическая диагностика сальмонелле-за поросят / Лаковников Е.А. // Свиноводство.- 2005. - №2.- С. 31-32.

21. Лаковников Е.А. Патоморфология ДВС-синдрома при сальмонеллезе поросят / Лаковников Е.А. // Ветеринария. - 2005. - №3. -С. 24-26.

22. Лаковников Е.А. Первичные изменения в органах иммунитета поросят и белых мышей при экспериментальном заражении разными ссровара-ми сальмонелл / Лаковников Е.А. // Международный вестник ветеринарии.-СПб., 2005. - №4.- С.53-56.

23. Лаковников Е.А. Цитологический состав паренхимы селезенки поросят 2- и 4-месячного возраста / Лаковников Е.А., Парфенов А.Ф. // Морфология (Архив анатомии, гистологии и эмбриологии). - СПб., 2005. -Т. 127, №1. -С.41-42.

Подписано в печать 01.03.06г. Зак. № 37 Объем 1,8 п.л. Тираж 100 экз. Издательство СПбГАВМ, г.С-Пб, ул. Черниговская, д. 5

Актуальность темы.

Важным условием пополнения продовольственных ресурсов России является сокращения падежа сельскохозяйственных животных от инфекционных болезней. В современных условиях это приобретает особую актуальность в связи с экономическими трудностями, которые испытывают многие свиноводческие хозяйства. Заболеваемость и гибель животных на фермах обусловлены широким распространением патогенной и условно-патогенной микрофлоры, среди которой одно из первых мест принадлежит сальмонеллам. Огромное количество серовариантов сальмонелл (род Salmonella Lignieres 1900) является патогенным для многих видов животных, а также для человека. Повсеместное распространение во внешней среде, заболеваемость сальмонеллезами сельскохозяйственных животных и птицы, восприимчивость людей всех возрастов делает проблему весомой для ветеринарии и медицины, а сальмонеллезы остаются опасными болезнями в эпизоотологическом и эпидемиологическом отношениях.

Всестороннее изучение сальмонеллеза и борьба с ним не может обойтись без надежной диагностики как в лабораторных, так и в производственных условиях. За многие годы накоплен значительный объем информации по всем сторонам этой проблемы, однако сложные аспекты морфофункциональных особенностей и взаимосвязей систем организма, некоторые вопросы патогенеза, морфологической диагностики еще недостаточно широко освещены и являются «белые пятнами».

Важность патоморфологической диагностики неоспорима. Еще в 1951 году известный отечественный ветеринарный патологоанатом профессор П.И. Кокуричев указывал на то, что в значительном количестве случаев бактериологическое исследование дает отрицательный ответ при наличии характерной патологоанатомической картины паратифа сальмонеллеза). Совершенствование патоморфологической диагностики остается по-прежнему неотъемлимой частью изучения этой распространенной инфекции.

Исследования, проводившиеся сотрудниками кафедры патологической анатомии Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины с 1989 года совместно с кафедрой эпизоотологии и лабораторией сальмонеллезов ВНИИ им. Л.Пастера, дают основание считать в настоящее время данную инфекцию в хозяйствах Ленинградской области актуальной проблемой. Научно-исследовательская работа сотрудников кафедры патологической анатомии СПбГАВМ под руководством заведующего кафедрой профессора Буянова А.А. на производственных линиях Санкт-Петербургского мясокомбината показала достаточно высокую зараженность убойных подсвинков (8 - 12 %) сальмонеллезом, у которых были обнаружены морфологические признаки сальмонеллеза (Тарасов С.А., Буянов А.А. и соавт., 1993). Обстоятельные фактические сведения о структурно-функциональных нарушениях при развитии инфекционного процесса приобретают особое значение при расшифровке патогенеза и прогнозирования исхода болезни, в разработке более эффективных способов диагностики и терапевтических воздействий.

Изучение патоморфоза (стойкое изменение клинических и морфологических проявлений) сальмонеллеза у свиней является важнейшим вопросом в исследовании этой болезни. Несмотря на то, что патоморфологические изменения «классического» проявления этой болезни давно известны, остается весьма затруднительной верификация диагноза. Течение болезни со стертыми проявлениями и при сочетании с другими патологическими процессами, а также инициация «нестандартными» для свиней сероварами делает ее актуальной в раскрытии иммунологической компетенции организма.

Остаются не вполне уточненными патологоанатомические изменения при некоторых формах течения сальмонеллеза поросят, вопросы танатогенеза этой болезни и посмертной экспресс-диагностики.

Цель работы.

Изучить морфофункциональные особенности изменений иммунокомпетентных и других органов при сальмонеллезе, вызванном различными сероварами сальмонелл, на основе патологоанатомических, гистологических, электронно-микроскопических и иммунологических методов.

Задачи исследования.

1. Дать морфологическую оценку изменениям в иммунокомпетентных органах, печени, легких и надпочечниках поросят при сальмонеллезе, вызванном разными сероварами сальмонелл у свиней, выяснить морфогенетические элементы возникновения их.

2. Воспроизвести моделирование острого сальмонеллеза у поросят и лабораторных белых мышей с использованием выделенных от свиней сероваров сальмонелл.

3. Определить ультраструктурные изменения в иммунокомпетентных органах, печени, легких и кишечнике у экспериментальных животных при заражении видоспецифичным и невидоспецифичным сероварами сальмонелл через 1 сутки после заражения.

4. Выявить специфичность морфологических изменений в иммунных органах в зависимости от серовара.

5. Исследовать морфологическое проявление геморрагического синдрома при остром сальмонеллезе у поросят.

6. Изучить возможность применения реакции иммунофлюоресценции для диагностики сальмонеллеза свиней.

Научная новизна заключается в системном подходе к решению поставленных задач, позволивших более подробно изучить последовательность специфических иммуноморфологических изменений в органах иммунитета поросят в зависимости от серовара возбудителя сальмонеллеза. Впервые проведено комплексное патоморфологическое, бактериологическое, иммунологическое и электронно-микроскопическое исследование сальмонеллеза поросят с использованием биологической модели.

Выяснена роль клеточных и гуморальных факторов иммунитета у поросят 2-4 месячного возраста в специфической защите организма при экспериментальном заражении видоспецифичным и невидоспецифичным сероварами сальмонелл. Использование в качестве экспериментальной модели белых мышей для воспроизведения острого сальмонеллеза выделенными от павших поросят сероварами Salmonella typhimurium и Salmonella typhi suis с учетом видоспецифичности применено впервые. Проведен подробный ультраструктурный анализ состояния органов иммуногенеза, тонкой кишки, печени и легких при экспериментальной сальмонеллезной инфекции у поросят и белых мышей в первые сутки после заражения патогенными сероварами возбудителя. Морфологические признаки, характеризующие развитие при остром сальмонеллезе геморрагического синдрома изучены впервые. Определены гистологические изменения в печени, легких и надпочечниках у поросят, в зависимости от серовара возбудителя. Разработана и впервые практически применена методика прямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) для выявления сальмонеллезного антигена в мазках-отпечатках из внутренних органов павших свиней.

Теоретическая и практическая ценность.

Результаты проведенных исследований уточняют и дополняют сведения о патоморфогенезе сальмонеллеза поросят, что способствует совершенствованию диагностики этой болезни. Изучение морфологического проявления геморрагического синдрома при остром сальмонеллезе помогает определить его участие в танатогенезе. Использование для воспроизведения сальмонеллезной инфекции белых мышей и поросят позволяет выявить начальные патологические процессы в органах и проследить судьбу сальмонелл разных сероваров в первые сутки после заражения при применении электронной микроскопии. Определение иммунного статуса у экспериментально зараженных разными сероварами сальмонелл поросят послеотъемного периода выявляет функционирование некоторых звеньев иммунитета в начальные этапы болезни, что может быть использовано при разработке превентивных мер борьбы с сальмонеллезной инфекцией. Применение прямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) с использованием диагностического флюоресцирующего сальмонеллезного иммуноглобулина к антигенам А, В, Д НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН может быть использовано в качестве средства экспресс-диагностики сальмонеллеза при посмертном исследовании органов свиней.

Полученные данные применимы в практической деятельности ветеринарных врачей и лабораторных специалистов при посмертной диагностике сальмонеллеза поросят, позволяют глубже осмыслить суть происходящих патологических процессов.

Результаты исследований по патоморфогенезу сальмонеллеза вносят вклад в развитие ветеринарной патологии, могут быть использованы в учебном процессе на морфологических и клинических кафедрах ветеринарных факультетов, а также их можно рекомендовать для включения в учебные руководства по патологической анатомии животных.

Апробация работы.

Результаты исследований доложены и обсуждены на: Международном семинаре «Проблемы моделирования патологических процессов у человека и животных и испытание биологически активных препаратов» (Санкт-Петербург, 1992); Международном семинаре «Проблемы моделирования патологических процессов у человека иживотных: иммунодефицита, их диагностика и коррекция» (Санкт-Петербург, 1994); Межвузовской учебно-методической конференции

Применение современных образовательных технологий в учебном процессе» (Кострома, 2000); Всероссийской научно-методической конференции патологоанатомов ветеринарной медицины (Омск, 2000); научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2003, 2005); Всероссийской научно-методической конференции патологоанатомов ветеринарной медицины (Уфа, 2003); Международной научно-проихзводственной конференции «Актуальные вопросы эпизоотологии на современном этапе» (Санкт-Петербург, 2004). Внедрение результатов исследований.

Материалы диссертации используются в учебном процессе и при проведении научно-исследовательских работ в сельскохозяйственных высших учебных заведениях России, что подтверждено соответствующими справками и заверено. Методическое пособие для ветеринарных врачей «Обнаружение сальмонеллезного антигена в мазках-отпечатках методом РИФ» (Лаковников Е.А., Сидоров В.Л., 2000) рекомендовано к использованию в практике ветеринарной медицины Северо-Западного района РФ научным Координационным Советом по животноводству и ветеринарии СЗНЦ Россельхозакадемии (протокол №4 от 14 июля 2000 г.) и рекомендовано Коллегией Комитета Правительства Республики Дагестан (протокол от 11 марта 2005 года № 1).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Сальмонеллы вызывают деструктивные изменения в центральных и периферических органах иммуногенеза.

2. Патоморфологические изменения в иммунокомпетентных органах зависят как серовара возбудителя, так и от реактивности организма поросят.

3. Незавершенный фагоцитоз макрофагами приводит к внутриклеточному паразитированию сальмонелл в макрофагах внутренних органов.

4. Существенную роль в танатогенезе болезни имеет геморрагический синдром.

5. Обнаружение возбудителя в органах возможно при использовании прямой реакции иммунофлюоресценции со стандартными диагностическими иммуноглобулинами.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Наиболее подвержены заражению сальмонеллезом поросята в возрастной категории 27-106 суток, у которых болезнь вызывается сероварами Salmonella typhi suis, Salmonella typhimurium и Salmonella cholerae suis.

2. Прямая реакция иммунофлюоресценции, проводимая на мазках-отпечатках из внутренних органов трупов свиней с использованием диагностического флюоресцирующего сальмонеллезного иммуноглобулина к антигенам А, В, Д, может быть использована в качестве вспомогательного теста в диагностике сальмонеллеза.

3. Патоморфологические изменения у поросят, павших от сальмонеллеза, свидетельствуют о развитии иммунодепрессивного состояния с наличием определенных отличительных особенностей в морфологическом составе иммунокомпетентных органов при заражении разными сероварами сальмонелл.

4. У поросят при заражении Salmonella typhi suis происходит острая фолликулярная гиперплазия с некрозом центров фолликулов брыжеечных лимфоузлов, свидетельствующая о воздействии на гуморальное звено иммунитета.

5. При заражении Salmonella typhimurium в лимфатических узлах поросят развивается острый лимфаденит с выраженным экссудативным компонентом, свидетельствующим об активизации клеточного звена иммунитета.

6. В селезенке поросят при сальмонеллезе происходит делимфатизация, сопровождающаяся в случаях заражения сероваром Salmonella typhimurium нейтрофильной реакцией, а в случаях заражения Salmonella typhi suis эозинофильной реакцией в красной пульпе.

7. При остром течении сальмонеллеза у поросят происходят изменения в микроциркуляторном русле органов, имеющие характер геморрагического синдрома, который принимает участие в танатогенезе болезни.

8. В первичном иммунном ответе при экспериментальном заражении Salmonella typhimurium и Salmonella typhi suis имеются отличия, выражающиеся более ранней и адекватной реакции клеточного и гуморального звеньев при заражении S. typhimurium. При заражении S. typhi suis страдает звено неспецифической защиты, связанное со снижением фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов крови.

9. В течение первых суток после заражения в первичном очаге происходит элиминация возбудителей за счет фагоцитоза макрофагами, имеющего незавершенный характер при заражении патогенным (видоспецифичным) сероваром. Разрушение сальмонелл сопровождается выделением эндотоксина, вызывающего альтерацию клеток.

10.В печени поросят и белых мышей, экспериментально зараженных сероварами Salmonella typhi suis и Salmonella typhi murium, в первые сутки развиваются альтеративные изменения, финалом которых является некроз гепатоцитов. Происходит формирование гранулематозной реакции, стимулированной наличием сальмонелл среди клеточных элементов печени.

11 .Гематогенное проникновение сальмонелл в тимус поросят и белых мышей происходит в первые сутки после экспериментального заражения и вызывает разрушение тимоцитов с развитием акцидентальной трансформации, острого тимита, приводящего к недостаточности органа при формировании адекватного иммунного ответа.

12.В периферических иммунокомпетентных органах поросят и белых мышей в первые сутки после экспериментального заражения иммуноморфологическая реакция проявляется в основном со стороны макрофагов и гранулоцитов с признаками незавершенного фагоцитоза и активизации лимфоцитов. Незавершенный фагоцитоз и наличие свободных сальмонелл является ведущим фактором в происходящей персистенции возбудителя в органах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Применение прямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) с использованием диагностического флюоресцирующего сальмонеллезного иммуноглобулина к антигенам А, В, Д НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН может быть использовано в качестве средства экспресс-диагностики сальмонеллеза при посмертном исследовании органов свиней.

2. Полученные данные применимы в практической деятельности ветеринарных врачей и лабораторных специалистов при посмертной диагностике сальмонеллеза поросят, позволяют выяснить происхождение патологоанатомических изменений.

3. Результаты исследований по патоморфогенезу сальмонеллеза могут быть использованы в учебном процессе на морфологических и клинических кафедрах ветеринарных факультетов ВУЗов, а также их можно рекомендовать для включения в учебные руководства по патологической анатомии животных.