Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Основные биологические свойства и серотипизация возбудителя стрептококкоза нутрий

государственная комиссия совета министров ссср по продовольствию и закупкам

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВЕТЕРИНАРНАЯ АКАДЕМИЯ имени К. И. СКРЯБИНА

На правах рукописи

ВАШАКИДЗЕ Манана Ревазовна

УДК 619 : 6)6.98 : 579.862.1 : 616—078 : 636.932.3

ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И СЕРОТИПИЗАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СТРЕПТОКОККОЗА НУТРИЙ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

/

МОСКВА 1990

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии имени К. И. Скрябина.

Научный руководитель — доктор ветеринарных наук, профессор Конопаткин А. А.

Официальные оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук, профессор Сидоров М. А.

2. Кандидат ветеринарных наук Панин А. Н.

Ведущая организация — Витебская ордена «Знак Почета» ветеринарный институт им. Октябрьской революции.

Защита диссертации состоится « № » .¿¿/^//Я 1990 г. в «/Л> часов на заседании специализированного совета К-120.36.05 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук . при Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии им. К. И. Скрябина.

(109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. 377-93-83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МВА.

Автореферат разослан » Л/. 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета

Федосеева Т. Н.

' ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОЮ .

. Актуальность теш. Одной из важнейших задач, поставленных КПСС и Советским правительством перед работниками животноводства, является улучшение их качества, надежное обеспечение стра -. ны продовольствием и сельскохозяйственным сырьем.

Среда различных причин, тормозящих-решение этой задачи, особое место занимают широко распространенные инфекционные болезни сельскохозяйственных.животных, среда которых стрептококкоз является наиболее значительным. В ряде случаев он может наносить весьма ощутимый урон.

Стрептококковые инфекции известны сравнительно давно,многие его характеристики остаются недостаточно изученными. 3 особен -ности это относится к этиологической структуре возбудителя ин -фекции, лабораторной диагностике и специфической профилактике стрептококкоза нутрий, в результате болезнь трудно поддается зпизоотологическому контролю и наносит огромный ущерб (А.А.Коно-паткин и др., 1990). Поэтому как в нашей стране, так и за рубе- . жом, ведется интенсивная разрабртка научных и прикладных вопросов стрептококкоза животных (В.Нестерев и др.,1981; Р.А.Кадамов, Г.Э.Дунямашев, 1986; Е.А.Клепенина, А.И.Ивашура, 1988; r. Sundberg et al. , 1981; J. . Beer , 1987).Возбудители СТреПТОКОККОЗОВ согласно ключу определителя бактерий Берги (1986) относятся к семейству Streptococcaceae , рода Streptococcus . Они ДОВОЛЬНО широко распространены в природе. Их находят в воздухе, воде, лище, на слизистых оболочках и йоже животных и человека. Стрептококковые болезни встречаются почти повсеместно. Поэтому ' профилактика стрептококкоза прежде всего направлена на выполнение ветерянарно-санитарных правил разведения животных, повышение их общей резистентности. Но общепрофилактические мероприятия часто оказываются недостаточными. В результате актуальной научной проблемой является разработка более эффективных специфических средств и методов специфической профилактики, а для этого важно знать этиологическую структуру возбудителя стрептококкоза и на этой основе разработать серогрупповую дифференциацию возбуди -теля и лабораторную диагностику болезни.

Цель и задачи исследований. Стрептококкоз в виде спорадических случаев регистрируют во многих звероводческих хозяйствах. Нередко болезнь проявляется в септической форме и массовым пора-

- 2 - ; ' жений зверей,' в связи с этим рентабельность нутриеводческих ферм снижается до 40

Из анализа доступной нам отечественной и зарубежной литературы ( В.Baldeiii , I95o; B.Bruno , 1956;, А.В.Абовян, 1981; И.П.Сырникова, В.А.Есепенок, 19Ьо) можно сделать заключение о том, что этиологическое значение различных групп стре тококков при стрептококкозе нутрий изучено недостаточно. Это связано с тем, что нет специфических диагностических имм уносы вороток. .•.••■■

Наша работа направлена на изыскание методов получения группоспецифических иммунных сывороток для групповой дифферен циации стрептококков, выл,еденных от нутрий. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1) выявить наличие инфекционных агентов в патологическом материале от нутрий, больных стрептоконкозом;

2) изучить морфологические, культурально-биохимические, патогенные и вирулентные свойства выделяемых стрептококков;

3) разработать оптимальные варианты схем для иммунизации кроликов; ' ,

4) получить группоспецифические.антистрептококковые преци-питирующие сыворотки серогрупп А, В, С, Д и F;

Ь) провести сравнительную оценку нескольких методов изготовления стрептококковых антигенов для РП и РДП;'

6) испытать полученные антистрептококковые сыворотки на активность и специфичность в РП и РДП;

7J применять РП и РДП для идентификации стрептококков, выделенных от нутрий.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые получены антигены из вирулентных стрептококков, выделенных от нутрий, неблагополучных по стрептококкозу звероводческих хозяйств различных регионов страны и отработана схема 'гипериммунизации кроликов, ¿¡первые в нашей стране получена группоспецис(ическая сыворотка к возбудителю стрелтококкоза нутрий и доказана его серологическая принадлежность к группе С. Доказана культуральн морфологическая и ферментативная идентичность, возбудителя стрелтококкоза нутрий рода Btreptococcus. группы С и установлен, прямая связь между патогекностью возбудителя и бета-гемолитиче! кой активностью. Отработаны оптимальные условия'постановки РДП для серологической групповой дифференциации стрептококков, выделенных от пораженных нутрий и дана оценка серологической peai

(ии в сравнении с бактериологическим и биологическим методами идентификации возбудителя стрептококкоэа нутрий. '■

Практическая ценность работы. Разработан способ получения активной группоспецифической сыворотки к возбудителю стрепто-гоккоэа нутрий (группа С), отобран наилучший способ получения группоспецифического полисахаридного С-антигена для постановки реакции кольцеприципитации и диффузионной преципитации и отработаны оптимальные условия постановки РДП, как наиболее простого и чувствительного метода для серологической дифференциации стрептококков. Материалы диссертации были использованы при разработке "Временной инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации стрептококкоэа нутрий", утвержденной Главным управлением ветеринарии ГосагроПрома СССР 21 апреля 1988г.

Апробация, Основные положения диссертации изложены и обсуждены на научных конференциях ветеринарного факультета МВД (1987-1989 гг.), на межкафедральном совещании сотрудников ка-ферд микробиологии, эпизоотологии, паразитологии, вирусологии и, лаборатории болезней молодняка.

Публикация. 11о теме диссертации опубликовано Z статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация написана на русском языке на 166 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений. Работа иллюстрирована 4? таблицами, 22 рисунками. Список литературы содержит 216 источников, из которых 66 иностранных.

ССЗСТВйШЬй ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования

Работу выполняли на кафедре эпизоотологии Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии з течение 1986-1989 гг.'

Материалы для Выделения и исследования, стрептококков получали от нутрий из неблагополучных по стрептококкозу нутриевод-ческих ферм зверосовхозов:"Родники", Московской области, "Майский" Кб.АССР, "Северинский" Краснодарского края, "Сипрус"Эс -тонско.т ССР и. из Акналического хозяйства Армянской ССР.Мссле-довали селезенку,легкие, печень, почки, головной мозг павших

шщ вынужденно убитых животных.

Д;;Я экспериментальной работы использовали 450 кроликов, 50 нутрий, 970 белых мышой и 270 .морских свинок. Бактериологи- . чоскому, микробиологическому и серологическому исследованию бы-, ло подвергнуто 300 проб патологического материала: 66 - из сов- ' хоза "Р.одники", 64-"Майский", 58 - "Северинский", 57 - "Сипрус", ¿5 - из Акналичоского хозяйства Армянской ССР. Выделение и исследование стрептококков вели с использованием, мясо-пелтонного . бульона (ШБ), мясо-пептошюго агара (!.ША), полужидкого агара (ПЖА), кровяного агара (КА), среды Китта-Тароцпл. Среды примени-' ли с добавлением 0,5-1 % глюкозы. Эту работу проводили согласно "Рекомендаций по индикации и идентификации стрептококков" (1976)/ и "Методических указаний по лабораторной диагностике стрептококк коза животных" (1983).

Наличие инфекционного агента в исходном материале выявляли . путем высева из материала на вышеуказанные искусственные питательные среды. Посевы инкубировали в термостате при 37-38° С в течение 24 час. Учитывали характер роста на всех использованных средах. .'*.-...

Морфологические свойства всех выделенных стрептококков изучали путем микроскопии мазков, приготовленных из различных пи-,', тательиых срэд и окрашенных по Граму. • Патогенность чистых культур стрептококков, выделенных от нутрий, проверяли на белых мышах, вводя им внугрибршишю 0,2-0,5 мл 18-24-часовых культур, на морских свинках (доза 5 мл) и на кроликах (доза 10 мл).

Для определения вирулентности использовали белых мышей,которых заражали. 1Ь-20-часовши культурами, внутрибрюшинно последовательно десятикратными разведениями исходной (10эм.г./мл) взвеси стрептококка в физиологическом растворе в объеме 0,1 мл.' Среднюю смертельную дозу (ДД50) микробов определяли по методу Спирмена-Кербера (Закс Л., 1976).

. При дифференциации стрептококков,выделенных из патологического материала нутрий, использовали тесты: 1)выявление гемолитической активности на 5 % кровяном агаро; 2) рост в глюкозосывороточ-ном бульоне в присутствии 10 и 40 % желчи; 3) рост на среде с 6,5 % поваренной соли (КаС1); 4) рост в натуральном молоке;

5) обесцвечивание молока с 0,2 % раствором метиленовой сини;

6) рост в желатине; 7) рост.при 10 и 45 °С; 8) рост в среде с хН-9,6; 9) определение, термореэистентиости; 10) выявление ферментации на цветных средах с лактозой, глюкозой, мальтозой, сахарозой,

арабинозой, сорбитом, маннитом, дульцнтом, инозитом, галактозой, рафинозой, ксилозой. , ■

Дифференциацию стрептококков от стафилококков проводили по каталазной пробе и споообности стафилококков расти на средах, содержащих 10 % хлорида'натрия (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, 1982; "Методическое указание по лабораторной диагностике стрептококкоза животных", 1983).,

. Серологическую дифференциацию выделенных культур стрептококков осуществляли с помощью реакции кольцепреципитации (РП) по методу Lencefield (1928, 1933)в модификации института ■ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалея АМН СССР и в реакции диффузной преципитации по методу Оухтерлони (1948) с помощью изготовленных наш прешиштирутацих иммунных сывороток.

- С целью серологического группирования стрептококков, выделенных от нутрий, мы'получали .группоспецифические антистрептококковые ггреципитирутадие свворотки путем иммунизации кроликов. Использовали кроликов породы шиншилла, массой 2,5-3,5 кг. Антиген для иммунизации кроликов готовили из эталонных штаммов стрептококков групп A, i3, С, Д и Р и из пяти толевых, свежевнделенных штаммов. Сыворотки крови получали по общепринятой методике, расфасовывали в пенициллиновые флаконы по 5,0 m и хранили до исполь -зования при температуре - 10 - 18 °С.

Для получения высокоактивных и специфических снвороток в сравнительном аспекте, антиген для гипериммунизации кроликов гото -вили по методу, предложенному Р.С.Москаликом (1974) и по методу, описанному К.А.Бородиюком и П.М.Лямпертом (1986). Также в сравнительном аспекте испытали четыре схемы гяперкммунизации,отличающихся количеством и качеством вводимого антигена, числом инъекций и интервалом между ниш.

Активность и специфичность полученных гипериммунных сывороток оыла испытана в перекрестных реакциях преципитации с антигенами из эталонных штаммов разных групп стрептококков.

Групповой полисахаридами С-антиген для серологических реакций в сравнительном аспекте готовили тремя способам: кислотным, гидролизом по Ленсфилду (19*8, 1933) в'модафикации, применяемой, в институте эпидемиологии и микробиологии имони И.Ф.Гамалеи (Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, 1973), термической экстракцией автоклавированием по Кун-теру'в модификации Карташова и Гинзбурга (А.А.Гинзбург, 1979) и

дезинтеграции микробных клеток путем замораживания и оттаивания . (Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, 1973).

Б процессе наших исследований были определены, оптимальные условия для дастанозки РДГ1. С этой целью нами б или изучены еле-. дующие вопросы, влияющие на ход и результаты реакции: различная , концентрация агара фирмы "Дифко", концентрация хлористого, натрия, температура, различное расположение лунок и рН среды.

Было приготовлено 180 преципитирувдих сывороток против .эта-, лонных штаммов стрептококков разных групп, среди них: против группы А - 36 сывороток, группы В - 36 сывороток, группы С - 36, группы Д - 36', ,рущщ Р-- 38, против полевых' свежо выделенных от нутрий шташов стрептококков - 60 сывороток.

В реакции кольцепрециштащш и диффузионной преципитации исследовано <¡43 культуры стрептококков, выделенных из органов' '.•: нутрий пяти неблагополучных по стрептококкозу зверосовхозов страны. Для статистической обработки полученных данных использовали руководство Л.Закса (1976). Подсчитывали количество сов-, падений результатов и уровень доверительной вероятности (Р).используя таблицу критерий 'знаков, основанную на биноминальном распределении.

, РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ '

Выявление наличия инфекционных агентов в патологическом .•

материале от нутрий, больных стрептококкозом, .и их морфологические, культурально-биохимические,патогенные и вирулентные свойства

Патологический материал исследован от 50 нутрий. В исходном материале от всех животных были обнаружены однотипные бактерии-стрептококки. .

В шзках-отпечатках из. внутренних органов (печень, почка, . селезенка) микробные клетки обнаруживали, кучками, состоящими из нескольких грамполояительных, округлых бактерий, а из крови, сердца - стрептококки располагались одиночно, попарно, короткими цепочками.

В мазках из бульонной культуры бактериальные клетка чаще располагались длинны!,га цепочками, их,количество в одной цепочке било непостоянно и колебалось от трех до нескольких десятков, напоминая собою женское ожерелье. Стрептококки, выросшие на ■ плотных питательных средах' и полужидком агаре, в мазках раопола-

гались параш, короткими цепочками или скоплениями, напоминающими грозди стафилококка.

Стрептококки, выделенные от нутрий оказались требовательными к питательным средам и хорошо росли только на средах, обогащенных глюкозой. При посеве на МПБ с глюкозой в большинстве .случаев отмечали придонно-пристеночный рост в виде хлопьев,при этом вся среда оставалась прозрачной. При взбалтывании осадок поднимался косичкой,легко разбивался и переходил в гомогенную взвесь, которая постепенно со временем опять осаждалась и бульон становился прозрачным. Но были и случаи, когда при встряхивании пробирки стрептококки не давали гомогенной взвеси: бульон оставался прозрачным, а хлопья не разбивались и напоминали механические частицы песка.

На ША с добавлением глюкозы стрептококки росли в виде мелких колоний диаметром около I мм, колонии выглядели сероватыми или. бесцветными с-ровными краяш и без врастания в агар. В полужидком агаре с глюкозой стрептококки расли по уколу в виде хлопьевидных образований, которые более, интенсивно формировались в средних и нижних слоях среды.

Все испытуемые изоляты стрепктококков хорошо окрашивались анилиновыми красками, были неподвижные и спор не образовывали.

Подавляющее большинство свежевыделенннх культур стрептококков образовывали капсулу, которую обнаруживали при окраске по Гинсу.

Сравнительна интенсивное капсулообразование отмечали у стрептококков, выделенных из крови сердца, легких и печени. Из всех 293 выделенных и исследованию: культур стрептококков 90,9, % образовывали капсулу при росте на ША, 91,8 % - на КА и 90,5 % на МПБ.

Из 293 выделенных от нутрий стрептококков 96,7 % обладали /3- гемолитической активностью, 0,4 % вызывали - гемолиз и 2,9 % не обладали гемолитической активностью. Гемолитическая активность на 6-ой месяц культивирования на искусственных питательных средах снижалась до 2,1 а на 7-ой месяц - полностью исчезала.

Стрептококки, выделенные из разных органов нутрий из разных зверосовхозов страны оказались патогенными и вызывали гибель белых мышей от 92 до 100 % и морских свинок от 85 до 98 % при заражении внутрибршинной бульонной культурой, дозой соответственно 0,5 мл и 5 мл с концентрацией 2.10 м.т./ш, а для кроликов они били не патогенны.

. Изучая" вирулентность изолятов,выделенных из разных органов,

оказалось, что в среднем 1еЛД5о стрептококков, выделенных из легких составляет 1,6998 и их вирулентность была выше, но при расчете доверительной вероятности (Р) оказалось, что Р> 0,05 и во всех случаях одинаково недостоверен, что -свидетельствует о том, что в основном выделанные стрептококки из разных органов были высоковирулентными, за исключением изолятов стрептококков из головного мозга, где Р<0,05 и они характеризуются сравнительно низкой вирулентностью.

Повысить вирулентность стрептококков, которые во время их • использования утратили это качество, удалось путем длительного пассирования этих стрептококков через организм мышей. Оказалось, что вирулентность всех <¡2 изучаемых изолятов была минимально!: до 4-5 пассата, затем постепенно повышалась и достигала максимума к 9-10 пассажу.

Оптимальная температура для культивирования изолятов стрептококков била на уровне 37 °С. 98,8 % из 243 изолированных стрептококков не росли на среде с 10 % и 99,6 % - на среде с АО % желчи крупного рогатого скота, 99,6 % не росли на среде с 6,5 % хлористого натрия, не редуцировали метиленовый синий в молоке и не разжижали желатин, 99,2 % не свертывали молоко. Они не росли при температуре 10 0 и 45° и в среде с рН - 9,6, гибли ' ' после 30-минутного прогревания при 60 °С. Эти стрептококки фер- -монтировали глюкозу "(100 %), а подавляющее большинство - ксилозу (99,6 %), галактозу (99,2 %) сорбит (98,4 %), салицин (97,5 %), лактозу (96,7 %), сахарозу (89,7 %); не ферментировали арабино-зу (100 %), рафинозу (100 %), трегалозу (100 %), инулин (98,3:0, мальтозу (96,3 %) и маннит (96,7 %).

Таким образом из всех паренхиматозных органов исследованных нутрий была выделена чистая культура стрептококка, которая со- 1 ■ гласно ключу определителя бактерий Берги (1986) по морфологиче-сгаад, физическим, культурально-биохимиче ским свойствам' относят- -' СЯ К роду аЪгер^соссиз группы С.

пошлший ташосшад-шлзйа анткстр^игококкозых ■ ."

СШ0Р0Т0К С£Р0ГРУШГА,В,С,Д И Р-

Результаты изыскания оптимального опособа изготовления стрептококковых антигенов и выяснения оптимальных вариантов схем для иммунизации кроликов . ■

С целью получения .'гипериммунных антистрептококковнх сывороток в качестве продуцентов были отобрана клинически здоровью,;

массой 3-4 кг кролики породы шиншила, не содержащие нормальных антител против стрептококков.

Антиген для иммунизации готовили из эталонных штаммов стрептококков групп А, В, С, Д и ? по методу, предложенному Р.С.Мбс-каликом (1974). Для 1-го цикла гипериммунизации суточную бульонную культуру стрептококка центрифугировали при 3000 об/мин 20 мин. и трижды промывали физиологическим раствором. Этим же раствором разбавляли микробную массу до концентрации 2 млрд м.т./мл и взвесь прогревали в водяной бане при 56° в течение 1,5 часа. Для П-го цикла гиперишунизации готовили также, но без прогрева -ния (живой антиген).

Антигены из эталонных штаммов стрептококков групп А, В, С,Д и Е готовили также па методу, описанному Н.А.Бородиюком и И.М. Лямпертом (1986), при этом антиген для I и П циклов гипериммунизации готовили одинаково: 18-часовую культуру центрифугировали при 3000 об/шн в 'течение 30 мин. и трижды отмывали физиологическим раствором, из микробной массы готовили взвесь в физрастворе, содержащую около 10^ м.т./мл и прогревали в водяной бане при 56-5В °С в течение 45 минут, к осадку добавляли 0,25 % раствор пепоина и оставляли при 37 °С в термостате на 4 часа, после чего трехкратно отмывали от пепсина физраствором и готовили взвесь стрептококков в физрастворе 2*103 м.т./мл концентрацией.

В сравнительном аспекта испытали четыре схемы гапершмуни-зации (таблица I).

В процессе исследования были изучены оптимальные условия, влияющие на проявление и ход реакции. В результате многочисленных наблвдений установлено, что для получения более четких и специфических результатов в РДД оптимальными параметрами постановки реакции были: 0,85 % содержание хлорного натрия, I %-ный агаровый гель, рН геля 7,0-7,5, комнатная температура, 4 мм-ые лунки, находящиеся друг от друга на расстоянии 4 мм. Для нормального течения РП оптимальная величина рН преципитогена должна находиться в пределах 6,8 - 7,2.

С помощью разработанного метода РДП и с помощью реакции кольцепреципитации оценивали специфичность и чувствительность полученных сывороток и антигенов. Для этого ставили перекрестные реакции с гомологичными и гетерологичными антигенами и сыворот -каш. , ' ■

Таблица I

Четыре схемы гипериммунизации кроликов с целью получения антистрептококковых сывороток

Цикл Шетод приго- ¡Место взе- !_

имму- !товлепия анти-!дения анти- 1 низац1ш!гена .'гена ! I Г

Неделя и доза антигена • мл !

а ! 3 ! 4 . !

JШШ

3 ! 4 !

Шшунизации I в неделю

I схема гяшшммптизаиии

I По методу Р.С.Москалика убитой нагреванием - Краевая вена уха 0,5 1,0 2,0 3,0 1.0 2,0 4,0 6,0 4 дня подряд 3 дня перерыв

П живой 0,25 0,5 1,0 П «схема гилеттвдунизапии 1.5 0,5 1,0 2,0 3,0 1 о

I п По методу Р.С.Москалика убитой нагреванием живой Краевая вена. 1,0 1,0 1,0 уха 1,0 1,0 1,0 Ш схема гипешммунизашт 1.0 1,0 2,0 1,0 4,0 2,0 8,0 4,0 16,0 6,0 Один раз _ Пшт

I . п Обработка пепсином Краевая вена уха 0,25 0,5 0,75 0,25 0,5 0,75 1.0 1,0 0,5 0,5 1,0 1.0 1,5 1,5 2,0 2,0 4 дня подряд 3. дня перерыв

1У" схема гипетаммунизании

I Обработка пеп- Подкожно и

сшом внутривенно 0,25 0,5 0,75 1,0 0,5 -1,0 1,5

П 0,25 0,5.0,75 1,0 0,5 1,0 1,5

2,0 '4 дня подряд- . 2 о 3 дня перерыв

Преципитирующие сыворотки груш В, Д и Р были строго специфичны и реагировали с антигенами, приготовленными только из гомологичных груш стрептококков. Антистрептококковые сыворотки против эталонных штаммов,стрептококков группы А и С положительно реагировали с гомологичными шташами, но также вступали в перекрестную реакцию друг с другом, которую удалось устранить методом разведения сывороток рте при 1:4.

. При изучении специфичности и активности полученных пгаер-ишунных- сывороток наблюдали, что результаты РП и РДП были идентичны.

При изучении активности гипериммунных сывороток в РП и РДП, с. антигенами, приготовленными по методу Ленсфилд и по способу , Кунтера, установили, что гипериммунние сыворотки, полученныэ по схеме П и 1У, имели наиболее высокие титры антител в разведении 1:64. Сыворотки групп С и А оказались более активными, чем сыворотки групп Д и Р.

Наши исследования дают основание сделать вывод, что титры преципитиноз антистрептококковых сывороток группы С и А после Д цикла иммунизации возросли до разведения 1:64, тогда как после I цикла они равнялись разведению 1:4, 1:8.

Сравнительный анализ полученных результатов показал, что . группоспецифический полисахаридный антиген для РП и РДП, приготовленный путем замораживания и оттаивания, по своей активности уступает антигену, приготовленному термической экстракцией, который сам по себе по этим же свойствам не уступал антигену, приготовленному кислотным гидролизом.

. Исходя из полученных результатов, можно сделать заключение, что испытанные схемы гишриммунизации обеспечивают накопление антител в достаточно высоком титре, однако наибольшее предпочтение следует отдать П и 1У. схеме. Гипериммунизация кроликов по этим схемам дает возможность достигать высокого уровня антител, они более рациональны и. могут быть использованы для определения групповой принадлежности стрептококков разных серогрупп. Гипериммунные сыворотки проявляли максимальную активность в РП и РДП с полисахаридным антигеном, приготовленным путем кислотного гидролиза по Ленсфильду и термической экстракцией автокла-вированием по Кунтеру. Эти антигены по своей специфичности и активности были идентичны.

*

Следует отметить, что при иммунизации одним видом антигена у различите кроликов передаю получали сыворотки с различной активностью, что указывает на индивидуальную особенность иммуногенеза у подопытных животных. Такую индивидуальную иммунореак-тивность организма кроликов необходимо учитывать в процессе получения группоспоцифкческих иммуносывороток, к возбудителю стреп-тококкоза нутрий.

Скорость появления линии преципитации РДП была неодинакова, кроме того, нами было замечено, появление двух линий лреципита- '. ции, что свидетельствует о. сложной структуре стрептококкового полисахарида.

Пргалененио РДП для идентификации стрептококков, . выделенных от нутрий

После того, как были выявлены наилучшие • схемы. (П и 1У) . гипериммунизации кроликов для получения высокоспецифичных и , ■ высокоактивных группоспецифических сывороток и определены оптимальные условия постановки РДП, приступили непосредственно к ■ ; серологической дифференциации, выделенных нами от нутрий стрептококков. Ддя этой цели заново получили группоспецифические антистрептококковые сыворотки к референтным штаммам серогрупп А, В, С, Д и 3?. Сыворотки также получили к.антигенам, приготовленным из пяти свожевыделенньсх от нутрий изолятов стрептококков с типичными биохимическими и культуральнши свойствами.

Гипериммунизацию кроликов проводили по схеме 1У, а при при- ■ готовлении группоспецифического голисахаридного антигена предпочли кислотный гидролиз по Денсфилд.Солянокислый экстракт готовили из всех выделенных нами изолятов стрептококков от нутрий из разных зверосовхозов страны, а также из эталонных штаммов стрептококков серогрупп А, В, С, Д и Р. . -

С помощью РДП провели групповое серологическое типйрование 243 изолятов стрептококков, выделенных от нутрий из вышеназванных зверосовхозов страны.

Антистрептококковые сыворотки против возбудителя стрепто- ■ коккоза нутрий положительно реагировали на групповой антиген всех стрептококков (100 %), изолированных от нутрий из разных зверосовхозов страны. Этим установили, что'культуры стрептокок- .. ков, выделенные от нутрий из разных регионов страны, имеют общий полисахаридаый антиген. Эти сыворотки также реагировали полози-жительно на групповой антиген эталонного штамма стрептококка ..

группы С, а с антигенами группы А, В, Д и 3? давали отрицательную реакцию. ,

Анти С-сыворотка дала положительную реакцию с групповыми антигенами 236 из. 243 изолятов, а анти-А, В, Д и F сыворотки во всех случаях давали отрицательные. Такие результаты подтверждают, что 97,12 % изолятов стрептококков по групповому специфическому полисахариду относятся к стрептококкам серологической группы С. Принадлежность же 7-ми изолятов из 243 ( 2,8 %) к той или иной группе установить не удалось.

Помимо■специфичности полученных сывороток мы изучали и их активность. Оказалось, что сыворотки против возбудителя стрепто-коккоза нутрий были более активны по сравнению с анти-С-сыворот-. кой и имели активность в разведении 1:128 после П цикла гипериммунизации.

Из результатов исследования следует, что РЛД можно рассматривать, как достоверный метод идентификации возбудителя стрепто-кокооза нутрий и стрептококков груш А, В, С, Д и Р.

ВЫВОДЫ

1. Комплексное исследование культурально-морфологических, ферментативных и антигенных свойств 243 культур стрептококков, изолированных от нутрий пяти неблагополучных по стрептококкозу звероводческих хозяйств различных регионов страны, показало,что стрептококкоз нутрий вызывают стрептококки групш С ( str. гоос-pidemicus ).

2. Культурально-морфолотаческие и ферментативные свойства возбудителя стрептококкоза нутрий идентичны таксономическим признакам рода streptococcus группы С. Свежевыделенные * изоляты возбудителя в 98,4 % не растут в средах с желчью крупного рогатого скота, в 99,6 % - в средах о 6,5 %-пт содержанием натрия хлорида, а также при температурах IQ0 и 45°.С и 1Й

среды 9,6; не редуцируют мехиленовай синий в молоке, не свертывают молоко и не разжижают желатину. Оптимальная температура культивирования 37° С при 6,7 - 8,0 рН среды.

3. Возбудители стрептококкоза нутрий ферментируют глюкозу (100 %), ксилозу (99,6 %) галактозу (99,2 $), сорбит (98,4 %), салицин (9.7,5 %), лактозу (96,7 %) сахарозу (89,7 %); не ферментируют арабинозу, рафинозу, трегалозу (100 %), инулин (98,05, мальтозу (96,3 %), • • ■ ■

4. Б свежеввделенных культурах возбудителя стрептококкоза нутрий при росте на МПБ, полужидком и кровяном агаре капсула-образование проявляется в 90,5-91,8 %, бета-гемолиз в 96,7 %, альфа-гемолиз - в 0,4 % и отсутствует гемолиз у 2,3 % изолятов. Установлена прямая зависимость между бета гемолитической активностью и вирулентностью для белых мышей и морских свинок.

5. Биологические свойства возбудителя стрептококкоза при многократном пассировании на искусственных питательных средах и длительном хранении существенно изменяются, теряется способность калсулообразования и гемолитическая активность, резко снижаются вирулентность и ферментативная активность. Эти свойства удается восстановить путем 9-10 -кратного последовательного пассирования возбудителя через организм белых мышей.

6. Гиперимадунизация кроликов антигеном, приготовленным обработкой живой клетки пепсином по схеме, состоящей из двух циклов с интервалом I месяц, при которых кроликам вводится антиген параллельно подкожно и внутривенно в течение 4 недель, еженедельно 4 дня подряд с 3-дневным перерывом, постепенно увеличиваемой дозой от 0,25 до 0,5; 0,75; 1,0 мл позволяет получить высокоактивные группоспецифические сыворотки, пригодные для групповой идентификации возбудителя стрептококкоза нутрий в реакции кольце-преципитации и РДП.

7. Сравнительный анализ полученных'результатов показал, что групповой полисахаридный С-антиген для реакции, приготовленный путем замораживания и оттаивания по своей специфичности и чувствительности уступает антигену, приготовленному термической экстракцией по методу Кунтера, который сам по себе по этим ке свойствам не уступает антигену, приготовленному кислотным гидролизом по Ленсфилд.

.8. Реакция даффузной преципитации .с учетом разработанных оптимальных условий при идентификации возбудителя стрептококкоза нутрий и стрептококков серологических групп А, В, С, Д и Р высокочувствительна и специфична. Активность получаемых анти -стрептококковых сывороток груш А, 3, С, Д и Р по предложенной схеме в РДП была 1:8-1:64, а сывороток на возбудителя стрептококкоза нутрий 1:64 - 1:128.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРВДОЖЕШН

1. Для серологической идентификации выделенных от нутрий» стрептококков в качестве основного теста рекомендуется реакция диффузной преципитации- с использованием группоспецифического полисахаридного антигена, приготовленного кислотным гидролизом или' термической экстракцией и гиперишунных прециштирутащих кроличьих сывороток. '"'..'.'.

2. Материалы диссертации вошли во "Временную инструкцию о мероприятиях по профилактике и ликвидации стрептококкоза нутрий", (утверждена ГУБ Госагроцрома СССР'21 апреля 1988 г.).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Конопаткин А.А.,Есепенок В.А., Вашакидзе М.Р. Серологическая идентификация возбудителя стрептококкоза нутрий. - М., 1989. - 6 е./ Моск.вет.акад.им.К.И.Скрябина.- Деп. во ВНИИТЭК-агропром.- 20? ВС-89. // Опубл. в серии 30 "Инфекционные болезни животных". - 1989. - № 7. - С. 5. '

2. Вашакидзе М.Р. Реакция преципитации при дифференциации стрептококков, выделенных от нутрий, при стрептококкозе,- М., 1989. - 6 с.Доек.ват.акад.им.К.И.Скрябина. - Деп. во ВНЖГЭИ-агропром. - № 206 ВС-89 // Опубл. в серии 30 "Инфекционные болезни животных", 1989. - К 7. - С.5.