Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Оптимизация условий культивирования вируса чумы мелких жвачных для получения диагностических и вакцинных препаратов

На правах рукописи

КАПУСКИН Егор Вадимович

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА ЧУМЫ МЕЛКИХ ЖВАЧНЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ

16.00.03. «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2008

003171514

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных», г Владимир

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор

ЗАХАРОВ Валерий Михайлович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

ДУДНИКОВ Андрей Иванович

ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г Владимир,

доктор ветеринарных наук КОЛОМЫЦЕВ Алексей Александрович ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии», г Покров

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ВНИТИБП, г Щелково Московская область)

Защита диссертации состоится "25" июня 2008 г в "10" часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220 015 01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу 600901, г Владимир, мкр Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан "22" мая 2008 г

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук, ^

старший научный сотрудник ^^^^ггл&г^ Г М Семенова

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ I Актуальность темы Чума мелких жвачных (ЧМЖ) - высококонтагиозное, остро или подостро протекающее вирусное заболевание овец и коз, характеризующееся лихорадкой, язвенными поражениями слизистой оболочки ротовой полости, геморрагическим гастроэнтеритом, поражением лимфоидной системы и пневмонией

Первоначально чума мелких жвачных (ЧМЖ) регистрировалась в странах Западной Африки, в последующем ее стали отмечать в Центральной и Восточной Африке, а с 1980 года и на Аравийском полуострове Сейчас это заболевание имеет широкое распространение на африканском континенте и в Азии

Чума мелких жвачных в РФ не регистрируется Но в результате анализа эпизоотической ситуации по ЧМЖ в мире выявлена тенденция приближения нозоареала к границам РФ Данное заболевание зарегистрировано в следующих государствах Турции, Афганистане, Казахстане, Таджикистане, Монголии и Китае И вследствие широких экономических, культурных и других связей со странами, неблагополучными по этому заболеванию, существует реальная угроза заноса ее на территорию нашей страны

Экономический ущерб, причиняемый ЧМЖ овцеводству и козоводству, велик, так как заболеваемость в первичных очагах болезни может достигать 100%, при высоком уровне летальности Кроме того, ЧМЖ обуславливает возникновение сопутствующих болезней у животных, что определяет высокий уровень экономических потерь

В связи с вышеизложенными обстоятельствами, все это обуславливает целесообразность изучения этой важной экзотической болезни, представляющей угрозу для животноводства РФ

Цель и задачи исследований Целью исследований являлись анализ эпизоотической ситуации в мире по чуме мелких жвачных, усовершенствование технологических параметров культивирования возбудителя этого заболевания для получения диагностических и вакцинных препаратов В задачи исследований входило• — провести анализ эпизоотической ситуации по ЧМЖ в мире за период 19962007 гг,

— оценить риск заноса этой инфекции на территорию РФ,

— изучить чувствительность различных клеточных культур к вирусу чумы мелких жвачных,

— подобрать оптимальные условия культивирования вируса чумы мелких жвачных, обеспечивающие высокое накопление вируссодержащего материала,

— разработать технологию изготовления живой вирусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой,

— провести испытания опытных серий вакцины против чумы мелких жвачных,

— использовать оптимальные условия культивирования вируса при изготовлении специфических антигенов и гипериммунных сывороток

Научная новизна Изучена эпизоотическая ситуация по ЧМЖ в мире за период 1996-2007гг и проведен качественный анализ риска заноса данного заболевания на территорию РФ

Изучены иммунобиологические свойства оригинального вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ»

Исследована чувствительность различных клеточных культур к вирусу ЧМЖ, в результате чего подобрана оптимальная система культивирования

Усовершенствована технология культивирования вируса ЧМЖ, обеспечивающая высокое накопление вируссодержащего материала для изготовления диагностических препаратов и вирусвакцины против чумы мелких жвачных

Получены экспериментальные серии вирусвакцины против чумы мелких жвачных и проведены испытания их иммунобиологических свойств

Практическая ценность работы На основании проведенных экспериментальных исследований разработана технология культивирования вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» для производства вакцин против ЧМЖ и изготовления диагностических препаратов Получен производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ» вируса чумы мелких жвачных, который депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (5 марта 2007 г)

По материалам работы подготовлена, одобрена ученым советом и утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ» «Методика культивирования и титрования вируса чумы мелких жвачных в перевиваемой культуре клеток СЬ-91» (2007 г)

Экспериментальные материалы по оптимизации культивирования вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ» вошли в утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ»

- Инструкцию по применению вирусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой,

- СТО 00495527-0095-2008 на изготовление вирусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой

Апробация работы Результаты исследований по теме диссертации были опубликованы и доложены на «Международной научной конференции по проблемам животноводства, ветеринарии и кормопроизводства», 16-18 мая 2007 г, Бишкек, КиргНИИЖВиП, на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» 16-18 апреля 2008 г , г Владимир, и на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2005-2007 гг Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них две статьи в изданиях, по перечню ВАК

Личный вклад Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно Отдельные этапы диссертации проводились совместно с к б н А В Щербаковым раздел - «Идентификация вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» (изучение идентичности вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» методом полимеразной цепной реакции), д б н А П Пономаревым раздел - «Идентификация вируса ЧМЖ шта!мма «ВНИИЗЖ» (электронно-микроскопическое исследование), к в н Марковым Г В и к в н Онищенко Р M раздел - «Устойчивость вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» при лиофилизации»

Диссертационная работа выполнена в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2005-2008 гг

Объем к структура диссертации Диссертация изложена на 155 страницах, иллюстрирована 26 таблицами и 18 рисунками Список используемой литературы включает 227 источников, из которых 164 иностранных Основные поло/Кения, выносимые на защиту

- условия культивирования вакцинного вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ»,

- характеристика антигенных свойств вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ»,

- технология изготовления вирусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой,

- результаты лабораторных испытаний иммунобиологических свойств вирусвакцины,

- технология изготовления специфических антигенов и гипериммунных сывороток

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы для исследований Вирус В работе был использован вирус чумы мелких жвачных, полученный из музея ФГУ «ВНЙИЗЖ»

Животные. Для изучения антигенной активности экспериментальной вакцины, проверки на безвредность, реактогенность, реверсибелыюсть и возможность контактной передачи вируса были использованы овцы (109 голов) и козы (27 голов) 12-24 месячного возраста

Культуры клеток Для культивирования, титрования и получения высокоактивного вирусного материала с целью изготовления вакцинных препаратов, а также для постановки РН использовали перевиваемую культуру клеток гонад козы (Ch-91)

На различных этапах работы были использованы следующие культуры клеток первично трипсинизированные - почки ягненка (ПЯ), тестикулы ягненка (ТЯ), почки козленка (ПК), тестикулы козленка (ТК), а также перевиваемые - почки эмбриона КРС (MDBK), почки теленка (RBt), почки сайги (ПС), почки овцы (ПО), почки эмбриона свиньи (СПЭВ), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка - шведская линия (ВНК-21/13), почки африканской зеленой мартышки (Vero)

Культуры клеток в виде монослоя или суспензии клеток получали из отдела культивирования клеток ФГУ «ВНИИЗЖ»

Реактивы и растворы При культивировании клеток и наработке вируссодержащих материалов использовали поддерживающие среды, приготовленные по стандартным прописям Игла, ПСС, ПСП, раствор Хенкса, ДМЭМ и 199

Питательные среды в готовом виде получали из лаборатории биотехнологии ФГУ «ВНИИЗЖ»

Для культивирования культур клеток в ростовую среду вносили 10% сыворотки КРС, пенициллина 100000 ед, стрептомицина 0,1 г, 10 мл 60%-го раствора L-глутамина на 1 дм3, рН среды - 7,2-7,4

Для культивирования вируса ЧМЖ в питательную среду вносили 2% прогретой при 56°С в течение 30 мин фетальной сыворотки, пенициллин 100000 ЕД, стрептомицин 0,1 г и L-глутамина 10 мл 6%-го раствора на 1 дм3 среды, 7,5% раствором натрия двууглекислого доводили рН до 7,4-7,6

Определение стерильности промежуточных вирусных материалов и изготовленных вакцинных препаратов проверяли высевом на бактериальные среды тиогликолевую (ТГС), мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА)

При изготовлении лиофилизированных вакцинных препаратов в качестве защитной среды использовали 50% раствор сахарозы, 20% раствор гидролизата лактальбумина, 20% раствор желатозы и гликоколовый буфер

Для концентрирования и очистки вируса ЧМЖ использовали 50% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 (ПЭГ), 50% раствор полиэтиленимина (ПЭИ), 10% раствор гидроокиси алюминия (ГОА)

На разных этапах исследований использовали фосфатно-буферный раствор, 0,25% раствор трипсина, диспергирующую смесь, состоящую из трипсина и версена в соотношении 9 1

Методы исследований Культивирование вируса В опытах использовали клеточные культуры, выращенные в матрасах объемом 50 см3, 250 см3 и 1500 см3 общепринятыми методами Посевная концентрация клеток составляла 300 - 400 тыс кл /см3

Культуры клеток выращивали с использованием ростовой среды с 10% сыворотки крови КРС При культивировании вируса ростовую питательную среду заменяли на поддерживающую с 2% сыворотки КРС, которую обновляли через каждые 2-3 суток инкубирования В ростовую и поддерживающую питательные среды с рН 7,2-7,4 добавляли 4% раствор гентамицина из расчета 1 мл раствора на 500 см3 среды Инкубирование культур вели при температуре 37°С до поражения 8090% клеток, после чего сосуды с инфицированной культурой клеток замораживали при температуре минус 20°С Полученные пробы вируссодержащего материала

каждого пассажа титровали в одноименной культуре клеток, используемой для размножения вируса

Определение биологической активности вирусов. Биологическую активность определяли титрованием на соответствующих культурах клеток

Вируссодержащий материал титровали методом последовательных десятикратных разведений в трехкратной повторности Зараженную и контрольную культуру клеток выдерживали при температуре 37 "С с заменой питательной среды через каждые 3-4 суток

Результаты титрования учитывали по характерному поражению клеток монослоя в течение 14 суток Титр вируса рассчитывают по методу Кербера в модификации Ашмарина и выражали в 1§ ТЦЦ50/СМ3

Определение уровня вируснентрализующнх антител к вирусу ЧМЖ. Исследуемые сыворотки прогревали в водяной бане при температуре 5б°С в течение 30 минут Для постановки РН готовили двукратные разведения испытуемых сывороток от 1 2 до 1 512 на растворе Хенкса рН 7,2-7,4 с добавлением антибиотиков Затем готовили необходимый объем вирусного материала, содержащий 1000 ТЦД50/СМ3 вируса чумы мелких жвачных и вносили по 0,5 см3 в каждый пенициллиновый флакон с равным объемом разведенной сыворотки Пенициллиновые флаконы со смесью вируса и сыворотки встряхивали и оставляли на контакт при 37,0 ± 0,5°С в течение 1 часа Затем эту смесь вируса с сывороткой вносили в объеме 0,2 см3 во флаконы с культурой клеток после удаления ростовой среды и выдерживали при 37,0 ± 0,5°С в течение 1 часа На каждое разведение сыворотки использовали 4 флакона с культурой клеток Потом в каждый пенициллиновый флакон вносили по 0,8 см3 поддерживающей среды Игла с 2% фетальной сыворотки и антибиотиков Пенициллиновые флаконы с культурой клеток инкубировали при 37,0±0,5°С 14 суток со сменой среды через каждые 2-3 суток

Одновременно ставили контроли с заведомо положительной и отрицательной сыворотками, контроль вируса и интактной культуры клеток Учет реакции нейтрализации проводили после появления цитопатического действия вируса (100 ТЦД50/см3) в контроле, где оно отмечалось на 10-12 сутки

Изготовление живой лиофилизированной вакцины. Для изготовления вакцины использовали вируссодержащий материал с биологической активностью вируса ЧМЖ не ниже 5,5 !д ТЦД50/см3

При лиофилизации в клеточную суспензию, содержащую вирус ЧМЖ, добавляли защитную среду из расчета 20% раствор ГЛА до конечной концентрации 3%, 20% раствор желатозы до конечной концентрации 0,6% и 50% раствор сахарозы до конечной концентрации 3%

Лиофилизацию вирусвакцин проводили на базе лаборатории болезней птиц совместно с к в н Марковым Г В и к в н Онищенко Р М в сублимационной установке Б М I «Ш^кмс!» (Франция) После окончания сушки камеру установки заполняли сухим стерильным воздухом и герметизировали флаконы по ОСТ 64-7-85-79, в зависимости от объема используемых флаконов при расфасовке 1 вирусвакцины Флаконы проверяли визуально в проходящем свете на отсутствие трещин и на наличие вакуума при помощи аппарата Д'Арсонваль согласно ГОСТ 28083-89 Массовую долю влажности в высушенном материале определяли согласно ГОСТ 24061-89

Определение стерильности Определение стерильности вирусного материала и изготовленных вакцинных препаратов проводили согласно ГОСТ 28085-89

Определение безвредности вакцины Испытание вакцинных препаратов на безвредность проводили на двух овцах или двух козах Вакцина считалась безвредной, если все животные после введения стократной иммунизирующей дозы в объеме 5,0 см3 в течение срока наблюдения (14 суток) не наблюдалось повышения температуры и отклонений от физиологической нормы

Определение антигенной активности вакцин Антигенную активность вакцинных препаратов определяли на трех овцах или трех козах и оценивали по уровню прироста антител в сыворотке крови через 21 сутки после иммунизации Антитела к вирусу ЧМЖ определяли в реакции нейтрализации

Проведение качественного анализа риска заноса возбудителя ЧМЖ на территорию РФ Методологически существует несколько вариантов оценки риска качественный, полуколичественный и количественный анализ Безусловно, первый из них является наиболее простым методом, позволяющим получить информацию быстро и в общедоступной форме Однако полученные в результате качественного

анализа данные не могут трактоваться однозначно, что сводит к минимуму достоинства этого метода Количественный метод более информативен, но требует наличия широкого спектра точных данных, достаточно длителен, а осознание его результатов без специальной подготовки затруднительно

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы Statistica Basic 'Statistics and Tables, а также методов, приведенных в руководстве Ашмарина И П (1962 г)

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Качественный анализ риска заноса ЧМЖ на территорию России Качественный анализ риска состоит из нескольких этапов идентификации опасности, анализ эпизоотической ситуации, плотности распространения восприимчивых к ЧМЖ животных, приграничной торговли и миграции населения, возможных путей заноса возбудителя ЧМЖ из неблагополучных стран на территорию России

Источником инфекции являются больные и переболевшие животные Восприимчивые животные овцы и особенно козы, газели, нубийские горные козлы, овцы ларистан, американские белохвостые олени, крупный рогатый скот и буйволы, у двух последних ЧМЖ протекает бессимптомно

В естественных условиях заражение происходит через пищеварительный тракт, возможно также через слизистую оболочку носовой полости

Распространению ЧМЖ способствуют неубранные трупы павших и вынужденно убитых животных, шкуры, кишечное сырье, кости, рога, копыта, шерсть

Исходя из вышеизложенного, можно констатировать, что занос в страну возбудителя заболевания возможен с импортируемыми восприимчивыми животными, мясом и другими продуктами животного происхождения Географическое распространение ЧМЖ

На рис 1 представлены сведения о странах, в которых регистрировали данное заболевание в период с 1996 по 2007 гг

ШШ ЧМЖ не регистрировалась I I Энделшчность до 5 лет рЩ Онле.мичность в течение 5-12 лет

Рис. 1. Географическое распространение ЧМЖ за период 1996-2007 гг.

Из рис. 1 следует, что наибольшее географическое распространение ЧМЖ получила в Западной и Центральной Африке, Аравийском полуострове, в странах Ближнего Востока и Азии (эндемичность от 5 до 12 лет).

В результате анализа данных эпизоотического процесса в мире за период с 1996 по 2007 гг. по чуме мелких жвачных была выявлена тенденция динамического распространения болезни в 2001-2004 гг. (в 1996 г. было 20 неблагополучных стран, а в 2001, 2002, 2003, 2004 гг. - 27, 32, 32, 31, соответственно). Также выявлено приближение нозоареала к границам РФ (в Турции впервые ЧМЖ была зарегистрирована в 1999 г., в Монголии - 2001 г., в Афганистане - 2002 г., в Таджикистане- 2002 г., в Казахстане - 2003 г. и в Китае в 2007 г.).

Предположительно ЧМЖ распространилась гораздо шире, так как она могла протекать латентно. Также необходимо отметить, что многие страны не предоставляют данные о вспышках в МЭБ или подают их с запозданием, что усложняет анализ распространения ЧМЖ в мире.

Таким образом, можно предположить, что наибольшую угрозу РФ в отношении возможности заноса возбудителя ЧМЖ представляет распространение болезни в следующих государствах: Турции, Афганистане, Иране, Индии, Пакистане, Казахстане, Таджикистане, Монголии, Китае.

Анализируя влияние факторов (плотность восприимчивого поголовья, близость к границам неблагополучных государств) можно предположить, что эта болезнь представляет максимальную угрозу для Южного федерального округа из-за

сосредоточения в нем наибольшего количества восприимчивого поголовья животных, близостью к неблагополучным регионам по ЧМЖ и наиболее подходящими климатическими условиями Имеется большой риск заноса ЧМЖ в Республики Тыва и Алтай, непосредственно граничащих с Монголией

Следующими факторами, способными влиять на эпизоотическую обстановку по ЧМЖ являются приграничная торговля и миграция По интенсивности вышеуказанных процессов на первом месте находится Южный федеральный округ, куда не исключен нелегальный завоз животных из Турции и Ирана через Грузию, Абхазию и Южную Осетию

Республики Татарстан и Башкортостан, имеющие высокую концентрацию овец и коз, хотя и удалены от неблагополучных по ЧМЖ территорий, тем не менее, могут считаться угрожаемыми по ЧМЖ, так как возможен занос возбудителя в эти республики по крупным транспортным линиям из Казахстана и Монголии

В связи со сложной экономической ситуацией в странах Центральной Азии и относительно низким уровнем жизни населения не исключено, что мигрирующее население перевозит в Россию продукты животного происхождения

В Центральный федеральный округ, характеризующийся наличием развитой инфраструктуры, вероятность заноса ЧМЖ незначительна в связи с низкой плотностью восприимчивого поголовья и слабой восприимчивостью к возбудителю ЧМЖ местных пород животных

Анализируя вышеизложенное можно констатировать, что вероятными путями заноса возбудителя ЧМЖ из неблагополучных стран на территорию России являются нелегальный импорт животных и животноводческих продуктов, легальный импорт мясопродуктов, продукты питания туристов/мигрантов, автотранспорт (перевозящий животных и животноводческую продукцию), «естественное» распространение в приграничной зоне, контаминированные корма и фураж (в т ч зерновые), отходы с бортов железнодорожных составов, отходы с бортов авиалайнеров и судов, дикие восприимчивые животные, аэрогенное распространение, биотерроризм

Из перечисленных выше факторов наиболее вероятным путем заноса ЧМЖ является нелегальный импорт животных и продуктов животноводства из неблагополучных государств

Есть и другой возможный путь заноса ЧМЖ на территорию России - это легальный импорт животных и продуктов животного происхождения Процесс импорта в РФ пользовательского и убойного скота регламентирован только при ввозе овец и коз

Изучение чувствительности клеточных систем к вирусу ЧМЖ В настоящее время культуры клеток являются основной биологической системой для выращивания вирусов Определение наиболее чувствительных к вирусу клеточных систем необходимо для получения вируссодержащего сырья с высокой биологической активностью для изготовления вакцинных и диагностических препаратов

Репродуктивную активность вируса ЧМЖ изучали в различных клеточных системах первично трипсинизированных - ПЯ, ТЯ, ПК, ТК, перевиваемых - MDBK, СПЭВ, ПО, ПС, RBt, IB-RS-2, ВНК-21, Vero, Ch-91 В опытах использовали клеточные культуры, выращенные в матрасах объемом 50 см3 или 250 см3 общепринятыми методами

Полученные пробы вируссодержащего материала каждого пассажа титровали в одноименной культуре клеток, используемой для размножения вируса Культивирование вакцинного вируса в этих клеточных системах проводили в течение 5 последовательных пассажей

В результате проведенных исследований было установлено, что наиболее активные вирусные материалы получены в культуре клеток Ch-91, на уровне 5-го пассажа титр вируса составлял 6,21±0,31 lg ТЦД50/см3 Наименее чувствительными культурами клеток оказались RBt, ВНК-21 и СПЭВ, титр на уровне пятого пассажа составлял 1,26±0,07 lg TLUWcm3, 3,50±0,25 lg ТЦД50/см3, 4,00±0,50 lg ТЦД50/см3 соответственно Во всех культурах клеток, за исключением RBt, наблюдалась тенденция к увеличению биологической активности в зависимости от пассажа При культивировании вируса ЧМЖ в культуре клеток RBt наблюдалась тенденция к уменьшению биологической активности в зависимости от числа пассажей, что может объясняться низкой чувствительностью данной культуры клеток к вирусу В остальных культурах вирус накапливался в пределах 4,47-5,75 lg ТЦД50/см3

Наибольшая чувствительность к вирусу ЧМЖ установлена при заражении перевиваемых культур клеток Ch-91, MDBK и Vero Цитопатическое действие вируса проявлялось в первом пассаже на 7 сутки, а в третьем пассаже - на 2-3 сутки

Изучение репродукции вируса ЧМЖ в культуре клеток Ch-91 при разной множественности инфицирования Для этого формировали четыре группы по 45 флаконов {50 см3) с полностью сформировавшимся монослоем культуры клеток Ch-91, культуру клеток в каждой группе инфицировали вирусом ЧМЖ при множественности инфицирования 1,0, 0,1, 0,01 и 0,001 ТЦД50/кл и инкубировали при 37°С со сменой среды через 2-3 суток Через каждые сутки после инфицирования из групп брали по 3 флакона с инфицированной культурой клеток на протяжении 15 суток и промораживали их при минус 20°С После оттаивания определяли активность вируса методом титрования в культуре клеток Ch-91 Результаты опыта представлены на рис 2

Время культивирования, сутки

-1,0ТЦЦм/кл 0,1ТЦЦ5()кл

---0 01ТЦД50/кл --ОООПЦД^/кл

Рис 2 Накопление вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» в культуре клеток СЬ-91 при различной множественности заражения

Данные рис 2 показывают, что при множественности инфицирования 0,1 ТЦД5о/кл на 7-8 сутки активность вируса в суспензии достигала 6,00-6,25 ^ ТЦДя/см3 При увеличении множественности заражения до 1,0 ТЦД50/кл накопление вируса шло более быстро, но при этом снижалась биологическая активность до 5,25 ^ ТЦД5о/см3 Это может объясняться тем, что большая заражающая доза вируса способствует образованию и накоплению дефектных и интерферирующих частиц, которые в дальнейшем обеспечивают персистенцию вируса ЧМЖ в культуре клеток

При множественности заражения 0,01-0,001 ТЦЦ50/кл из-за интенсивной пролиферации клеток (пораженные клетки замещались вновь выросшими) титр вируса снижался до 5,50-5,75 ^ ТЦД50/см3, также при этом увеличивалось время культивирования до 9-11 суток

Из данных, представленных на рис 2, видно, что уровень накопления вируса после шести суток культивирования практически не менялся и находился на уровне 6,0-6,25 ^ ТЦД5о/см3, однако значительно превышал показатель в период до 4 суток и после 9 суток выращивания Следовательно, оптимальным сроком сбора урожая вируса следует считать время культивирования - 6-8 суток При появлении ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) на 70-90% монослоя накопление вируса ЧМЖ было максимальным

Накопление вируса в зависимости от вида питательной среды Питательная среда представляет собой раствор определенного состава Минеральные компоненты в этом растворе подобраны так, что он выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотно-щелочной баланс среды в процессе культивирования Среда обеспечивает питание клеток, их пролиферацию и дифференцировку

Для определения влияния различных поддерживающих сред на репродукцию вируса в опытах были использованы следующие среды ПСС, ПСП, Игла (по прописям ФГУ «ВНИИЗЖ»), Игла + ПСП в соотношении 1 1, 199 и ДМЕМ В каждую среду добавляли 2% фетапьной сыворотки и инкубировали до появления ЦПД на 80-90% монослоя Активность вируса определяли методом титрования в культуре клеток С11-91

По результатам исследований установлено что, наиболее активное накопление вируса отмечалось при использовании питательной среды Игла, где титр составлял 5,82±0,17 ТЦД50/см3 и ПСС-5,69±0,08 ТЦД50/см3 В случае использования поддерживающей среды 199 вирус накапливался в сравнительно низких титрах (4,33±0,19 ^ ТЦД50/см3)

Зависимость репродукции вируса ЧМЖ от вида сыворотки в поддерл-ивагощей среде. Сыворотка представляет собой чрезвычайно сложную смесь мелких и крупных молекул, способных как вызывать, так и тормозить рост и репродукцию клеток

Изучение накопления вируса ЧМЖ проводили с использованием различных видов сывороток крови инактивированных - фетальной, КРС, ягненка, лошади, неинактивированных - фетальной, КРС Контролем служила среда без добавления сыворотки Результаты исследований представлены в табл 1

Таблица 1

Зависимость репродукции вируса от вида сыворотки в поддерживающей среде

Доза заражения (ТЦДм/кл) Титр вируса (1% ТЦ&о/см3)

Среда с добавлением 2% сыворотки крови Среда без добавления сыворотки

фетальная ин фетальная| КРС ин. КРС ягненка и н лошади и н

Среда Игла

0,1 6,39±0,25 4,45±0,23 5,75±0,14 3,09±0,08 4,75±0,16 4,65±0,23 3,75±0,11

0,01 6,0б±0,11 4,27±0,22 5,55±0,25 3,25±0,28 5,08±0,15 4,35±0,61 3,07±0,17

0,001 5,75±0,13 4,19±0,18 5,47±0,23 3,13±0,34 5,10±0,25 4,12±0,21 2,51±0,09

Среда ПСС

0,1 6,00±0,31 3,75±0,13 5,03±0,24 2,85±0,27 4,51 ±0,31 4,05±0,25 2,73±0,05

0,01 5,91±0,29 4,71±0,28 4,61±0,11 3,45±0,43 5,07±0,14 4,55±0,20 2,73±0,24

0,001 5,42±0,12 3,69±0,35 4,53±0,16 3,14±0,50 4,52±0,26 4,21±0,26 3,01±0,18

Как видно из табл 1, наибольшее накопление вируса отмечалось при использовании инактивированной 2% фетальной сыворотки и среды Игла, а также дозы заражения 0,1 ТЦД5(/кл, где титр составлял 6,39±0,25 ^ ТЦД50/см3 Достаточно высокие титры вируса были и при использовании инактивированной фетальной сыворотки, среды ПСС и дозы заражения 0,1, 0,01 ТЩЬо/кл, а также при использовании питательной среды Игла и дозы заражения 0,01, 0,001 ТЦД50/кл, титр составлял от 5,75 до 6,00 ^ ТЦД50/см3 Внесение среды Игла с инактивированной сывороткой КРС и множественностью заражения 0,1 ТЦЦ30/кл вызывало накопление вируса в титре 5,75±0,14 ТЦД50/см3 Более низкий показатель биологической активности вируса отмечался при использовании сред без добавления сыворотки, а также неинактивированной сыворотки КРС Установлено, что при использовании неинактивированных сывороток титр вируса был ниже на 1,0-2,0 ^ ТЦДзо/см3

Из вышеизложенного следует, что для получения вируса с высокой биологической активностью необходимо использование инактивированной фетальной сыворотки, а при наработке вирусной суспензии для изготовления вакцин экономически целесообразно использовать в составе поддерживающих сред инактивированную сыворотку КРС

Влияние системы культивирования на репродукцию вируса Одним из путей повышения эффективности производства вирусных препаратов является выращивание вируса в роллерных сосудах I

Культуры клеток MDBK, Vero и Ch-91, выращенные в матрасах и в роллерных сосудах, инфицировали вирусом с множественностью заражения 0,1 ТЦД50/кл Накопление вируса контролировали по титру биологической активности

По результатам исследований установлено, что при роллерном способе культивирования на протяжении пяти пассажей во всех клеточных системах накопление вируса было больше, чем при стационарном способе культивирования, разница составляла 0,25-0,50 lg ТЦЦ50/см3 и была недостоверной при статистической обработке Наибольшее накопление вируса отмечалось при роллерном культивировании в культуре клеток Ch-91, к пятому пассажу титр вируса составлял 6,49±0,19 lg ТЦЦ50/см3 Наименьшее накопление вируса отмечалось в культуре клеток Vero, где титр составлял 5,59±0,14 lg ТЦЦ50/см3 (стационарный способ культивирования) и 5,67±0,13 lg ТЦД50/см3 (роллерный способ культивирования)

Устойчивость лиофилизированных материалов вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» при хранении Для изучения устойчивости штамма «ВНИИЗЖ» в лиофилизнровных препаратах готовили по три партии сухих препаратов с каждой стабилизирующей средой и размещали на хранение при температуре 4 °С Через 3, 6, 9, 12, 18, 24 месяца хранения из каждой партии извлекали по 3 флакона, содержимое их ресуспензировали до первоначального объема поддерживающей средой, смешивали и определяли биологическую активность вируса методом титрования в культуре клеток Ch-91

Степень снижения активности вируса оценивали по разнице титров исходных и хранящихся материалов Результаты сохраняемости лиофилизированных материалов штамма «ВНИИЗЖ» с различными стабилизирующими добавками при различных температурах хранения приведены в табл 2

Таблица 2

Устойчивость лиофилизированных материалов штамма «ВНИИЗЖ» при температуре 4 °С

№№ Лропи сей сред Состав стабилизирующих сред Титр после сушки Активность вируса через месяцы хранения в ТЩЬо/см3 Внешний вид продукта в процессе хранения

3 6 9 12 18 Т4

1 сахароза 3%, желатоза 0,6% 5,22±0,18 5,03±0,12 4, 23±0,19 3,57±0,23 3,18±0,16 2,22±0,18 1,95±0,52 таблетка слегка деформировалась

2 сахароза 3%, декстран 0,6% 5,17±0,14 4,57±0,25 4,06±0,13 3,34±0,22 2,87±0,14 1,75±0,14 1,08±0,22 таблетка слегка деформировалась

3 мальтоза 3%, желатоза 0,6 4,67±0,30 4,50±0,00 4,07±0,08 3,75±0,14 3,25±0,28 2,63±0,31 2,15±0,25 таблетка деформировалась

4 мальтоза 3%, декстран 0,6% 4,75±0,14 4,68±0,13 4,17±0,19 3,76±0,22 3,15±0,18 2,68±0,11 2,09±0,2б габлетка деформировалась

5 ГЛА 3%, сахароза 3%, желатоза 0,6% 5,38±0,12 5,36±0,14 5,30±0,22 5,27±0,19 5,21 ±0,3 6 5,20±0,25 5,18±0,14 не изменился

6 ГЛА 3%, сахароза 3%, декстран 0,6% 5,41±0,07 4,72±0,19 4,56±0,25 4,16±0,22 3,94±0,52 3,50±0,07 3,13±0,62 таблетка слегка деформировалась

7 ГЛА 3%, мальтоза 3%, желатоза 0,6% 4,б7±0,08 4,25±0,14 4,00±0,29 3,61±0,10 3,18±0,16 2,50±0,28 1,83±0,08 таблетка слегка деформировалась

8 ГЛА 3%, мальтоза 3%, декстран 0,6% 5,27±0,14 5,17±0,04 4,90±0,28 4,58±0,30 4,12±0,36 3,82±0,22 3,27±0,12 таблетка слегка деформировалась

9 пептон 4%, сахароза 3%, желатоза 0,6% 4,98±0,25 4,88±0,16 4,50±0,34 4,26±0,27 4,08±0,19 3,96±0,08 3,68±0,15 не изменился

10 пептон 4%, сахароза 3%, декстран 0,6% 5,32±0,15 5,3! ±0,17 5,26±0,23 5,20±0,08 5,17±0,59 5,00±0,14 4,85±0,23 не изменился

11 пептон 4%, мальтоза 3%, желатоза 0,6% 4,77±0,13 4,57±0,23 4,21 ±0,3 6 3,77±0,15 3,35±0,17 3,05±0,24 2,75±0,19 таблетка слегка деформировалась

12 пептон 4%, мальтоза 3%, декстран 0,6% 5,21±0,11 5,01±0,23 4,67±0,22 4,45±0,25 4,26±0,14 4,03±0,12 3,95±0,28 таблетка слегка деформировалась

13 пептон 4%, сахароза 3% 5,07±0,19 4,84±0,29 4,49±0,14 4,12±0,50 3,90±0,06 3,58±0,16 3,21±0,08 таблетка слегка деформировалась

14 пептон 4%, мальтоза 3% 5,13±0,28 4,85±0,35 4,56±0,19 4,32±0,41 3,99±0,14 3,58±0,28 3,12±0,22 таблетка слегка деформировалась

15 ГЛА 3%, сахароза 3% 5,27±0,42 5,00±0,24 4,59±0,!7 4,07±0,12 3,62±0,31 3,15±0,22 2,69±0,18 габлетка деформировалась

16 ГЛА 3%, мальтоза 3% 5,34±0,23 4,81±0,25 4,46±0,11 3,88±0,19 3,12±0,14 2,27±0,20 1,19±0,14 таблетка стала рыхлой

17 без стабилизаторов (контроль) 3,50±0,14 2,07±0,19 0,54±0,22 0 0 0 0 таблетка сильно деформировалась

Как видно из табл 2, вирус ЧМЖ, высушенный без каких либо стабилизаторов, сравнительно быстро инактивировался

Лучшим защитным эффектом в лиофилизированных препаратах обладали стабилизирующие добавки по прописям №№ 5, 6, 9 Добавки по прописям №№ 5 и 9, 10 обеспечивали наилучший товарный вид препарата при хранении

Таким образом, проведенные испытания по сохранности лиофилизированного вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» в присутствии различных стабилизаторов позволили сделать выбор состава стабилизаторов для длительного хранения препарата Таковой оказалась защитная среда, содержащая ГЛА 3%, сахарозы 3%, желатозы 0,6%

Изучение безвредности и реактогенности вируса ЧМЖ штамма «ВШШЗЖ». С этой целью вируссодержащий материал вводили двум овцам и козам 12-мес возраста и козлятам 3-мес возраста, в объеме 5см3 с содержанием вируса 5,0 ^ ТЦД50/см3 За животными вели наблюдение с ежедневным измерением температуры тела в течение 21 суток

Через 7, 14, 21 сутки после иммунизации от животных получали пробы крови, сыворотки которых исследовали в РН и ИФА '

Результаты наблюдений показали, что у одного козленка регистрировалось повышение температуры до 39,9°С Других каких-либо отклонений от физиологической нормы не отмечали Исследование сывороток крови показало, что специфические антитела обнаруживались уже на 7 сутки в низких титрах (1 40 в ИФА), а на 14 и 21 сутки они выявлялись в сравнительно высоких титрах (до 1 320- 1 640 в ИФА)

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что вирус ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» является слабо реактогенным для овец и коз

Реверсибельность и контагиозность вируса ЧМЖ штамма «ВШШЗЖ» Одним из важнейших требований к вакцинным штаммам является отсутствие реверсибельности и контагиозное™ для животных

Для определения реверсии вирус вводили подкожно в дозе Ю50 ТЦД5о/см3 двум ягнятам в объеме 5 см3 на голову Через шесть суток у этих ягнят отбирали кровь в объеме 20 см3 для получения вируссодержащих лимфоцитов крови и одного из них умертвили для отбора лимфатических узлов (предлопаточных,

подчелюстных, паховых, мезентериальных) Из лимфатических узлов готовили 20%-ю суспензию на стерильном физиологическом растворе (рН=7,2-7,4) Каждый из полученных вируссодержащих материалов (суспензия лимфоцитов крови после трехкратной заморозки-оттаивания и 20%-я суспензия из лимфоузлов) вводили подкожно в разные точки подмышечной области следующим двум ягнятам в объемной дозе по 5 см3 Аналогичным способом провели пять последовательных пассажей В каждом из полученных вируссодержащих материалов проверяли наличие вируса методом ПЦР, результаты проверки представлены в табл 4 За животными на протяжении 5 пассажей вируса вели клинические наблюдения в течение 21 суток

Таблица 3

Результаты Определения реверсибелыюсти вируса чумы мелких жвачных

животных штамма «ВНИИЗЖ»

Наименование вируссодержащего материала Номер пассажа на ягнятах

1 2 3 4 5

Лимфоциты + - - - -

20%-я суспензия из лимфоузлов + - - - -

По результатам опыта установлено, что вирус является стабильным и нереверсибельным, так как повышения температуры тела и симптомов болезни чумы мелких жвачных у животных не наблюдалось Местная реакция на введение вируссодержащей суспензии отсутствовала Необходимо отметить тот факт, что геном вируса ЧМЖ обнаруживался только в вируссодержащем материале первого пассажа, на втором пассаже возбудитель не обнаруживался, что свидетельствовало об отсутствии реверсии

Возможность контактной передачи вируса изучали при совместном содержании двух ягнят и двух козлят, привитых вирусным материалом с титром биологической активности 5,0 ТЦД50/см3, и интактных животных (двух козлят трехмесячного возраста) Через 21 сутки у всех животных определяли в сыворотках крови уровень антител к вирусу ЧМЖ методом непрямого варианта ИФА У козлят, находящихся в контактной группе, в сыворотках крови не обнаружили специфических к вирусу ЧМЖ антител, тогда как у привитых животных титр был в пределах 1 320 - 1 640

Таким образом, контактная передача вакцинного вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» животным не установлена

Изучение антигенных свойств вируса ЧМЖ. Антигенную активность вируса оценивали по способности его вызывать образование вируснейтрализующих антител у овец и коз

Для подбора наиболее технологичной системы культивирования изучали антигенные свойства вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ», в зависимости от системы репродукции Для этого вирус культивировали в культурах клеток Vero, MDBK и Ch-91 Затем каждый полученный вируссодержащий материал вводили трем овцам 12-24-мес возраста в дозе 100ТЦД5о/см3 Данные этих исследований представлены в табл 4

Таблица 4

Изучение иммунобиологических свойств вакцинного вируса ЧМЖ штамма _«ВНИИЗЖ» в зависимости от системы репродукции_

Тшр антител в РН, к>й

Доза вируса срок после иммунизации, суток

7 1 14 I 21

Ch-91

ЮОТЦДзо/см1 2,09±0,07 | 5,14±0,21 | 6,94±0,17

Vero

ЮОТЦДзо/см' -* | 4,21±0,09 | 6,01±0,21

MDBK

100 ТЦД50/см' - | 4,76±0,13 | 5,55±0,37

вируснейгрализующие антитела не обнаружены

Как видно из табл 4, наибольший титр вируснейтрализующих антител 6,94±0,17 был получен с вирусом, который культивировался в культуре клеток СЬ-91 Также необходимо отметить, что вируснейтрализующие антитела на 7 сутки регистрировались только у трех овец, тогда как на 14 сутки антитела обнаруживались у всех животных в титрах от 4,21±0,09 до 5,14±0,21 к)^

Вакцинопрофилактика животных должна быть экономичной и эффективной В связи с этим была определена минимальная доза иммунизации для овец и коз, вирус культивировали в культуре клеток СЬ-91 С этой целью вирусом прививали трех овец и трех коз 12-48-мес возраста, подкожно в различных дозах и исследовали в реакции нейтрализации сыворотки крови от этих животных, взятые на 7, 14, 21 сутки после прививки Данные представлены в табл 5

Таблица 5

Результаты определения оптимальной дозы вируса при иммунизации _овец и коз_ _

Вид животного

Доза овцы козы

вируса Титр вируснейтрализующих антител, 1ое2

ТЩЦо/см3 срок после иммунизации, суток

7 14 21 7 14 21

10000 2,27±0,11 5,76±0,31 7,91±0,17 1,63±0,04 5,81±0,19 7,57±0,18

1000 1,07±0,22 5,05±0,51 6,84±0,61 1,35±0,11 5,17±0,46 6,68±0,24

100 1,15±0,14 4,95±0,05 6,31 ±0,25 1,08±0,33 4,64±0,33 6,12±0,44

10 1,7±0,14 2,65±0,07 - 2,00±0,11 2,75±0,13

*- вируснейтрализующие антитела не обнаружены

Данные табл 5 свидетельствуют, что при иммунизации животных в дозе 10 ТЦД50/см3 у них индуцировались вируснейтрализующие антитела на 21 сутки в титрах у овец 2,65±0,07 1оя2 и у коз 2,75±0,13 log2 По информации МЭБ, данный уровень антител является недостаточным для надежной защиты животных от ЧМЖ Иммунизация животных вакцинным вирусом ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» в дозе 100 ТЦЦ5о/см3 стимулировала у них формирование на 21 сутки вируснейтрализующих антител у овец на уровне 6,31 ±0,25 1од2 и у коз 6,12±0,44 1о§2 При увеличении дозы вируса до 1000 ТЦД50/см3 наблюдалось незначительное увеличение образования антител в среднем на 0,5 1о§2 Из вышеперечисленного следует, что оптимальной дозой вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» для иммунизации животных является 100 ТЦД5о/см3 Исследования показали, что уровень антител у овец и коз в среднем был одинаковым Следовательно вирус ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» обладал выраженными антигенными свойствами для овец и коз при применении в дозе 100 ТЦД5о/см3

Концентрирование и очистка вируса ЧМЖ Для получения очищенного и концентрированного антигена использовали химические и физические методы На основании анализа данных литературы по очистке и концентрированию РНК-содержащих вирусов и собственного опыта работы с возбудителем ЧМЖ были отобраны следующие методы

- осаждение вируса 4% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ),

- осаждение вируса 8% раствором ПЭГ,

- осаждение вируса 8% раствором ПЭГ с добавлением 0,1% ГО А,

- механический способ снятия монослоя,

- снятие монослоя раствором трипсина

Осаждение вируса при помощи ПЭГ(1, 2, 3 методы) Для концентрирования использовали ПЭГ-6000 в виде 50%-го стерильного раствора Очистку вируссодержащей суспензии для освобождения от чужеродных белков проводили с использованием 10%-го раствора полиэтиленимина

Для высвобождения из клеток вируса проводили 3-кратное замораживание-оттаивание вируссодержащей суспензии, после чего осветляли низкоскоростным центрифугированием при 1000 об/мин в течение получаса, надосадок отбирали В полученную смесь добавляли ПЭГ-6000 до конечной концентрации 8% или 4% (в зависимости от метода) и 0,15 М раствор №С1, а при отработке третьего метода добавляли ГОА до 0,1%, затем суспензию инкубировали при 4°С в течение 12 ч После осаждения вируса ПЭГ вируссодержащую суспензию повторно центрифугировали при 3000 об/мин в течение 1ч, надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в фосфатно-буферном растворе до конечного объема суспензии, равного 1,25% исходного объема

Очищали суспензию внесением 1/10 объема 10% раствора ПЭИ с последующим центрифугированием суспензий при 1000 об/мин в течение 15 мин Вируссодержащую надосадочную жидкость использовали в опытах

Механический способ снятия монослоя инфицированной культуры клеток СИ-91 Монослой снимали петлей в фосфатно-буферном растворе до конечного объема суспензии, равного 1,25% исходного объема Для высвобождения вируса из клеток проводили 3-кратное замораживание-оттаивание вируссодержащей суспензии, потом центрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 минут, надосадок отбирали

Снятие инфицированного монослоя культуры клеток Ск-91 раствором трипсина Данный метод отличался от предыдущего только тем, что монослой снимался не петлей, а 0,25%-м раствором трипсина Все остальные манипуляции как в предыдущем методе

Биологическую активность полученных препаратов определяли путем их титрования на культуре клеток СЬ-91 Данные представлены в табл 6

Таблица 6

Результаты коицентрнрования вируса ЧМЖ_

Метод концентрирования Биологическая активность, ТЦД50/СМ3

Осаждение вируса 4% раствором ПЭГ 7,25±0,14

Осаждение вируса 8% раствором ПЭГ 7,54±0,11

Осаждение вируса 8% раствором ПЭГ с добавлением 0,1% ГОА 2,31 ±0,24

Механический способ снятия монослоя . . 5,07±0,19

Монослой снимали раствором трипсина 2,83±0,20

Исходный материал 5,77±0,21

В результате проведенных исследований установлено, что наибольший титр вируса был отмечен в концентрате с 4 и 8% ПЭГ и составлял 7,25 и 7,5 ^ ТЦД50/СМ3, соответственно

Гипериммунизация животных. Антигенную активность очищенных и концентрированных препаратов изучали на овцах Были сформированы 8 групп животных Каждая опытная группа включала 3 головы Инокуляцию антигенов проводили внутримышечно и подкожно с внутренней поверхности бедра трехкратно с интервалом в 7 суток Контрольным животным вводили плацебо Отбор проб крови для получения иммунных сывороток производили перед каждой иммунизацией и через 21 сутки после третьего введения антигенов Результаты исследования антигенной активности вируса ЧМЖ представлены втабл 7

Таблица 7

Вируснейтрализующая активность гипериммунных сывороток

Метод концентрирования Гипериммунизация

подкожная внутримышечная

без адъю ванта неполный адъювант Фрейнда без адъюванта неполный адъювант Фрейнда

Осаждение вируса 4%-м раствором ПЭГ 8,75±0,56 9,61±0,24 9,14±0,36 10,48±0,17

Исходный материал 8,53±0,50 9,24±0,36 9,02±0,43 9,45±0,44

Контроль <1,0 <1,0 <1,0 <1,0

•

Результаты табл 7 демонстрируют, что высокий титр вируснейтрализующих антител в сыворотке был отмечен с использованием антигена, полученного с помощью 4% ПЭГ, и внутримышечной инокуляции с неполным адъювантом Фрейнда (титр составлял 10,48±0,17 log2) Необходимо отметить тот факт, что во всех случаях при использовании адъюванта и при внутримышечной инъекции титр был выше, чем без адъюванта и при подкожной инъекции Исходя из вышеизложенного установлено, что для получения гипериммунных сывороток необходимо использовать специфические антигены, полученные осаждением вируса 4% ПЭГ, с неполным адъювантом Фрейнда и при 3-кратной инокуляции внутримышечно

4. ВЫВОДЫ

1 Анализ эпизоотической ситуации по чуме мелких жвачных в странах мира за период 1996-2007 гг показал, что. это заболевание овец и коз имеет широкое распространение, особенно в Западной и Центральной Африке, Аравийском полуострове и Азии, а в последние годы выявлена тенденция приближения нозоареала к границе РФ Качественный анализ риска заноса заболевания в РФ свидетельствует о высокой вероятности возникновения чумы мелких жвачных в России

2 Установлено, что наибольшей вирусрепродуцирующей способностью к вирусу чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ» обладали перевиваемые культуры клеток Ch-91, Vero и MDBK

3 Показано, что максимальное накопление вируса чумы мелких жвачных в титрах 6,5-6,75 1 g ТЦД50/СМ3 происходит в культуре клеток Ch-91, при множественности заражения 0,1 ТЦЦ50/кл, с применением поддерживающей среды Игла и с 2% инактивированной фетальной сыворотки, стационарном способе культивирования и сборе вирусного материала при 80% поражения монослоя

4 Установлено, что лучшими защитными свойствами при лиофилизации вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ» обладает среда, содержащая в конечной концентрации 3% ГЛА, 3% сахарозы, 0,6% желатозы, которая обеспечивает возможность использования вирусвакцины в течение двух лет при температуре хранения 4 °С

1 5 Установлено, что изготовленные вирусвакцины против чумы мелких жвачных из штамма «ВНИИЗЖ» безвредные и ареактогенные для овец и коз, не контагиозные при контакте вакцинированных и интактных животных, не реверсибельные при пассировании на овцах и козах

6 Показано, что вирусвакцина против чумы мелких жвачных обладает ярко выраженными антигенными свойствами и индуцирует выработку вируснейтрализующих антител в титре 6,0-7,0 1о§2, что соответствует международным требованиям Установлено, что оптимальная иммунизирующая доза для овец и коз составляет 100 ТЩЬо/см3

7 Установлено, что оптимальным способом получения специфических антигенов вируса чумы мелких жвачных является осаждение вируса ПЭГ-6000 в конечной концентрации 4% с дальнейшей очисткой ПЭИ, в результате титр вируса повышается на 1,50 ^ ТЦД50/см3 При гипериммунизации животных данным антигеном специфические сыворотки крови имеют титр 10,48±0,17 ]о§2 в РН

8 Воспроизводимость разработанной технологии культивирования вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ», обеспечивает наработку высокоактивного вирусного материала для изготовления диагностических и вакцинных препаратов, подтверждена комиссионными испытаниями с участием сотрудников ФГУ «ВГНКИ»

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ На основании проведенных экспериментальных исследований разработана технология культивирования вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» для производства вакцин против ЧМЖ и изготовления диагностических препаратов Получен производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ» вируса чумы мелких жвачных, который депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (5 марта 2007 г)

По материалам работы подготовлена, одобрена ученым советом и утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ» «Методика культивирования и титрования вируса чумы мелких жвачных в перевиваемой культуре клеток СЬ-91» (2007 г )

Экспериментальные материалы по оптимизации культивирования вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ» вошли в утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ»

- Инструкцию по применению вирусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой,

- СТО 00495527-0095-2008 на изготовление внрусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Капускнн, Е В. Изучение чувствительности клеточных культур к вакцинному вирусу чумы мелких жвачных штамма "ВНИИЗЖ"/ Е В Капускин // Вестник Кыргызского научного-исследовательского института животноводства, ветеринарии и пастбищ имени Арстанбека Дуйшеева (КыргНИИЖВиП) -Бишкек, 2007 -№ 1 -С 212-215

2 Изучение иммунобиологических свойств вакцинного штамма «ВНИИЗЖ» вируса чумы мелких жвачных / Е.В. Капускнн, Н И Ковалишина, Б Л Манин, В В Борисов // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов материалы международной научно-практической конференции - Щелково, 2007 -С 110-113

3 Биологические свойства вакцинного штамма «ВНИИЗЖ» вируса чумы мелких жвачных /ЕВ Капускин, Н И Ковалишина, А М Евсеев, В И Диев, А П Пономарев, В В Борисов, В М Захаров // Вестник Кыргызского научного-исследовательского института животноводства, ветеринарии и пастбищ имени Арстанбека Дуйшеева (КыргНИИЖВиП) - Бишкек, 2007 -№2 -С 154-158

4 Капускнн, Е.В. Изучение культурадьных свойств вакцинного вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» /ЕВ Капускин // Ветеринарная патология - 2007 -№4(23) - С 42-45

5 Капускин, Е В. Качественный анализ риска заноса чумы мелких жвачных на территорию России /ЕВ Капускин // Ветеринарная патология - 2007 -№4(23)-С 18-24

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Тираж 90 экз , « » май 2008 г

Инфекционные болезни, среди которых одно из ведущих мест занимают болезни вирусной этиологии, наносят животноводству значительный экономический ущерб, слагающийся из снижения продуктивности, вынужденного убоя, гибели больных животных, а также затрат на проведение охранно-карантинных, ветеринарно-санитарных и других мероприятий [89, 119, 172, 226].

Благодаря развитию отечественной ветеринарной науки и усилию практической ветеринарной службы на территории нашей страны ликвидирован ряд опасных инфекционных болезней сельскохозяйственных животных (чума крупного рогатого скота, контагиозная плевропневмония крупного рогатого скота и др.), а также снизился уровень заболеваемости при многих других инфекциях.

Считается, что в настоящее время существует всеобщий глобальный риск заноса возбудителя в любую точку мира. Современный этап мировой эволюции характеризуется выходом многих ранее локальных болезней за пределы эпизоотических очагов, за границы стран и даже континентов [4, 75].

Болезни, которые на данном историческом отрезке времени не встречаются в стране, но регистрируются в других странах мира, принято называть экзотическими, такой является и чума мелких жвачных (ЧМЖ) [35] .

Первоначально ЧМЖ регистрировалась в странах Западной Африки, в последующем ее стали отмечать в Центральной и Восточной Африке, а с 1980 года и на Аравийском полуострове. Сейчас это заболевание имеет широкое распространение на африканском континенте и в Азии.

Расширению ареала распространения этой инфекции могут способствовать не только социально-экономические, но и природные факторы.

ЧМЖ в РФ не регистрируется. Но вследствие широких экономических, культурных и других связей со странами, неблагополучными по этому заболеванию, существует реальная угроза заноса ее на территорию нашей страны[1, 4, 23, 26, 34, 35, 36, 40, 48, 57, 58, 61, 62, 77, 119, 127, 136, 140].

В связи с вышеизложенными обстоятельствами, все это делает целесообразным изучение этой важной экзотической болезни, представляющей угрозу для животноводства РФ, с целью иметь возможность, при необходимости, наработать соответствующие диагностические и вакцинные препараты.

Цель и задачи исследований

Целью исследований являлось усовершенствование технологических параметров культивирования вируса чумы мелких жвачных для получения диагностических и вакцинных препаратов.

В задачи исследований входило: провести анализ эпизоотической ситуации по ЧМЖ в мире в 19962007 гг.; оценить риск заноса этой инфекции на территорию РФ; изучить чувствительность различных клеточных культур к вирусу чумы мелких жвачных; подобрать оптимальные условия культивирования вируса чумы мелких жвачных, обеспечивающие высокое накопление вируссодержащего материала; разработать технологию изготовления живой вирусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой; провести испытания опытных серий вакцины против чумы мелких жвачных; использовать оптимальные условия культивирования вируса при изготовлении специфических антигенов и гипериммунных сывороток.

Научная новизна

Изучена эпизоотическая ситуация по ЧМЖ в мире за период 19962007гг. и проведен качественный анализ риска заноса данного заболевания на территорию РФ.

Изучены иммунобиологические свойства оригинального вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ».

Исследована чувствительность различных клеточных культур к вирусу ЧМЖ, в результате чего подобрана оптимальная система культивирования.

Усовершенствована технология культивирования вируса ЧМЖ, обеспечивающая высокое накопление вируссодержащего материала для изготовления диагностических препаратов и вирусвакцины против чумы мелких жвачных.

Получены экспериментальные серии вирусвакцины против чумы мелких жвачных и проведены испытания их иммунобиологических свойств.

Практическая ценность работы

На основании проведенных экспериментальных исследований разработана технология культивирования вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» для производства вакцин против ЧМЖ и изготовления диагностических препаратов. Получен производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ» вируса чумы мелких жвачных, который депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (5 марта 2007 г.).

По материалам работы подготовлена, одобрена ученым советом и утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ» «Методика культивирования и титрования вируса чумы мелких жвачных в перевиваемой культуре клеток СЬ-91» (2007 г.).

Экспериментальные материалы по оптимизации культивирования вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ» вошли в утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ»:

- Инструкцию по применению вирусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой;

- СТО 00495527-0095-2008 на изготовление вирусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой. и

Основные положения, выносимые на защиту:

- условия культивирования вакцинного вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ»;

- характеристика антигенных свойств вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ»;

- технология изготовления вирусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой;

- результаты лабораторных испытаний иммунобиологических свойств вирусвакцины;

- технология изготовления специфических антигенов и гипериммунных сывороток.

Апробация работы

Результаты исследований по теме диссертации были опубликованы и доложены на: «Международной научной конференции по проблемам животноводства, ветеринарии и кормопроизводства», 16-18 мая 2007 г., Бишкек, КиргНИИЖВиП; на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» 16-18 апреля 2008 г., г. Владимир, и на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2005-2007 гг.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них две статьи в изданиях, по перечню ВАК.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 155 страницах, иллюстрирована 26 таблицами и 18 рисунками. Список используемой литературы включает 227 источников, из которых 164 иностранных.

Личный вклад

Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы диссертации проводились совместно с к.б.н. A.B. Щербаковым раздел — «Идентификация вируса ЧМЖ штамма

ВНИИЗЖ» (изучение идентичности вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» методом полимеразной цепной реакции); с д.б.н. А.П. Пономаревым раздел -«Идентификация вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» (электронно-микроскопическое исследование); с к.в.н. Марковым Г.В. и к.в.н. Онищенко P.M. раздел - «Устойчивость вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» при лиофилизации».

Диссертационная работа выполнена в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2005-2008 гг.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ВЫВОДЫ

1. Анализ эпизоотической ситуации по чуме мелких жвачных в странах мира за период 1996-2007 гг. показал, что это заболевание овец и коз имеет широкое распространение, особенно в Западной и Центральной Африке, Аравийском полуострове и Азии, а в последние годы выявлена тенденция приближения нозоареала к границе РФ. Качественный анализ риска заноса заболевания в РФ свидетельствует о высокой вероятности возникновения чумы мелких жвачных в России.

2. Установлено, что наибольшей вирусрепродуцирующей способностью к вирусу чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ» обладали перевиваемые культуры клеток Ch-91, Vero и MDBK.

3. Показано, что максимальное накопление вируса чумы мелких жвачных в титрах 6,5-6,75 lg ТЦД5о/см происходит в культуре клеток Ch-91, при множественности заражения 0,1 ТЦД50/кл, с применением поддерживающей среды Игла и с 2% инактивированной фетальной сыворотки, стационарном способе культивирования и сборе вирусного материала при 80% поражения монослоя.

4. Установлено, что лучшими защитными свойствами при лиофилизации вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ» обладает среда, содержащая в конечной концентрации 3% ГЛА, 3% сахарозы, 0,6% желатозы, которая обеспечивает возможность использования вирусвакцины в течение двух лет при температуре хранения 4 °С.

5. Установлено, что изготовленные вирусвакцины против чумы мелких жвачных из штамма «ВНИИЗЖ» безвредные и ареактогенные для овец и коз, не контагиозные при контакте вакцинированных и интактных животных, не реверсибельные при пассировании на овцах и козах.

6. Показано, что вирусвакцина против чумы мелких жвачных обладает ярко выраженными антигенными свойствами и индуцирует выработку вируснейтрализующих антител в титре 6,0-7,0 log2, что соответствует международным требованиям. Установлено, что оптимальная иммунизирующая доза для овец и коз составляет 100 ТЦД5о/см3.

7. Установлено, что оптимальным способом получения специфических антигенов вируса чумы мелких жвачных является осаждение вируса ПЭГ-6000 в конечной концентрации 4% с дальнейшей очисткой ПЭИ, в 5 результате титр вируса повышается на 1,50 ^ ТЦД50/см . При гипериммунизации животных данным антигеном специфические сыворотки крови имеют титр 10,48±0,17 в РН.

8. Воспроизводимость разработанной технологии культивирования вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ», обеспечивает наработку высокоактивного вирусного материала для изготовления диагностических и вакцинных препаратов, подтверждена комиссионными испытаниями с участием сотрудников ФГУ «ВГНКИ».

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных экспериментальных исследований разработана технология культивирования вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» для производства вакцин против ЧМЖ и изготовления диагностических препаратов. Получен производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ» вируса чумы мелких жвачных, который депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (5 марта 2007 г.).

По материалам работы подготовлена, одобрена ученым советом и утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ» «Методика культивирования и титрования вируса чумы мелких жвачных в перевиваемой культуре клеток СЬ-91» (2007 г.).

Экспериментальные материалы по оптимизации культивирования вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ» вошли в утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ»:

- Инструкцию по применению вирусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой;

- СТО 00495527-0095-2008 на изготовление вирусвакцины против чумы мелких жвачных культуральной сухой.

1.13. Заключение

Из приведенных литературных данных видно, что в настоящее время ЧМЖ является самостоятельным заболеванием мелкого рогатого скота, а возбудитель отнесен к семейству Paromyxoviridae, роду Morbillivirus.

Наибольшее географическое распространение ЧМЖ получила в Западной и Центральной Африке, Аравийском полуострове, в странах Ближнего Востока и Азии.

Расширение ареала ЧМЖ к востоку и распространение ее в Турции, Афганистане, Иране, Индии, Пакистане, Казахстане, Таджикистане, Монголии и Китае создает определенную угрозу заноса данной инфекции и в нашу страну, что может принести к значительному экономическому ущербу овцеводства и козоводства. В России до сих пор пока нет промышленной технологии изготовления надежного вакцинного препарата против ЧМЖ, которая обеспечивала бы получение вакцины с выраженными антигенными свойствами, не утрачиваемыми в процессе хранения и применения.

Разработка технологии изготовления вирусвакцины против чумы мелких жвачных является актуальной проблемой на сегодняшний день. Такой вакцинный препарат должен в случае необходимости надежно защитить овцеводческие и козоводческие хозяйства при возможном заносе ЧМЖ из неблагополучных по данному заболеванию стран.

Одним из основных технологических вопросов при изготовлении вирусвакцины и диагностических препаратов является оптимизация условий культивирования вируса, позволяющая получать вируссодержащий материал с высоким накоплением специфического антигена, что являлось темой диссертации.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы

2.1.1. Вирус. В работе был использован вирус чумы мелких жвачных, полученный из музея ФГУ «ВНИИЗЖ».

2.1.2. Животные. В работе использовали овец и коз 12-24-месячного возраста, не привитых против ЧМЖ, для изучения антигенной активности вакцины, проверки препаратов на безвредность, реактогенность, реверсибельность и возможность контактной передачи вируса.

2.1.3. Культуры клеток. Для культивирования, титрования и получения высокоактивного вирусного материала с целью изготовления вакцинных препаратов, а также для постановки РН использовали перевиваемую культуру клеток гонад козы (Ch-91). Культура клеток Ch-91 была получена Г.А. Худяковым, В.Н. Герасимовым и Е.Е. Федоровой в 1992 году во «ВНИИЗЖ». В 1996 г. культура клеток была запатентована (Пат. РФ №2061753) и занесена в реестр Европейской коллекции культур тканей и клеток.

На различных этапах работы были использованы следующие культуры клеток: первично трипсинизированные - почки ягненка (ПЯ), тестикулы ягненка (ТЯ), почки козленка (ПК), тестикулы козленка (ТК), а также перевиваемые - почки эмбриона КРС (MDBK), почки теленка (RBt), почки сайги (ПС), почки овцы (ПО), почки эмбриона свиньи (СПЭВ), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка - шведская линия (ВНК-21/13), почки африканской зеленой мартышки (Vero).

Культуры клеток в виде монослоя или суспензии клеток получали из отдела культивирования клеток ФГУ «ВНИИЗЖ».

2.1.4. Реактивы и растворы. При культивировании клеток и наработке вируссодержащих материалов использовали поддерживающие среды, приготовленные по стандартным прописям: Игла, ПСС, ПСП, раствор. Хенкса, ДМЭМ и 199.

Питательные среды в готовом виде получали из лаборатории биотехнологии ФГУ «ВНИИЗЖ».

Для культивирования культур клеток в ростовую среду вносили 10% сыворотки КРС, пенициллина 100000 ед., стрептомицина 0,1 г, 10 мл 60%-го раствора Ь-глутамина на 1 дм3, рН среды - 7,2-7,4.

Для культивирования вируса ЧМЖ в питательную среду вносили 2% прогретой при 56°С в течение 30 мин фетальной сыворотки; пенициллин 100000 ЕД; стрептомицин 0,1 г и Ь-глутамина 10 мл 6%-го раствора на 1 дм3 среды, 7,5%) раствором натрия двууглекислого доводили рН до 7,4-7,6.

Определение стерильности промежуточных вирусных материалов и изготовленных вакцинных препаратов проверяли высевом на бактериальные среды: тиогликолевую (ТГС), мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).

При изготовлении лиофилизированных вакцинных препаратов в качестве защитной среды использовали 50% раствор сахарозы, 20% раствор гидролизата лактальбумина, 20% раствор желатозы и гликоколовый буфер.

Для концентрирования и очистки вируса ЧМЖ использовали 50% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 (ПЭГ), 50% раствор полиэтиленимина (ПЭИ), 10% раствор гидроокиси алюминия (ГОА).

На разных этапах исследований использовали фосфатно-буферный раствор, 0,25% раствор трипсина, диспергирующую смесь, состоящую из трипсина и версена в соотношении 9:1.

Для изготовлений питательных сред и вспомогательных растворов использовали реактивы квалификации «чда» или «хч» и деионизированную дистиллированную воду.

2.2. Методы исследований

2.2.1. Культивирование культур клеток.

Разморозка и выращивание культур клеток в 1,5 литровых матрасах.

Две ампулы музейного запаса производственной линии клеток извлекали из хранилища с жидким азотом и размораживали при температуре 37°С±1°С в течение 1-2 мин при встряхивании. В боксе ампулы протирали тампоном, смоченным в спирте. Суспензию клеток из каждой ампулы с помощью пипетки переносили в отдельный матрас вместимостью 1,5 дм3 с 200 см3 ростовой среды.

Сосуды с суспензией клеток помещали в термостат и инкубировали при температуре 37°С±1°С в течение 2-3 суток до получения полного монослоя.

За сутки перед пересевом питательную среду в матрасах заменяли на свежую.

Качество культуры клеток контролировали путём визуального просмотра матрасов и микрокопирования монослоя.

Кондиционный монослой должен быть плотным, полным, без дегенеративных изменений, клетки в монослое должны быть веретенообразными, выпуклыми и прозрачными без наличия вакуолизации.

Из каждого матраса с матровой расплодкой брали пробы для определения бактериального и грибного загрязнения.

Бактериальное и грибное загрязнение характеризуется следующими показателями:

- при визуальном контроле - помутнением питательной среды, изменением цвета среды к жёлтому или фиолетовому, наличием колоний грибов в среде или на стенках сосудов;

- при микроскопировании - наличием колоний бактерий светло-коричневого цвета, нитей мицелия грибов, изменением морфологии клеток и помутненем монослоя;

При наличии хотя бы одного из перечисленных признаков культуру клеток выбраковывали.

Поддержание перевиваемых культур клеток. Для поддержания перевиваемых кулыур клеток использовали пассирование в стандартных условиях.

Для пересева выбирали матрасы с культурой клеток в виде сформировавшегося плотного равномерного монослоя с четко выраженными границами между клетками, без наличия скопления вакуолизированных и округлых клеток: клетки в монослое были прозрачными, выпуклыми, полигональной формы, без зернистости.

За сутки перед пересевом в матрасе с культурой клеток меняли ростовую среду.

Из отобранных для пересева культуральных сосудов сливали среду, монослой клеток промывали подогретым до 37°С, диспергирующим раствором в количестве, обеспечивающем полное покрытие монослоя клеток. Через 5-10 мин. раствор сливали, матрасы помещали в термостат, сосуды с круговым слоем - в роллерный аппарат. Через 5-7 мин. монослой набухал и при резком встряхивании полностью разрушался. В сосуды с клетками добавляли небольшое количество среды ПСП или Игла и энергично встряхивали для получения однородной клеточной суспензии.

Подсчёт клеток в суспензии проводили по общепринятой методике. Пробы помещали в камеру Горяева, где подсчитывали процент погибших клеток и одновременно определяли концентрацию клеток в суспензии. К 1 мл концентрата клеток добавляли 9 мл 0,5% ГЛА, из полученных 10 мл брали 1 мл и смешивали с 1 мл 0,1%-го раствора трипанового синего. После 1-3 мин. окрашивания каплю суспензии микропипеткой вносили в счётную камеру. Погибшие клетки легко окрашивались в синий цвет. Клетки подсчитывали под малым увеличением светового микроскопа МБИ-3 в обеих камерах во всех больших квадратах.

Для точности результатов подсчёт проводили в двух пробах. Количество клеток в 1 мл суспензии определяли по формуле:

0x1000x20 , х - число клеток в 1 см3 суспензии,

С) - среднее число клеток в счётной камере по результатам подсчёта в двух пробах,

1000 - число кубических миллиметров в 1 см3,

20 - коэффициент разведения исходной клеточной суспензии,

0,9 - объём счётной камеры Горяева в 0,1 см3.

Процент жизнеспособных клеток подсчитывают по формуле: кп = 2^x100,где а кл. - процент жизнеспособных клеток, а - общее число клеток, в - число погибших клеток,

100 - коэффициент.

Разведение клеточного концентрата проводили так, чтобы конечная

3 5 3 концентрация его была приблизительно 1x10 -2x10 кл/см. Если концентрация больше или меньше указанной, то возрастает ошибка подсчёта. Также учитывали, что камера Горяева даёт 15% ошибки счёта.

Затем концентрацию клеток доводили питательной средой с 5% сыворотки крупного рогатого скота до 130 тыс. в 1 см ; рН среды - от 7,2 до 7,4.

В работе использовали суспензию, содержащую не менее 90% живых клеток и прошедшую контроль на стерильность. Суспензию клеток, не отвечающую одному из этих показателей, выбраковывали.

Полученную клеточную суспензию рассевали в культуральные сосуды. Культуральные сосуды помещали в термостат и инкубировали в течение 2-3 суток до получения полного плотного монослоя.

2.2.2. Культивирование вируса. Процесс культивирования вируса ЧМЖ включает следующие этапы:

- отбор матрасов с клеточной культурой;

- инфицирование клеточной культуры вирусом ЧМЖ;

- культивирование вируса ЧМЖ в клеточной культуре;

- микроскопия инфицированной культуры;

- замораживание инфицированных клеток в культуральных сосудах при температуре минус 20°С±1°С;

- оттаивание вируссодержащего материала; отбор проб для контроля на стерильность и биологическую активность.

Из матрасов с плотным монослоем сливали ростовую среду, монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса с добавлением антибиотика (100 Ед/см3 канамицина) и вносили 10 см3 вирусной суспензии с необходимой множественностью инфицирования.

Матрасы с инфицированной культурой помещали в термостат для контакта вируса с клетками на 1 час при температуре 37°С±0,5°С. Затем в матрасы вносили 200 см3 поддерживающей среды с 2% инактивированной фетальной сывороткой и с величиной рН 7,2-7,4. Вирус культивировали до поражения 70-90% поверхности монослоя. Для контроля культуры и поддерживающей среды оставляли незараженными 2 матраса: один - со сменой ростовой среды на поддерживающую, другой - без смены среды. Матрасы с инфицированной культурой просматривали под микроскопом каждые сутки. Матрасы, в которых отмечают четкие цитопатические изменения с поражением 70-90% клеточного монослоя, отбирали, визуально просматривая на контаминацию бактериальной микрофлорой, грибами, и замораживали при температуре минус 20°С±1°С.

После замораживания вируссодержащую суспензию в матрасах оттаивали при комнатной температуре, тщательно отбивая инфицированные клетки льдинками с поверхности стекла сосудов. Оттаявшую суспензию сливали в 3-, 5- или 10-литровые бутыли. Из каждой бутыли брали по две пробы: одну - для высева на стерильность, другую - для титрования вируса. При активности ЧМЖ не ниже 5,0 lg ТЦЦ5(/см стерильный вируссодержащий материал использовали в дальнейшей работе.

2.2.3. Подбор чувствительных культур клеток для культивирования вируса ЧМЖ. Подбор чувствительных культур клеток для вируса ЧМЖ осуществляли путем серийных пассажей вирусов в первично трипсинизированных - ПЯ, ТЯ, ПК, ТК и перевиваемых - MDBK, RBt, СПЭВ, IB-RS-2, ВНК-21, Vero, Ch-91 клеточных культурах. Для опытов использовали культуры с полностью сформированным монослоем, выращенным в 50 см стеклянных матрасах. Культуру клеток инфицировали вирусом с определенной множественностью заражения и оставляли на контакт в термостате при 37°С в течение часа, затем добавляли поддерживающую среду. В процессе культивирования вирусов для каждой культуры клеток использовали соответствующую питательную среду. При поражении 60% монослоя культуру замораживали. В случае отсутствия ЦПД время культивирования составляло 9-10 суток, т.е. проводили «слепой пассаж».

В качестве контроля оставляли по одному матрасу каждой незараженной культуры клеток.

После каждого пассажа культуры клеток промораживали при минус 20°С и после оттаивания из них отбирали пробы для титрования. Для следующего пассажа в качестве матрового материала использовали пробы с наибольшим титром вируса.

2.2.4. Определение биологической активности вирусов.

Биологическую активность определяли титрованием на соответствующих культурах клеток.

Титрование вируса ЧМЖ проводили в 2- дневной клеточной культуре Ch-91, прошедшей 3-5 пассажей после размораживания клеток. Культуру клеток выращивали в пенициллиновых флаконах в питательной среде с 10 % сыворотки л

КРС рН 7,2-7,-4 при посевной концентрации 130-150 тыс.кл./см до получения ровного монослоя. Для определения биологической активности вируса ЧМЖ выросшую культуру просматривали под микроскопом. Отбирали флаконы с ровным сформированным монослоем без признаков дегенерации клеток. Клетки должны быть блестящими с четко выраженными границами. Отобранные флаконы маркировали и расставляли в коробки, указывая номер пробы и кратность разведения. Для контроля культуры и поддерживающей среды оставляли незараженными 8 флаконов: четыре - со сменой ростовой среды на поддерживающую, остальные - без смены среды.

Вирус, предназначенный для титрования, разводили в поддерживающей среде с 2 % инактивированной фетальной сыворотки рН 7,2 - 7,4, делая десятикратный шаг от 10"' до 10"7. Разведения получали следующим образом: в 7 пробирок наливали по 4,5 см3 поддерживающей среды. В первую л пробирку вносили 0,5 см разведенной до исходного объема вакцины. Чистой пипеткой смешивали содержимое первой пробирки и 0,5 см3 переносили во вторую пробирку. Последующие разведения готовили таким же образом. Суспензией каждого разведения вируса, начиная с наибольшего, заражали по о

4 флаконов с культурой клеток, внося по 1 см . В качестве контроля брали 4 флакона с культурой клеток, в которые вносили поддерживающую среду без вируса. Зараженные и контрольные культуры клеток во флаконах инкубировали в стационарном положении при 37°С±1°С, смену среды проводили через каждые 2-3 суток. Просмотр титрования начинали с 3 суток после инфицирования. Окончательный учет проводили на 14 сутки по наличию цитопатических изменений в зараженных флаконах, при отсутствии таковых в контрольных флаконах с культурой клеток. Титром вируса считывали наивысшее его разведение, вызывающее четкое ЦПД в 50% культуры клеток С11-91.

Титр вируса рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина. ТЦД50 находят по следующей формуле: ТЦД50 = ДОде* (ЕЫ - 0,5), где

ТЦД5о/см - титр вируса в объеме 1,0 см ;

Бп - минимальное испытуемое разведение; а - логарифм кратности разведения, равный 1;

1л - отношение числа зараженных культур клеток, давших ЦПД к общему числу зараженных культур клеток;

Е1л - сумма значения 1л, найденная во всех испытуемых разведениях.

2.2.5. Определение уровня вируснейтрализующих антител к вирусу

ЧМЖ. Исследуемые сыворотки прогревали в водяной бане при температуре 56°С в течение 30 минут. Для постановки РН готовили двукратные разведения испытуемых сывороток от 1:2 до 1:512 на растворе Хенкса рН 7,27,4 с добавлением антибиотиков. Затем готовили необходимый объем вирусного материала, содержащий 1000 ЩД^о/см3 вируса чумы мелких жвачных и вносили по 0,5 см3 в каждый пенициллиновый флакон с равным объемом разведенной сыворотки. Пенициллиновые флаконы со смесью вируса и сыворотки встряхивали и помещали в термостат при 37,0 ± 0,5°С на 1 час. Затем эту смесь вируса с сывороткой вносили в объеме 0,2 см3 во флаконы с культурой клеток после удаления ростовой среды и выдерживали при 37,0±0,5°С в течение 1 часа. На каждое разведение сыворотки использовали 4 флакона с культурой клеток. Потом в каждый пенициллиновый флакон вносили по 0,8 см3 поддерживающей среды Игла с добавлением 2% фетальной сыворотки и антибиотиков. Пенициллиновые флаконы с культурой клеток инкубировали при 37,0±0,5°С 14 суток со сменой среды через каждые 2-3 суток.

Одновременно ставили контроли с заведомо положительной и отрицательной сыворотками, контроль вируса и интактной культуры клеток. Учет реакции нейтрализации проводили после появления 3 цитопатического действия вируса (100 ТЦД50/см ) в контроле, где оно отмечалось на 10-12 сутки.

2.2.6. Изготовление живой лиофилизированной вакцины. Для изготовления вакцины использовали вируссодержащий материал с биологической активностью вируса ЧМЖ не ниже 5,50 lg ТЦД50/см3.

В клеточную суспензию, содержащую вирус ЧМЖ, добавляли защитную среду для лиофилизации из расчета: 20% раствор ГЛА до конечной концентрации 3%, 20% раствор желатозы до конечной концентрации 0,6% и 50% раствор сахарозы до конечной концентрации 3%.

Лиофилизацию вирусвакцин проводили на базе лаборатории болезней птиц совместно с к.в.н. Марковым Г.В. и к.в.н. Онищенко P.M. в сублимационной установке S.M.J. «Usifroid» (Франция). После окончания сушки камеру установки заполняли сухим стерильным воздухом и герметизировали флаконы по ОСТу 64-7-85-79 или другим, в зависимости от используемых флаконов при расфасовке вирусвакцины. Флаконы проверяли визуально в проходящем свете на отсутствие трещин и на наличие вакуума при помощи аппарата Д'Арсонваль согласно ГОСТу 28083-89. Массовую долю влажности в высушенном материале определяли согласно ГОСТу 24061-89.

2.2.7. Определение стерильности, безвредности и антигенной активности вирусвакцины.

Определение стерильности. Определение стерильности вирусного материала и изготовленных вакцинных препаратов проводили согласно ГОСТу 28085-89. Метод заключался в определении отсутствия роста бактериальной и грибной микрофлоры в посевах образцов вакцины, вируссодержащей суспензии или антигена на питательных средах.

Определение контаминации микрофлорой проводили путем высева на пробирки с МПА, МПБ и ТГС. Пробирки выдерживали в термостате при температуре 37°С в течение 10 суток с ежедневным просмотром сред. О стерильности судили по отсутствию роста микроорганизмов на средах.

Определение безвредности вакцины. Испытание вакцинных препаратов на безвредность проводили на двух овцах или двух козах. Вакцина считалась безвредной, если все животные после введения стократной иммунизирующей дозы (5,0 см ) овцам или козам в течение срока наблюдения (14 суток) оставались, живы без видимых отклонений от физиологической нормы.

Определение антигенной активности вакцин. Антигенную активность вакцинных препаратов определяли на трех овцах или трех козах и оценивали по уровню прироста антител в сыворотке крови через 21 день после иммунизации. Антитела к вирусу ЧМЖ определяли в реакции нейтрализации.

2.2.8. Проведение качественного анализа риска заноса возбудителя ЧМЖ на территорию РФ. Методологически существует несколько вариантов оценки риска: качественный, полуколичественный и количественный анализ (табл. 1). Безусловно, первый из них является наиболее простым методом, позволяющим получить информацию быстро и в общедоступной форме. Однако полученные в результате качественного анализа данные не могут трактоваться однозначно, что сводит на нет достоинства этого метода. Количественный метод более информативен, но требует наличия широкого спектра точных данных, достаточно длителен, а осознание его результатов без специальной подготовки затруднительно.

Очевидно, что эти методы не только дополняют друг друга, но зачастую и реализуются одновременно в процессе решения одной задачи. Тем не менее в типичном случае мы можем: качественно - оценить риск заноса заболевания на ранее благополучную территорию; количественно - оценить возможное распространение и ущерб от заболевания; полуколичественно - оценить общий риск в данной ситуации.

Качественный анализ риска заноса ЧМЖ на территорию РФ был проведен по данным литературы и информации МЭБ [14, 22, 39, 60].