Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ИНДИКАЦИЯ ВИРУСА ЧУМЫ СВИНЕЙ И ИЗУЧЕНИЕ ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВА МЕТОДОМ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

.0- гчдъъ

всесоюзный ордена ленина институт экспериментальной ветеринарии

всесоюзной ордена ленина академии сельскохозяйственных наук имени в. и. ленина

На правах рукописи

Аспирант ПАНИТКОВ Михаил Алексеевич

ИНДИКАЦИЯ ВИРУСА ЧУМЫ СВИНЕЙ И ИЗУЧЕНИЕ ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВА МЕТОДОМ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

(16.00.03 — ветеринарная вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

/' С

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ В, И. ЛЕНИНА

На правах рукописи

Аспирант ПАНИТКОВ Михаил Алексеевич

ИНДИКАЦИЯ ВИРУСА ЧУМЫ СВИНЕЙ И ИЗУЧЕНИЕ ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВА МЕТОДОМ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

(16.00,03 — ветеринарная вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

МОС:;очу.;, • ... .. .-.й-, Лес,,'..:: : > - .■.^-■искд

Работа выполнена в лаборатории по изучению болезней спшгей Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (директор — заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных на VI;, академик ВАСХНИЛ Я- Р. Коваленко).

Материалы диссертации изложены на 163 страницах машинописного текста, из них: 3 страницы введение, 21 — обзор литературы, 93 — собственные исследования, 14 — обсуждение, 3 — выводы и практические предложения, иллюстрированы 17 таблицами и 34 фотографиями. Список: использованной литературы включает 287 источников, в том числе 120 иностранных авторов.

Научный руководитель — заслуженный деятель 'науки РСФСР, доктор биологических наук, профессор П. И, Приту-лин.

1. Доктор ветеринарных наук М. А. Сидоров

2. Кандидат ветеринарных наук Б. А. Комаров.

Ведущее научное учреждение — Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный циститу,т.

Защита диссертации сс 1975 г. в 14 часов на засе,.

го ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии по адресу 109472, Москва, Ж-472, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Ученый секретарь Совета ВИЭВ — кандидат биологических наук В, В. Калугин, =

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан

ВВЕДЕНИЕ

Интенсификация свиноводства, с созданием крупных промышленных комплексов, в которых на ограниченной территории концентрируется большое поголовье животных, выдвигает перед ветеринарными специалистами сложные проблемы по предотвращению заноса в зти хозяйства болезней. Особую опасность для хозяйств подобного типа представляет классическая чума свиней.

Трудности в борьбе с чумой свиней связаны прежде всс-го с тем, что в системе мер профилактики , и ликвидации этой инфекции до сих пор наиболее слабым звоном является ранняя и дифференциальная диагностика. Поэтому ветеринарная наука как в нашей стране, так и за рубежом уделяет особое внимание разработке надежных лабораторных методов диагностики,

В отечественной и зарубежной литературе имеются данные об изучении в целях диагностики различных лабораторных методов: РСК, РП, РДП в агаровом геле, аллергической пробы, РИГА, РНГА, пробы Тэйлора, гематологических и гистологических исследований, метода иммунофлуорееценции и др. Однако результаты испытаний перечисленных методоь разноречивы и потому не могут быть рекомендованы длл широкого практического применения.

Среди разрабатываемых методов диагностики особого внимания заслуживает метод флуоресцирующих антител (МФА).

В СССР изучением реакции иммунофлуоресценции при чуме свиней занимались Г7- И. Притулин, А. А. Конопатки»! (1964, 1966), И. И. Кулеско, А. И. Собко, Н. М, Соболев (1966, 1967), X. Г. Гизатуллин, Р. X. Юсупов (1968, 1969, 1973), М. Ф. Мамаиашвилн (1970), Н. В. Лихачев и сотр. (1974) и др. Разрабатывая этот метод для диагностики чумы свиней, авторы высказали мнение о целесообразности дальнейшего изучения н усовершенствование его с целью индикации вируса чумы в органах и тканях больных животных, а также обнаружение его у животных вирусоносителец.

Изучение естественных резервуаров возбудителей в при-

С

роде и длительности их пребывания в организме больных, переболевших и иммунных животных представлнт теоретический интерес и имеет важное практическое значение.

Анализ многочисленной литературы и наблюдения практики свидетельствуют о гом ,что наиболее опасными в смысле распространения инфекции являются вирусоносителм. Однако условия формирования и длительности носительсгва лрл многих заболеваниях, п том числе и при чуме свиней, до настоящего времени остаются спорными и недостаточно изученными.

В последние годы в связи с применением живых вакцин в том числе и лапинизированной вирусвакцины из штамма К, появились высказывания о том, что они являются глазной причиной создания условий для носнтельства эпизоотического вируса чумы. Поэтому особого внимания заслуживает вопрос об изучении условий формирования н длительности носи-тельства вирулентных штаммов вируса чумы у свиней, привитых живыми вакиинамн и его индикация.

По нашему мнению проблема ликвидации чумы свиней не может быть успешно решена без быстрых и точных методов' лабораторной диагностики, изучения причин и сроков вирусо-иосительства при этой инфекции.

Учитывая особую актуальность перечисленных вопросов и борьбе с чумой свинец перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Получить кроличьи и свиные противочумные иммунсы-сюротки, приготовить из них люмипеснирующие антитела и испытать их в различных вариантах МФА для индикации вируса чумы свиней.

2. Изучить некоторые биологические свойства вируса чумы свиней в культуре клеток с помощью реакции иммунофлуэ-ресцешши.

3. Методом ФА определить возможность накопления эпизоотического вируса чумы в различных органах и тканях больных чумой свиней.

4. Определить возможное носительстро эпизоотического нируса чумы У свиней, зараженных вирулентным вирусом а отдаленные сроки после комплексной иммунизации с применением вирусвакпины из штамма К методом лю.мнпесцирую-1Ш1Х антител..

' СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал и методы. В опытах было использовано 123 гол, свиней разного возраста и 49 кроликов. Кроме того, а целях контроля исследовали материал от 27 больных вирусным гэ-

строэнтеритом, 18 — ИАР, II — болезнью Ауески, 4 — рожей, а также от 40 клинически здоровых животных,

В работе применяли следующие биопрепараты: сухую ла-пинизированную вирусвакцину из штамма К, сухую вирус-вакцину ГНКИ против болезни Ауески, вакцину против рожи из штамма ВР2 и живую вакцину из штамма ТС—177 против паратифа поросят. Вакцины и их смеси вводили в дозах, предусмотренных наставлениями по их применению.

Для получения свиных гипериммунных сывороток, а также контрольного заражения подопытных животных и препаратов культур клеток, использовали вирус чумы штймм 'Дорсет с титром Г06ЛД1оо/мл.

Гипериммунные сыворотки получали путем иммуиизащг! кроликов по схемам Н. А. Граевской (1969) и Кио—Сшпд— Уиап ((957). Свиней иммунизировали но схеме, предложенной Д. Боером н А. Рессангом (1970) в нашей модификации. Поросятам живым весом 40—45 кг, вводили лапинизирован-ную вирусвакцину на штамма К согласно наставлению. Через 10'—12 дней инъецировали подкожно вирулентный штамм Дорсет вируса чумы в дозе 1 мл, а на 10-й день вводили вну-трнбрюшшшо по 250—300 мл внруссодержащей крови с титром 10вЛДюо/мл. Через 2 недели после последнего введения антигена брали кровь для определения активности.

Специфичность и аткивность сывороток определяли комплексными методами в РП, РДП в агаровом геле и непрямой реакции иммунофлуореспепции.

Глобулиновые фракции сывороток выделяли путем высаливания насыщенным раствором сернокислого аммония по общепринятой методике. Иммунные белки метили изотноциа-патом флуоресцеина (ФИТЦ). Конъюгацию проводили по методу Маршалла и сотр. (1958). Краситель брали из расчета 0,02 мг на 1 мг белка, Обессоливание и удаление неспн-загшегося красителя производили путем гельфильтрации на колонках с сефадексом Г—25 или Г—50.

Оценку качества, полученных конъюгатов проводили путем определения рабочего титра, обработки гомологичных и гетерологичных препаратов. Было приготовлено и использовано в опытах 9 серий свиных и 16 кроличьих сывороток. Кроме того, в целях контроля в прямом варианте МФА применяли люминесцируюнше антитела против вирусного гастроэнтерита (шт. ВД2 н Талдом) и энтеровирусной инфекции (шт. «Ключевский»).

При непрямом методе использовали цельные кроличьи гипериммунные сыворотки и стандартные ослин/ые антикроличьи сыворотки ,меченые ФИТЦ. Последние получали из

Института эпидемиологии и микробиологии им. Н, Ф. Гамалея,

Объектом исследования служила культура клеток СПЭБ (перевиваемая линия клеток почек эмбриона свиньи), выращенная на узких полосках покровных стекол во флакончиках из под пенициллина. В качестве питательной среды использовали 0,5% раствор гидролизата лактальбумнна с бычь-еп сыворотки или среду № 199 с 5—10% бычьен сыворотки. Поддерживающей средой служил 0,5% раствор гидролизата лактальбумнна на растворе Хэнкса или среда 199 без сы-иоротки.

На 3—5 сутки культивирования .после образования сплошного монослоя на стеклах, клетки заражали лапиннзнрован-ним вакцинным штаммом К и эпизоотическим штаммом Дорсет вируса чумы свиней. В каждый флакончик, после удаления среды, вносили по 0,2—0,5 мл взвеси вируса и инкубировали при 37° в течение 1 часа, а затем наливали по 1,8 мл поддерживающей среды и продолжали культивировать прч 37°. В аналогичных условиях выдерживали и контрольные препараты.

При изучении динамики взаимодействия вируса чумы с клетками, полоски покровных стекол извлекали через каждые 5 и 15 минут, затем через 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 и 96 часов, обрабатывали флуоресцирующими сыворотками и исследовали под люмииесиентным микроскопом.

Помимо культур клеток, как в прямом, так и непрямом вариантах указанного метода, исследовали мазки-отпечатки и криостатовые срезы из селезенки, печени, почек, поджелудочной железы, миндалин, подчелюстных, мезептериальпых глубоких паховых лимфатических узлов, убитых и павших экспериментально зараженных чумой, болезнью Дуески, вирусным гастроэнтеритом и др. болезнями.

Препараты просматривали под люминесцентным микроскопом МЛ—2Б в падающем свете. Для оценки результатов использовали четырех крестовую систему. За положительную флуоресценцию мы принимали наличие четких, зеленовато-светящихся образовании в структурных -элементах клетки (цитоплазме и ядре).

Для изучения вирусоносительства и вирусовыделеиия иммунизировали подопытных животных и в разные сроки (через 6, 8 и 12 месяцев) после вакцинации заражали подкожно эпизоотическим вирусом чумы свиней штамма Дорсет в дозе 1 мл с титром 106 ЛДюо'мл. В день заражения к ним ставили на контакт иеиммунных против чумы подсвинков. Кроме того, для обнаружения вируса в органах и тканях, 6

подопытных животных убивали через 3 недели после контрольного заражения. От каждого убитого животного отбирали материал из лимфоузлов, селезенки, печени, ночек, костного мозга, мышечной ткани {в количестве 200—300 г), готовили суспензию, которую по 250—300 мл вводили подкожно неиммунным к чуме поросятам и дополнительно скармливали им по 300—400 г осадка тканей.

Из органов убитых и павших животных (предполагаемых вирусоносителен) готовили мазки-отпечатки, криостатовые срезы, а суспензией из органов заражали культуру клеток СПЭВ и исследовали под люминесцентным микроскопом с целью обнаружения характерного для антигена вируса чумы специфического свечения. Опыты сопровождались контролем активности вируса путем заражения 1—2-х непривитых поросят.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Изучение динамики взаимодействия вируса чумы свиней с клетками культуры ткани СПЭВ методом флуоресцирующих антител

Выбор культуры ткани был обусловлен ее доступностью и пригодностью для поддержания и репродукции вируса чумы свиней. Формирование моиослоя обычно заканчивалось к 72—96 часам.

Исследованиями установлено, что заражение тканевого монослоя вирусом чумы свиней не приводило к цитопатичес-кому действию (ЦПД), а в 16—20% препаратов уже через 5 минут в 5—6% клеток наблюдали слабое свечение в виде мелких зеленоватого цвета гранул в центре ядра около ядрышек. Через 3 часа специфическое свечение в виде гранул наблюдали в цитоплазм этической части 20—25% пораженных клеток в 40—79% исследуемых препаратах, а к 6 часам вирусный антиген обнаруживали в околоядерной зоне цитоплазмы в виде гранул, количество которых увеличивалось, а число клеток со специфическим свечнием достигало примерно 30— 40%.

К 12 часам количество ярко-зеленых гранул увеличивалось и их обнаруживали чаще в периферической части цитоплазмы. К 24 часам отмечали диффузное распределение антигена, также встречали клетки с ярко светящимися гранулами в цитоплазме. Нарастание интенсивности специфического свечения и количества светящихся гранул наблюдали до 72

часов. В более поздние сроки антиген распределялся по всей цитоплазме. В препаратах нередко наблюдали целиком пораженные клетки с диффузным свечением цитоплазмы.

Установлено, что число включений ярко-зеленого цвета зависело от величины заражающей дозы. В препаратах с меньшими заражающими дозами вируса, динамика внутриклеточного распределения аптигено-в была менее четкой, а свечение более слабым. Довольно часто в одни и те же сроки после заражения тканевой культуры в препарате можно было обнаружить клетки, характер специфического свечения которых соответствовал разным стадиям процесса поражения их вирусом.

В ранние сроки репродукции лапинизнрованного вируса чумы из шт. К, наблюдали темные контуры клеток, либо участки со слабым свечением в центре ядра в виде мелких гранул зеленоватого цвета. Через 60 минут подобные включения выявляли и в цитоплазматической части клеток. К 3 часам в цитоплазме единичных клеток обнаруживали гранулы различной величины с зеленоватым свечением. К 24 часам наблюдали не только поражение новых клеток, но и слияние мелких гранул в участки свечения сферической или неправильной формы. В 95% препаратов число клеток со специфическим свечением достигало 40—45%, К 48 часам количество препаратов с наличием специфического свечения у 50—60% клеток составляло 95—100%. На 4—5 сутки репродукции вируса находили участки монослоя с ярким специфическим свечением всей клетки.

Динамика накопления вирусного антигена в клетках культуры ткани СПЭВ была совершенно идентичной как при прямом, так и непрямом вариантах этого метода.

В ранние сроки репродукции вируса чумы установлены некоторые различия в характере включений между лапипизи-рованным и эпизоотическим штаммами вируса, Штамм Дорсет вызывал специфическое свечение светло-зеленого цвета п виде гранул в основном в ядре, а при заражении лапини-зированным вирусом подобные включения обнаруживали очень редко и через 1 час их наблюдали как в ядрах, так и в цитоплазме, но большая часть таких включений находилась в ядре. В клетках, пораженных вирулентным вирусом, подобные включения были большие по величине, встречались только в ядрах, а к 3 часам их можно было видеть уже и в питоплазматической части клеток. К 6 часам и в последующие сроки репродукции обоих штаммов вируса чумы существенной разницы в характере свечения установить не удалось. 8

Индикация вируса чумы свиней методом флуоресцирующих антител в органах и тканям эксприментально зараженных животных

В прямом и непрямом вариантах названного метода исследовали 9135 мазков-отпечатков и 5957 гистосрезов из органов и тканей 123 убитых и павших экспериментально зараженных чумой свиней. Контролем служил материал ог 40 клинически здоровых и 60 свиней, больных другими болезнями.

Первую серию опытов проводили с целью определения возможности применения и выяснения степени чувствительности метода иммунофлуоресценцни для индикации антигена вируса чумы. Для этого исследовали в сравнении: селезенку, печень, почки, миндалины, поджелудочную железу, подчелюстные, заглоточные, средостенные, портальные, мсзентериаль-пые и др. лимфоузлы от 61 экспериментально зараженного чумой подсвинка. В день взятия материала или па следующий день готовили мазки-отпечатки и криостатовые срезы по 3—4 препарата из каждого органа и не менее двух исследовали под люминесцентным микроскопом.

В препаратах, приготовленных из органов н тканей боль-пых чумой животных и обработанных противочумными флуоресцирующими сыворотками, наблюдали специфическое свечение большинства ретикулярных н лимфондных клеток. Оно было особенно интенсивным в препаратах из селезенки, подчелюстных и мезентериальных лимфатических узлов.

Метод ФА практически позволяет обнаружить вирусный антиген у всех исследованных животных как прямым, так и непрямым вариантом, Процент обнаружения специфического свечения был почти одинаков. Так при исследовании прямым методом мазков-отпечатков специфическое свечение обнаруживали в 72% ,а в гистосрезах 86%, в то время как непрямым вариантом соответственно — в 70%, а в гистосрезах п 83% случаев.

В наших исследованиях не все препараты обладали одинаковой флуоресценцией, что, видимо, было связано с различной степенью накопления вируса чумы в органах и тканях больных животных, В серии специальных исследований было установлено наибольшее накопление вируса на 5—10-н день после заражения в селезенке — в 95—98%, а в подчелюстных и мезентериальных лимфоузлах — в 86—97% случаев,

В препаратах из лимфатических узлов п селезенки обнаруживали скопление лимфоцитов, плазмоцнтов, плазмобластов, а □ пх цитоплазме н ядре наблюдали зернистое, в виде мелких

включений, или однородное, ярко-зеленое специфическое свечение.

Достаточно хорошее свечение мы наблюдали п в препаратах из миндалин — 81—83%, но в ряде случаев отмечали н значительное фоновое свечение, связанное с наличием гнойно-пекротического воспаления этого органа.

В поджелудочной железе специфическое свечение зарегистрировали в 42—62% случаев с оценкой в один—два и очень редко в три креста. Причем, приготовить удачные и полностью пригодные препараты из этого органа почти невозможно, так как в нем имеется большое количество жировых клеток, неспе-Пифическое свечение которых сильно затрудняет правильную оценку результатов реакции.

В препаратах из печени специфическое свечение отмечали в 60—78%, а из почек — в 68—86% случаев.

Данные свидетельствуют о том. что МФА является специфичным в отношении антигена вируса чумы и позволяет обнаружить его непосредственно в препаратах из органов и тканей больных чумой свиней.

Во второй серии опытов мы проводили исследования по выявлению вирусного антигена в препаратах из органов п тканей 99 больных чумой в различные стадии инфекционного процесса.

В препаратах из лимфоузлов и селезенки были выявлены специфиечскн флуоресцирующие клетки уже на 4-й день после заражения в 50—71%, а па 6—8-й день — в 61—85% случаев с оценкой в 3—4 креста Если животные погибали в более поздние сроки, то процент выявления клеток со специфическим свечением несколько снижался и к 12—13 дню после заражения составлял 53—60% случаев.

При анализе контрольных препаратов, приготовленных нз органов и тканей больных другими болезнями иногда отмечали незначительную флуоресценцию клеток с оценкой на 1—2 креста, что не принималось за специфическое свечение.

Применение метода контрастной иммунофлуоресценции для обнаружения вируса чумы свиней- Одной из трудностей при использовании МФА является наличие неспецифического свечения в препаратах, обработанных конъюгатами. Поэтому в своих опытах мы решили испытать в сравнительном аспекте прямой н непрямой варианты МФА с методом контрастной иммунофлуоресценции, используя для гашения песпецифического свечения синьку «Эванс» по методике, описанной Д. Урбане-ком и сотр. (1970).

При обработке криостатовых срезов специфическими конъюгатами с синькой «Эванс» специфическое свечение клеток 10

было светло-зеленым н однородным, а все несиеннфическн реагировавшие клетки окрашивались в ярко-красный цвет,

В гпстосрезах ]ы селезенки специфическое ярко-зеленое свечение в основном локализовалось в цитоплазме единичных клеточных групп п редко распространялось на всю поверхность среза. Эластические соединительнотканные волокна сосудов, капсулы окрашивались в ярко-красный цвет, а красная и белая пульпа флуоресцировала умеренно красноватым оттенком, Картина свечения срезов различных лимфоузлов в основном была такая же, что и препаратов из селезенки. Специфически светящиеся светло-зеленым цветом клетки днффузно распределялись в лимфатической ткани.

Клетки эпителия почечных канальцев окрашивались в оранжево-красный, а соединительнотканные и эластические волокна в темио-красный'цвет. Специфическая реакция антиген-антитело проявлялась в виде светло-зеленого свечения в единичных клетках клубочков н интерстнциальнои ткани. Особенно четкое светло-зеленое свечение наблюдали в цитоплазме некоторых эпителиальных клеток канальцев, однако такое свечение отмечали не всегда.

Выявление вирусного антигена методом контрастной нмму-нофлуоресценцнн проводили также и в мазках-отпечатках. Не-специфпческн реагирующие клетки окрашивались в красный цвет, а среди них лежали поодиночке, а иногда скопления клеток с ярким свегло-зеленым свечением, которые и содержали антиген вируса чумы.

Некротические участки ткани .клеточный детрит и частичф грязи постоянно интенсивно светились зелено-желтым цветом, но они отличались от специфического свечения отсутствием у них клеточной структуры. Поскольку при чуме свиней очень часто наблюдается гпойно-некротпческое воспаление миндалин- то в препаратах нередко отмечали свечение участков некроза и клеточного детрита, которые но данным ряда авторов легко адсорбируют флуоресцирующие антитела давая неспе-цнфическое свечение. Поэтому для обнаружения вирусного антигена лучше всего брать макроскопически неизмененные органы и ткани.

Для провреки специфичности реакции иммунофлуоресцен-ции проводили контрольные исследования. Часть препаратов обрабатывали гетерологнчнымп конъюгатамн, а препараты из органов и тканей больных ИАР, вирусным гастроэнтеритом, болезнью Ауески и заведомо здоровых животных, окрашивали специфическими люмннесцнрующнми противочумными сыворотками. Результаты исследования были отрицательными. Для подтверждения полученных данных н проверки нри-

годности этого метода для индикации вируса чумы, мы апробировали его на 28 экспериментально зараженных чумой подсвинках, у которых удалось обнаружить вирусный антиген. В то же время установлены значительные различия в специфическом свечении мазков-отпечатков н гнстосрезов отдельных органов- Если в препаратах из селезенки вирусный антиген был выявлен у 100% исследованные, то в гистосрезах из подчелюстных н мезептернальпых лимфоузлов у 92 /о, £] В МЙЗК£5Х" тпечатках только у 85% экспериментально зараженных чумой; в печени н поджелудочной железе — 35—46% случае».

Параллельно с методом контрастной нммунофлуоресцен-цнн в сравнительном аспекте исследовали препараты из органов и тканей 46 экспериментально зараженных чумой и больных другими болезнями подсвинков в прямом и непрямом вариантах МФА.

Было установлено, что методом контрастной нммунофлуо-ресценщш в мззках-отпечатках в 87%, а в гнстосрезах б 91 % случаев удалось обнаружить вирус чумы, в то время как яри непрямом варианте соответственно 80—84%, а при прямом — 81 и 85% случаев.

Наши исследования показали, что метод контрастной им-мунофлуоресценции заслуживает высокой оценки при индикации вируса чумы свиней в патматериале. Различные контрольные опыты, особенно на свиньях больных другими болезнями, подтвердили специфичность данной реакции, поэтому положительная пммупогнстологпческая реакция позволяет судить о наличии вируса чумы.

Влияние сроков храпения на качество люминесцируюших сывороток. Отсутствие до настоящего времени промышленного изготовления противочумных люмипесцнрующнх сывороток непозволяет в данный момент дать окончательное заключение о предельных сроках хранения специфических коиъюгатов. При широком практическом использовании сывороток необходимо знать, как влияют условия и сроки хранения на их специфичность и окрашивающую способность.

В своих опытах конъюгаты. полученные путем гельфиль-трацпн на колонках с сефадексом Г—25 или Г—50, консервировали мертиолатом до концентрации 1:10000 и расфасовывали в ампулы по 1—2 мл. Приготовленные таким образом лю-минесцирующие антитела, сохраняли высокую активность и специфичность и использовали без дополнительной очистки для специфической окраски антигенов. Ампулы с готовыми конъюгатамн хранили при -1-4°. В момент приготовления и по истечении 1, 4, 0 и 12 месяцев на свежеприготовленных препаратах пз органов и тканей экспериментально зараженных чу-12

мой поросят, проверяли их специфичность и активность. С этой целью, различным» разведениями сывороток, было обработано п исследовано в прямом и непрямом вариантах МФА 1060 мазков-отпечатков, в том числе 385 препаратов пз органов л тканей больных ПАР, вирусным гастроэнтеритом и клинически здоровых подсвинков.

Установлено ,что кроличьи люминесцпрующие антитела менее стабильны и к 4-му месяцу их титр снижался на 30—50%, а вирусный антиген обнаруживали в 33—60% случаев. В то время как свиные конъюгаты в эти сроки сохраняли активность в первоначальном титре и только через 12 месяцев она гадала до 25—50%, что позволяло обнаруживать специфическое свечение в 40—75% нсследованнных препаратах.

По нашему мнению способность свиных лгоминесцнрующих сывороток сохранять лрн +4° до года свою активность н окрашивающую способность указывает на высокую стабильность, что очень важно при изготовлении специфических коцъюгатов в промышленных условиях в целях широкого практического использования их при индикации вируса чумы свиней.

Изучение носительства и выделения вируса чумы у свиней, зараженных эпизоотическим вирусом через 6, 8 и 12 месяцев после комплексной вакцинации с помйщью биопробы

С этой целью было поставлено 4 опыта, в которых использовали 51 голову свиней разного возраста.

ОПЫТ № 1, Иод опытом находилось 10 животных. 4-х свиней за 6 месяцев до постановки опыта вакцинировали комплексно пртнв чумы, рожи, паратифа и бол, Ауески. Поместили в изолятор и подвергли контрольному заражению. Один подсвинок служил контролем вируса (в отдельном изоляторе).

Для выяснения вирусовыделения к животным в день заражения поставили двух неиммунных поросят 4-месячного возраста н содержали созместно в течение 20 дней. За период наблюдения все 6 подсвинков не проявили клиники заболевания, в то время как контрольный подсвинок заболел на 3-й и пал на 7-й день после заражения с типичными признаками болезни.

Для определения носительства вируса чумы иммунными свиньями, произвели их убой через 3 недели после контрольного заражения. При тщательном послеубойном осмотре не обнаружено изменений, характерных для чумы свиней. Приготовленную из их органов н тканей суспензию ввели подкожно трем ненммуппым к чуме подсвинкам, В первые два дня у апх

отмечали угнетение, понижение аппетита. Затем эти признаки исчезли, температура тела, общее состояние в течение 30 дней былл в пределах нормы. За это время подсвинки как контак-тируемые, так п получившие суспензию не заболели чумой. Такого рода результаты свидетельствовали или об отсутствии вирусоносительства и внрусовыделения или о наличии иммунитета у них. Для решения этих вопросов произвели контрольное заражение их. Все они заболели на 3—4-й и пали на 8— 10-й день с характерными для данного заболевания клиническими признаками и патологоанатомнческими изменениями.

Вышеизложенное свидетельствует о том, что свиньи, зараженные эпизоотическим вирусом чумы через б месяцев после комплексной иммунизации, не являются вирусоносителями и вирусовыделнтелямн. В их организме не создается условий для формирования носительства вируса чумы.

Полученные результаты послужили основанием для продолжения опытов в этом направлении.

ОПЫТ № 2. В опыте использовали 17 животных. Из них Э свиноматок весом 130—140 кг за S месяцев до этого были вакцинированы комплексно против чумы, рожи, паратифа п бол. Ауески. Животных выдержали в условиях вивария и после проведения гематологических исследований заразили вирулентным вирусом чумы в указанной выше дозе. Один подсвинок служил контролем.

Для выяснения внрусовыделения иммунными свиньями, в лень контрольного заражения к ним в станок поместили 3-х неиммунных к чуме поросят и содержали вместе в течение 3-х недель- За этот период как иммунные, так и животные стоявшие на контакте не проявили клиники заболевания. Контрольный подсвинок заболел на 4-й и пал на 10-й день после заражения с типичными для чумы клиническими признаками и на-тологоанатомическнмп изменениями. Полученные данные подтверждают результаты предыдущего опыта.

Убедившись в отсутствии вирусвыделения, через 3 недели после контрольного заражения произвели их убой с последующим приготовлением из органов и тканей суспензии, которую ввели трем непммунным к чуме поросятам. У всех трех поросят в течение 28 дней не наблюдали признаков болезни. Для подтверждения восприимчивости к вирусу чумы произвели контрольное заражение пх н одного интактного подсвинка эпизоотическим вирусом. Все они заболели на 3—5-й н пали на 10—14-н день после заражения с типичными для чумы клиническими признаками и характерными патологоанатомически-мп изменениями.

Полученные результаты этого опыта позволяют сделать

вывод, что иммунные животные, зараженные эпизоотическим вирусом спустя 8 месяцев после комплексной накцппацпн. не выделяют вирус чумы в активном состоянии н не содержат его п органах н тканях.

Убедившись в этом, мы решили выяснить возможность пп-русоноснтельства в более отдаленные сроки.

ОПЫТ N3 3. Для постановки опыта из Кузнецовского совхоза-комплекса км. 50-летия СССР Московской обл. завезли 7 свиноматок в возрасте 3—4 лет, живым весом каждая 200— 210 кг, которые за 12 месяцев до постановки опыта были вакцинированы комплексно с применением внрусвакшты из шт. К. (Опыт проведен совместно с ветврачом этого комплекса Р. И. Пихооя).

Животных выдержали в условиях изолятора, произвели гематологические исследования, после чего подвергли контрольному заражению. Один непммучшын к чуме подспннок служил контролем вируса чумы.

Для выяснения внрусовыделенпя, в день заражения к свиноматкам на контакт поставили 3-х иепммунных к чуме подсвинков и содержали вместе в течение 23 дней. У обеих групп животных каждые 5 дней проводили гематологические исследования с ежедневным измерением температуры тела. Все контрольные н подопытные животные за этот период нормально развивались и не заболели. Это свидетельствовало об отсутствии вирусовыделенпя у свиноматок.

В целях определения возможности впрусоноснтельства свиноматками произвели их убой через 23 дня после введения вируса. Подсвинков, находившихся па контакте, оставили для дальнейшего наблюдения. При тщательном осмотре органов и тканей убитых свиноматок не было обнаружено изменений свойственных для чумы свиней. Приготовленную из их органов н тканей суспензию, ввели подкожно трем иеиммунпым к чуме подсвинкам, которые в течение 3-х недель наблюдения не за-бблелн чумой. По истечении 47 дней подсвинков, находившихся на контакте, а также 3-х подсвинков — на 21-й день после введения суспензии, подвергли контрольному заражению эпизоотическим вирусом чумы. В этот же день этим вирусом, с целью его контроля, заразили одного нсиммуниого к чуме поросенка. Все они заболели па 3—4-й п пали на 5—9-й деньпос-ле заражения с характерными для чумы клиническими признаками и патологоанатомическими изменениями.

Полученные данные свидетельствуют о том, что свиньи, зараженные эпизоотическим вирусом чумы спустя одни год после вакцинации ,не являются впрусовыделптслямп, в их организме не создаются условия для формирования впрусоноснтельства,

Для подтверждения результатов, полученных в предыдущих опытах, был проведен еще один опыт по несколько иной схеме.

ОПЫТ № 4. В опыте находилось 9 подсвинков 3—5-месячного возраста. Двух из них вакцинировали ланиннзнрованной гшрусвакциной из шт. К- С целью проверки иммунитета, через 10 дней после вакцинации, обоих подобии ков подкожно заразили вирулентным вирусом чумы в дозе по 1 мл. По истечении 12 дней им внутрнбрюшинио ввели вирус—кровь в количестве 300 мл от экспериментально зараженного чумой подсвинка с титром Ю^ЛДюо'МЛ. На 8-й день после введения вируса, к мим в станок поместили двух неимунных к чуме поросят и содержали на контакте в течение 22 дней. Через 2 недели одному иммунному подсвинку дополнительно ввели виутрнбрю-шинно 500 мл вирус—крови.

Необходимо отметить, что у животных после и ведения вирус— крови наблюдали угнетенное состояние и понижение аппетита. С целью определения вирусоносительства их убили через 2 недели после последнего введения антигена. При осмотре в их органах н тканях не было отмечено изменений свойственных для чумы свиней, а приготовленную нз органов н тканей суспензию ввели трем неиммунным подсвинкам, которые в течение 28 дней не заболели чумой.

В результате контрольного заражения поросят, которым вводили суспензию, а также находившихся на контакте, все они заболели на 3—4-й и пали на 7—10-й день с типичными для данного заболевания клиническими признаками и патоло-гоанатомическнмн изменениями-

Эти результаты еще раз подтверждают, что в иммунном организме эпизоотический вирус не репродуцируется и при его введении даже в больших дозах не создаются условия для формирования впрусоиосптельства.

Применение реакции иммунофлуоресценции для выявления* возможного вирусоносительства при чуме свиней

Для индикации вируса чумы свиней в органах и тканях животных, предполагаемых вирусоноеителей, параллельно с биопробой использовали метод флуоресцирующих антител. Мы решили испытать его в этой серии экспериментов с целью выявления вирусного антигена у иммунных животных, зараженных эпизоотическим вирусом чумы через 6, 8 и 12 месяцев после комплексного применения живых вакцин.

Для чего был использован материал от следующих катего-рнй животных: иммунных к чуме — 22, экспериментально зараженных чумой — 29, больных ИАР — 5, вирусным гастроэн-

тернтом — 6 и клинически здоровых — 8 голов свиней. Из исследованных 500 мазков—отпечатков, 296 криостатовых срезов и 302 препаратов культуры ткани СПЭВ, приготовленных пл органов н тканей предполагаемых вирусоносптелен, при люминесцентной микроскопии нам ни в одном случае не удалось обнаружить специфического лля вируса чумы свиней свечения. В то же время в аналогичных препаратах, приготовленных из органов и тканей экспериментально зараженных.чумой, у всех 29 подсвинков обнаружен вирусный антиген в мазках—отпечатках в 82%, криостатовых срезах—90%, а в препаратах, зараженных клеток культуры ткани СПЭВ — в 95% случаев.

Наряду с этим следует отметить, что в препаратах, приготовленных из органов и тканей больных другими вирусными болезнями, обработанных темп же люмннесцнрующнми сыворотками и при тех же режимах, иногда наблюдали в цнтоплаз-матической части клеток стечение на 1—2 креаа. Поэтому приходилось использовать больше контролен, а также готовить препараты из органов и тканей больных другими болезнями и клинически здоровых животных, при оценке которых мы не обнаруживали специфического для вируса чумы свиней свечения.

Все вышеизложенное снпдетельствует о том, что в иммунном организме эпизоотический вирус, подвергаясь воздействию как специфических, так и несиешгфических факторов защиты организма, по всей вероятности, не находит условий для своего развития и теряет всякую способность к репродукции. Видимо поэтому в препаратах, приготовленных из органов и тканей таких животных (предполагаемых вирусоносптелен). нам не удалось обнаружить специфического свечения, характерного для возбудителя данного заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Метод флуоресцирующих антител н разработанном нами варианте, является высокочувствительным и специфичным при выявлении вируса чумы свиней в органах и тканях больных животных, а также в нпфпцнрованых препаратах культуры клеток СПЭВ.

2. Получение специфических люмпиесцирующих сывороток путем гельфпльтрацин па колонках с сефадексом Г-25 или Г-50 в сравнении с методом диализа сокращает процесс обработки их. Приготовленные конъюгаты сохраняют высокую'ак-тнвность п специфичность и могут быть использованы без дополнительной очистки для специфической окраски антигенов.

3. Противочумные сыворотки, полученные от свиней путем

17

гштергшмуннзацил вирулентным штаммом Дорсет вируса чумы, меченые ФИТЦ, более стабильны, обладают высокой активностью н специфичностью по сравнению с кроличьими лю-минесцирующимн антителами. Вследствии этого для индикации антигена вируса чумы метолом флуоресцирующих антител следует использовать гппернммунные сыворотки свиней.

4. Обнаружение вируса чумы методом пммунофлуоресцен-нпн в крпостатовых срезах из органов и тканей больных чумой свиней, а также инфицированных препаратах культуры клеток СПЭВ, показал больший процент выявления положительных случаев по сравнению с мазками-отпечатками.

5. Модифицированный метод флуоресцирующих антител с применением контрастирующего красителя синьки «Эване», является специфичным при индикации вирусного антигена непосредственно в препаратах из органов и тканей больных чумой свиней и позволяет обнаруживать его в 84—91% случаев.

6. Латшнзпрованный штамм К и эпизоотический штамм Дорсет вируса чумы свиней репродуцируются в перевиваемой линнн клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) без проявления цнтонатического действия. В клетках этой культуры в начальной стадии репродукции вирус формирует включения, которые обнаруживаются методом иммунофлуоресценцин в ядрах клеток в виде ярких светло-зеленого нвета гранул в первые 5 минут после внесения вируссодержашего материала.

7. Методом люминесцирующих антител не обнаружено существенной разницы в динамике вирусных антигенов при репродукции как вакцинного, так и эпизоотического вируса чумы в культуре клеток СПЭВ.

8. У свиней, иммунизированных комплексно с применением тшрусвакцнны пз штамма К. и зараженных вирулентным вирусом через 6, 8 и 12 месяцев после вакцинации, п течение первых 3-х недель в органах и тканях вирус чумы методом биопробы в иммунофлуоресценцин не обнаруживается. Следовательно, такие животные не являются носителями и выделителями вируса и в эпизоотологическом отношении они безопасны.

9. Высскзя чувствительность, простота и специфичность метода флуоресцирующих антител позволяет рекомендовать его в прямом и непрямом вариантах для обнаружения вирусного антигена в органах и тканях больных чумой, а также в препаратах культуры клеток СПЭВ и постановки диагноза в комплексе с эннзоотологическнмн, клиническими и патологоанато-мнческпмн методами диагностики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Учитывая стабильность, высокую активность и специфичность свиных противочумных люминесцирующих сывороток, полученных путем гельфильтрацпп на колонках с сефадексом, их можно использовать в практических условиях как в прямом варианте, так и с применением контрастирующего красителя синьки «Эванс» лля индикации вирусного антигена непосредственно в препаратах из органов и тканей больных чумой свиней, а также в инфицированных клетках культуры ткани СПЭВ.

2. Простота и специфичность метода флуоресцирующих антител, с учетом большего процента обнаружения антигена вируса чумы в гпстосрезах из органов и тканей больных чумой животных, а также инфицированных препаратах культуры клеток СПЭВ, позволяет рекомендовать его для постановки диагноза в комплексе с эпнзоотологпческими, клиническими и п а тол огоа »атомическим и методами диагностики.

Слисок опубликованных работ по теме диссертации:

1. Применение иммуиофлуоресцеицин для индикации вируса чумы свиней. Ветеринария, 1974, 7, 39—40.

2, Применение метода флуоресцирующих антител для изучения взаимодействия вируса чумы свиней с культурой клеток СПЭВ. Доклады ВАСХНИЛ, 1974, 11, 40.

Материалы диссертации доложены па заседании Ученого Совета ВИЭВ, ноябрь, 1974.

Ответственный за выпуск — заслуженный деятель науки РСФСР, доктор биологических наук,' профессор П. И, Приту-лин.

Заказ 1494 Тираж 150

Типография Московской ордена Трудового Красного Знамени ветернрарной академии имени К- И- Скрябина