Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Обоснование разработки иммуноактивных препаратов для лечения и профилактики инфекционных болезней

Гг .5 ОД

„ „ 1ЧЛ1! (ЖКТ-ЖГЕРБУРГСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЗ ИНСТИТУТ

2 0 1:10 Н и:.:ч

на правах рукописи

ИГНАТОВ Петр Евгеньевич

УДК 619:616.37:616-097:615.37

ОБОСНОВАНИЕ РАЗРАБОТКИ ИШУНОАШШЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОйЯЛАКПШИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

ОЗ..00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисканиэ ученой степени доктора биологических наук

Салкт-Пе?ер5урр - 1994г

Работа выполнена в Нижегородском сельскохозяйственном института, ВИЭВ, институте иммунологии МЗ РФ,

Научные консультанта:

академик РА Ой, профессор, доктор ветеринарных наук В.П .Урбан член-корреспондент РАСХН, профессор, доктор ветеринарных наук В.Б.Сочнев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И Л.Болотников, доктор ветеринарних наук, профессор, член-корреспондент

РАСХН ' Р.Н.Мзровш доктор ветеринарных наук, профессор К.В.Иумилов

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт биологический промышленности (ШШБП)

Защита диссертации состоится "04" июля 1994г. в II часов на заседании специализированного совета Д 120.20.02 при Санкт-Петербургском ветеринарном институте (1960Э4§ г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербург ского ветеринарного института.

Автореферат разослан "_"июня 19У4 года.

Ученый секретарь специализированного совета, доцент О.В.Узюмова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ

Актуальность теиы^ Борьба о инфекционными болезнями остается вполне? актуальной и до настоящего орекеяи- Более» того» в причинном комплексе ряда болезней» ранее считавшихся неикфек-цнсэнныни* только в последнее время выявлены специфические возбудители»

Инфекционная иммунология как самостоятельный раздел современной биологии сейчас полечила довольно интенсивное» развитие- На ее основе расшифрованы особенности взаимодействия паразита и хозяина при многих болезнях и создано немало высокоэффективных пратективных препаратов» Тем не нрнео в этой области знаний имеется целый ряд проб-леи» где традиционные подходы не позволяют получить ведае-ных результатов-

Для одних болезней невозможность создания иммунитета связана с отсутствием инмчкизнрукгишх свойств в компонентах возбудителя« реализующих патогенные Функции» для других -с большой вариабельностью антигенных композиций или выраженный "антигенным дрейфом" .

Для некоторых болезней (туберкулез» бруцеллез) определенные трудности з создании иммунобиологических препаратов связаны Ь рядом нежелательных иди индуцируемых побочных эффектов (серпозитивность» реактогеиность» аллергяруютчая активность ) (П*А*Вермидоаа •1974.«Здродовский 1963- «В«11 «Урбан 19ВЗ)

Пытаюсь решать эти проблемы* многие отечественные и эару-беяшые исследователи применяли разнообразные и интересные подходы» Предлагалось использование совместно с антигенами поликлональных иннуноад*ы«вантов * преддагалось-идти по пути.совершенствования очистки различных антигенов»

Ряд авторов использует для повышения устойчивости организма к воздействии» возбудителей «болезней просто препараты» неспеиифически активирутоадие различные системы иммунитета (И.Е-Ковалев 1980. Кику 1931)•

Тем не менее до настоящего времени нет стройной системы диф-Ферениированногп подхода к созданию и применению иммунизирующих и имиуностинчлирукнйих соединений- & недостаточной степени обоснована и учитывается роль Факторов патогенности воз-б*мителей и особенности пато- и инмунсгенеза при различных болезнях*

ТУирокое распространение болезней животных и человека* при которых не разработаны э^Фгктионые методы воздействия на систему иммунитета* и созданные предпосылки для рехления этих

проблем подтверждают актуальность выбранной теки-

^Цель работ« - разработать и предложить новые подходы для создания сп&циФическмх и неспеииФических инмуностинуляторов с учетон особенностей инфекционных болезней и их патогенеза-В задачу исследований сходило:

1-На конкретном примере (бруцеллеза) определить особенности патогенеза и пути поиска протектнвных антигенов.

2-Разработать» методы получения иммунобиологических препаратов для профилактики болезней, сопровождающихся вкутрифаго-цитарной персистенцкек возбу/штеля-

3«Разработать эффективные препарат**» неспециФическьз стиму-лируюшие клеточные <иакрофаги и Т-клетки) и гуморальные звенья иккунитега п обосновать их применение при различных болезнях•

-новизна? В настоящей работе вп&рвы& изучены и установлены некоторые особенности патогенеза бруцеллеза о позиций колекулярных взаимодействий в системе "паразит-хозяин"• Научно обоснованы подходы к конструированию вакцин нового поколения» с оаранее ¡заданныии свойствами» при болезнях животных* сопровождавшихся внчтри<?агоиитарным персйстированнем возбудителя*

Впервые разработан и предложен ряд иниуностинулиру*очих препаратов ч воздействующих на различные системы иммунитета« и определены новые лояходьз к воздействию на эпизоотический процесс при ряда болезней хкивотных«

На количественной юноае показана эффективность применения Ьшнуностниулируоддах препаратов лля различных систем ведения жив отноводства•

..Практическая лценности? Показана научная и практическая ценность совершенствования иннунобиологических препаратов при болезнях о различной этиологией« Разработаны» апробированы и внедрены иммуностимулирующие препараты ''Мастии" и "Достим" • Выдвинутые на основании исследований положения вошли в научно-норкатквнуш документацию <ГУ» наставление по применению в ветеринарной практике ипнуностммулирумиих препаратов: Достии \ТУ wo-10-07г23в-Я1, наставление по прикенению No-22-5-2/44. Мастин (ТУ No- 10» О 7, 'Л ** 9*f . наставление по прииененши No•lO*Q?JG6'9t/> \ анатоксин стафилококковый поливалентный < ТУ * No »ОВ0-&4-19-012-*34» наставление по применению Ыо.19-4-2/166>, вакцина импукопотениироваиная чумная - ВИЧ tТУ No-10-07.052-93» наставление по применению Wo.19-4-2/76)-На замиту bhhocsitch следующие? вопросы:

1«Подходы к созданны профилактических препаратов протио инфекций» сопропожламшиися внчтри^агочитатжой персистен-цмой возбмдителя•

2-Подходы ic создания) препаратов для профилактики различных болезней и лечения бальных пчтем неспециФичепкай стимуляции систены иммунитета хозяина-

_Пчтм рралиоаиии« Результаты исследований могут быть использовав для разработок: bskuwv нового поколения и создания иниуностпнчлир'-тъзих препаратоо л ля профилактики различных болезнкн и лечения больных »ивотных» а также в учебном про-U©cce при подготовке кадров ветеринарной и обшебиологической профессий.

пАпробация работа.-. Материал« диссертации доложены и обсчи-дены на научно-гсроиоводитветтх конференциях (Москва 19ВЗ» Нижний Ноэгорол 1905-I990? Новочеркасск 1907? Новосибирск-Краснообск 1937-1*/91>» на Всесоюзном съезде иммунологов <Сочи 1991Jv на V-он объединенной съезде эпидемиологов и микробиологов < Алма-Ата 1991) * на scecotoaiiDíi конференции по хроматографии о биологии и медицине (Москва 1993)? на научной конференции СНГ по биотехнологии (Таыкент 1993)« на межкафедральном заседании прс$ессоР1;ко-лретюлавательского состава Нижегородского сельскохозяйственного института СII.Новгород 1994).

Материалы диссертации опубликованы в 56 научных статьях» научных отчетах* рекомендациях» в научно-нормативной документации > авторских свидетельствах и патентах»

Внедрение«^ ^Реэчлътаты исследований в 19Q5-94 г - г • под авторским надзором внедрены с положительным эффектом в учреждениях государственной и производственной ветеринарии Российской Федерации• Подготовлены и рассмотрены на заседании Фармакологической комиссии и утверждены «Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ ТУ на изготовление и контроль препаратов "Достмм" и "Мастим" Ыо.10.07-236-91 и Na. /О, О 22.2 ~9V соответственно- Подготовлены и утверяден-i постоянные наставления по их применении» 1993-94 г-г*

..Объем работы» Работа состоит иэ введения»обзпра литературы» собственных исследований» обсуждения полученных результатов» выводов»практических предложений»списка литературы и приложений -Диссертация изложена на /4£страиииах машинописного текста»иллюстрирована 19 рисунками и »12 таблицами-Список попользованной литературы включает 234 наименований»иэ них id иностранных авторов•

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы»методы и объемы исследований« В условиях "ít* vi tro" оначителт:ная часть исследований была проведена на первич1шх культурах перятонеальиых макрофа-

гов»которые получали путем вымыраиия клеток из бркыиой полости мышей или игреки* свинок-

Для проверки иммуногенности препаратов "in vivo" обычно нспольэовали иетод экспериментального заражения зшвотных различными доэани вирулентной культуры-

В производственных условиях регистрировали случаи естественного эара«ения а эффективность иммунобиологических препаратов определяли по проценту сохранности аивотных»

Для анализа структуры антигенов применяли различные методы жидкостном хроматографии^ионообменной»гельпроникашаей* ВЭЖ/Í» тонкослойной)»биохимического аналиоа(белок»полисахариде 13) «а такке различные серологические реакции(РА »РДСК« РПГА»РБП»РШ1*РК и РИЭ)»которые ставили согласно соответству-юиим методикам-

В качестве экспериментальных моделей использовали лабораторных животных (ныши »морские свинки>»сельск:охоо54йстаен-ных(КРС»свиньи> и домашшх »шзотных<собаки и кошки)-

Все материалы обрабатывали' статистически» выводя уровень достоверкости Р-

РЕЗУЛЬТАГЬг ИССЛЕДОВАНИЙ Многие проблены конструирования иммунобиологических препаратов связаны с теня или иными значительными трудностями -Вполне возможно что этих затруднений ноьнс было бы избежать» если применить дифференцированный подход к их созданию-

Прежде всего таи» где возбудитель имеет невысокую антигенную вариабельность в пределах вида» имеет выраженные патогенные свонстаа» а болезнь протекает хронически» имеет смысл говорить о создании специФичзских иммуностимулирующих конструкций <вакцин) » создающих длительный иммунитет.

Причем для конструирования любых вакцин должны быть использованы жизненно ватные для процессов паразитирования возбудите-да фактор« патогенности-

Еольише возможности открывают перспективы испольаииаНпГ. данных факторов с определенной степенью очистки и химической кодификации» так как позволяют удалить нежелательные эффекты (реак-тогенкость» аллергиэация) и придать конструируемым препаратам необходимые свойства (усиливать синтез специфических антител, ГЗГ и г.д.).

Б случаях же с невысокой патогЕ?ниостьм» но высокой антигенной вариабельностью возбудителя или ассоциации возбудителей» а также при возмоккостл выделения в технологической животно-

водческой цепи кратковременных "периодов риска" более оправданными нежно считать применение препаратов, неспеии.Фически активируниаих клетки иммунной систем«.Лричен здесь такяе должны быть учтены патогенетические особенности болезни* так как при одних ^олегнях зч>Фсктивно усиление синтеза антител » а при других - актирпция Фагоцитов или индукция ГЗТ»

Рассматривая конкретный вариант реализации первого подхода на примере наиболее характерной модели- бруцеллеза, следует констатировать» что до настоящего времени не были определены молекулярные механизмы» позволяющие выживать бруцеллам э интакт-ном макрофаге* не установлены факторы реализующие этот эффект,

не найдены протективные анигены бруцелл и не ясны возможности создания эФФекти»ных вакцин с заданными свойствами на основе молекчл их микробной клетки*

fХарактеристика основных звеньев систенм "паразит -

riT *£>ЭЗИНи

13 данной работе рассматривали три ссноиные системы, участвующие в лорнировании иммунного ответа!

i«система гуморальных факторов сыворотки крови 2«система димфоидных клеток система фагоиитоэ Существует мнение о значительной роли гуморальных Факторов D развитии протмвофруцеллезного иммунитета - Вместе с тем имеются данные и противоположного характера - В связи с этик было очень интересно проследить возможность подавления жизнеспособности бруцелл год влиянием гуморальных факторов.

Поэтому прежде всего анализу была подвергнута система гуморальных факторов (антитела и комплемент)* В экспериментах "in vitro" установлено» что в условиях отсутствия клеточных элементов специфические бруцеллезные анитела в гип^ринмуньой емворотк» не способны реализовать эффект иитотоксичности и подавлять жизнеспособность брчиелл- Интересно» что в ответ на обработку специфическими иммуноглобулинами (а это преимущественно анти-ЛГТС-иммуноглобулинтн) бруцеллы быстро теряли полисахарндные детерминанты ЛПС и в дальнейшем с S-cwbqpotkok не реагировали- Данный Факт может объяснять Феномен,"антигенного дрейфа" и возможность появления п популяции инпунизироанных »ивотных < например» стадах КТС) бруцелл я виде Е-вариантов» а также обосновать природную целесообразность механизмов диссоциации как приспособительных» адаптивных процессов•

, Учитывав результата экспериментов» приведенных в этой работе* а такге исследования других авторов » следует сдг*л*тъ вывод о том* что специфически© имлуноглоЗулшш < г»нти-ЛПС> « в основном« выполняют функцию пиганда» окагыаая опсонг.зиру-

ышее действие- Однако их ннгибнрукыая» тем более цитотокси-ческая роль крайне невелика«

Поэтому не случайно* что титр этих иммуноглобулинов» как правило» не коррелировал с состоянием иммунной невосприимчивости животных к бруцеллезу» что обычно и подтверждалось при экспериментальном их заражении*

Касаясь системы комплемента» об активности которой судили» сравнивая бактеркцидность прогретой (систека комплемента разрушена) к непрогретой <интактной) сыворотки» то результаты экспериментов могут свидетельствовать о его способности ингибиро-вать жизнедеятельность бруцалл- По всей видимости это связано с образованием цитолитического белкового комплекса»

Изучение всего многообразия Функций» которые выполняют лимфоциты в процессе иммуногенеза* не вхадяло в поставленную задачу« Она ограничивалась изучением цитолитической киллернсй активности лимфоцитов» опосредованной через системы лимфоцитов-кал-леров» При проведении экспериментов " i n vi tro" в системе "дим-Фоцит-бруцелла" был представлей максикальбыи набор Факторов» т.е» лимфоциты не разделяли ка популяцхш» а использовали полноценный пул» С целью выявить возможности ацтителозависимого цитотсжсыческаго эффекта б систему добавляли гипериммунную сыворотку« В случае получения выраженного киллерного эффекта в отношении бруиелл рабрту планировалось продолжить для выявления наиболее активной в этом отношении субпопуляции лимфоцитов» определить механизмы ингибиции ее функций бруцедлани и т«д-

Однако в условиях п сведенных эксприиентоп не удалось установить явления достоверно выраженного киллинга в системе с лимфоцитами иммунных живстодх по отношению к контролю (тест-система с лимфоцитами интактных животных>•

Следовательно» популяция лимФоцимтов» имнутшх к бруцеллезу животных либо содержит очень небольшое количество клеток» специфически осуществляющих киллкнг бруцелл» либо кидлерный механизм сенсибилизированных лимфоцитов в отношении бруцелл мало эффективен«

Однако вполне возможно* что эту роль лимфоциты "iti vivo" реализуют не непосредственно» а опосредованно через систему других Факторов (например» активацию и перестройку макрофагов с помощью лимфокинов)- 7 ¿»к:»;;; сбрззом« на основании вышеприведенных материалов * свидетельствующих о крайне низкой киллернай активности лимфоцитов» работа с системой этих клеток не получила дальнейшего развития» а основное внимание в исследованиях было перенесено на систему Фагоцитов•

Из анализа литературных данных было известно, что макрофаги от иммунных к бруцеллезу животных значительно более эффективно

~ Э -

Фагоцитируют и лизмрумт клетки бруцелл» чем макрофаги интакт-»их» л которых возбудитель бруцеллеза может перелизать и размножаться < Бра'-где г1.Г«1963) Однако вопрос а специфичности этого npouecca ресьиа дискутабелей до.настоящего времени-

Яарактеризуггтся ля макрофаги животных просто неспецифической активацией своих Функциональных механизмов 'фактически такую неспециФическую актив ¿иию можно получить и путей внутрибрюшииного введения раствора пептона) или же этот процесс более специфичен- Поэтому в качестве мишеней для макрофагов* полученных от иммунных к бруцеллепу жиьотныэс были взяты кзк бруцеллы (специфическая ми'день) * так и St - aureus < нишень неспецкФическая) -мкроорганизмы* hp обладаюыче выраженной способность» персмсти-ровать п Фагоците, таким образом эксперимент методически был РЕЛаеи следуюьтп образом» если сам эффект неспецифичеи» то макрофаги от иммунных животных должны в равной степени интенсивно инактивиропать как клетки бруцеллч так и стафилококки, а» если специфичен1 то киллинл в отношении бруцелл должен быть более выражен- Результаты эксперинеитов свидетельствовали о больней правдоподобности второго предположения-

Таким образок« очень интересной представлялась гипотеза некоторых авторов о реализации специфической направленности макроФага за счет цитофильмых* т.е» Фиксированных на мембранах анти тел- Была предпринята попытка сорбировать через Fc -рецепторы» которые имеются на мембранах макрофагов $ специфические антитела к. бруцелдам на поверхности шггактного ttaKpov&va*. Для этого мо-чослой перитонеалъкых мвкроФагов обработали бруцеллезной гипер-иннунной сывороткой* а затем отмывали от несвязавмихся иммуноглобулинов«

Результаты эксперимента ре позволили сделать вывода о подобном механизме Формирования "иммунных" макрофагов» Возможно в условиях "in vitro" методически не было полноценно учтено воз-дествие каких-то иных Факторов * участивших в процессе формирования "иммунного" макрофага ( Т-лил^оцитов»•например)% а* возможно! этот Фгнонен опосредуется через какой-то друтоц, механизм < экспрессия других рецепторов « изменение» внутриклеточного метаболизма и др.).

Так или иначе* но разгадка тайны Формирования таких фагоцитов в организме иммумиэирооанныг животных могла бы пролить свет на многие аспекты Формирования иммунной невосприимчивости*

Анализируя предыдущий материал» становится очевидным ^акт интенсивного киллинга бруцелд Фагоцитами иммунных животных и подавления этгго процесса в интактных Фагоцитах-

Каким net образом происходит это подавление киллерных свойств фагоцитов? Как бруиеллам удается избегать киллинга* жить и раз-

множаться внутри Фагоцита?

Нарушение брццеллаии Фагоцитарного киллинга.

Для ответа на эти вопросы было решено отдельно исследовать основные механизмы киллшгга (респираторный взрыв, секреторную дегрануляцию и фаголизосомальное слияние) в условиях "in vitro"« а также некоторые молекулярные механизмы функциональной регуляции макрофагов• В качестве миыеин были выбраны клетки высоковирулентного штампа Вп» abortrus 54 (т-е. та мтаень» которая ингибнрует киллинг)V а в качестве контроля клетки того же штамма* но убитые быстрым нагревание»> Достоверные различия при проявлении активности s том пли ином тесте доданы были свидетельствовать об изменении этого процесс« (икгибяции киллерной системы) под влиянием живых бруцелл вирулентного итапна-

При изучении процессов респираторного взрыва путеп регистрации в НСТ-тесте су п © рок: смдн dt о аниона < продукта»;образующегося в результате этого процесса) не было отлечено каких-либо различий между тест-системами с вивыми или убитыми клетками Вт-abortus 54« To-есть деятельность бруцелд вирулентного штамма существенно не влияет на механизмы окоилительного кидлщп-а» Вполне естественно предположить» что не этот процесс лежит в основе подавления визнедеятлъности бруцедд» тен более« что бру-целлы выдерживают довольно значительную концентрации перекиси <ü*0iji)f т-е» условия» индуцируемые проявлением респираторного взрыва» не являются дл&. них губительными-

Возможно эта особенность бруцелл связана с их номнын катадлазкым "вооружением" <катадасза разлагает Н;)» которая и зашивает бруцедлы от токсического действия перекиси- Ряд авторов даае связывал уровень содержания каталазы в микробной клетке бругцелл с ее вирулентность».

Однако » как известно» наибольший бактерицидный эффект достигается при воздействии на микроб не только активных Форм кислорода* но и ферментов и галогенов, содержащихся в лизо-сонах макрофагов* специфических и азурофильных гранулах нейтрофилов• Поэтому следующим этапом было определение активности секреторной дегрануляции как процесса* характеризующего доставку лизосои к песту конте*н.-га $агсцг:та и ниыени-

Вот именно при реализации этого механизма и были отмечены интересные факты• Установлено» что при контакте и фагоцитозе живых бруцелл вирулентного штамма перитонеальпыми макрофагами процессы секреторной дегptut'jляции в пероые же часы резко блокируются » то-есть нарушается процесс доставки Ферментов и галогенов для создания »dwjihx бактррициднызс систем в месте контак-

та» Подтверждение положения о нарушениях живыми бруцеллами процесса доставки содержимого лиэосом к месту локализации возбудителя мы находим и в механизмах фаголизосомального слияния- При люминисцентном микроскопировании окрашенных препаратов можно было наблюдать i что лиэосомы н акрофагсв » Фаг* оцитиров а вы их живые илетки Br». abortus 54» преимущественно располагались в виде скоплении и были удалены от Фагосон* Это может свидетельствовать о затруднении актсп фаголизосомального слияния при фагоцитозе живых бруцелл вирулентных ытгнмоэ-

Таким образом t при Фагоцитозе возбудителя бруцеллеза резко нарушаются механизмы секреторной дегрануляцни и Фаголизосомального слияния« обеспечивающие доставку к месту локализации объекта Фагоцитоза ферментов и галогенов« В результате ннгибиции этих процессов сдерживается образование мойных бактерицидных систем» что и позволяет бруаеллам сохранять свои жизнеспособность при контакте» а так^е внутри фагоцита.

Однако что же лежит в основе этой ингибиции? Каковы молекулярные механизмы» прииодяиие к вышеописанному эффекту?

На настоящий момент наиболее изучена и вызывает все возрастающий интерес исследователей Функция циклических нукдеотидов (ц.ДМФ и ц-ГМф)« Этим двум субстанциям приписывают многообразные« но преимущественно противоположные функции* что и позволяет йм» изменяя свою концентрацию, локально влиять на активность различных клеток. Действие циклических нукдеотидов на макрофаги начали изучать сравнительно недавно« нет четкой ясности в их влиянии на Функциональные особенности Фагоцитоз * однако« известно» что накопление больших количеств ц-АМФ тормозит киллерные способности макрофагов в отношении некоторых микроорганизмов*

В данном случае также интересно было исследовать количественные показатели ц-AMtp при Фагоцитозе вирулентной живой и убитой культуры бруцелл- Опыты ставили как в условиях "in vivo"« так и в условиях "in vitro"- В результате экспериментов "in vitro" в динамике было установлено» что в тест-системе с гиги-ми бруцеллаии концентрация ц-АМФ увеличивается как бы в два приема* Этот показатель резко увеличивается в начальные сроки Фагоцитоза» но уже через 2-3 часа стремится к норме» Можно предположить» что макрофаг в это время стремится Физиологически сбалансировать» нормализовать содержание ц.АИФ за очет каких-то внутренних ресурсов» однако« через 4« 5 и тек болрв 6 часов от начала фагоцитоза содержание этого нукдеида онохзь возрастает« что- в конечном итоге может привести к гибели клэтии- Кратковременное и не.шачительное увеличение содержания ц-АМФ в тест-си-стене о убитыми бруцеллаии является отражением известного Физиологического процесса» связанного с актом поглощения <Маянс-

КИЙА-Д.19В4)

Так как эксперименты "in vi tr-o" могут недостаточно верно моделировать процессы» происходящие в живом организме» был постав-леи экспримент "in vivo"» где мышей заражали вирулентной культурой бруцалл? а затем через 25 дней после заражения исследовали соотношение «-ГМР / в перигонэальных макрофагах* Часть мыиейг оставляли: интактнымиу и их перитонеальные макрофаги служили контролем» В результате было установлено» что концентрация ц.АМф в "зараженных" накроФагах увеличивается по сравнению с этим показателем у интакгяых клеток почти в 4 раза* а содержание ц.ГМФ в то же время снижается более чем в два раза-То-есть накроФагм заравенных животных имеют резко сниженный «ю В раз) показатель ц-ГИФ / и-ДМ<Р в этот период - период генерализованной инфекции»

Следовательно» живые бруцеллы вирулентных ытаиков обладают слособноотьи изменять соотношение циклических иук-леотидов» существенна снижая показатель ц.ГМФ/ц-АМф» Именно этот механизм может лежать в основе подавления процессов секреторной дегрануляции и Фаголизосомального слияния» та!с как иизкий показатель нарушает сократительную

способность микроФиламентовt а также движение лизосок из аппарата Гсльдяи- Все это» в конечном итоге подавляет кид-лерные Функции Фагоцитов» в результате чего Фагоцитированные бруцелды гюгут,оставаться живыми внутри фагоцитов -

Тем не менее сами бруцеллы при Фагоцитозе должны были оказывать какое-то материальное воздействие на фагоцит» включаи-Ъ1Ки механизмы ингнбицига его киллерных способностей. Следовательно нужно было искать какой-то материальный Фактор» проду-иируемый бруцеллани» который» по всей видимости» образуется только гшвынк клетками» о чем свидетельствуют эксперименты с живыми и убитыми мишенями при ингибиции секреторной деграну-лации к Фаголкзосомального слияния*

Исходя из теоретических посылок» возникало предположение» что данный фактор должен был продуцироваться при контакте бру- • целл с макрофагом к дальнейшем развитии процессов респираторного взрыва» т.е- при воздействии на клетку возбудителя активных Форм кислорода и других токсических продуктов- В противном случае икгибиции киллерных систем не произошло бы.

Поэтому в условиях *'in vit-ro" была предпринята попытка смоделировать для живых клеток бруцелл условия» в которых они оказывает с а при контакте с Фагоцитам и в процессе Фагоцитоза- Для этого была сконструирована питательная среда» содержащая все необходимое для поддержания нормальной жизнедеятельности бруцелл» куда были добавлены токсические продукты в предварительно оттитрованных концентрациях. lía до отметить, что рост

и накопление биомассы бруцелл в такой среде резко подавлялось» но тем не менее? »оэ^члитель брчинллмгза сохранял coast» жизнеспособность в условиях термостата < "37 С) в течение 3-5 суток (срок наблюдения>• То-естъ в такой "стрессируннией" среде возбудитель был способен длительно персистировать•

Фактор« который должен был оказывать воздействие на макрофаги« должен быть легко секретируемым мл» легко смываемым во внеыенмн среду с поверхности бруцелл о тем» чтобы воздействовать на Фагоцит« Нортону макроФагингибируюиий Фактор пытались выделить прежде всего из культуральнои среды« Тем более« что используемая среда была стандартной» синтетической« имела известный состав« не содержала белков и полисахаридов« что и позволяло сразу обнаружить появившиеся новые компоненты. В результате инкубации возбудителя бруцеллеза в такой "стрессирунпдей" среде удалось выделить ряд компонентов« названных экзоцеллзоляр-ным антигеном OA)« структура которого рассмотрена ниже- О его составе особое внимание привлекал пизкомолекуляриый компонент ( НК)* который обладал определенными свойствами макрофаготокси-на• Под его влиянием снижалась киллерная способность макрофагов в отношении St• aureus и Br- abortus 19« Однако интересно« что добавление НК в тест-систему с вирулентным штампом Br- abortus не выявило достоверных различий в показателе жизнеспособности по сравнению с контролем* Данный Факт может быть связан с тем« что вирулентный штамм бруцелл сам продуцирцет НК в количествах« достаточных для подавления киллермых способностей макрофага. ИК при добавленном в тест-систему макрофагов с убитыми клетками Br* abortus 54 вызывал эффект шггибиции секреторной дегрануля-ции« сходный с аналогичным эффектом« воэннкаодим з результате воздействия на Фагоциты живого итамма Br- abortus 54« Сходные эффекты наблюдали и при Фаголиэосомальном слиянии«

Смеете с тем макрофаги от иммунных животных былм способны противостоять токсическому воздействию НК- Следо-вательно*этот компонент можно рассматривать как материальный носитель Функции бруцелл» подавлйКииЛ ккдлерныв cnb-собности фагоцитов« что» на'наш взгляд» и лежит в основе« т.е. является первоначальным эвеном всего патогенетического процесса-

Таким образом« анализируя полученные о данном работе Результаты* можно гипотетически предположить следун^кй механизм взаимодействия бруцелл и Фагоцитов» в результате которрго и проявляется Феномен внутримакроФагальнсй переметенцми бруцелл.'

При контакте возбудителя Бруцеллеза с фагоцитом и.дальнейшем Фаго'дитозе последний реализует каскад ферментативных реакцйй респираторного оэгыва» в результате которого образуются активные формы кислорода* Однако наличие'-целого ряда ферментов* й '

Прежде всего каталасзы» заадииает микробную клетку бруцелл от токсического воздействия перекиси н других кислородных радикалов - Одновременно возбудитель бруцеллеза вырабатывает н искомо лекулярныи макрофаготок.син* который воздействует на смете-* му циклаз» приводя в конечном итоге к внутрмфагоцитарному накоплен*» ц.АИф« Накопление этого регулятора приводит к резкой ингибиции секреторной дегрануляции и других процессов цитопа-тогенного действия Фагоцита-

Фагоцитированы© клетки бруцелл или агрегаты их клеток находятся в Фагосомах» где не образуется мойных, бактерицидных систем и Фактически созданы условия для жнсзнедеятельностк бактерий- По всей видимости образование активных форм кислорода продолжается м в Фагосоме* что должно несколько сдерживать активное размножение бруцелл в первое -время- Б дальнейшем же происходит полное истощение ресурсов, а затем и ингибиция функций Фагоцитов* возбудитель при этом интенсивно размножается« а Фагоцит лизнруется * *

В случао же Формирования "нмяунных" макрофагов подавления киллерных функции но происходит« так как такой макрофаг приобретает какме-то системы* блокирующие пакрофаготоксические функции низконолекулярного компонента бруцелл- В результате в.полной мере образуются все необходимые бактерицидные системы (фер-, менты активные?' Формы кислорода - галогены) , которые» воздействуя на бруцедд* очень быстро их убивают- Думае тся» что именно такой механизм создает невосприимчивость иммунных животных к экспериментальному йли естественному зарааению бруцеллезам*

Изыскание'протективных антигенов бруцелл

Изучение процессов патогенеза и формирования иммунной невос-.приимчнвоотн интересно не только в теоретическом* но, прежде всего» в прикладном 'аспекте * при конструировании вакцинных препаратов*

Работа была начата со скрининга наиболее нммчногенных антигенов« определения их локализации в структурах микробной клетки и выбора технологических методов для их изоляции» Причем выбор антигенов проводили среди клеток» находящихся на различной стадии диссоциации» т-е. как среди Б~»так и среди Р-вариантов бручелл-

Анализ дитературк свидетельствовал о том, что протективные компоненты обнаруживали у бруцелл как в ^поверхностных структурах» так и в средних слоях микробной клетки (ПиЬгаз М-1979) Кроме того, известны случаи изоляции протективкых Факторов из глубинных структур. Вср нто побуди ло начать раГГотч . с мзоаяции .^итигенол '»и "ргизли^ны* слоегэ микробной клр гки» са именно* с повг?рхнссти имкробигэй картхн ( ) * п^-итмдл-глкклнанегм Фракции, Го, л с с- гиу-

*:инннх антиггноо ( солпоой антиген) » а такжи внчтретглеточных ан-ТМГРИОО <фракция риСо^ом)»

При па лучении антигенных тр акции определяли серопозитио иуи» и протективнун» их активность «причем протектипную активность определяли как в отношении Б-? тан и п отношении П-вариантов бру-целл* Предложенная конструкция экспериментов имела своей целью дать ответ сразу на несколько «опросов:

1) Определить структуры микробной клетки« в которых преимУо}ест-веио локализованы лротективные субстанции.

2) Выяснить возможности индукции антигенными комплексами« выделенными из 5-вариаитов бруцелл» заижты при оаравении Р-вариан-танм и наоборот« т.е. имеется ли перекрест протективных свойств между 5- и Р-вариамтанн бруиелл-

3) Определить стадию диссоциации» в которой должна находиться микробная клетка» продуцирующая наиболее эффективные протектяп-иые компоненты.

4) Определить наличие в • антигенных комплексах * полученных из

и й-форн бруиелл, обшнх антигенов» я также возможность индукции серологически* перекрестов между этики комплексами у подопытных животных» что позволило бы оценить их значение в процессе формирования иммунной невоспниипчисостн»

Анализ обиих антигенов о составе комплексов» проводимый с поноем реакции кольцепреципитации и двойной иммунодиффузи^ а геле» позволил установить * что антигены» выделенные из в-фори« реагировали только, с З-сыворотками> а антигены из Р-Форм - только с П-сыворотками'« каких-либо перекрестных реакций не наблюдалось ■

В первой эксперименте» где заражение проводили Вг• 713

(возбудитель находился в П-фаэе) * отметили» что наиболее имму-. ногекмып перпаратон оказался СПК» изолированный с поверхностных структур З-клеток бруцелл» При это» антигенный комплекс БПК не вызывал синтеза антител» улавливаемых и реакциях с Т?-диагкости-кунол. Таким образом в этих экспериментах не обнаруживался серологический перекрест меяду «антигенами из 5- я Я-вариантов бру-целл» хотп тдкой перекрест э, протект'ивном отношении был налицо.

Г. другом эксперимент© заражение животных проводили с пома-иьи возбудителя» находящегося в гладкой <5-) Фазе- В данном опыте наиболее эффективны» также оказался БПК« Антител» улавливаемых Р-диагностикунаяи« з группах» иммунизированных антигенами из ¿-форм» также не обнаружено- То-ость рорологичзекмх перекрестов нет« . .

Зоплужипакмин внимания представляется и тот ф«»кт» что титр антител у экспериментальных жяэопшх как к I?-» т£к и к Я-антигенан не.коррелировал с состоянием, специфической устойчивости к зараърииго, и аиво?»п.к>» «м»10ми<?* нноокин титр антител»

ногли зарадаться. а низкий - могли противостоять заражении.

Суннирма результаты этих опытов« нокмо сфорнчлиров&тъ следу — инии© положения?

1) Существует перекрест протективного эффекта у антигенов* изолированных из 5- или Е-вариантов бруцелл.

2) Протектиэные антигены бруцелл локализуются в поверхностных структурах клеточной стенки бруцелл.

3) Антигенные комплексы, выделенные из и Б-вариантов, содержат в своем составе идентичные или очень близкие по стрктуре протектнвные антигены <протективный перекрест), причем в антигенах иэ Б-ФОРМ бруцелл они находятся в более активной Форме иди в большем количестве*

4) Все анатигены их З-форн» так же как и антигены из В-форн^ содержат в своей составе общие компоненты (видимо 5-АПС и И-АПС>« который вызывает синтез Б-или В-антител*

5) Антигены« не индуцирующие синтеза антител к В-антигенам

<ВПК из 5-кдеток>« теп не менее защищают от экспериментального заражения 13-Формани бруцелл« Следовательно факт активного участия специфических антител в формировании иммунной невосприимчивости к бруцеллезу очень сомнителен- Это подтверждается и отсутствием корреляции между титром антител и состоянием иммунной невосприимчивости животных * которое устанавливается с помомью экспериментального заражения.

В дальнейшем поиск наиболее эффективных протективных антигенов перешел от позиций структурной к позициям Функциональной направленности- Базируясь на положении о том« что иммунная невосприимчивость к инфекционной болезни возникает лииь при синтезе 8 организме хозяина компонентов« специфически или неспецифически блокирующих активность патогенных факторов возбудителя « была предпринята попытка попользовать в качестве протективной субстанции - экзоцеллюлярный антиген (ЭА> бруцелл <методические подходы к его получении описаны выше). Теоретически предполагалось « что возбудитель бруцеллеза в "стрессируюмих" условиях начнет продуцировать фактор« помогающий ему сохранять свою жизнеспособность в макрофаге, а иммунологическая нейтрализация этого Фактора привадит при экспериментальном заражении к потере возбудителен возможности защищаться от воздействия киллерных систем иммунитета- При проверке протективных свойств ЭА на модели морских свинок оказалось« что ЭА обладал хорошими протективны-ми качествами« особенно в дозе 0*4 мг, значительно превосходя по этому показатели) РПК- Это свойство характеризовало его как весьма перспективный препарат- Кроме этого при иммунизации ЭА индуцировал синтез антител« регистрируемых в РА» т•е « содержал1 ' по"всей видимости* структуры ЛЛС-

- 17 *

Изучение стрчктчрных и функциональных особенностей экзоцеллюлярного ачтигена<ЭА) бруцелл.

В дальнейшем была поставлена задача анализа структуры ЭЛ и, нозпоща, его дальнейшей очистки- В данной случае« исхода из предыдущих экспериментов, свидетельствующих об отсутствии корреляции между протектииным -^-фи-ктом и титром специфических антител» ставилась задача получения профилактического препарата« лишенного способности индуцировать анатитела, злтрчдияюиие диагностику бруцеллеза» т.е. создания вакцины без серопоэитивно-сти. Эта задача не представлялась невыполнимой, так как известно, что серопоэитмвностъ преимущественно связана с ЛПС и« следовательно» удалив ЛПС» кы удалим и способность препарата к св-ропоэитивности, которая выявляется в общепринятых тестах на бруцеллез (РА, РСК, РБП и т.д.). Представлялось интересный проверить это предположение и в отониении антигенов-индукторов ГЭТ, тем более, что в предыдчиих экспериментах с БПК не удалась ответить корреляции между протективньт эффектом и пробой Бмрне V морских свинок- Некоторые исследователи роль субстанций» вызывающих ГЗТ, отводят белкам глубинных структур, имеюыии молекулярный вес от 40 до 100 килодальтон. Следовательно, очистив антигенный комплекс от белков с такими свойствами, иояно полччить профилактический препарат! лишенный аллергизируюших свойств, улавливаемых во внутрихожнои тесте с бруцеллином.

Таким образом» перечисленные задачи я перспектив« обусловливали и выбор методов очистки и разделения» Наиболее перспективными в данном случае являлись методы жидкостной хроматографии.

Вначале был опробован для разделения метод ионообменной хроматографии- Это наиболее технологичный прием, м в случае успеха с его помощь» можно было бы нарабатывать значительные количества очищенного антигена. В настоящее время рядом зарубежных Фирм (например, ЦКВ) выпускаются промышленные установки и сорбенты для ионообменной хроматографии. В результате этой работп удалось разделить ЭА на ряд компонентов, иесумих различный заряд.

Однако выделять из них наиболее перспективный компонент не представлялось возможным, так как инмуногениость всех фракций была сравнительно одинаковой. Кроме того, во всех фракциях содержались антигены, вызывающие сиетеэ антител, регистрируемых в РА, РСК и РБП-

Фактически аналогичные результаты были получены на разных ионообменных сорбентах <ДЁАЕ-целлюлоэе и силожроне С-80), что свидетельствует а топ, что ЭА неоднороден по составу и состоит из-неешмьких компонентов различного заряда. Протективкые»

и сероиппитионые антигены таки«? содержатся в составе нескольких пиков» Исходя но этого,.и окно сделать предположение2 либо про-тективных компонентов несколько и « инея различную фияико-хиии-ческ*ло структуру, они элюируются при хроматографии соотсртст-пенно в разных пиках* либо С что более вероятно) выходят с различных пиках в результате комилексирования п другими балластными компонентами•

Однако так или иначе данный метод не позооля.1 реыить пост а и -ленные задачи, и в дальнейшем был использован,метод высокоэффективной хроматографии высокого .давления и г гль проникагсиь'и хроматографии . Эти методы, основанные на раэде?Л«>нии веществ на основе их молекулярной массы, позволили раал€»лить ЭА на два осно-вных компонента - высокомолекулярным пик с молекулярной массой . более ВО килодальтон, содоржаше'й ЛПС« белки и полисахариды, и низкомолекулярпый пик» содержат^* гликопротеины с молекулярнпй массой 1-В килодальтон* Было очевидным, что низкомолокчлчуный пик не может содержать полисахарида ЛПС, вызыЬошыего сиитгэ антител и белков, вызываниях ал.лергизируч-уий эффект , так »а»к молекулярная масса ЛПС и сенсибилиэируюыих белков на.* Рирдст ниве 40 килодальтон* Это наило свое подтверждение -о экспериментах "m vivo" на морских свинках.

Введение ПК не вызывало у них выработки антител, регистрируемых в РА, тогда как высокомолекулярный пик» наоборот* индуцировал синтез антител * То есть даннмй приря пг»оголял отделить антигенные компоненты, вызывавшие се?Ропос*и-тивиость и а ллергизиpywvjик эффект » А какова протектннная активность полученных компонентов? Опыты с экспериментальный заражением иммунизированных животных показали* что низкомолекулярный компонент КК является наиболее ммнуно-генным компонентом ЭА, существенно превосходя по этому показатели ВПК- Следовательно* протектмвную функцию при бру-целлезе могут выполнять низкомолекулярные компоненты бруцелл.

Таким образом* с помошыо метода разделения ЭА по молекулярной массе удалось выделить наиболее перспективный компонент для создания профилактического препарата, который * обладая выраженный протглстиаиым эффектом, ие вызивал у иммунизированных жмпотных синтеза антител, регистрируемых в общепринятых тестах на бруцеллез•

Для анализа состава ИК использовали принцип разл«лр»»ий ком -пине-НТО« ПК по их э ле-к-трофорегнчечжой подни*ности при тппкиолпй -ной хроматографии - Г; поиошыо различных эдшируюадих растворов» m состава НК изилирогали. 1 1 компонентов, протектмвиля «»кч ивность к отогну mit: лрйоваиа на иод «.»ли морских свинок ♦ Л.» н н a sí рлбо-

та имела своей целью попытаться выделить протективный компонент в чистом виде для анализа его молекулярного строения» Однако результаты эксперимента свидетельствовали о том» что все изолированна компоненты обладали сравнительно одинаковой иммуноген-ностъх». Сльмов.стельно» лийо протективных компонентов несколько» либо исследчелые компоненты представлямт собой незначительно измененные молекулы одного и того ,*е вещества» либо протективный компонент очень низконолекулярен и имеет выраженные сорбционные свойства. Сорбируясь на различных веществах той или иной природы» он придает им и протективные качества-

Подходы к создании» эффективной противобруцеллезной ьакпины»

Сделав выбор в отношении специфического компонента» все последующее внимание при конструировании профилактического препарата было сконцентрироаано на выборе второго компонента создаваекой вакцины - вещества» неспецифически усиливающего имнуногенные свойства препарата. Необходимость испоиьиепния неспецифического иммуностимулирующего компонента \з состав о профилактического препарата была обусловлена рациональностью использования этих субстанций совместно с неживыми компонентами микроорганизмов•

Для этой цели был прсшеден широкий скрининг препаратов различного происхождения« структуры и механизмов воздействия на иммунную систему - Исследовались также разнообразные конструктивные формы профилактических препаратов» включающих и простую смесь иммуностимулирующих и специфических компонентов и их ко-валентное соединение и цреобразоваение в виде нерастворимой суспензии и эмульсии (вода в масле).

Серия экспериментов была проведена с использованием синтетического полимера поливинилпкрролидона (ПВП)« Было известно» что этот карбоцепной полимер нетоксичен» не является дорогостоящим и выпускается отечественной промышленностью• Проведенные эксперименты показали» что ПВП дане в crtecu усиливает иммуно-г«*ниме свойства бруцеллезн^х антигенов < БПК)• При этом полимер г^ольш»;й молен, у лирной массы атимулировал и эффект боль tas» продолжительности- По всей видимости» продолжительная стимуляция обусловлена пре«де всьго длительны» сохранение« ПВП (а с ним и бруцеллезных протективных антигенов) в организме.

П другой серии опытов изучали нммуносплпнулирукыие свойства» в отношении бруцеллезных антигенов, инмунрмодулятЬров природного происхождения - Пыли подобраны наиболее активные препараты и'-i числа известных по научной литературе« Причем одним из важ-ц|.->йших условий при выборе было активирующее поэдействие препа-/лн<> плкроФага/.ыше звено« Эти свойства исследуемых иимуно-

модуляторов были известны как ио литературы* так и из проведенного эксперимента "i»» vi tro" * где активацию макрофаг а учитывали по активности лизосомного аппарата.

Результаты экспериментов в условиях ''in vivo" на модели морских свинок показали, что наиболее высокими иммуностимулирующими свойствами в отношении бруцеллезных антигенов обладают лева-мизол и дрожжевой полисахарид-

В следующем опыте мзучали эффективность традиционных ад*ъю-вантов - водно-масляной эмульсии и гмдрооксида алюминия- Водно-масляные эмульсии успешно используются французскими фирмами для повышения иммунности бруцеллезных вакцин- Однако, несмотря на сильном местную реактогенность этих' ад-ъюванто»» добиться высокой стимуляции иммунного ответа не удалось- Небольшая тенденция к усилении, импуиогенности проявлялась в группе с водно-масляной эмульсией-

Учитывая хорошие результаты иммуностимулирующей активности ПВП-700, была предпринята попытка усилить этот эффект аа счет ковалентного присоединения ВПК к полимерному носители- Надо отметитьv что теоретические подходы к созданию иммунизирующих препаратов« основанные на конъюгации микробных антигенов и синтетических полимеров» в это время были разработаны Патроним I' - Б -и Хаитооым Р-М-

В данном случае поливикилпирролидои не имел реакционно-способных групп* и поэтому во ВНИИТИ кровезаменителей и гормональных препаратов провели активацию этого полимера (появление (СООН-групп) и осуществили конъюгацию антигена и полимера- Для анализа эффективности конъюгации был отработан метод контроля с помошыо гельфильтрации на колонке с сефадексом С-100. .

Результаты проведенного опита свидетельствовали о высокой протективиой активности такого кочнюгата, который превосходил по этому показателю механическую смесь исходных компонентов•

Таким образом* анализируя результаты скрининга иммуиостимч-лируямцмх компонентов к конструктивных Форм« в которых они наиболее эффективно работают« сделали выгод* что на настоящем этапе наиболее приемлемым для создания протиэобруиеллезных профи -лактмческих препаратов будет использование ко»г*н>гатов бруцеллезного антигена и иммуностимулирующих синтетических полимеров-

В дальнейшем для конструирования бруцеллезной искусственной вакцины в качестве иммуностимулирующего носителя использовали разрабатываемые в Институте иммунологии МЭ РФ полимеры мГра-деке"» "Лолмоксидоний"» а также сополимер винилпирролидина и акриловой кислоты- Синтез препаратов приводился группой синтез* Института иммунологии МЗ Рф- Контроль конъюгации,- проводиный также с попоить« методов гедьФйльтрации и биохимических методов (определение Сахаров)« показал« что основная масса антигена <дс>

965Í) вступает в реакцию- В данном случае в качестве специфического компонента нсполиэочалн ууе КК как более перспективный и иммунсгенный- Предварительно перед конъюгацией» в тесте с ТНБС» в составе НИ вило определено наличие реакционно-способных НИ групп- Именно благодаря э^им группам и проводили конъюгацию с полимерным носителем-

Полученные таким образом вакцинные препараты исследовали на способность заиишатъ от заражения ёруцеллапи» находящимися на различных стадиях диссоциации-

На модели морских свинок было установлено« что полученные контлогаты создавали у животных невосприимчивость к заражению возбудителен бруцеллеза« находящимся как в S-» так п в Е-Фазе-Причем нммуногенность кон*ьюгата прев осходила имм^ногенность чистого 1ÍK-

Что касается серопозитивних свойств конъкгировьтодх препаратов 9 то» как и следовало ожидать» ни. отмечено ни в один из срезков исследования появления в поствакцинальный период положительных реакций в РК» РДСК* РБП, РПГА.

С целью использования ewe одного методического приема для повышения иинуногеникости препарата исследовали возможности двукратной ммиуаизацми- Проведенные эксперименты свидетельствовал» а ^эффективности использования второй инъекции в раннее сроки» тогда ¡tax повторная Иммунизация через 30 дней усиливала остойчивость к заракекжо*

Следовательно в качестве наиболее перспективного профилактического препарата можно использовать кониюгат IIK с синтетическими полимерами <напримерч "Градексом">» которым следует иммунизировать животных дважды» черео месяц после первой инъекций- Такой конъюгат был.назван бруцеллезной искусственной вак-щшой. (£ЦВ>- Представляло определенный интерес сравнить имиу-ногенность такого препарата о наиболее эффективными профилактическими препаратами» используемыми у нас в стране и за рубежом*

С этой цель»» в аналогичных: условиях одного эксперимента» на модели морских свинок исследовали иммуногенные свойства ВИВ* пивом вакцины из ьзтанма 19» «ивой вакцины мэ ытимиа 82 и убитой корпускулярной вакцины из штамма 45/20 (Abortox - <2>раицмя>*

В результате опыта» продолжавшегося почти полгода* установлено» что при двукратной 'иммунизации Б*Ш не уступает по своим иммуногенным свойства» санын эффективным бруцеллезам в «годинам и к тому **е не вызывает синтеза • антител* затруднямыи^ диагное--тику бруцеллеза у больных» а'такше не индуцирует реакций Г37, улавливаемых в кожно-сексибилизируюшем тесте о бруцеллинои-

Однако использование в качестве лабораторное* модели норсмях спинок не давало полных гарантий» что предполагаемый препарат

будет иммуногенен и на сельскохозяйственных животных« например, крупном рогатом скоте*

Для проверки этого был поставлен эксперимент на молодняке крупного рогатого скота и взрослом поголовье, причем для того* чтобы определить оптимальную иимунизирукшую дозу БИВ, животных иммунизировали различными дозами вакцины* В результате этого опыта установили* что ВИВ ъ дозах 7 и 10 кг создает достаточную невосприимчивость к оарааению как у молодняка, так и у взрослых яивотных(100%). Синтеза антител в ответ на иммунизацию БИВ не происходило, о чем свидетельствовали отрицательные РА« PCfC м РБП-

Сладовательно, такой профилактический препарат« как БИВ, может быть использован в качестве профилактического средства и для крупного рогатого скота* Отсутствие же у него серопозитмэ-ных оиоиств не затрудняет диагностики больных бруцеллезом в стадах, вакцинированных ВДВ* А это позволяет в течение всего поит-вакцинального периода диагностировать и удалять источник заражения - больных бруцеллезом животных* Кроме того« отсутствие серопозитивных и аллергиэирУюиих свойств позволяет "подстегивать" иммунитет« т.е* многократно ревакцинировать при'падении напряженности иммунитета- В обадем, БИС и подобные ей препараты могут быть успешно вписаны о различные схемы противоэпмзоотиче-ских ьероприятий« которые в конечном итоге и определяют на по-пулиционном уровне борьбу с бруцеллезом-

Оанлко при многократных ревакцинациях возможны какие-либо тканевые патологии, определяемые только с помошью гистологических методов- Поэтому морским свинкам шестикратно вводили БИВ с интервалом в 21 день (усиленная антигенная нагрузка была преднамеренной)- Через 5 месяцев после начала иммунизации животных убивали, а с их паренхиматозных органов и лимфоузлов делали ги-стосрезы* которые затем исследовали под световым микроскопом• Полученные материалы свидетельствовали о том, что многократные введения антигена даже при яьной антигенной перегрузке вызывают лиыь доброкачественные пролиферативные изменения- Некротических и воспалительных реакций ив обнаружено- Кроме того« проведенный анализ аллергизируодих свойств БИБ не выявил положи* тельных результатов в кожно-сенсибилизирумщем тесте- Не появилось и положительных серологических реакций в РА, РСК, РБП даже после 6 инъекций-

Исходи из вышемзложенн^о можно считать» что явных противопоказаний для ревакцинации этим препаратом - нет- -

Таким образом, анализируя особенности патогенеза« предложен принцип получения специфического компонента и сконструирован Ш'Г/филакгмческий лротмвобруиеллезный препарат» который оаыишает жииотщах от заражения бруцеллезом не? хуже« чем самые Эффектив-

ные вакцины» и при этой он полностью лишен их недостатков* Этот препарат (или другие препараты на основе НК> имеет1 большие перспективы при условии гармоничного использования в системе проти-воэпизоатических мероприятий•

Использование аналогичных подходов для создания профилактических препаратор против других инфекций сопровождающихся Феноменом внутрифагоцитарного персистирования

В качестве модели был использован штамм 5» 1;урЬ1гоиг1Шп 415* так «сак известно» что сальмонеллы этого гида обладают способность» выбивать в макрофаге» В нетодическок аспекте работа по изоляции протективных компонентов принципиально не отличалась от такой ве работы с клетками бруцелл* а хроматографический профиль экзоцеллюдярного антигена сальмонелл на сефадексе с-100 несколько даже напоминал ЭА бруцелл.

Испытание протективных свойств садьмонеллезкого ЭА выявило его высокую активность в отношении зараваншега штамма- аналогичного вида* Получить не защиту от заражения штаммом другого вида не удалось» что свидетельствует о специфичности эффекта ЭА сальмонелл.

Можно думать* что предложенный принцип создания специфических кяиуноактивных соединений будет успешный и при других инфекционных болезнях» сопровождающихся внутриФагсцитарныи персистирова-ниен.

, Разработка неспецифических иммуностимуляторов-второе., направление иммунологической защиты-л

Второй представленный нами подход к создан»» препаратов» позволяющих защищать животных от инфекционных заболеваний»•может быть применен только в отношении возбудителей« не обладаниях высокой патогениостью. Зато с их яомовдьм и » довольно сжатые сроки можно защитить организм от возбудителей» обладающих широкой антигенной вариабельностью* или даже от иелых ассоциаций микроорганизмов. Речь идет о поликлональной стимуляции иммунитета с поношьм вегиеста, получивших название неспецифических им— муномодудяторов• , '

Этот подход также имеет свои особенности, которые связаны, как с механизмом их Фармакологического действия» так к с временем их использования в технологической цепочке различных яи-, вотноводческих систем. Это связано с тем» что препарат, стину-лирунклий имнунитет, нельзя применять в течение значительного периода» иначе можно получить противоположный» отрицательный эффект- Поэтому стимуляции иммунного статуса должна проводиться га периоды наибольиега риска возникновения болезни» а имен-

но: ранним постиатальный периол у молодтжа» в период» технологического стресса <перегоны» перевозки» отъем) и последующий за этим период контакта с ноеой микрофлорой- Стимуляцию можно проводить и в период уже развившейся болезни с целы« коррекции защитных сил органиэма-

Не ненее важное значение имеют и особенности механизмов действия иммуностимулирующих Факторов- Например* для молодняка« учитывая его несовершенную специфическую лимфоидну» систему* очень актуальны были бы стимуляторы» воздействующие на макро-Фагальну» систему иммунитета* так как в ранний постиатальный , период основная зашита организма базируется на неспецифических реакциях фагоцитов» А'функции Т- и "Б-лимфоцитов будут активи-роватъсп по мере созревания оргаъизма» значительно позтке. Следовательно* для активной поддержки защитных сил организма» препятствующих развитии* болезней хотя бы в первые дни жизни <а ииечно они являются критическими)« необходим препарат» ннжна активирующий систему Фагоцитов-

С другой стороны* в иммуногенезе многих инфекционных заболеваний существенную роль игра»? антитела» которые способны блоки ропать и тем самым обезвреживать вирусы* токсины» продукты распада и т-д. Важны и клетки-киллеры* индукторы ГЗТ и др.

Нами разработаны два иммуностимулятора с различным миханиэ-яоь действия- "Достим1'* где в качестве одного из активных веществ использовался бактериальный гликан» являлся преимущественно активатором Фагоцитарного звена» Лругой стимулятор -"Иастии" - представляет собой водно-иасляиуи) эмульсию» в состав которой входит АСД-2 и витамина. Этот препарат п основном активно воздействует на В-систену иммунитета* увеличивая количество октмтелопродуиирумыих клеток*

При изучении нх свойств ианалызв информации о применении иммуностимуляторов в тех или инь'х системах животноводства получил» результаты» подтверждающие обоснованность дифференцированного подхода при подборе иилуиоотмнуляторов для лечения и профилактики различных болезней-

Так» например* "Достим" был эффективен при профилактике болезней телят* где вь»дуыип этиолотическим Фактором были E-coli или некоторые вирусы* Там же» где а патоген»ум ассоциацию примешивались кокковые Формы микроорганизмов (стрептококк)* применение "Ластима", ив оправдывало себя- В то же время в этом случае положительного эффекта иожыб было достичь применением стимулятора В-сиотемч» иммунитета - "Кастима" *

Положения о различных протсктивных эффектах • иммуностимуля*-торов при заражении различными пккрсрганизмами получены и я экспериментах на лабораторных животных- Для иыыей* зараженных E-coli» большую протектмвну» активность в эксперименте проявил

- 25 -

"Достмм"| а для зараженных • ачпегда - "Мастин"•

Следовательно« при подборе иммуностимулятора для дечения и профилактики тех или иных болезней крайне важно учитывать особенности патогенеза возбудителя и механизмы заыиты организма хозяина. Класс иммуностимуляторов иокет иметь очень широкое применение» и поэтому разработанные нами иммуностимуляторы апробировались при различных патологиях у разных видов животных-

Был отмечен хороший эффект о*т их применения при болезнях молодняка раннего постнатального периода (телят» поросят) и боле-онях респираторного тракта у этих же животных' в более поздний период- Причем массовое профилактическое применение иммуностимуляторов в системе промышленного животноводства (свиноводства• например) позволяет получать очень значительный экономический эффект-

В последние годы в отечественной ветеринарии все большее значение приобретают методы лечения домашиих животных» Поэтому- иммуностимуляторы активно включали в комплекс терапевтических мероприятий при лечении тех или иных болезней- Установлено» что при лечении чун"ы плотоядных у собак довольно хорошие результаты давало применение препарата "Мастин"» особенно его модификации "Мастин М"• Использование препарата "Достим" для этих целей было приемлемо только на ранних стадиях развития болезни» так как позже» при прорыве гемато-энцефалического «барьера« стимулированные Фагоциты активно повреждают структуры мозговой ткани- Поэтому "Лостим" для лечения чумы практически не применяли-

Тем не менее "Достмм" оказался довольно эффективным препаратом при лечении инфекционного вирусного энтерита у собак - Его использование в комплексе с регидратирукуцей терапией и другими симптоматическими средствами позволяет существенно улучшить ре-, зультаты лйчеиия- Однако в данном случае речь идет лишь о стадиях болезни, когда животные еизе не имеют необратимых изменений в результате обезвоживания и не находятся- в коматозном состоянии •

Отмечен положительный эФФект от применения "Ластима" и при лечении болезней у кошек - панлейкопении, например-

Следовательно» при разных патологиях различные иммуностимуляторы будут проявлять и различную эффективность- Поэтому в практических условиях необходим набор различных препаратов этого класса, позволяющих врачу использовать наиболее эффективные для данной болезни- Более того, при профилактике важно определить и периоды наибольшего "риска" в данной системе животноводства и именно в эти периоды применять иммуностимуляторы-

Вполне возможно, что неспециФическай мммуностинуляиия станит копим крупным напраолечием в ветеринарии и медицине»

•Таким образом» дачная работа рассматривает двз подхода^ два

- 26 -

метода создания профилактических препаратов-

Один из них применим при создании препаратов против болезней« для возбудителей которых можно обнаружить обыие, константные антигенные компоненты» имеющих хроническое течение' например -бруцеллез* В работе приведен способ создания современного специфического в акцинируэоиего препарата с заданными свойствами против этом болезни-

Другой подход относится к созданий и использованию препаратов для профилактики и лечения болезней, вызываемых слабопато-генкыми« но имеющими обширные антигенные вариации микроорганизмами* Использование таких препаратов •» иеспециФически актиЕМру-юяаих различные клоны клеток иммунной системы, может оказаться довольно эффективным при условии правильного их подбора и оптимизации схемы применения в практических условиях- Кроме того, включение иммуномодуляторои в комплекс терапевтических мероприятий, как правило, оправданно при многих болезнях- Возрастающая в последнее время популярность препаратов этого нового класса у нас в стране и за рубежом свидетельствует о правомерности сформулированного нами подхода-

ЕГие раз анализируя представ ленный материал, оЗ'обшим основные достижения данной работы! - В условиях "in vitro" определена киллернаг способность

основных систем иммунитета в отношении бруцелл- Показано отсутствие этого эффекта в гуморальной и лимфоцитарией тест-системах, причем наличие специфических иммуноглобулинов в системе способствует "антигенному дрейфу" в структурах микроорганизма*

Основной киллинг бруцелл осуществляется в макрофагах« полученных от инмунных животных- В макрофагах интактных животных возбудитель персистирует и размножается»

Персистенцмя бруиелл в макрофаге возможна потому, что в последнем нарушаются процессы Фаголмзосомального слияния и секреторной дегрануляции- При этом бруцеллы довольно устойчивы к воздействию активных кислородных радикалов и tie ингибмруют процессов "респираторного.взрыва"-

Патология Функций Фагоцита может быть связана со снижением индекса ц-ГМ? / ц-АМФ, что приводит к нарушению подвижности лизосом-

В определенных условиях культивирования "in vitr-o" бруцеллы способны выделять экзоиеллюлярный Фактор, обладающий функциями иакрофаготоксика и наруыагоиий л структурах макрофагов процессы фаголиэосомального елимния и секреторной дргранулэцим*

^ Данный фактор изолирован* определены его основные физико-химические характеристики-

- 27 -

В результате поисков протективных антигенов бруцелл было установлено* что наиболее^ активными из клеточных антигенов были антигены» экстрагированные с поверхностных структур клеток бруиелл» находящихся в Б-форие. Причем» если серологически П и Э антигены бруцелл не имели никаких перекрестов » то в протективнс.»« отношении был установлен явный перекрест«

Для конструирования противобруцеллезной вакцины был определен наиболее перспективный специфический компонент« Представлены методы» позволяющие. избежать индукции препаратом нежелательных эффектов ( серопозитивности и ГЗТ).

Проведен поиск разнообразных препаратов и методов» усиливавших иккуногеиное действие бруцеллезной вакцины» Определены наиболее эффективные Формы конструкции препарата-

Проведено широкое испытание варианта бруцеллезной вакцины на различных животных« Установлены ее эффективность» безвредность ч а также отсутствие серопозитивности и индукции

гзт-

- Для подтверждения правомерности данного подхода предпринята попытка получения профилактического препарата против сальмонеллеза• В результате создан эффективный препарат» индуцирукгиий у лабораторных животных напряженный иммунитет« Разработаны два эффективных иммуностимулирующих препарата <"Достим" и "Мастим")» которые можно применять как для профилактики, так и для лечения болезней у животных (телят, поросят» собак* кошек и т»д-У• Показано» что один из них преимущественно воздействует на систему макрофагов и Т-кле-ток» а другой - на систему синтеза антител <В-систену>.

Установлено на издели различных животных < в условиях эксперимента и производственных условиях)< что данные препараты характеризуются не одинаковыми эффектами при болезнях с различным патогенезом- 3 одних случаях более сильным оказывался "Достим"* в других - "Мастим"-

Предпринята попытка обосновать необходимость разработки и«нуноактивнь-эх препаратов п соответствии с особенностям» биологии» антигенной структуры, патогенеза и *г«д«» с одной стороны» и особенностями Формирования иммунной защитной реакции - с другой« Данная работа может иметь продолжение и быть развита в качестве самостоятельной Фактически по каждому из перечисленных пунктов

ВЫВОДЫ

1- Ключевым звеном системы иммунитета« обеспечивающим пснллииг бруцелд в организме хозяина, являются Фагоциты- При этом только Фагоииты от иммунизированных животных могут достоверно снижать количество жизнеспособных клеток возбудителя*

2« При Фагоцитозе бруиелл иктактными макрофагами вирулентные штаммы возбудителя активно воздействуют на механизмы Фагоцитарного шиллинга, резко снижая внутрифагоцитарный уровень ц-ГМФ/'д.АИФ, блокируя процессы секреторной дегрсну-дяции и Фаголиаосомального слияния- Это приводит к длительной персистенции возбудителя внутри Фагоцита- Р-идино, этот первоначальный патологический процесс* и лежит в основе патогенеза бруцедлеза-

3- В экспериментах "in vitro"« моделирумших условия персистенции в фагоците, вирулентные штампы бруцедд продуцируют вешество (НЮ, которое выполняет роль макрофаготоксина, нарушающего фаголизосбмальное слияние и секреторную дет*ра-нуляциго Фагоцитов- Возможно это веыество является'одним из основных компонентов, участвующих в реализации патогенных Функций бр*гцелл •

4- Штаммы бруцедд,<находяыиеся в S- и R-фазе, не имеют выраженных антигенных перекрестов, улавливаемых в серологических реакциях- Однако достоверно установлен перекрест в протективнои отношении» Следовательно* протективный эф-. Фект прц бруцеллезе моает быть связан с одними антигенными структурами* а выработка анител * улавливаемых диаг-ностикумами - с другими-

Ь- ИК обладает протективными свойствами» создавая иммунитет в отношении бруцелл* находящихся как в S-, так и П-фазе диссоциацией нк не содержит в своем составе структур ЛПС и белков» вызываюиих сенсибилизации» организма» В силу этого при иммунизации животных НК у них отсутствует синтез специфических иммуноглобулинов, улавливаемых в стандартных реакциях на бруцеллез- Этот препарат имеет большие перспективы в качестве специфического компонента при кон-стр^провании противобруиеллезных вакцин-

7 - Эффективными иммуностимуляторами при бруцеллезе можно считать левамизол; дрожжовой гликан и некоторые полимерны« соединения• Действие иммунизируюыего препарата уси-•ливается при ковалентнои соединении специфической и им-

- 29 -

мчностинулирчющен полимерной части-

8. Созданая нами бруцеллезная^искусственная вакцина (БИВ) представляет собой иммуногеннмй препарат» не уступающий по этому показатели коммерческим вакцинам- Однако в отличие от них препарат "не вызывал синтеза специфических антител* улавливаемых в стандартных реакциях и затрудняющих диагностику бруцеллеза» а также не индуцировал положительных реакций на бруцеллин- БИВ не реактогенна и без видимых осложнений позволяет осуществлять многократные ревакцинации.

9. Принцип подхо да к поиску протективных антигенов путем анализа патогенеза у соответствующих возбудителей и выявления их патогенных Факторов правомерен и для других инфекций» сопровождающихся Феноменом виутримакроФагаль-ного персистироэания« ПЬлученный аналогичным методом антиген из Salmonella tvphimuriuro показал высокую протек-тивнум эффективность в проведенных экспериментах- Профилактический препарат» сконструированный на его ооновеi может иметь не только научное» но и практическое значение-

10- Для профилактики болезней» вызываемых микроорганизмами с невысокой патогенностыо» имеющих большое антигенное разнообразие» или в условиях недостаточно установленного- диагноза с успехом может быть использован другой подход - поликлональная инмунастимуляция. При этом большое значение имеют время и схема их применения а технологической цепочке той или иной системы иивотноводства-

II« Иммуностимуляторы » включенные в систему терапевтических мероприятий ч способны резко усиливать лечебный эффект. Учитывая неодинаковую активность воздействия различных иммуностимуляторов на разные звенья иммунной системы» необходимо дифференцированно подходить к их выбору» имея ввиду особенности пато- и иммуногенеза-

- зо -

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для профилактики брчиедлеаа новвт быть использована бруцеллезная искусственная вакотна* которая разрабатывалась совместна с Институтов иммунологии ИЗ РЧ> и НКВИНЗ (авт. свил. Но. 1518961).

Материалы .доклинических испытаний оформлены к переданы в ГИСК им. Тарасевича для подготовки испытаний БИВ на добровольцах .

2. Для профилактики и лечения заболеваний телят о клиническими признаками диаррем и бронхопневмонии9 поросят с такими же признаками * парвовируо'ного энтерита собак и многих других болезней может с успехом приценяться разработанный нами иннчиостинулятор "Достип" <ТУ Ко.10.07.052-93)< (авт. свид. Н0.1ВОВ331).

3. Лля профилактики и лечения некоторых болезней* где важна роль В-систены иммунитета Счуна плотоядных* кокковые инфекции)* нояно с успехоп использовать иммуностимулятор "Мастим"* разработанным нами совместно с НИБИ НЗ

<ХИ Ыо- 10.07.222-94)

4. Приниипы создания имнуноактиэных препаратов* предлагаемые о данной работе * были использованы нами при разработке анатоксина стафилококкового поливалентного (АСП) (ТВ-000-64-1'?-012-'94) и вакцины имнунопотениированной чумной (ВИЧ) ( ТИ Ио.ю.07.052-'ЭЗ> .

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ, ОТРАЖАЮЩИЕ ОСНОВНОЙ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАПИИИ

1■ Синтетические полинеры в качестве стимуляторов и пролон-гаторов мммуиогенного действия бруцеллезной химической вакцины / Игнатов Я.Е- * Уласевич П-С., Драновская E>ñ-, Билл. ВИЭВ, 19В0, No-SB, С.ЗВ-40.

2. Применение химической противобруцеллеоной вакцины с целью профилактики заболевания, вызываемого Вг». ovis / Игнатов П-Е., Нласевич П.С., Яранозская Е.А., Тр. ЕИЭВ, 1980, т.51, С.15-40.

3. A comparative study of the antigenic structure and ira-numologieai activity of brucella in the S- aTid E-forms / Уласевич П.С. , Драновская E.А..Игнатов П.Е., Bull-

WHO/ Crue/ B3.3S9, WHO/ zoop/ S3.161.

4. Иянуноотияуляция; сре/стза, нетоды, перспективы / Коро-нысловГ-ф. , Игнатов П-Е-, Селъскохоа- биология, , 19ВЗ, Но-7, С. 99-107.

5. Перспективы конструирования вакцин против брчиоллеаа на основе протективяого антигена /Игнатов П-Е.» Бждл. ЕИЗВ, 1983, нмп.50, С-3-6.

6. Антигенная стрчктчра брчцелл / Григорьева Г-И■, Игнатов П.Е., Успехи современном биологии, 1991ч Ко.6,

С.890-904.

7. факторы патогенности ir.it протективные антигены / Григорьева Г.И., Игнатов П-Е-. С/х биология, 1987, Но. 12,

С.100-104-

П■ Способ получения бр'-тцеллезного антигена / Игнатов П-Е.,

Федоров ft-И., A.C.1256258 от а пая 1986 г-9. Способ (Определения против обруцеллезных антител в биологических жидкостях / Григорьева Г-И-, Сочнеа В-В-, Тихонира-аа Е-Я-, Игнатов П.Е. , Д.с- Ыо.'1307661 от 8 декабря 1987 г. 10. Способ получения антигена сальнонелл / Игнатов П-Е-, Федоров А.И., Некрасов A.B., А.о. Mo.l55QlQQ от 15 декабря 1909 г.

11« Способ получений г^ашк« против бруцелеаа / Петров P.S., Хаитов P.M., Игнатов П.Е., Некрасов A.B., Свиридов В-Д.» Федоров ft-И-, Горяинов Д.А., Сочнев В.В., Григорьева Г.М., A.c. Mo-1518961 от 1 ИЮЛЯ 19S9 f.

12- Способ получения антигенов мо бактерий рода бр«зиедл / Григорьева Г.И., Игнатов П-Е-, Федоров А-И-, Сочнев В.В.,

А-с- Mo.1631706 dt 1 ноября 1990 г.

13- Способ получения препарата для профилактики бактериальных

- 32 -

заболеваний кивспных / Игнатов П-Е-ч Федоров А-И-. А-с. Но. 15В9449 от 1 пая 1990 г. 14- Спрсаб палчненмя биологически активного препарата из дрок-«еи / Игнатов П.Е-> Федоров•Л-И-« Горбатов Д.В.! А.с. Но.1808331 от 10 октября 1992 г. 15' Врепеыное Т« Ко.10.07.112 на производство препарата "Достин" -

16- Наставление по применению препарата "Лостмя" Ыо-О43-3 от 12 ноября 1991 т-

17- ТУ Но-10-07-236-91* на производство препарата "Достин" (взамен вреяенных ТУ Ыо-10.07.112-91>.

18- Наставление по применению препарата "Достин" в ветеринарии. Рег- N0-10-07.39-93 овфп от 19 нарта 1991 г.

19- ТУ Ыо-10-07-202-91 на производство препарата "Мастии".

20. Еретенное наставление на препарат "Мастин" Но.041-2 от 1 ноября 1991 г.

21. Постоянное ТУ »0-10.07.222-94 на производство препарата "Пастмя"-

22- Наставление по применению препарата "Мастин" в ветеринарии Рег. Но.Ю-07-106-94 ОВ4П от 15 февраля 1994 г-

ИГНАТОВ ПЕТР ЕВГЕНЬЕВИЧ АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать ЗТ.05.У4. Формат 60x84 I/I6. В.тип. J» 2. Иеч.л. 2,0. Б.л. 1,0. Тираж 100. Заказ ЗГЭ. ГТП изд-ва ССбУЭФ.

Издательство Санкт-Петербургского университета экономики и финансов

ISIC23, Санкт-Петербург, Садовая ул., д.2!.