Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Некоторые особенности неферментирующих бактерий (Acinetobacter, Moraxella, Pseudomonas, Flavobacterium) и их роль в инфекционной патологии человека и животных

' л. . • *>

СВИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЗООТЕХНИЧЕСКО-ВЕТЕИШАРНЫЙ УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ "БАКТЕРИОФАГ" ИМ.Г.ЭЛИАБА

На прайах рукописи ГАБИСОШЯ ТАРАСИ ГИВИЕВИЧ

НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ НЕФШЕНТИР/ЩИХ БАКТЕРИЙ (АСПгатоВЛСГКй, ИОНАХЕЫЛ | рззи-СОМОНАЗ, ИАТОВАСТЕИШ!) И ИХ РОЛЬ В ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

16.00.01 - Ветеринарная микробиология, вирусология, ЭПИЗООТОЛОГИЯ, микология, иммунология

"ДИССЕРТАЦИОННЫЙ ВЕСТНИК"

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Тбилиси - 1994

Работа выполнена в Грузинском государственном иы.Г.Элиава 1U10 "Бактериофага1, и ШШ эпидемиологии и микробиологии им.Г.Га-йричевского (г.Ыосква).

ОФИЦИАЛЬНЫЕ йШЮИЫШ: Т.Курашвили, доктор ветеринарных

наук, член-корреспондент Академии сельскохозяйственных наук Грузии В.Курашвили, доктор медицинских наук, профессор

Л. Кеачадяе, доктор биологических наук, профессор.

• л v.

Зшдита диссертации состоится ;я /ts " ¿^О_ 1994 г.

ь " " часов на заседании научно-аттестационного совета V 16.00 CN I6-I Грузинского Государственного Зоотехничесхо-ветй-¡шпарного учесмо-исследовательского института.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Грузинского Государственного Зротехническо-ветеринарного учебно-исследовате-.ш.ского институте.

Но адресу: 380I0V, Тбилиси-Крцаниси

"Диссертационный вестник" разослан " '" О У 1994 г

УНЫШ СЕКРЕТАРЬ Ши'ШО-АТТВДГАЦИОШЮГО СОВЕТА кандидат ьвте^инарных наук

Г.А.Цквитинидэе

ОБЩАЯ ХАРАЮ.ШСГИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. За последние годч отмечается изменение микробной флоры при гнойных инфекциях, связанные с некоторыми особенностями течения раневого процесса, иммунологическими изменениями в организме и рядом других факторов.

В микробных ассоциациях при хирургических, онкологических, урологических инфекциях приоритет преобрели неферыентирующие грам-отрицательные бактерии, которые вместе с грамполонительными микроорганизмами наиболее часто вызывают гнойно^-воспалительные процессы, увеличивают продолжительность госгитализации больных в стационаре и повышают летальность ( Г.¡1.Калина с соавт. 1985; А .Ф.Мороз, 1988; А.М.Далина с соавт, 1992; A.Kramer at al., 1989; A.F.Wold et al, 1989).

Неферментирующие бактерии широко распространены в природе. Ореол их распространения в основчом - вода, no4Ba(3«D.Henrik-een, 1973; Blaaevio D.J. , 1976).Они выделяются из продуктов питания, чаще всего из молока. Многие виды этих микроорганизмов ведут паразитарный образ жизни на здоровом теле человека и ивотннх, на коже, на слизистой оболочк- верхних дыхательных путей, в нижних отделах моче-половой системы. Инфекции, которые вызваны нефермен-тирующими бактериями, в основном, развиваются у человека и животных с пониженной естественной резистентностью: у детей, стариков, больных с тяжелыми соматическими болезнями, онкологических больных. В этом случае бактерии выделяются при острых пиэлонефритах, из желчи, в процессе воспаления желчных протоков, в эксудатах при гнойных коньюктивитах. Вырос также удельный вес этих бактерий в возникновении менингитов, пневмоний (В.И.Илыохин, 1985; R.Appelbaum et al.« 1988).

Представители грамотрицательных неферментяругщи.х бактерий отлич-ются множественной лекарственной устойчивостью.

К неферментирующим грамотрицательным бактериям относятся представители/Peeudononae^Aclnetotaoter ^Horexella ^Flnvo-bacterium. Их роль в патогенезе человека и животных мало изучена, что в свою очереди требует дополнительных исследований и уточнений (ii.Aucicen et »1.1991; M.r.^vi ; 1992). Физиологические и биологические особенности их неоднородные и это не дает возможность бактериологическим лабораториям идентифицировать ..к больив ЗС -60 /о.

Как видно из литературных данных изучение патогенных свойств

проводили на таком классическом объекте микробиологии, каким является кишечная палочка, а что касается неферментирующих грамот*-рнцательных бактерий, у них патогенные свойства почти нч изучались ( Бекбергенов Б.Г, с соавт. 1987; Мороз А.Ф, с соавт. 1990; т.Kioaa ,et al.1985). Не изучены вопросы, которые связаны с патогенными свойствами Aoinetobacter , Moraxella Flavobacterium в в некоторых случаях и Pseudomonas в частности: энтеро! .¡кси-генность, наличие антигенов адгезин, гемолитическая активность, продукция Экзотоксина А и др.

Не изучены вопросы, которые, связаны с множественной лекарственной устойчивостью грамотрицательных бактерий, их внехромо-сомная-плаамидная природа, группы несовместимости плазмид и т.д. (Еогатова И.С. и др., 1983; PWhalcedze Tfet al. I99J; HoffXer V., 1991). Вместе с уменьшением эффективного действия антибиотиков появляется потребность к создании новых высокоэффективных безвредных препаратов. Такими безвредными и высокоэффективными препара-__ тами являются лечебно-профилактические бактериофаги, которые за последние годы всё чал1е используются в медицинской и в ветеринарной прак-.ике.

Поэтому исследования, связанные с вопросами диагностики,патогенных свойств, антибиотикорезистентности и лечебно-профилактических бактериофагов являются актуальными.

Целью работы является изучение вопросов микробиологической диагностики некоторых представителей неферментирующих грамотрицательных бактерий (Acinetobacter , Moraxella , Pseudomonas , Pla-

vobacterlum) их патогенные свойства: энтеротоксигенность, антигены адгезивности, гемолитическая активность, наличие экзотоксина А, множественная лекарственная устойчивость и роль этих бактерий в инфекционной патологии человека и животных.

Задачи исследования-

1. Частота ввделения грамотршательных неферыентирующих бактерий при инфекционных патологиях человека и животных,, а также, из окружающей среды;

2. Разработки рационалыпх схем для идентификации некоторых йидон' неферментирующих бактерий;

3. Иаучение антигенных свойств Aolnetobacter , Moraxella t f 1 tivdVimoteviuui и pauuiiumonaB ; установление их родственности;

4. Изучении патогенных свойств этой грушш бактерий (антеро-i-oiuiirtiiiH^i'Tb, гемолитическая, активность, наличии антигенов адге-лш)ип1:'п1, ирпмупировмнил укиоюксипн А);

5. Установление множественной лекарственной резистентности

и её генетической природы у штяммов синегнойной палочки, ацинетог бактер, моракселла и флавобактерий;

б . Разработка новых лечебно-профилактических поливалентных препаратов против инфекций, вызванных неферментирующими бактериями;

7. Приготовление специфических эритроцитарных диагностикумов для постановления непрямой гемаглстинации и диагностики моракселл и ацинетобактер.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. После изучения культуральных свойств Moraxella и Flavo-bacterium разработана универсальная дифференциально-селективная среда, с помощью которой повышается частота выделения этих бактерий из патологического материале;

2. Использование иммунологических методов для выявления специфических антигенов И антител Acinetobactep и Moraxella в крови здоровых и больных людей;

3. Ьыделение штаммов Acii.etobüoter t Moraxella , plavo-bacterium от больных людей и животных, содержащих факторы патоген-ности (энтеротоксин, антигены адгеэивности, гемолизиныэкзотоксин А).

4. Подтверждение приобретения антибиотнкоустойчивости у % / дшщ2|нойпаладк>и обусловленной плазмидами, принадлежащими к гру- 11 ппам несовместимости incPi , тори , торг/ , mepvr , Mcpvir,

In орх XI • •

b. Изучг те в штаммах ацинетобактер распространения плазмид IncPi и ИсРИгрупп несовместимости;

6. Из культур моракселла выделены неконь дативные R -плазми-ды, м лекулярная масса которых составляет 3,2 «D $ 5,4 Ш> ; 7,0 мо возможность их использования в генно-инженерных работах;.

7. Необусловленность С. - плазмидамй фагорезистентности в .грамот питательных неферыентирующих бактериях к лечебно-профилвктичео-ким бактериофагам

8. Результаты использования адаптированных на госпитальных штаммах ле- збно-профигчктических бактериофагов.

Научная новизна.

- Разработана и апробирована на практике схема бактериологической диагностики для грамотрииате-ьннх неферментирующих бактерий.

-6- Из клинических стационаров различного профиля, животноводчески* ферм был получен патологический материал, в котором часто обнаруживались неферментирующ'ие грамотрицательные бактерии;

- После изучения некоторых видов Pseudomonas , Moraxella , i'lavobacterlum , Acinetobacter установлено наличие у них факторов патогенности (знтеротоксигенность, гемолитическая е<тивность, наличие антигенов адгезии, экзотоксин А ).

г- Установлено родство между антигенами A.calcoaceticua и A.lwüfil.a также с другими видади неферментирующих грамотрицате-льных бактерий;

- Выделен и изучен экзотоксин А из клинического штамма р,aeruginosa;

- Изучено наличие R- плазмид.антибиотикорезистентности в различных видах неферментирующих бактерий, которые принадлежат к группам несовместимости - Incpi , incpn ( Inoprv , Incpvi ,

Xuopvir Biopxil.

- Плазмид! обуславливают устойчивость к пенициллину (ро )■ оритримицин" (в»), хлорамфениколу (ст), канамицину (кт), кар-бенициллнну ( СЬ ), тетрациклину ( То ), стрептомицину ( Sm ).

- Резистентность к лечебно-профилактическим бактериофагам штаммов синегнойной палочки, флавобактерий, ацинетобактер и морак-селла не обусловлена R плаамидами;

- Плаамиды синегнойной п£1Л0чки могут распространяться в штаммах ацинетобактер и морькселла.

Практическая ценность работы.

- Разработанная схема для идентификации грамотрицательных неферментирующих бактерий улучшает бактериологическую диагностику.

- Создана дифференциально-селективная среда для выделения бактерий родов моракиелла и флавобактерий.

- Изучение приобретенной резистентности к антибиотикам у грамотрицательных' неферментирующих бактерий, выделенных в клинических стационарах различного "рофиля и из окружающей среды, создает.общее прецстаишше о характере распространения множественна voToiUiHbiix форм микроорганизмов. На основании виивленних ис-Г0ЧНИК01) загрязнении могут бить рекомендованы мероприятия по оз-iiopouucHiiio ¡пшпеммлщчни'ской. и ошшоотичеекой обстановки для нрбцигиршцнши paymmm niyiрнб'>лы!ич(ШЧ инфекций, вызванных

.>1 НЮ II (Ulli .1 -'l'll.null

- Исходя из полученных результатов, для лечения инфекций, . вызванных грамотрицательными неферментирущими бактериями могут быть успешно применены клафоран, фортум.

- Отличается высокой эффективностью созданный в НЛО "Бактериофаг" поливалентный бактериофаг, в состав ноторого входят пкоцианеус, моракселла и флавобактериофаги.

- Илазмиды, которые выделены из штаммов моракселла и детерминируют резистентность к одному ил« двум антибиотикам, могут быть применены как векторы в генетической инженерии.

- Использованы специфические фракции антигенов бактерий Aolnetobacter и Moraxella для приготовления эритроцитарных ДИ-агностикумов.

Внедрение в практику результатов научных исследований.

Основные положения и матери ли диссертации опубликованы в республиканских изданиях, за пределами республики, зарубежных странах, в том числе Соединенных Штатах Амерш г. Получены отзывы из многих стран мира (СМ, Чехия, Франция), а также приглашения для участия в международных симпозиумах.

Получено Авторское свидетельство на изобретение: "Способ получения лизина", » 4В4й692/13,от 02.07.90 г.

Получена приоритетная справка на изобретение: "Новый способ получения эритроиитарного диагностикума для выявления-антител Aolnetobacter csloonoeticu* " » 1099/01, ¿5.03.91 Г.

Авторское удостоверение на рационализаторское предложение > 05/91 от 19,03.91 "Способ получения концентратов бактериофагов с высокой активностью".

Авторское удостоверение на рационализаторское предложениеv * 0Ö/9I от 25.03.91 г."Способ производства высокоактивных бвктв-риофа ов, адаптированных на госпитальнь*' штаммах".

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены в г.Ереване в институте микробиологии, вирусологии и паразитологии (1990 г), в г.Телави на конвенции молодых ученых (1991), на нр-'чно-практической конференции по клинической микробиологии (1992), на няучиой конференции медицинского университета (1992), на расширенном научном сспте "Бякте иофаг" (1993).

Публикации.

Па ~еме диссертации опубликовано 26 научных трудоп, 2 методических письма, 2 изобретения Зарегистрированы в . осудврствеином

Кимитете по изобретениям и открытиям (г.Москва), получено авторское удостоверение по двум рационализаторским предложениям.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения» заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на£?4~страницах машинописи, включая 53 таблицы, II графиков, 39 фотоснимков. В Библиографический указатель включено 256 источников, из них 63 русских и 193 англоязычных и других авторов.

СОДЕИАШЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования. Работа выполнена в НПО "Бактериофаге" им.Г.Элиава, НШШ им.Г.Габричевского (г.Ыосква) и НИИМВП им.А.Алексаняна (г.Ереван).

Цикробиологическим исследованиям подверглись 8321 пробы,которые были взя^ы от 4635 больных, что составило 57,7 %, от крупного рогатого скота взято 1500 проб - 18,02 % и из внешней среды-2186 проб, что составило .соответственно 26,27 %.

Выявлено и идентифицировано 5350 штаммов различных видов условно-патогенных бактерий. Из них Moraxella- 115 штаммов, 273 ioinetobacter , 765 paeudomonaa и 27 штаммов Flavobacterium.

В работе использованы музейные культуры Moraxella , Plavo-tacterlum , Pseudomonas , Acinetobacter , полученные из контрольного института им.ЛЛарасевича (г.Москва).

Лосев биопроб и их,культивирование проводили по общепринятым методам (Калина Г.,1985).

Идентификацию грамотрицательных неферментирукщих бактерий проводили но следующим тестам: цитохромоксидазная, каталазная, протеолитичеекая активность, ферментация углеводов, образование индола, сероводорода, фенилаланиндезаминазы, липазы, редукция нитратов и нитритов, продуцирование лецитиназы, ДНК-азы. Получены иммунные сыворотки после трехкратной иммунизации кроликов,интервал - I неделя ШД.Зубкьа, 1986).

МузеНные культуры разрушали ультразвуком (Fisher, С.Ш.А.-' lÜV^) для приготовления антигенов.

Метод [шышой иммуноциффузии использовали для выявления в ьрсеи SA0f>oewK п больных людей соответствующих антител( Фримель к,, IÖ7S). Д«н зтих w« in'ticii нримнмли метод иммуноэлеитрофореэа

в агароэном геле по Оухтерлону и Грабара.

Получали отдельные белковые фракции антигенов с помощью хроматографии сефарозном геле (Остерман J1. 1985).

Патогенные свойства неферментирующих грамотрицателььсм бактерий, в частности энтеротоксигенность изучали на лигированном тонком кишечнике кролика (Мнацаканов С., 1984). Фимбриальные антигены адгезии выявляли по методу D.Evans (1978). Гемолитическую активность - по методу Ы.H .Зубкова (198.5), а экзотоксин А выделяли методом иммунноафинной хроматографии ( P.Liu ,1973). •

Определение чувствительности штаммов - 'Pseudomonas , Flavo-bacterium , Moraxella и Acinetobacter к антибиотикам И сульфаниламидам производилось на плотной питательной среде методами серийного разведения и диффузии препарата на плотной среде посредством бумажных дисков, пропитанных антибиотиками (Навашин С, 1982).

Коныогационшй перенос плазм ид из доноров в рецштиентные штаммы производили методом H.sagai , 1975.

Классификацию плазмид по признаку несовместимости, которые выделены ИЗ культур Pseudomonas , Acinetobacter , Moraxella , yiavobacterium проводили в системе тестерных плазмйд РАО И В.coll.

Плазмидную ДНК для электрофореза в 1 % -ном агароэном геле выделяли методом Т.Е 'íhardt , 1978 и с.Ka-do , 1981. Электрофорез для выявления плазмидной ДНК проводили в вертикальном или горизонтальном агарозном геле. Режим электрофореза 40 v , 6СЬл , 19 J»- Tris-НСл. -Боратном буфере pH -8,2 (J. Meyers ,1976).

Молекулярную массу выделенных шпзмид определяли с помощью тестерных плазмвд (Поляновский 0., 1978).

препараты плазмидных ДНК получали по методу D.cieneii 1974, ультрацентрифугированием в градиенте с«С1 при 42С00 об/мин, 48 ч.

Электронную минроскопию по изучению плазмидной ДНК производили по методу А»Kleineohmidt (1968). Размеры плазмид определяли известными реперньми плазмидями курвиметром.

Плазмадную ДНК; г деленную из донориого штамма, трлнсформчро-ввли в регжпиентный штамм hbIOI Б.coli по метолу м.мапм (1370). РестрикпионннР анализ проводили по Маииетису Т. (1904). Использовались следующие ферменты- Alui , Bnn$ir , яоопт , Вспн' , peti, nirní и, Hind иь

Электрофорез для изучения отдельны* фракций антигенвв яреео-

дили в полиакриламидном геле (Гааль Э, 1982). Препараты окрашивали кумаси-синим или емвдо-чернш. Молекулярные массы отдель- , ных фракций определяли с помощью известных маркеров.

Бактериофаги вьщеляли из сточных вод, а также их источником служили и свежевыделенные клинические штаммы (Адаме М.,19о1). Бактериофаги титровали методами Аппельмана и Грация.

Статистическую обработку полученных данных проводили по -Ашмарину И. (1952) и Каминскому JJ. (1964).

Химические реактивы, ферменты, готовые буфера и другие необходимые материалы для проведения работ получали из различных фирм: "Sigma", "3erva ", " 1KB " . "Merk

Автор благодарит научных консультантов: академика Т.Г.Чани-швили, профессора Б.А.Шендерова, Профессора А.Н.МеНпариани, а также профессора ЫД.Зубкова, профессора С.Т.Мнацаканова и старшего научного сотрудника Т.Я.Пхакадзе за оказанное содействие в процессе выполнения диссертации. •

результаты собствшшх исследований .

Для изучения патогенных свойств, наследственных детерминантов посредством генной инженерии, для выяснения молекулярно-гене-тических механизмов, неферментирующих грамотрицательннх бактерий, i! первую очередь, мы попытались изучить широкий спектр биологических свойств этих микроорганизмов, а частности: морфологические, тинкториальные, нультуральные, биохимические и другие. Однако, процесс выделения и идентификации моракселл, флавобактерий, а ташка в некоторых случаях представителей родов ацинетобактер и псс-ьдомонас затруднен. Они часто выделяются из мочи, эксудата, гноя, в микробных ассоциациях и поэтому весьма актуален вопрос, который касается приготовления новых селективно-диагностических сред для моракселл и флавобактерий. Значение имеет и компонентный состав питательной среди я поэтому мы изучили рост моракселл'и флаиоба-ктерий на различных питательных средах. Самая большая потребность к питательным веществам иэ pi да Moraxella оказалась у м.Оа-lüftiisfie, которая не растет на простых питательных средах. Клинические, и муаейньш штаммы этого »идя интенсигно растут на среде, куда добавлен отвар бычьего сердца, такие хорошо растут на сложных питательных гренах и M.lneuntitn . Замечена, что добавление и питательную среду человеческой или животной плазмы крови усили-

вает рост бактерий/ однако их добавление в сложных питательных' средах необязательно.

Очень хорошо растут штаммы M.nonliquefaoiens на пеп-тонной воде. Они растут и на других средах.

У штаммов м.bovia »идентификация которых имеет большое значение для медицинской и ветеринарной практики, растут очень разнообразно на различных питательных средах. У них большая потребность к полноценным питательным средам, однако добавление сывороток крови в среды иногда задерживает их рост. Поэтому для выращивания штаммов M.bovia особое значение придается точному подбору питательной среды.

Рост M.phenylpyruvica полностьп зависит от присутствия сыворотки крови в питательной среде, иногда добавляв! в каче--стве дополнительного компонента и Твин 80.

Изучен рост оактерий Flavojacterlura на нескольких питательных средах. Установлено, что F.aqustile интенсивно растет на среде, куда добавлен отвар бычьего сердца'. ?.devorana так- -яе не растет на пептонной воде и после добавления сыворотки крови растет всеже медленно. Для их роста оптимальным является добавление отвара бычьего сердца. y.marinotypicum росли на сложных питательных средах. Надо в целом отметить, что ввделение или культивирование выделенных штаммов yiavobeeteriuffl весьма затрудняется, так как они очень чувствительны к изменениям рн среды..

После проведения серий опытов по выращивании штаммов Мога-«11а, и Flavobacterium • на различных по составу питательных средах мы решили модифицировать богатые питательные среды. Поводов для этого послужило то, что тагче компоненты какими являются отвар бычьего сердца, Твин 80 не всегда доступны для практических лабораторий. Однако, добавка в питательные среды отвара сетчатки, руоца крупного рогатого скота давт весьма пг тожите-льный эффект. Бактерии видов Morarella и Flavobnoteriua расту" интенсивно.

Кро"е моракслла и флавобактерий был изучен рост на питательны* средах равных видов предете ителей Peeudomonae и Acinetobao;er» .Устш влено, что рост »тих бактерий принципиально н" зависит от состава питательной с~еды, они хор-по растут на разных по составу гоедах.

Для идентификации и селекции бактерий рода могв**Ив и

l'lavobaeteriu® были изучены разные селективно-дифференциальные среды, в там числе среда с телуритом калия, среда с линкомици-ном,.пенициллином, Однако, на этих средах вместе с энтеробакте-риями, кокками подавлялся или не подавлялся рост бактерий. Различные концентрации линкомицина и пенициллина, которые добавляли в питательную среду, часто не подавляли рост кокковых форм бак- , терий( стафилококк, стрептококк), а также энтеробактерий. Причиной этого явления-множественно лекарственная устойчивость штаммов различных видов стафилококков, стрептококков, энтеробактерий. Их.рост не подавляется высокими концентрациями пенициллина, линкомицина.

Таким образом, ранее предложенные питательные среды не могут удовлетворить потребности по выделению к идентификации различных видов ylavobaoteriua И Moraxella,

После серии опытов было установлено, что для ввделения и идентификации F. jvobacterimn и Moraxella наиболее подходящим антибиотиком является карбешшиллин. В среду добавляют кар-бенициллин только в оптимальных концентрациях, глюкозу, индикатор, с помощью которого отбираются карбенициллинорезистентные не-ферментирующие бактерии (Таблица I).

Применение этой среды дает возможность выделить из патологического материала все виды Moraxella и I Lavobacterium.

Изучение селективной среды для выделения штаммов Moraxella и Flavobaoterium из патологического материала

Таблица 1

Микрофлора

Struptocjccua-3 to [lity i OCOVÜiW t;n t о t-oba и teils с ей с neint-t obui-tei

ei 1 н l'JbVilt-lFt i Ulli

Частота выделения микрофлоры

Кровяной агар Селективная среда

або. % абс. /о

77 £3ü, V 2 2,5 0,001

26 26,0 0 0 0,01

31 3 6,2 Ü 0 0,05

31 36,2 31 36,2 0,01

¿<< 3,0 22 3,0 0,01

1 1,2 U", 13,2 0,05

При изучении септико-пиенических зг "юлеваний из патологического материала были выделены 755 штаммов, которые принадлежали к роду Pseudomonas . 51 культура была дифференцирована как Р.aeruginosa (58,94 %), M.maltophylio - 107 (14,1? %). к p.alcaligenee 95 штаммов (12,58 $), к P.cepacia принадлежало 43 штамма (5,69 %), к p.paeudoalcaligenea - 36 культур (4,76!?), к P.putida - 12 штаммов (1,58 %), К P.stutzeri - 12 (1,58 %} и к P.dimtnuta - 6 штаммов (0,79 %).

Выделено 237 культур Acinetobpicter , и.а которых к A.calco-aeetioua принадлезало -145 штаммов (61,18 $), к A.lwoffi -47 шташов (19,83 %), к A.bauraanii -25 штаммов, что составило 10,54 к A.Junii -10 штаммов (4,21 %), к A.Jonaon li отнесли такяа 10 штаммов (4,21%). У больных выделено 155 штамма Acinetobacter,у животных 45 и из внешней среды 37 штаммов.

К роду Moraxella отнесли следующие бактерии: 35 штаммов H.lacunata (30,43 %), 30 культр были - M.nonliquftfaoiens, что составило 26,0 %, 16 штаммов принадлежали к M.osXoenBio -(13,91 %), 15 культур - M.plu lylpyruvica - (13,04 %), 9 культур принадлежали M.uretraiia - (7,82 %) и 10 культур были отнесены к виду м.bovin - 8,69 %.

Выделены штаммы, принадлежащие к роду yiavobaoterdum - из них 8 штаммов принадлежали к p.devorans и F.aquatile - 29,62$ соответственно, к F.marinotypicum - 7 шташов, что составило 25,92 %, а к р.capsulatum принадлежали 4 штамма -14,81 %,

Изучение культуральных, биохимических свойств бактерий родов Pseudomonas и Acinetobacter ^показало, что у них наиболее выражены ферментативные свойства, чем у других граыотрииательних неферментирующих бактерий. Группы бактерий Moraseiln и Лато-baotTium вообще инертны к углеводам.

Для идентификации грамотрицательных неферментирующих бактерий предложены схемы, которые содержат 40-45 тестов, что в ового очередь затрудняет их дифференциация в клинических лабораториях.

Нами были предложены упрощенные схемы идентификации Acinetobacter , ИогажеПа и Flavobecter-ium.

Схема идентификации Acinetobacter содержит следующие тестя: морфология, подвижность, рост на средах Эндо и Мак-кокки, изменение цвета индикаторной среды с тройной сахарной добавкой, ферментация и окисление глюкозы на среде Хм>-Лейфсона,гфопукция ß-гялпк-тозидаз., нитратредуктазы, лизиндекарбекгилазн, гидролиз зску.тииа,

«елатины, мочевины ^чувствительность к полимиксину.

Для дифференциации üoraxella предложены тесты: метаболизм глюкозы на среде Хыо-Лейфсша, датохромоксидаэная активность, редукция нитратов, гидролиз мочевины, желатины, Твин 60, продукция фенилаланиндезаминазы, утилизация ацетата, рост на среде Эндо и Ыак-Конки, подвижность. •

Идентификацию yievobacterium проводили по тестам: морфология, наличие пигмента, оксидазная активность, окисление глюкозы, продукция аминазы и индола. Этим признаком флавобактерии принципиально отличаются от ашшетобактер и моракселл.

После изучения некоторых биологических свойств, выявления новых признаков и модификации методов нами были изучены патогенные свойства неферментируодих грамотрицательных бактерий.

Одним из основных показателей патогенности бактерий является ентеротоксигенность. Наличие этого признака было изучено нами у неферчентируюдахбактерий. В частности, из 155 штаммов Aci- „ netobacter, которые выделены от больных людей в 68,36*3,2 % продуцировали энтеротоксин.

В-клинике термического поражения г.Тбилиси этим признаком обладали 73,33*4,4 % штаммов, штаммы, выделенные из клиники ско- -рой лоиощи им.Склифасовского г.Москвы продуцировали энтеротоксин 60,03*2,3 %, а из железнодорожной больницы г.Тбилиси - М и №!: в первом случае продуцировали энтеротоксин в 55,55*4,1 % случаях, а во втором - ЗЬ,46*4,7 %. Энтеротоксин продуцировали штаммы Р.aeruginosa - 48,33*3,2 %. Самый высокий уровень продукции энтеротоксина отмечался у 121 штаммов, которые были выделены из клиник скорой помощи им.Склифасовского г. Ыосквы - 38,84*4,3 %, штаммы из J? I и № 2 железнодорожных больниц P.aeruginosa продуцировали токсин - 22,64-7,3 % и 23,07*6,8 % соответственно. Штаммы, выделенные из центра термического поражения также выделяли онтеротоксин - 21,8*7,5 %.

Выделенные от больных 75 штаммов Moraxella продуцировали антеротоксин - 57,33*3,3 % случаях, а из 20 штаммов Flavobac-terium в 40,0*2,С % слуцаег продуцировали энтеротоксин.

■ Угот признак обнаружен и у бактерий, выделенных из внешней

Дин А«luetot'notei' он составил ь7,0(3*4,2 %, у штаммов Ple-.лиЛп Iii« н|>1шши( aiiTispoTOKcHföiiiiocTH по детерминировался. I& шччшио» цега*ецл н 33,33^,1 1 ел.учяев продуцировали токсин,

ШТаммы P.aeruginosa - в 54,0*3,2 %,

Мы выделили и изучили от крупного рогатого скота штаммы не-ферментирующих бактерий на содержание знтеротоксина. Установлено, что штаммы A.caicoaceticuB в 48,0*2,3 % случаев, a A.lvjffi -40,0*2,6 % продуцировали энтеротоксин, Для культур Moraxella продукция этого признака была характерна d 56,0*2,5 % случаев. Штаммы p.neruginooa продуцировали изучаемый токсин в 60,0*2,2 % случаев, P.roaltophylii 25,0*2,9 %, P.ftlcaligenes _ 40,0*2,4 %, а p.puti da. , p.Btut2eri , p.diminutn не,'продуцировали токсин.

Таким образом, из 237 штаммов Acinetobaoter этим признаком обладали 50,63*2,4 %, Из 445 штаммов poeudomonaa энтероток-сигенными были 37,52*1,8 из 115 культур Moraxella -57,39*2,6% а 27 штаммов Flavobecterium только 29,62*1,5 % продуцировали знтеротоксин.

В выражении патогенных свойств огромное значение имеет способность бактерий прикрепляться к эпителию тонкого кишечника и колонизация этого отдела.

Установлено, что у кишечной палоч::и и у некоторых представителей семейства Tinterobaeteriaceae адгезивные свойства обусловлены специальными антигенами адгезии, которые распределены на фим~ бриях.

Нами были изучены адгезивные свойства штаммов Acinetobaoter„ Poeudomonaa , Moraxella и Flavobacterlum ,выделенных ИЗ четырех клинических стационаров, двух скотоводческих фер< и окружающей среды.

Культуры Acinetobaoter , которые были выделены от людей , ; из внешней среды обладали адгезинами человеческого типа CPA (CFAI, СРАН).

Штаммы от крупного рогатого скота обладали антигенами адгезии как человеческого, так и животного типа адгезинов- К 88, К 99, ▼ir, Похожая картина была обнаружена и при изучении штаммов Moraxella, Штаммы, выделенные от людей и внешней среда имели адгезины человеческого типа, а ш'.аммы от животных оМадали как человеческими, та: и животнши типами.

Культуры Pseudon пая и Plavobaeterium ,выделенное от л^дей и внеш- ей среда, обладали адгеэг .тми ан-игенами челорочесчого типа. Штаммы, выделенные от жиротных имели антигены адгезии, как человеческого, ¡гак и животного типе

Гемолитической активностью характеризовчлисттяммы *<?i~

иеюЪасгагввделенные от больных и внешней среды клиники скорой помощи им.Склифасовского, она составила 26,59-2,7 % и 20,0*1,9 % соответственно.

Привлекает внимание то, что в двух нелеэнодорожных клиниках из внешней среды не выделили культуры, которые продуцировали гемолизины, а от больных, выделенные штаммы несли гены, ответственные за гемолитическую активность 27,77¿2,7 % и 15,38*4,2 Ж соответственно.

Из внешней среды в Центре термического поражения выделенные штаммы были более гемолитичны - 2В,5+2,3 %, чем штаммы,выделенные от больных 20,0*2,1 %.

Для крупного рогатого скота была характерна низкая гемолитическая активность штаммов, в первой ферме - 8,5*1,1 %, а во второй ферме она составила - 10,0*1,2 %.

Штаммы Moraxella ,выделенные от больных из четырех больниц: клиника им.Склифасовкого, 1' I и 2 «елечнодройные больницы и Центр термического портления, обладали гемолитической активностью -15,38*1;5$; 23,07*2,2 %-, 28,S?*2,2 %\ 14,28*1,3 % соответственно.

Из внешней среды первых трех клиник выделенные штаммы гемолитической активностью не обладали. Только в Центре термического поражения штаммы имели это свойство - 11,11*1,1 %.

Штаммы, которые были выделены из двух форл, обладали гемолитической актиЕНоетьр - 13,33*1,3 % в первом случае, ß во второн-10,0*1,0 %. ■

Представители рода Pseudomonas также обладали этим свойс-тьом. В клинике скорой помощи им.Склифасовкого выделенные от больных штаммы несли детерминанты гемолитической активности в 20,66*2,2 % случаев, а из внешней среды - 7,69*1,7 % случаев.

Этот показатель патогенности был менее выражен у штаммов от больных из )• I и » 2 железнодорожных клиник- в первом случае 30,18*3,1 %, а во втором - 17,94*1,7 '%. Из внешней среды 10,0*1,И и 30,0*3,1 % соответственно.

В Центре термического поракения выделенные от больных штаммы в 34,37*3,3 % случаев характеризовались этим признаком, а что касаемся внешней среды - гемолизины продуцировали 29,26*2,6 % соответственно.

Штаммы, внцеленные из двух фе[.« ¿или гемолитичны, в первом и втором случаях они составили - 25,0*2,3 %.

У штаммон iOnvobnuturtum гемолитическая актипность не отмечались.

Кроме этих признаков патогенности, у бактерий были выявлены и другие, в частности, р.пегив!пова - синтез эгзотоксина А (Р,легик1пова).

Исходным материалом служил фильтрат штамма Р.пеги$1лозп Р407, который наносили на колонку иммунноафинной хроматографии, которая была концентрирована 10 раз 65 % раствором аммония сульфата. Вместе с токсином были выявлены и другие белковые фракции, для их удаления был использован метод гель-фильтрации в сефакри-ле 3-200. После проведения эксперимента был'выделен чистый препарат. Он характеризовался адфрибозил трансфераэной активностью (рисунок I).

Рисунок I. Характеристика различных препаратов экзотоксина А в агарозном геле, выделенных из штамма р.9вгие1пояа р '407.

1. Концентрированный фильтрат культуры

2. Препарат после гель-фильтрации

3. Препарат после иммуюсорбента.

I

2>

Дпя конечной очистки препарата использовали метод элюции после проведения электрофореза в полмакриламидном геле. Полученным препаратом - экзотоксином А, иммунизировали кроликов для получения антисывороток, Из антисывороток готовили антительный сорбент, который использовали для выделения экзотоксина А из нультурального фильтрата. Выход активного продукта составил 8-10 ыг в I литре из исходного фильтрата.

Иммунохишческий анализ с поливалентной сывороткой, электро-форетический анализ белковых фракций в полиакриламидном геле доказал, что препарат является гомогенным, состоит из одного антигенного компонента, одного белкового компонента, отмечается только адф-рибоэид трансферазная активность.

О чистоте препарата говорит высокий удельный вес поглощения ультрафиолетовыми лучами, биологическая активность 9000-10000^Д/иг," молекулярная масса выделенного препарата составила 66000 дальтон.*

После изучения антигенных свойств неферментирующих бактерий установлено, что кроме известных перекрестных реакций между u.ie-oimata , M.nonliquefaoiene , M.bovie ' обнаружены общие антигены И у M.oßloenals , M.phenylpyruvica и A.lwofii,

Штаммы A.calcoaceticus не имели перекрестных реакций с Pseudomonas и Flavobaoteriura , Между A.calcoaceticus и A.lwof-r^ была выявлена слабая антигенная связь.

Четко выраженные перекрестные реакции были выявлены (таблица tj) (1:320 - 1:640) У M.lacunata , H.nonliquefacieno , Ы.bovis. Их антисыворотки слабо реагировали (титр 1:10-1:60) с антигенами H.oslo-insiB , M.phenylpyruvica , A.lwoffi . Антисывороткн A.calcoaceticus отличались определенной типоспедафичиостъю и давали перекрестную реакцию только с A.lwofii (титр 1:80). Такая типоепецифичноеть отмечалась у P.aquatile .которая давала перекрестную реакцию с l^devorans (титр 1:320). Относительно специфична реакция агглютинации у Р.aeruginosa с ' P.putida (титр 1:320). р.aeruginosa дает слабуо реакцию с A»l«offi (титр 1:60) и с p.Rtjuatile (титр 1:20). (таблица 2).

Как видно из приведенного материала у грамотрицательных нефер-ментирующих бактерий отмечалось наличие обо;и> антигенов и которые дают перекрестные реакции.

Нами были проведены эксперименты по выявлении специфических ыгсигенов или отпелмш« видов бактерий. Получив суммарные антигены, методом i'f-ш.- фильтрации раацеиилп их на отдельные фракции.

<s

1

X

0)

f-.

o

n

<D

&

u.

s

s

s

<u

c*

o

o

t.

o

in

o

a

t-i

u

a T* s

3

a> a

ra f

o

3 n.

o

m

a

3 CJ

5 N

i

1 jp X

>i

t-,

«i w M

rs

s

3

s

i>

o,

a

n,

H

s

tí

a

i

a

0) a x ¡s 01 to >i

0PT* -nd'd

B sou -l3r\j

BUTMOA -3PM

»TH« -nbe y

TJ -JOMT •v

snafl ■ aaMoo .fao-y

uofAna -MilAi aqd'K

vjs -vaox -80*1'

BJ A

-oq'K

PV3J0

■anlTX -uou'f

nuns

-sri';'

O CO «18

II I'll

I I

II III

o

CM

o

-CM co

a o

¡8 3

3

ii ii

-co-cr CM -

H <£>

I I I

O O

C3 8

i

-rr

S

i i

8 i

CO CNJ

I I I I

-er"

Q 00

§ s $ a

O O O ') o

H <}> w ^r

I I I I I

o o 35 W 5J <M r J ri m

liili

o o

\0- 'D

O «3*

lili

o

U3 o o

'O o o

c\¡ >0 O CO f-1

í—( i—f t—1 l-H f-l

O I

X t"

w 3

3

u

•H

o el

V(

ra w +> 3

ci

3 .

(I tí tí o r-t (3

tr

t>

3 h f>. P.

rí <u íl

O k

f

u'j

o a

a]

á o

o rj o

í-l 9 fl

■H ■rl •H 01

Vi JJ k M Jf

«H u! o a

o 3 > h

ES cr a)

l-f ol C? ■i P.

• ■ •

>64 f»«

• » O M

c- 'O OI t-( l-í

I I I

С помощью хромат.ографии были получены фракции антигонов,которые имеют различные, а также одинаковые молекулярные веса.

Для Moraxella специфической и различающейся от Plavg-beoteriun\ Acinetobacter была вторая фракция. Такой же типо-специфической для Acinetobacter была четвертая фракция, из которых были приготовлены эритроцитарные диагностикумы. У штаммов Flnvobacterlum не выявлена специфическая фракция. Диагностикумы, приготовленные из фракций Flavobacterium давали перекрестную реакцию с Acinetobacter и Moraxella.

Методом иммуноэлектрофореэа в крови больных выявлены специфические антитела. Кроме этого изучена кровь 82 практически здоровых лвдей. Возраст доноров 23-Ь5 лет.

Из эталонных штаммов Moraxella t Acinetobacter ( Pseudomonas и iiavobacterJчт приготовлены антигены. Изучение в крови здоровых людей титра антител дало следующие результаты: корреляционный коэффициент между различными данными составил от 0,24 до 0,16, что укаэывяет на слабое взаимодействие между различными фракциями других видов. На основании пол: ¡енных результатов установлена ориентировочные диагностические титры для агглютиногии. Минимальным диагностическим титром в реакции считают такое разведение сыворотки, которое в 2-4 раза превосходит максимальный уровень среднего геометрического показателя, вычисленного с 99,У % точностью.

Лослр установления титров в сыворотке крови у здооовых людей методом иммуноэлектрофореэа выявлены антитела у больных.

Изучена антибиотикочувствительность 115 штаммов Moraxella к 10 антибиотикам. Установлено, что все штаммы резистентны к различным антибиотикам. Особый уровень устойчивости отмечали к пенициллину, оксациллину, линкомицину, тетрациклину, эритромицину, хло-рамфениколу и стрептомицину. Штаммы Moraxella были менее резистентны к канамицину и карбенициллину, я к гентамицину , клафорану и полимиксину все штаммы были чувствительными. Минимальная .подавляющая концентрация антибиотика относительно низка.

Из штаммов Moraxella lacunatа ml 121 выделены 4 плазмиды, мол кулярная массе которых составила: iß.OslD ; 7,0 md ; 5,4 md; 3,2 md . Эти плазмиды несли маркеры резистентности в первом случав к пенициллину, хлорамфениколу, эритромицину и она была обозначена как pjiia 121 . Вторая плазмида определяла устойчивость к эритромицину ч хлорамфениколу и обозначена как pMLCE 121.

Третья плазмида 120 обуславливает резистентность к хлорам-

фениколу. Эта плазмида обнаружена в штамме MII20 и ML 36. Все плазмиды, выделеннме из Moraxella, были неконыогативними. Плазмида рмьв 36 определяла устойчивость к эритромицину.

Методом ультрацентрифугирования выделили сверхчистые препараты плаэмидных ДНК, которые изучены с помощью электронного микроскопа. Репером служила плазмида Р"П с молекулярным весом 1,9 MD. Все 27 культур Plevobaoteriua оыли изучены на чувствительность к антибиотикам. К четырем антибиотикам резистентный были 14,81*1,1 з>, к пяти 25,92+1,6 %,'к шести и к семи антибиотикам - I4,8I*I,Ij 11,11*1,0 Я.штампов, а к восьми и девяти антибиотикам ,2^*2,0^. и" 11,11*1,0 % соответственно.

Рост резистентных штаммов Plavobaoterium подавляется низкими концентрациями антибиотиков - 10-20 мкг/мл. В пяти штаммах выявлена плазмида с молекулярным весом 7,0 MD , которая определяет устойчивость к эритро!.: щину и хлорамфениколу , обозначенная как р?ЗГ2, Выделена плазмида с молекулярной массой 3,5 MD, определяющая устойчивость только к хлорамфениколу и обозначена как pFCra 312,

Методом ультрацентрифугирования в .градиенте Ceci выделены чистые препараты этих плазмид. Все плазмидн Flevobacterium не-коныогативние.

Изучены 23? культур Acinetobacter на чувствительность к антибиотикам.

К одному антибиотику резистентны были 4 штамма - 1,66*0,1 %, к двум 10 штаммов - 4,2*0,4 %, к трем антибиотикам резистентность выявлена у 8 штаммов - 3,37*0,4 %, к четырем - 12 культур -5,Ou*0,ti i, к пяти антибиотикам резистентны 90 штаммов - 8,43±1,1^> к шести - 25 штаммов - 10,54*1,3 %, к семи и восьми антибиотикам устойчивые были 35 и 38 штаммов, что составило 14,76*2,2 % ; 16,03*2,3 % еоответстэенно! н девяти, десяти и одиннадцати антибиотикам устойчивы били 52, 10, 15 культур, что составило 21,94*2,оь 4,2-0,4 % и 6,32*0,0 % соответственно,

- Использование метода мшшмальн-й подавляющей концентрации антибиотика показало, что устойчивость к пенициллину,онсацилличу, ампициллину, тетрациклину и эритромицину выражается в высоких концентрациях 100-200 икг/мл. К сильнодействующим антиоиотикрм- кла-форнну, полимиксину, гентаминину, карбемициллину и канамицину по-павчнющив концентрации составили 10 миг/Мл, 20 мкг/мл и 50 мнг/мл.

Особый интерес вызвало установление наличия R- плазмид в . штаммах Acinetobacter и их классификации. Донорами использо- . ваны 50 мнокественнорезистентных штяммов ацинетобактер, от которых плазмиды резистентности передавались в полиауксотрофный штамм ML 4262 (рао) . Донорные штаммы Оыли резистентны к

стрептомицину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу,тетрациклину, канам-цину, эритромицину, кэтоцефу, полимиксину.После скрещивания донорных и реципиентных штаммов установлено, что у 46,0 % культур содержатся R - плазмиды. В состав плазмид вводят генн, которые детерминируют резистентность к стрептомицину, хлорамфениколу, канамицину, карбенициллину и тетрациклину.

Резистентность к кэтоцефу, полимиксину не контролируется R-плазмвдами.

Из штамма Ао 107 .оделена плазмида с молекулярной массой 280,0MD , коньюгативная Incpi группы и детерминирует устойчивость к карбенициллину, канамицину, тетрациклину, такая плазмида выявлена в шт ммахАо 136, Ао 17, Ас31. Из штамма Ас 188 выделена плазмида, которая относится к группе несовместимости tncpii имеет молекулярную массу 170,0 MD и детерминирует резистентность к карбенициллину. Штамм Ас 28 содержит плазмиду с молекулярной массой 230,0 MS , принадлежит к incpi группе несовместимости, и детерминирует устойчивость к карбеницил-. лину, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, гентамицину, стрептомицину.

& штаммах Ао 17 и Ас 31 выявлены неконьюнативные плазмиды с молекулярной массой 25,0 MD и 18,0 ив .Определяют устойчивость к стрептомицину и сульфаниламидам и относятся к группе несовместимости Incpiv (таблица 3).

Таким образом установлено, что госпитальные штаммы Acfce-tobaoter содержат коньпгативные и неконьюгативные плазмиды, которые принадлежат к РАО системе плазмид.

У 755 штаммов Pseudomonas к пенициллину, оксациллину, «шицшг чу, эритромицину, л-мкомицину отмечалась 100 ъ устойчивость. К шести антибиотикам резистентны были 25 штаммов.-3,Л*0,6 к семи,восьми,девяти,десяти и одиннадцати антибиотикам - 5?, II, 35, 107 дтаммо*, что составило - 6,75*1,0 11,6541,3», 14,03+1,4 12,5841,Ь 14,1741,6 * соответственно. К двенадцати, тринадцати и четырнадцати антибиотикам устойt; эость »гибч'-'лвсь у с31, 50 и 42 культур, что составило %,

Плазмиды,,вьдаеленные из госпитальных штаммов. Aelnetobecter

Таблица L

Плазмида Фенотип Группа несовместимости Частота коньвга-тивной передач! Молекулярная масса (md)

рАо 107 Cb, Ka, Te, Tra+ ЩСР1 10"° ¡¿60,0

РАС 17 Cb, Km, Te, Tra+ '' mcpi Ю-3 280,0

рАо 31 Cb, Km, То, Tra+ inepr ■ ИГ4' 280,0

рАо 136 Cb, Km, Te, Tra4 mopi кг3' 280,0

РАС I8P Cb,' Tra+ incPII ю-4 170,0

pao -¿а Cb, То, Cm, Gn, 3m, Tra" №CPI Ю"3 230,0

рАс 5 17 Sra, Su, Tra' XncPrV - 25

pAoS 31 3ro, Su, Tra IncPTV - 18

pAoSS 17 3ra, Üu, Tra IncPlV - 18

pAoSS 31 Sra, Su, Tra IncPlV - 25

6,62*1,0 ъ, 5,56*0,9 1Ь соответственно.

По отношению к штаммам изучена минимальная подавляющая концентрация антибиотика. К тетрациклину, стрептомицину., хлорамфени-колу, канамицину и карбенициллину концентрация антибиотика была 50 мкг/мл, а к гентамицину, клафорану, кэтоцефу и полимиксину 50 мкг/мл.

Для изучения генетической природы резистентности у штаммов раешЗото.ав изучено 92 штамма. Они несли детерминанты резистентности-к стрептомицину (78,2 ть), гентамицину (68,4 ъ), тетрациклину 160,8 7а), карбенициллину 457,6 ть), канамицину (57,6 20 > штаммов содержат й-плазмиды резистентности.

Резистентность к полимиксину, клафорану и кзто^фу контролируется хромосомными генами. Выявлен., плазмида рЭП , молекулярная масса 250 МО , детерминирует устойчивость к каобенициллии", канамицину, тетрациклину.Она коньюгативна и относится к группе несовместимости 1поР1 . Выделена плазмида. рэ23 с ыолег'>лпрной массой 240,0мп , принадлежит к группе несовместимости РГ

и определяет устойчивость к карбенициллину, канамицину,тетрациклину,

хлорамфениколу, гентамицину, стрептомицину (таблица 4).

Плазмиды, выделенные из госпитальных штаммов Pseudomonas

Таблица 4

Плазмида >........... Фенотип Группа несовместимости Частота коныога- тивности Молекулярная масса (MB )

рз И СЪ, Кга, Тс, Тга+ mopi IO"4 250

P323i3 Cb, Km, То, Om,Oi»,Sm, InoPI , IO"4 240

pS 36 Ob, Trn InoPXI Ю-3 240

PeR.36 Cb, 3ra,am,Tra+ mopvx IO"3 80

Рз 113 Sra, Hg, Tra+ InoPSIX IQ-3 210

PSRII3 So, Tra InoPVXI IO"4 120

Как видно из полученных результатов широкое распространение инфекциогчых заболеваний, вызванных антибиотикорезистентными штаммами неферментирущих грамотрицателыщх бактерий, указывает ня необходимость применения новых или модифицированных биологических пре паратов для борьбы с этими заболеваниями.Наиболее перспективными являются специфические .бактериофаги. На современном этр 'е применяются пиоцианеус и ацинетобактериофаги, однако, при этом не учтены 5-6 новых видов бактерий этого рода. Что касается бактериофагов против Moraxella и Flavobaoterium , работы по этому вопросу не проводились.

Против госпитальных и эпизоотических штаммов были выделены гри фагаШ 32,Щ 64, Ш III. У них негативные колонии средних и больших размеров и принадлежат к III v 1У морфологическим типам. Для Flefobaoteriua выделены два фага FLPI5 и PUII8, у который таки- средние и большие негативные колонии. Они принадлежат гм» классификации к У и III морфологическим типам.

й®32 обравуют негативные колонии, которые имеют диаметр 2-3 нм (рнсуно* 21.

М® fc4 и I» III бактериофаги образуют большие негативные ко-ясни», диаметр которых составляет 4-7 им (рисунок 3>.

Рис.2. Негативные колонии фага МФ 32 на твердой ' питательной среде

Рис.3. Негативные колонии фага И> 64 на твердой питательной среде

Для отдельных фагов вычислили константу нейтрализации антифаговой сыворотки (таблица 5).

Серологическая характеристика фагов Moraxella

Таблица 5

Фаги Определение качества нейтрализации антифаговых сывороток

U4 > 32 10 64 МФ. III

мин~* % мин"* * мин"* *

Мф 32 Мф S4 М®., III 96,7 18,6 37,3 I0U 100 100 92,3 95,3 14,1 100 100 14,6 - - .

Константа нейтрализации к гомологичному фагу соответствовала 100 %.

?ХЯ6 фа! образует негативные колонии, диаметр составляет 4-6 мм (рисунок 4).

Ркя. 4. Негативны^ колонии фага FUI Б на твердой питательной среде Диаметр ..егативиой колени и фага WJI6 достигал 6-7 мх (рксуиок Ъ).

на< твердой питательной среде

Вычислили константу нейтрализации .фагов ПауоЬасюз^иш в отношении антифаговых сыворосок (таблица 6)

Серологическая характеристика фагов Р1ауоЬас1ег1ит

Таблица 6

Фаги Определение качества нейтрализации антифаговых сывороток

РЬ? 15 Р1Р ПВ

% мин""* *

РЬР 15 ПЛ? 118 ЗР,2 26,1 100 100 92,1 18,6 100 100

Изучена чувствительность штаммов МогахвПи специфическим бактериофагам, она составила - £И,3±1,3 %, также высокой чувствительность» отличаются штаммы р1ауоЬао1вг1ип к специфическим бактериофагам - 65,18*1,6 %,

Еыл разработан поливалентный лечебно-профилактический бактериофаг, в состав которого входили флаво и моракселлабактерио-фаги. Третьим компонентом был добавлен пиоцианеус бактериофаг, размноженный на госпитальных штаммах, чувствительность штаммов Pneudoraonae составила 90,0*2,1 %.

Установлено также, что резистентность к бактериофагам штаммов Moraxella , pseudomonae , Aclnetobaoter ( Fla-vobaoteriuniHe обусловлена наличием в этих штаммах R- плазмид.

Таким образом, проведенные эксперименты, клинико-лаборатпр-ные исследования дополняют и расширяют представления о культу-ральных, биохимических, антигенных, вирулентных свойствах и ан-тибиотикорезистентности бактерий Aoinetobaoter , Moraxella,

Pneudomonn , Flavobacterium.

Полученные данный дают возможность по новому рассмотреть роль этой группы бактерий инфекционной патологии человека и животных в формировании госпитальных и эпизоотических штаммов.

ВЫВОДЫ:

1.Ha основании проведенных морфофизиологических, биохимических и других исследований установлено, что грамотрицательные нефермен-тирующие бактерии составляют'21,19 % от общего числа условно-патогенных бактерий, которые выделены из клинических стационаров и животноводческих ферм. Полученные результаты подтверждают возрастающую этиологическую роль Aoiçetobaoter, Moraxella , peeudomonaa

Flavobaoterlua в гнойно-воспалительных процессах, а также при эпидемиологических и эпизоотических инфекционных вспышках.

2. Использование оригинальней, агаризованной селективно-дифференциальной среды, которая приготовлена на отварах бычьего сердца, сетчатки или рубца, куда д;бавлены дрожжевой экстракт, глюкоза, Твин 60, карйенициллин, индикатор повышает аффект ввделрния Moraxella и piavobaoterium за счет подавления кокковой микрофлоры и дифференцирует колонии по цвету.

3. Разработаны на обнове традиционных методов схемы идентификации бактерий Moraxella , A^lnetohaoter . , Flavobecterlua , В которые включено минимальное количество тестов и апробированы в клинических лабораториях.

4. У различных видов бактерий рода Moraxella , Acinetobacter Pseudomonas , Flavobaoterium отмечаются перекрестные антит^н ные реакции, однако, для них характерны и специфические антигенные свойства, которые были выявлены с помощью хроматографии, электрофореза и другими методами.

5. Установлено, что грамотрицательные неферментирующие бактв( .|и характеризуются выравненными патогенными свойствами: энтеротоксиген-ностьи, адгезивностыо, гемолитической активностью.

6. Выделенные от больных и из внешней среды штаммы Aotneto-bacter,Moraxella , Pseudотопив , ?iavob:oteriu/a характеризуются антигенами адгезии.человеческого типа CFAI , CîAII , CFAiii, а штаммы, выделенные от крупного рогатого скота как человеческие,i, так и антигенами адгезии животного типа- к88, к99, vir.

7. Еивотноводчг^кие фермы могут являться загрязнителями внешней среды условно-патогенными бактериями, в частности, • Acinstobt. ter > Moraxella , Pseudomonas , Flavobacterlua и следовательно,факторами передачи возбудителя.

8. Выделены и обработаны отдельные специфические антигешше фракции Acinstobacter и Boraxella , с помощью кото; [jx наго товлены эритроцитарныа диагностикумч.

9. Питательная среда, приготовленная на основе Мартеновского бульона обеспечивает продукцию экзотоксина А . Токсическая активность продукта, полученного от Р.aeruginosa р407 100-150Ь р, '50.

10. Гомогенный препарат экзотоксина * выделяется после культивирования 15-16 часов, который диссоциируется после иммунохими-ческого, электрофсрезного анализа и гель-фильтрации в сефакриле S- 200.

11. Изучена антибиотикочувствительность бактериальных штаммоз к 19 антибиотикам, их минимальная подавляющая концентраци® и установлено, что клинические и эпизоотические штаммы Moraxella , Plavobncterium , Peeudomonaar , Aiin*tobaoter характеризуются природпй и приобретенной (плязмидная) резистентностью по отношению к тем антибиотикам, которые наиболее часто применяются против грамотрицательных неферментирующих бактерий.

12. В штаммах Moraxella , piavobaoterium распространены неконьюгативные Н-ьлаамиды, молекулярная масса которых составляет! 18,0; 6,0t 5,4; 3,2} 7,0; 3,5 М1),соответственно.0ни определяют резистентность к пенициллину, хлорамфениколу, эритромицину. Бактери" Acinetobacter и Peeudoяопав содержат неконьюгатив-ные R- плазмида, у которых молекулярная масса 18,0; 25,0 МР; они принадлежат к группе несовместимости incpiv и детерминируют устойчивость к стрептомицину и сульфаниламидам.

13. Различные виды рода Acinetobaoter содержат коньюгатив-ные плазмиды, молекул-рная масса которых 260,0 HD , 230,0 MS 170,0 MD .Они определяют устойчивость к карбенициллину, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, гентамицину, стрептомицину

и относятся к группам несовместимости incpr, терц.

14. Штаммы Pseudomonas содержат коньюгативные н-плазмиды, имеют молекулярные массы 250,0 МБ , 240,0 MD , 210,0 MD ,120,0 MD, 90,0 MD .Определяют резистентность к карбенициллину, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, гентамицину, серебру и принадлежат

к групп» несовместимости Ir-Pl, Incprr, iacPYl, mcpvn, Iaepxil.

15. Плазмиды"с маленькими молекулярными весами, которые детерминируют устойчивость к одному или двум антибиотикам, могут быть примвнет в -енн'-иншенерныл работгт.

16. Выделены специфические бактериофаги против Moraxella

и nevrfhacter/ua , которые принадлежат к III, У, и Ш,1У i:op-фелогкчеекж» типам. Бактериофаги отличаются высоко., эффективностью

действия против этой группы бактерий.

17. Фагорезистентность неферменти,,ующих граыотрицательных Оактерий к лечебно-профилактицеским бактериофагам не обусловлена Ч- плазмидами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Идентификация неферментирующих грамотрицательных бактерий в клинических бактериологических лабораториях рекомендуется в два этапа. На первом этапе используются пять основных прчзна-ков: морфология клеток, образование пигмента, подвижность,окси-дазная активность, окисление глюкозы. Для окончательной лиагнси;-тики должны быть применены следующие тесты: рост на среде с 6,5% НаИ, рост при 42°С, на мак-конки, окисление лактозы, мальтозы, ксилозы, галактозы, образование иддола, сероводорода, газового азота, утилизация и флуоресценция цитрата, редукция нитратов, образование желатиназы, уреазы, аргининдегидрогеназы,амилазы, фенилланани^деэаминазы, каталазы.

2. Систематический анализ бактериологического материала,выделенного от Сольных и из внешней среды, дает возможность определить эпидемиологическую ситуацию.

3. Плазмиды Moraxella и Flavobacterium с цаиенькими молекулярными массами, которые детерминируют устойчивость к одному или двум антибиотикам, могут быть применены в генно-инженерных работах.

4. Для оздоровления эпидемиологической ситуации в Центре-термического поражения'(г.Тбилиси) применены поливалентные бактериофаги, адаптированные на госпитальных'штамма .

5. Коньюгативные R - плазмиды »clnetobaoter , pseudo«-гаопаа с большими молекулярными массами,,которые легко распространяются на различных видах бактерий, могут быт^ рассмотрены как показатели и маркеры чпидемиологичеекий ситуации.

ü. Разработаны и внедрены эритроцитарныи диапюстикумы для Aoinetobacter, Moraxella.

CilHCUi РАБОТ,ОПУШЖОВАННЫХ 110 ТЫ11£ ДИССЕРТАЦИИ

I. Распространение Я - плазм ид среди клини".' ikiü iut/шмив оинегнойной палочки // Актуальные вопросы биоионш и м:'Шкннь.

¿fit' о ^тъ-опе/ъ^

»1, «.изв. АН Грузии.сер. биологическая "Мецниереба".1988. с 358-362/ в соавт. Алавидзе З.И., Тедчашвили М.В., Чанишвили Т.Г.

2. Распространение R- плазмид* в клинических штаммах стафилококков // Актуальные вопросы биологии и медицины, №1, ж.изв. AJ1 Грузии, сер. биологическая "Мецниереба". 1980. с. 352-357/

в соавт. Алавидзе З.К., Тедиашвили М.В., Чанишвили Т.Г.

3. Выявление и изучение коньюгятивных R- плазмид среди клинических штаммов синегнойной палочки // I? Республиканская научная конференция молодых медиков. Бакуриани 6-1I апреля 1988 г. Теез.докладов. с. 525-526/ в соавт. Тедиашвили М.В., Аухуна-мвилиТ.Д,, Махвиладзе К.Л.

4. Плаэдиды и некоторые биологические свойства менингококка // Вопросы физиологии у лтаболизма и идентификации микроорганизмов Сборник научных трудов. Москва. 1988 г, с 134-136/ в соавт. Хецу-рианиК.Г., Гоциридзе И.А., Миронова Т.К.

5. Плазмиды ме"ингококка // Журнал Микробиологии,вирусологии, иммунологии S3, 1989, с, 27-30/ в с авт.Хецуриани К.Г., Миронова Т.К., Костюкова И.И. < Москва)

6. Распросгранение R - плазмид в госпитальных штаммах золотистого стафилококка // Медико-социальные вопросы охраны материнства и детства. Тез.докл. 18 Республиканская конференция молодых медиков Грузии. 1989 г. с. 69 / в соавт. Тодуа М.А., Метревели Д. Ч., Имнадзе П.Г.

7. Изучение спектра антибиотикореэистентности у штампов протея // Медико-социальные вопросы охраны материнства и детства.Тез.

,окл. 18 Республиканская конференция молодых медиков Грузии.1989 г. с. 101 / в соавт. Чиквиладзе Д.П., Имнадзе П.Г., Квиташвили И,А.

8. Комплексное лечение неспецифических заболеваний органов дыхания у больных хроническим легочным туберкулезом// Эпидемиология; клиника и лечение туберкулеза. Сборник трудов т.20.Тбилиси 1989 г., с. 136-144/ в соавт Кереселидзе Т.Г., Вашакидзе Л.Ш.

9. Некоторые особенности госпитальных штаммов золотистого сп.нлококка // Республиканская научно-практическая конференция "Современны» научно-техниче кий прогресс". Сборник трудов,27-28 октября. I9W . с. II0-II1. Цхилтубо.

10. Сода»л conjugate® K-pl(i«raid«e isolated from hospital stnalnr ef pseudomonee aeruginosa/VAlli arid for p- tdent VSA of an-

tibiotico, 1989, v.7, N4. рЗ (wlth T.Kereeelidze, L.Olatman, f.öaluihico, T.Chaniehvili),

11. Антибиотикочуствительность и фяготигчрование клинических штаммов синегнойной палочки различных О-серогрупи// В книгй: Акт. альные вопросы гематологии и трянсфуэологии, Тбилиси,1990г., с. 143-152 / в соавт, Чанишвили Т.Г., Иашвшш Б.П., Гомарели Г Р.

12. Распространение R - плазмид в госпитальных штаммах рго-Ьеия // Журнал серия биологическая 1990 г, т.16, №15, с. 318-324/ в соавт. Чиракадэе И.Г., Чиквила,:.je Д.П., Чиджавадэе Ы.Л.

13. Электронномикроскопическое изучение плазмид, выдпенны^ из госпитальных штаммов воло?^истого стафилококка// Материалы XX Республиканской научной конференции. Тез.докл. Бакуриани. 15-£) февраля.1991 г. Тбилиси, I99J г. с. 22-23/ э соавт. Тодуа М.А.

14. Видовая идентификация и антибиотикочувствительность штаммов Морак^елла // Серия биологическая 1991 г., т.17, № 5, с.335-327 / в соавт. Ыакаридзе М.Р., Чиковани A.A., Чанишвили Т.Г.

15. Видовая идентификация и антибиотикочувствительность штаммов Acinetobactjr // Журнал серия биолигическая. 1992, т.18,

)Н, с. 36-40/ в соавт. Ыакаридзе М.Р., Чанишвили Т.-Г. (Москва)

16. Ü методах, выявляющих внехромосомныо факторы патогенное-ти и антибиотикорезистентности'у токсигенных клостридиев// Методические рекомендации. 1991 г. Тбилиси, с.Т-20.

17. Изучение некоторых факторов патогенности у бактерий кишечной палочки и анаэробных бактерий // Методические рекомендации.

1991 г., Тбилиси, I-I8 с.

18. Факторы патогенности у бактерий рода Auiaetobaoter // Журнал Микробиология, вируслогия и. иммунология № I, с. 14-15,

1992 г./ в соавт. Шендеров Б.А., Чанишвили Т р., (.Москва)

19. кнтибиотикочувствительность и факторы патогенности госпитальных штаммов синегнойной палочки, выделенных у больных из реанимационного отделения// Журнал "Антибиотики" № 2, с. 17-10.1992 г./ в соавт. Макаридр". М.Р., Чанишвили Т.Г., йащвили В.II. ifiocHBu)

20. Изучение коньюгативных н - плазмид, выделенных из госпи •гальных'штаммов синегнойной палочки, / Яурнал Антибиотики, 12, ч. 39-41, 1992 г./ в соавт. Галушка Ф.П., Чанишвили Т.Г. (Ыо^нвз)

21. Изучение плазмид антибиотикорезистентности и.ч различны* штаммов золотистого стафилококка // Журнал "Антибиогнки", " V,«. 33-3ü,I993 г./ в соавт. Чанишвили Т.Г,, Мянприп . М.Р. (Уо квн)

22. Нарушение гемомикроциркуляции в печени и её влияние на концентрацию ампициллина в крови при экспериментальном остром • гнойном холангите// Груз. НИИНГИ д^понир. 05.07.91 г. » 748-91/ в соавт. Сахеварашвили Г.И.

23. Способ получения лизина // Авторское свидетельство

И 4845692/13 2.УИ.90 г. Москва. Государственный комитет изобр. и откр. / в соа т. Арутюнян С.А.

24. Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления антител к Ао1.ггв*оЬас1ег оа1ооас«иси« // Авторское свидетельство от 17.УП.1990 г. » 63548./ в соавт. Ригвава С.АДМосква).

. 25. Способ получения концентратов бактериофагов с высокой активностью// Удостоверение на рационализаторское предложение I» 05/91 от 19.03.91 1./ в соавт. Алавидзе З.И., Годердзишвили М.Г;

26. Способ производства высокоактивных бактериофагов, адаптированных на госпитальных штаммах// Удостоверение на рационали-ааторское предложение * 06/91 от 25.03.Л.

фоЛоЬп ¿одоЦ ¿а ¿айлЬгоБпл

Р1ауоЪаогег1ига, Могаже11а, РявиЛотопа») Ът^поЛстп

9йпо лпеч1 аа^эообпьо с^л (зьтуу^ий

''Диссертационный вестник" (на русском)

Заказ 121 Тиран ЬО

Типография V 4