Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Генетическое разнообразие и фармакодинамическое обоснование прогноза резистентности к антимикробным препаратам нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp. в различных регионах России и Беларуси

На правах рукописи

004599700

МАРТИНОВИЧ Алексей Александрович

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРОГНОЗА РЕЗИСТЕНТНОСТИ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ ACINETOBACTER SPP. В РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНАХ РОССИИ И БЕЛАРУСИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

1 kW? 2910

Смоленск -2010

004599700

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и микробиологической лаборатории НИИ антимикробной химиотерапии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

Доктор медицинских наук, профессор Козлов Роман Сергеевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор медицинских наук, профессор Ушкалова Елена Андреевна Доктор медицинских наук Сидоренко Сергей Владимирович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «21» ^ 2010 г. в

Л часов на заседании диссертационного совета Д 208.097.02 при ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (214019, г. Смоленск, ул. Крупской, д. 28)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Смоленской государственной медицинской академии

Автореферат разослан Ллй^^Д. 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Яйленко А. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Нозокомиальные инфекции являются основной инфекционной проблемой любого современного стационара (Relio J, 2002). Особенно остро этот вопрос стоит в отделениях со значительным потреблением антибиотиков, где нозокомиальная инфекция развивается у каждого пятого пациента и является основной причиной летальности (Alberti С, 2002). Одним из наиболее проблемных нозокомиальных возбудителей в зарубежных странах является Acinetobacter spp., при этом более 75% штаммов в Европе (Masterton R.G., 2005) и более 50% в США (Rhomberg PR, 2009) резистентны практически ко всем имеющимся антимикробным препаратам. Относительно высокую активность сохраняют карбапенемы, однако, благодаря продукции приобретённых карбапенемаз, и эти препараты теряют свою эффективность (Perez F., 2007). В связи с этим ведётся постоянный мониторинг резистентности к данной группе препаратов (Turner P.J., 2008). По данным российских исследователей, в нашей стране ежегодно отмечается порядка 2,5 млн. нозокомиальных инфекций (Акимкин В.Г., 2005). Причиной 15% из них в ОРИТ является A. baumannii, который более чем в 60% случаев является резистентным к трём и более группам антибиотиков. Группа карбапенемов сохраняет довольно неплохую активность, но некоторые штаммы проявляют устойчивость и к данным препаратам (Решедько Г.К., 2008). Масштабы распространения резистентности к карбапенемам, а также её механизмы на настоящий момент времени не изучены. Необходимо проведение крупного микробиологического исследования, которое помимо этого должно ответить на вопрос, какие препараты могут быть рекомендованы для включения в лекарственные формуляры и использованы в эмпирической терапии инфекций, вызванных полирезистентными ацинетобактерами, а какие следует исключить при данных инфекциях. Для возможности прогнозирования активности карбапенемов в будущем, необходима также оценка эпидемических свойств циркулирующих штаммов.

Цель исследования

Изучить с помощью современных методов генетическое разнообразие, динамику резистентности к антимикробным препаратам и распространённость карбапенемаз среди нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp., выделенных в отделениях с интенсивным потреблением антибиотиков, и разработать на этой основе рекомендации по оптимизации эмпирической и этиотропной терапии инфекций, вызванных этими микроорганизмами.

Задачи исследования

1. Оценить в динамике распространенность Acinetobacter spp. в общей структуре грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций.

2. Определить с помощью современных методов чувствительность Acinetobacter spp. к используемым и перспективным антимикробным препаратам.

3. Разработать технологию ЛЦР в реальном времени для детекции приобретённых карбапенемаз молекулярного класса D у Acinetobacter spp.

4. Выявить распространённость металло-р-л актам аз и ОХА-карбапенемаз среди клинических штаммов Acmeiobacferspp., нечувствительных к карбапенемам.

5. Оптимизировать протокол мультилокусного секвенирования-типирования Acinetobacter baumannii и с его помощью изучить генетическое разнообразие карбапенемазо-продуцирующих штаммов.

Научная новизна работы

Впервые:

1. Организована система мониторинга карбапенеморезистентных штаммов Acinetobacter spp., вызывающих нозокомиальные инфекции в стационарах 21 города 7 федеральных округов Российской Федерации и 2 городов Беларуси.

2. Дана оценка in vitro активности перспективных антимикробных препаратов в отношении нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp.

3. Разработан метод ПЦР в реальном времени для быстрого выявления генов приобретённых ОХА-карбапенемаз у Acinetobacter spp.

4. Изучена принадлежность карбапенеморезистентных штаммов Acinetobacter spp., вызывающих инфекции в стационарах России и Беларуси, к циркулирующим международным эпидемическим клонам.

Практическая значимость работы

1. Организованная система мониторинга карбапенеморезистентных штаммов Acinetobacter spp. в стационарах России и Беларуси является одним из направлений работы Научно-методического центра Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по мониторингу антибиотикорезистентности.

2. Полученные фармакодинамические данные по активности различных классов и групп антимикробных, препаратов позволяют прогнозировать резистентность нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp. в России и

предложить рекомендации по этиотропной и эмпирической терапии инфекций, вызываемых данным родом микроорганизмов. 3. Разработанный метод ПЦР в реальном времени и оптимизация протокола мультилокусного секвенирования-типирования А. ЬаитаппИ позволяет расширить возможности лабораторий центров Госсанэпиднадзора и микробиологических лабораторий при лечебно-профилактических учреждениях по своевременному выявлению эпидемиологически опасных штаммов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. АЫпе1оЬас1ег эрр. является вторым по частоте неферментирующим грамотрицательным возбудителем нозокомиальных инфекций в отделениях с интенсивным потреблением антибиотоков многопрофильных стационаров России.

2. Выявленная у Ас'теЬЬа^ег эрр. в России и Беларуси продукция приобретённых ОХА-карбапенемаз и принадлежность к новым и известным эпидемическим клональным группам является неблагоприятным прогностическим признаком распространения карбапенеморезистентности в ближайшем будущем.

3. Перспективными препаратами для терапии инфекций, вызванных Асте1оЬаЫег эрр., в настоящее время являются имипенем, дорипенем, меропенем и цефоперазон/сульбактам, а в будущем - колистин и лолимиксин Б.

Внедрение результатов в практику

Практические рекомендации, разработанные в диссертации, используются в работе медико-профилактических учреждений гг. Екатеринбурга, Новосибирска, Москвы, Краснодара, Минска, Смоленска. Основные положения работы излагаются на семинарах и циклах повышения квалификации врачей и курсах усовершенствования лаборантов в НИИАХ ГОУ ВПО СГМА Росздрава, на конгрессах, конференциях и семинарах МАШАХ, на практических занятиях и лекциях кафедры клинической фармакологии ГОУ ВПО СГМА Росздрава.

Апробация работы

Результаты исследования представлены на Международном конкурсе научно-исследовательских работ по антимикробной химиотерапии, памяти члена-корреспондента РАМН, д.м.н., профессора Л.С. Страчунского (Смоленск, 2007 г.), 35-й конференции молодых ученых СГМА (Смоленск, 2007 г.), Научно-практическом семинаре «Бета-лактамазы: значение и методы выявления» (Смоленск, 2007 г.),

Научно-практическом семинаре «Определение чувствительности к антибиотикам: практические аспекты и значение для клинической практики» (Смоленск, 2007 г.),

XVIII конгрессе ECCM1D (Барселона, 2008 г.), Ш Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2008), курсах усовершенствования лаборантов (Смоленск, 2008, 2009 гг.), циклах повышения квалификации врачей-бактериологов (Смоленск, 2008, 2009 гг.), циклах повышения квалификации клинических фармакологов (Смоленск, 2008, 2009 гг.), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009 г.),

XIX конгрессе ECCMID (Хельсинки, 2009 г.), XI Международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии (Москва, 2009 г), 37-й конференции молодых ученых СГМА (Смоленск, 2009 г.), XIX Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2009), 49-й конференции ICAAC (Сан-Франциско, 2009 г.), Научно-практическом семинаре «Молекулярная бактериология: идентификация, типирование и выявление антибиотикорезистентности» (Смоленск, 2009 г.), совместном заседании сотрудников кафедр госпитальной педиатрии с курсом неонатологаи ФПК и ППС, клинической фармакологии, микробиологии, поликлинической педиатрии, терапии педиатрического и стоматологического факультета, терапии ФПК и ППС, общественного здоровья и здравоохранения, травматологии и ортопедии, урологии, факультетской терапии, сотрудников НИИ антимикробной химиотерапии ГОУ ВПО «Смоленская медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Смоленск, 2010 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них в ВАК рецензируемых журналах - 2, в зарубежных научных изданиях - 4, в центральных научных изданиях - 2.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, который включает 27 отечественных и 257 иностранных источников. Материал иллюстрирован 15 таблицами, 35 рисунками, содержит 1 приложение.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Фенотипическое изучение микроорганизмов

В исследование включался клинический материал, полученный от пациентов с нозокомиальными инфекциями любой локализации, находящихся на госпитализации в лечебных учреждениях России и Беларуси. На каждый штамм Acinetobacter spp. заполнялась специально разработанная индивидуальная регистрационная карта. Для регистрации штаммов нами была создана база данных «КАРАТ» на основе программы M-Lab (НИИАХ, Смоленск). Повторные изоляты одного вида, полученные от одного пациента, в исследование не включались. Культурапьное исследование клинического материала и предварительную идентификацию производили в локальных лабораториях, реидентификацию - в лаборатории НИИАХ ГОУ ВПО СГМА Росздрава на основании тинкториальных и биохимических свойств (Приказ №535, 1985). МПК антибиотиков устанавливались методом двойных серийных разведений в агаре Мюллера-Хинтон II (Becton Dickinson, США) химически чистых субстанций антибиотиков (BioRad, США). Результаты оценивали в соответствии с МУК 4.2.1890-04. Все микроорганизмы, в зависимости от полученной МПК, были разделены на чувствительных к определённому антибиотику и нечувствительных (умеренно-резистентные + резистентные). Контроль качества определения чувствительности производили с использованием референтных штаммов Американской коллекции типовых культур Р. aeruginosa АТСС®27853, Е. coli АТСС®25922 и Е. coli АТСС®35218. Штаммы Acinetobacter spp., нечувствительные к карбапенемам, были изучены на продукцию метапло-бета-лактамаз методом синергизма двойных дисков с ЭДТА.

Обработка данных и статистический анализ

Обработка данных и анализ результатов исследования были проведены с использованием программ Excel (Microsoft, США) и M-Lab (НИИАХ, Смоленск). Статистический анализ проводился в системе статистического анализа SAS (SAS Institute, США, версия 8.02 для Windows ХР). Качественные признаки представлены в виде долей, процентных интервалов, абсолютных чисел. Сравнительный анализ качественных переменных проводился с помощью критерия Хи-квадрат, если более 20% ожидаемых частот были менее 5, то использовался точный двусторонний

критерий Фишера. Результат представлялся в виде критерия «р», различие считалось достоверным при р < 0,0001.

Генотипическое изучение A. baumannii

Наличие генов V1M- и IMP- лактамаз устанавливалось методом ПЦР (Шевченко О.В., 2007). Длина продуктов амплификации изучалась с помощью электрофореза (PowerPac Basic, BioRad, США) в 2% агарозном геле (peq Gold Universal agarose, peQ Lab GmbH, Германия) и 0,5х TBE буфере (Sigma-Aldrich, Inc., США).

Разработка методики по выявлению приобретённых ОХА-карбапенемаз осуществлялась на основе известных последовательностей генов Ь/зоха'- ОХА-23 (Na GB -AJ132105), ОХА-24 (№ GB - AJ239129), ОХА-25 (№ № GB - AF201826), ОХА-26 (№ GB - AF201827), ОХА-27 (Na GB - AF201828), ОХА-40 (№ GB - AF509241), ОХА-49 (№ GB - AY288523) и ОХА-58 (№ GB - DQ385607), полученных в базе данных NCBI с помощью программы CLC Combined Workbench 3 (CLC bio, Дания). Для дизайна прай-меров использовали программы GeneRunner (Hastings Software Inc., США) и BioEdit (Isis Pharmaceuticals Inc., США). Проверка специфичности праймеров осуществлялась на сайте PubMed с помощью функции Primer-BLAST.

Выбор методики для мультилокусного секвенирования-типирования штаммов А. baumannii осуществлялся из двух работ: английской (Sergio Bartual, 2005) и французской (Keith Jolley, 2004). Большей достоверностью и дифференцирующей способностью характеризовался первый метод, но он имел ряд недостатков, которые ухудшали качество результатов реакции, а иногда и приводили к невозможности её постановки. Это: 1) отсутствие единого протокола амплификации и секвенирования; 2) вырожденность праймеров; 3) различные температурные режимы работы праймеров; 4) большая длина праймеров; 5) наличие описанных замен в местах посадки праймеров. Для усовершенствования методики было необходимо: а) разработать собственные праймеры, лишённые указанных недостатков; б) создать единый протокол амплификации и секвенирования; в) для сохранения преемственности, набор изучаемых генов, длину и состав анализируемых фрагментов оставить прежними.

Дизайн праймеров осуществлялся на основе известной последовательности генома штамма A. baumannii АТСС 17978, полученной в базе данных NCBI с помощью программы CLC Combined Workbench 3 (CLC bio, Дания). Разработка праймеров велась на программном обеспечении GeneRunner (Hastings Software Inc., США) и BioEdit (Isis Pharmaceuticals Inc., США). Проверка специфичности праймеров осуществлялась на сайте PubMed с помощью функции Primer-BLAST. Амплификацию про-

водили на термоциклере Chromo4 (Bio Rad Laboratories, США). Очистка продуктов амплификации для последующего секвенирования осуществлялась колонками (Promega Corporation, США) либо набором ферментов ExoSAP-iT (Fermentas, Канада). Секвенирование проходило на термоциклере DNA Engine РТС-200 (MJ Research Inc, США). Отмывка продуктов секвенирования осуществлялась этиловым спиртом (РосБио, Россия). Для анализа использовали секвенатор ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Результаты исследования и их обсуждение

География и сроки проведения исследования

Исследование проходило в 4 этапа. В 1997-1999 гг. изучалась грамотрицательная флора 29 ОРИТ 14 городов России, в 2002-2004 гг. - 33 ОРИТ 22 городов России, в 2006-2008 гг. - 36 стационаров различного профиля 26 городов России, расположенных в 7 федеральных округах. С 2008 г. нами была организована система мониторинга резистентных к карбапенемам Acinetobacter spp. в стационарах России и Беларуси. В её рамках к концу 2009 г. были получены штаммы из 7 стационаров 2 городов Беларуси и 7 стационаров 6 городов России. Всего в исследовании участвовало 74 стационара 35 городов (Рис. 1). Из них было получено

Рис. 1. География центров-участников исследования.

8167 штаммов микроорганизмов: 2787 в первый, 3042 во второй, 2224 в третий и 114 в четвёртый этапы исследования. Общее количество ацинетобактеров составило 1114 штаммов.

Структура нозокомиальных возбудителей в России и положение Acinetobacter spp.

Рис. 2. Структура нозокомиальных патогенов в ОРИТ в 1997-1999 гг.

В 1997-1999 гг. частота выделения Acinetobacter spp. в ОРИТ России составляла 7,25% и он являлся шестым грамотрицательным нозокомиальным патогеном после Р. aeruginosa и ряда энтеробактерий (Рис. 2).

17,8*/.

К. рпеитот 13,8

Другие ГОБ 33%

_ Другие ГОНФБ

1,9%

P. aeruginosa 34,6%

Acinetobacter spp.

153%

Всего: 3 042 штамм«

Рис. 3. Структура нозокомиальных патогенов в ОРИТ в 2002-2004 гг.

В 2002-2004 гг. доля ацинетобакгеров выросла более чем в два раза (15,3%, р < 0,0001) и по значимости он уступал только Р. aeruginosa, а суммарная доля неферментирующих бактерий превысила 50% (Рис. 3).

Proteus spjb

19 7% Всего: 1 292 цгтаииа

Рис. 4. Структура нозокомиальных патогенов в ОРИТ в 2006-2008 гг.

В 2006-2008 гг. частота обнаружения Ас/пе&>6айег эрр. выросла незначительно (16,3%, р = 0,37) и он стал третьим грамотрицательным и вторым нефермен-тирующим патогеном в ОРИТ России (Рис. 4).

Таким образом, доля нозокомиальных инфекций, вызванных АстеЫаЫег эрр., в российских ОРИТ с годами неуклонно растёт, а группа неферментирующих бактерий является лидирующей в структуре патогенов.

Оценивая роль изучаемых микроорганизмов в отделениях различного профиля следует отметить, что наибольшую значимость в 2006-2008 гг. ацинетобактеры имели в ожоговых отделениях и отделениях инфекционной хирургии, где они являлись причиной 28,9% инфекций, а общая доля неферментирующих бактерий превышала 75%. В хирургических отделениях Ас1пе1оЬаЫег эрр. выделялись в 10,9% случаев, в терапевтических отделениях наблюдались единичные случаи инфекций, а в отделениях гематологии и онкологии не было отмечено ни одной инфекции, вызванной ацинетобактерами (Табл. 1). Суммарно представители Ac/лefoЬacfeг эрр. явились причиной 15% нозокомиальных инфекций и были третьими грамотрицательными и вторыми неферментирующими патогенами в стационарах России в 2006-2008 гг.

Таблица 1

Структура грамотрицательных патогенов в стационарах России в 2006-2008 гг.

"^-^Отдоленив МО Все отделения ОРИТ ОИ Хирургия ОГ Терапия

P. aeruginosa 35,4 35,9 44,4 32,7 11,1 46,4

К. pneumoniae 16,7 19,7 6,1 12,3 33,3 12,5

Acinetobacter spp. 15,0 16,3 28,9 10,9 0 3,6

Е. coli 13,7 9,6 3,9 23,3 22,2 23,2

Enterobacter spp. 6,3 5,4 6,1 6,7 22,2 3,6

Proteus spp. 4,2 3,5 5,6 5,8 0 3,6

S. marcescens 2,7 3,9 0 1,4 0 0

S. maltophilia 2,5 3,3 . 2,2 1,1 1,6 3,6

Другие ГО Б 3,1 1,9 2,2 5,1 9,5 3,6

Другие ГОНФБ 0,5 0,5 0,6 0,6 0 0

Всего МО 2224 1292 180 626 63 56

ОИ - ожоговая и инфекционная хирургия, ОГ- онкология и гематология.

Динамика резистентности к используемым антибиотикам и различия в зависимости от профиля отделения

Оценить динамику резистентности возможно только на примере ОРИТ. Из представленных на Рисунке 5 данных видно, что уже в конце 90-х гг. высокой активностью в отношении нозокомиальных Acinetobacter spp. обладали только имипенем и амикацин, менее активными были ципрофлоксацин и цефепим. Остальные препараты были неактивны в 50% случаев и более. В период с 1999 г. по 2002 г. произошёл скачок резистентности и в 2002-2004 гг. единственной высоко активной группой препаратов осталась группа карбапенемов, резистентность к другим препаратам превышала 60%. В 2006-2008 гг. было отмечено снижение активности и карбапенемов, в меньшей степени имипенема, в большей -меропенема. Однако по-прежнему эти препараты сохраняли высокую активность в отношении нозокомиальных Acinetobacter spp. Более 95% штаммов были нечувствительны к цефалоспоринам III поколения и пиперациллину.

ДмлкаЦПЯ 1997-1999 гг. НЧ, % п - 205 Ч "<■ 2002-200-1 гг. НЧ. % „ - 464 ч. % 2006-2008 гг. НЧ.'ъ п-2П Ч.%

9.4 ■ | 90,6 65,1 ■■■ 1 343 81 ■■■■■ОЛ 19

Гентамнцив 69 ■■■■■ИЗ 51 88.3 ■■■■■■□ 1 и 82 ■■■■■■□□ 18

Швшенем Левофлоксяцие Меропенем

2,5 1 1 9-г 2.4 1 | 9" .6 4" | | 953

1 Не оыл тучен 1 |<:зНВВ 13-- 90 ■■■■■О Ю

| Н е оыл щучен [ 3.' 1 1 963 123 {■_| 8"."

Пыперяцплтш 'з,4 ■■¡■■НИ!266 912 ■■■■■■_] 3.8 93.1 ■■■■ 1,9

Пппертязо

55-2 ЯШ/ШШ "4.1 ■■■■■СШ 25.» 382 ■■■■■■СИ И 8

Тик/клав Цефеппм [~~Не был тучен | 1 Не был плчен | 30.1 ■■^■■ЯЛЦ

48 ВН^Н 63.4 ШПШ 9.6 ■^■■■^31 20'~'

Цефоперяэон 1 Не был тучен 1 9".« ■■■■■■Н 2.4 99/ ■■■■■■■ 0,5

Цефотакспм

823 ■■■■■ЦЛ1'' 933 ■■■■■■] 6.~ 9"2 ШШИШШШШ 2-8

Цефтл-шдпм

А 1.1 нвш "5.4 ■■■■КИП 24.6 95." ННН 43

Цппрофлоксаци в 31 ШГ [69 ~з,~ ■■■■■тз 2<>^ 93.8 ■■■ 6.2

п - количество штаммов, пипер/тазо - пиперациллин^газобактам, тик/клав - тикарцил-лин/клавулунат

Рис. 5. Динамика резистентности Аапе1оЬаЫег эрр. в ОРИТ России.

При изучении активности антимикробных препаратов в отделениях различного профиля видно, что наиболее благоприятная ситуация наблюдалась в хирургических отделениях. Ситуация в ОРИТ сопоставима с таковой в ожоговых отделениях и отделениях хирургической инфекции, однако в последнем случае практически все штаммы были нечувствительны к гентамицину и пилерациллину/тазобактаму, меньшей активностью обладал амикацин. При оценке карбапенемов следует отметить, что лучшей активностью во всех отделениях обладал имипенем, наибольшая резистентность к которому наблюдалась в ОРИТ и составляла 4,7%. В ожоговых и отделениях хирургической инфекции не было выделено ни одного устойчивого к имипенему штамма, однако уровень резистентности к меропенему был самым высоким - 23,1%. Резистентность к меропенему в хирургических отделениях была выше таковой в ОРИТ, что может говорить о нерациональном применении меропенема в хирургии.

Хирургия И% и = 68 Ч, % он ЯЧ,% U-52 ■7. "о OPIIT НЧ,\ п- 211 Ч,

Ампкацпн 6is шшшшт 1 38jl 94 Л 5's 81 ■■■■■■ | 19

-

Гентамыцпн so з Н 19,1 98,1 Ц И 1.9 82 ЯШШ _] 18

-

Шшпенем 1,5 L 98,5 »1 100 4-1 I 953

_

Левофлок сядпа "2.1 НИНЕ! П 2"<> 1 | т 90 ■ I 10

-

Меропенем »."в _ 1 853 23,1 ■ -ei пзи )8

Ппперлцнлтпн 92.« Н ■Д "..4 98.1 ЗШВШИМШЕЖ 1<9 98,1 ■■ Hi

-

Пппертазо Г; 11.8 шВН Ml 3.8 382 ■Ли ■ J 11.8

-

Та к.-к лав зол Я | 19.1 84.6 ■■ CJ 15'4 80.1 МаЯ _ 19J>

-

Цефепам 32.4 Ш| _11-,6 И&ШШ В (15.4 '•>.!, П J 20.4

Цефоперазон

95.6 Ш ■J 4.4 98.1 ■ 99- ПИВ Hfl 0.;

-

Цефотакслм 9U| С s.8 98,1 ИН HQ 1.9 НЕН ■U 2.8

Цефтазпдп м

91.2 ННМС 8.8 962 ЯН 95,- в ■Li 4.3

Цппрофлоксацв н

83,8 ^ 1 [ 1« 93.8 Щ ■J 6-2

ОИ - ожоговые отделения и отделения хирургической инфекции, п - количество штаммов, пи-пер/тазо - пиперациллин/тазобактам, тик/клав - тикарциллин/клавулунат. Рис. 6. Резистентность /\cOTefobacierspp. в стационарах России в 2006-2008 гг.

Оценка активности перспективных антимикробных препаратов

В ситуации неуклонного роста устойчивости к карбапенемам необходимо иметь в резерве антибиотики, активные в отношении полирезистентных Acinetobacter spp. В данной работе была произведена оценка 5 перспективных препаратов: дорипенема, колистина, нетилмицина, полимиксина Б и цефоперазона/ сульбактама (Рис. 7). Из них, наибольшую активность проявили полимиксины: резистентных к колистину штаммов выделено не было, нечувствительным к полимиксину Б был только один штамм. Дорипенем и цефоперазон/сульбактам характеризовались сходной активностью и уступали только полимиксинам и имипенему. Нетилмицин был наиболее активным препаратом в группе аминогликозидов, но наименее активным среди перспективных. Использовать его в терапии инфекций, вызванных нозокомиальными, следует только после подтверждения его активности in vitro.

НЧ. % и - 333 ч, %

Ампклщш 20,9

Гейтами цин 15.8

Нетлмицнн 21.8 НЯЯВМ 1 -Я 2

Дорнпенем "3 ЯМ 1 92"

Меропенем и' шятш ...... 1 855

Имнпенем г.- ■ I 97.3

-

Левофлоксяцин ыа

Цппроф доксацин 3.5

Ппперацнллнн 2~

Пнпер та то 10.6

Тик/кляв 19.1

- 18.8

Цефепим

Цефоперазон 1.2

Цефопер сульб 103 ииг- " "1 89."

Цеф отакснм 3.6

Цефтазпднм 4.8

Ко.ШСШН 0 1 ' 1 1<Н)

Полпмнксин Б 1 0.3 1 1 99."

Рис. 7. Резистентность Ас/пе?оЬас?ег эрр. в стационарах различного профиля в России в 2006-2008 гг.

Ввиду высокой активности полимиксинов, карбапенемов и цефоперазона/ сульбактама представляется целесообразным рассмотреть распределение их МПК в отношении 333 Аа'пеЬЬаЫегзрр., выделенных в России в 2006-2008 гг. (Рис. 8-13).

Все изученные штаммы были чувствительны к колистину (Рис. 8), причём большинство штаммов отстояло от границы резистентности на два разведения, что свидетельствует о возможности сохранения высокой активности препарата и в ближайшем будущем.

____ мг/мл

0,25 0,5 1 1 I

Рис. 9. Распределение Асте^Ьа^ег зрр. по значениям МПК полимиксина Б.

Полимиксин Б имел схожее с колистином распределение МПК (Рис. 9), однако один штамм был резистентен к препарату. Большая часть штаммов также отстояла от границы резистентности на два разведения, что является хорошим признаком.

30,9 30,3

0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 ■ 8 16 32

Рис. 10. Распределение Ac;лefobacferspp. по значениям МПК дорипенема.

мг/мл

Распределение МПК дорипенема имело мономодальный характер, что затрудняет выделение групп резистентности к данному препарату.

ч

УР

%

9,7

0,06 0,125 0,25 0,5 1

0,6

8

1,8 03

мг/мл

16 32

Рис. 11. Распределение Лc/лeíoЬэcíer эрр. по значениям МПК имипенема.

УР

%

03 03 !>5

25,2 _ 23,6!

0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4,8

0,9 03

мг/мл

16 32

Рис. 12. Распределение Дс/пейзЬайег эрр. по значениям МПК меропенема.

31,2

УР

% 19,7 I

| 12,4

03 0,6 1,5 2,1 ------------- ,•- - аР-с^-ф-л 1 1

16 -32 • 64

мг/мл

0,125 0,25 0,5 1 2 4 8

Рис. 13. Распределение Ас/пе(оЬас(ег врр. по значениям МПК цефоперазо-на/сульбактама.

Как видно из представленных рисунков, наилучшее положение действительно имели полимиксины, так как большая часть штаммов отстояла на два разведения от границы резистентности и, вероятно, в ближайшее время будет сохранять чувствительность к данным препаратам. Распределение МПК имипенема носило бимодальный характер и совпадало с установленными критериями резистентности, большая часть штаммов также отстояла от границы на два разведения. Согласно бимодальному распределению меропенема, нечувствительными к нему являются

штаммы с МПК > 1 мг/мл, то есть 57,2% штаммов. Дорипенем имел мономодальное распределение МПК, однако оно было схожим с меропенемом; в таком случае резистентность к нему так же будет выше установленной - 53,1%. Более 20% штаммов находилось на границе резистентности к цефоперазону/сульбактаму и потенциально может потерять чувствительность к нему в ближайшее время. Для данного препарата также было характерно бимодальное распределение, согласно которому резистентными к препарату являются 44,5% штаммов.

Перекрёстная резистентность к карбапенемам

Для того чтобы знать, как часто штаммы АстеЬЬа^вг эрр., нечувствительные к одному карбапенему, являются нечувствительными и к другим препаратам этой же группы, был проведён анализ перекрёстной резистентности к карбапенемам среди нечувствительных штаммов (МПК любого карбапенема >8 мг/мл). Из 54 штаммов, выделенных в 2006-2008 гг., 53,7% были резистентны только к одному из трёх карбапенемов, 42,6% - к двум антибиотикам данной группы. Лишь два штамма (3,7%) были невосприимчивы ко всем трём препаратам (Рис. 9).

Рис. 9. Перекрёстная резистентность к карбапенемам нозокомиальных ^Ac/лetoЬacíeг врр. в России в 2006-2008 гг.

Выявление приобретённых карбапенемаз и разработка технологии ПЦР для детекции генов приобретённых ОХА-карбапенемаз

За время исследования было получено 186 штаммов АЫпеЬЬаЫег врр., устойчивых хотя бы к одному из двух карбапенемов (МПК имипвнема и/или

Дорипенем

Пмппене;

меропенема >8 мг/мл): 5 на первом, 17 на втором, 50 на третьем и 114 на четвёртом этапе. Ни одного продуцента МБЛ среди них обнаружено не было. Для возможности выявления генов приобретённых КМКД была разработана собственная технология ПЦР в реальном времени: осуществлён дизайн 6 праймеров для трёх описанных у ацинетобактеров групп данных ферментов (Табл. 2), оптимизирован состав реакционной смеси (0,6 мкМ каждого праймера, набор азотистых оснований дНТФ - 200 мкМ ка>едого, 1,7 мМ MgCI2, 1,5 Ед Taq-F ДНК-полимеразы, 5 мкл однократного безмагниевого ПЦР-буфера, 0,5 мкл SYBR Green I, 6,7 мкл воды и 2 мкл образца ДНК, полученного кипячением 3-5 колоний в ТЕ буфере) и отработан температурный протокол ПЦР (активация Taq-F полимеразы: 95°С, 15 мин.; 30 циклов амплификации: денатурация 95°С, 20 сек, отжиг 59°С, 20 сек, элонгация 72°С, 30 сек, анализ кривых плавления: стабилизация смеси 72°С, 3 мин.; плавление в диапазоне 72°С - 95°С с задержкой в 30 сек на 72°С и последующим подъёмом на 1°С каждые 5 секунд) для термоциклера Rotor-Gene 2000 System (Corbett Research, Австралия). В результате было получено три продукта амплификации, имеющих различные температуры плавления, которые методом электрофореза были причислены к соответствующей группе ОХА-карбапенемаз. Разработанным методом было выявлено 132 продуцента приобретённых ОХА-карбаленемаз: 1 в 1997-1999 гг., 11 в 2002-2004 гг., 9 в 20062008 гг., 58 в 2008-2009 гг. в России и 53 в 2008-2009 гг. в Беларуси (Табл. 3). Таким образом, до 2008 г. в России наблюдались единичные случаи инфекций, вызванных ОХА-продуцирующими штаммами, в географически отдалённых друг от друга городах. Обращает на себя внимание выделение OXA-58-продуцирующих штаммов

Таблица 2

Праймеры, разработанные для детекции приобретённых КМКД у Acinetobacter spp.

Название Ген Последовательность Длина продукта,

OXA-23-F1 Ыа охА-23 TGAAACCCCGAGTCAGATTGT 498

OXA-23-R1 Ыа оха-23 CTAAATGGAAGCTGTGTATGTGCT

OXA-40-F Ь/с?оХА-40 GATG AAG СТСАААСАС AG G GTG 587

OXA-40-R Ыа охА-40 TTTCCATTAGCTTGCTCCACC

OXA-58-F Ыа OXA-58 GGGCTTGTGCTGAGCATAGT 739

OXA-58-R Ь/Э0ХА-58 CGTAGAGCAATATCATCACCAGC

Таблица 3

География продуцентов приобретённых КМКД.

Тип КМКД Страна Город Центр Год Кол-во

ОХА-58 Россия Ставрополь 1 1997 1

ОХА-23 Россия Иркутск 1 2002 2

ОХА-58 Россия - Москва 2 2002 4

ОХА-58 Россия Москва 2 2003 1

ОХА-58 Россия Новосибирск 2 2003 3

ОХА-23 Россия Москва 11 2004 1

ОХА-58 Россия Екатеринбург 1 2006 2

ОХА-58 Россия Екатеринбург 4 2006 1

ОХА-58 Россия Новосибирск 1 2006 4

ОХА-58 Россия Москва 2 2006 2

ОХА-23 Россия Краснодар 2 2008 14

ОХА-40 Беларусь Минск 1 2008 5

ОХА-40 Беларусь Могилёв 1 2008 5

ОХА-40 Беларусь Могилёв 2 2008 2

ОХА-23 Россия Краснодар 2 2009 8

ОХА-40 Беларусь Минск 2 2009 28

ОХА-40 Беларусь Минск 3 2009 4

ОХА-40 Беларусь Минск 4 2009 3

ОХА-40 Беларусь Минск 5 2009 2

ОХА-40 Беларусь Минск 6 2009 2

ОХА-40 Беларусь Минск 7 2009 2

ОХА-40 Россия Москва 12 2009 5

ОХА-23 Россия Ростов-на-Дону 1 2009 1

ОХА-40 Россия Самара 1 2009 16

ОХА-40 Россия Санкт-Петербург 3 2009 6

ОХА-58 Россия Санкт-Петербург 3 2009 2

ОХА-58 Россия Смоленск 2 2009 4

ОХА-58 Россия Смоленск 3 2009 2

Аа'пе1оЬас!ег $рр. на протяжении нескольких лет в центре №2 г. Москвы, что может свидетельствовать о циркуляции карбапенеморезистентных штаммов либо факторов резистентности к карбапенемам в среде данного стационара. В 2002 г.,

возможно, имела место вспышка инфекций, так как все 4 штамма были получены в течение одного месяца. В центре №1 Новосибирска в 2006 г. так же могла иметь место циркуляция либо возбудителя, либо факторов резистентности к карбапенемам. В 2008-2009 гг. количество карбапенеморезистентных штаммов значительно выросло, а инфекции иногда стали приобретать массовый характер и возникать в близлежащих городах. Более того, все полученные штаммы продуцировали ту или иную группу ОХА-карбапенемаз. Похожая ситуация наблюдалась и в Беларуси, где за аналогичный период времени было получено 56 резистентных к карбапенемам штаммов, из которых 53 являлись продуцентами приобретённых КМКД. В большинстве стационаров Беларуси наблюдались случаи единичных инфекций, однако из центра №2 г. Минска было получено 30 штаммов в течение трёх месяцев, что свидетельствует о серьёзности проблемы и о высокой патогенное™ данного возбудителя.

Также в работе был проведён поиск разработанным методом «молчащих» генов приобретённых ОХА-карбапенемаз у 168 чувствительных к карбапенемам штаммов (МПК и меропенема, и имипенема <8 мг/мл). Результаты исследования во всех случаях были отрицательными. Это, во-первых, подтверждает эпидемические свойства ферментов, во-вторых, показывает, что наличие генов приобретённых КМКД всегда свидетельствует о резистентности штамма к карбапенемам.

Оптимизация методики мультилокусного секвенирования-

типирования штаммов Acinetobacter baumannii

Модернизация методики типирования штаммов A. baumannii осуществлялась путём дизайна 14 праймеров к локусам 7 генов (Табл. 4), оптимизации состава реакционной смеси (0,6 мкМ каждого праймера, набор азотистых оснований дНТФ - 200мкМ каждого, 1,7 мМ MgCI2, 1,5 Ед Taq-F ДНК-полимеразы, 5 мкл однократного безмагниевого ПЦР-буфера, 0,5 мкл SYBR Green I, 11,2 мкл воды и 2 мкл образца ДНК, полученного кипячением 3-5 колоний в ТЕ буфере) и отработки температурного протокола ПЦР (активация Taq-F попимеразы: 95°С, 15 мин., 30 циклов амплификации: денатурация 95°С, 20 сек., отжиг 54°С, 30 сек., элонгация 72°С, 45 сек.; и анализ кривых плавления: стабилизация смеси 72°С, 3 мин.; плавление в диапазоне 72°С - 94°С с подъёмом на 1°С каждые 5 сек.) для термоциклера Chromo4 (Bio Rad Laboratories, США). Данные условия обеспечивали выраженную специфическую амплификацию, а длина продукта амплификации каждого локуса, определяемая при электрофорезе, соответствовала указанной в

Таблица 4

Собственные праймеры для секвенирования-типирования A. baumanniï.

Локус Праймер Последовательность праймера Размер ампликона Opt T° Задача

gltA gltA-f АСА GTG GCA CAT TAG GTC С 722 63,4 А+С

gltA-r GCA GAG ATA CCA GCA GAG ATA CA 63,5 А+С

дугВ gyrB-f AAC CAT CTC AAC GAA АТС TTC С 909 64,7 А+С

дугВ-г CTG GGT CTT TTT CCT GAC А 64 А+С

gdhB gdhB-f1 CCA CAT GCT TTG TTA TGG GG 775 65,3 А+С

gdhB-r1 GAT TTA AGC GTA ATA CTT TAC CCA T 64,4 А+С

гесА гесА-f GGT CCT GAA TCT TCT GGT AAA AC 425 64 А+С

recA-г GAA TTT AAG AGC ATT ACC ACC AGT 64,5 А+С

српбО cpn60-f CAA CTG TAC TTG CTC AAG С 479 54,5 А+С

српбО-г CGC TTC ACC TTC AAC АТС TTC 64,1 А+С

9Р> gpi-f AAA АТС CAT GCT GGG CAA TA 508 65 А+С

gpi-r1 CAT СТА TAC CAA TCG TTA GGG CT 65 А+С

rpoD rpoD-f GTG AAG GTG AAA TCA GCA TTG С 492 66,6 А+С

rpoD-r GCA ATT TGT TCA TCT AAC CAA GC 66 А+С

оригинальной методике. Условия секвенирования также были несколько изменены. Объём секвенирующей смеси равнялся 10 мкл и включал 2 мкл смеси терминаторов, по 1 мкл 5-кратного секвенирующего буфера, праймера и продукта ПЦР, 5 мкл воды. Конечный протокол секвенирования состоял из активации при 96°С в течение 1 минуты и 30 циклов амплификации: денатурация 96°С, 10 сек.; отжиг 50°С, 10 сек.; элонгация 60°С, 4 мин. В результате анализа продуктов секвенирования были получены чёткие хроматограммы.

Генетическое разнообразие А, ЬаитаппИ в России и Беларуси

Для оценки генетического разнообразия циркулирующих в стационарах России и Беларуси штаммов А. ЬаитаппИ из каждого центра было взято по одному ОХА-продуцирующему штамму с характерной антибиотикограммой. Всего в работу было включено 15 штаммов: 14 штаммов А. ЬаитаппИ и один штамм А. !моШ (Табл.

5). Перед проведением мультилокусного секвенирования-типирования было проведено типирование по локусу гесА, в результате которого штамм А. ЬаитаппИ МУУ-3577 был реидентифицирован как Аапе(оЬас(ег геномовид 10, а штамм А. ¡\NQffn N32-1777 - как А. ЬаитаппИ. Штамм М\Л/-3577 из дальнейшего анализа был исключён. В результате МЛСТ были установлены аллельные варианты изучаемых генов каждого штамма (Табл. 6). В большинстве случаев полученные аллели были идентифицированы как ранее описанные. Однако было выделено 16 новых аллелей, отличающихся от известных на 1-4 нукпеотидные замены. Каждый из изученных штаммов содержал хотя бы один новый аллель, поэтому все они были отнесены к 9 новым сиквенс-типам. Методом минимальных нуклеотидных различий и методом аллельных вариантов было установлено высокое генетическое сходство большинства штаммов с известными сиквенс-типами (Табл. 6), которые являются причиной ряда нозокомиальных инфекций в Австралии и в различных странах Европы и Азии с 1991 г. Для оценки эпидемических свойств изучаемых штаммов по

Таблица 5

Штаммы Ac/лeío6acíeгspp., выбранные для секвенирования-типирования.

№ МО ОХА Год Город Центр

ЕК1-386 А. ЬаитаппИ 58 2006 Екатеринбург 1

ЕК2-1283 А. ЬаитаппИ 58 2006 Екатеринбург 4

1Я-547 А. ЬаитаппИ 23 2002 Иркутск 1

КК-26517 А. ЬаитаппИ 23 2008 Краснодар 2

Мв-25674 А. ЬаитаппИ 40 2008 Могилёв 1

М1-25818 А. ЬаитаппИ 40 2008 Минск 1

М\Л/-797 А. ЬаитаппИ 58 2002 Москва 2

М\Л/-3577 А. ЬаитаппИ 23 2004 Москва 11

М\Л/-2282 А. ЬаитаппИ 58 2006 Москва 2

М\/У-816 А. ЬаитаппИ 58 2003 Москва 2

N81-2280 А. ЬаитаппИ 58 2003 Новосибирск 2

N32-1671 А. ЬаитаппИ 58 2006 Новосибирск 1

N32-1744 А. ЬаитаппИ 58 2006 Новосибирск 1

N32-1777 А./иго/У» 58 2006 Новосибирск 1

31.-248 А. ЬаитаппИ 58 1997 Ставрополь 1

их МЛСТ профилям методом кластерного анализа невзвешенных средних арифметических величин (иРвМА) было установлено, что большинство штаммов действительно относятся к описанным клональным группам, а значит, имеют доказанное клиническое и эпидемическое значение. Интересным представляется факт циркуляции штаммов, имеющих абсолютно одинаковое строение изучаемых локусов, в географически отдалённых городах двух стран (Новосибирск-Екатеринбург-Могилёв; Москва- Новосибирск). В тоже время в одном стационаре Новосибирска было выделено три штамма, имеющих абсолютно разное строение.

В рамках данного исследования был проведён анализ зависимости типа продуцируемой карбапенемазы от принадлежности к той или иной клонапьной группе. Было выявлено, что штаммы, имеющие одинаковые или близкие сиквенс-типы, несли гены приобретённых ОХА-карбапенемаз различных групп. Таким образом можно говорить о независимом наследовании факторов устойчивости к карбапенемам нозокомиальными штаммами Ас/пе(оЬас(егБрр.

Таблица 6

Результаты типирования штаммов А. Ьаитапп/7.

Ыг Штамма дИА дугВ дсЖВ гесА српбО др> гроЭ Родственный СТ

МРН ЗДЛ

81.-248 1 15 23х 12 4 12х 2 20 20

113-547 1х 15 16х 11 15х Зх 2 - -

М\Л/-816 1 15 23хх 10 14 12х 18 37 34, 35, 37,48,49

ГШ-2282 1 15 2х 15 1 14х 18 - 45

М\Л/-797 1 15 2х 15 1 14х 18 -

N82-1777 1 15 2х 15 1 14х 18 -

N31-2280 10 12 4х 11 4 9х 5 16, 25 43,44 44

ЕК1-386 10 12 4х 11 4 9х 5

ЕК2-1283 10 12 4х 11 4 9х 5

МС-25674 10 12 4х 11 4 9х 5

N32-1671 10 12 4х 11 14 9х 5 -

N82-1744 1 12 Зх 2 2 19х 3 6, 33 4, 21,33

М1-25818 1 3 Зх 2 2 7х 3 22,41 22,41,53

КК-26517 10 25х 4х 11 4 23х 5 - -

х, хх - новые варианты аллелей, наиболее близкие к указанному цифрой, МРН - метод минимального различия нуклеотидов, ЗДЛ - метод замещения двух локусов, СТ - сиквенс-тип

Выводы

1. Acinetobacter spp. является вторым по частоте встречаемости (15%) неферментирующим грамотрицательным патогеном в отделениях с интенсивным потреблением антибиотиков в 2006-2008 гг. в России, причём, количество вызванных им инфекций в отделениях реанимации и интенсивной терапии в России за последние 12 лет увеличилось в 2,3 раза и составило 16,3%.

2. Наибольшую in vitro активность в отношении нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp., выделенных в России, проявляют: колистин -> полимиксин Б -> имипенем -» дорипенем -> цефоперазон/сульбактам меропенем -> нетилмицин, чувствительными к которым оказались 100% -> 99,7% 97,3% -> 92,7% -> 89,7% -»• 85,5% -> 78,2% штаммов, соответственно.

3. Создание 6 новых праймеров и оптимизация состава реакционной смеси и протокола ПЦР в реальном времени позволили разработать способ выявления всех известных генов приобретённых ОХА-карбапенемаз.

4. Распространённость приобретённых ОХА-карбапенемаз среди карбаленеморезистентных штаммов Acinetobacter spp. в 2006-2008 гг. в России составила 18% (100% - ОХА-58), в 2008-2009 гг. - 100% (39,7% - ОХА-23; 46,5% -ОХА-40; 13,8% - ОХА-58). Распространённость ОХА-карбапенемаз в 2008-2009 гг. в Беларуси составила 94,6% (100% - ОХА-40). Металло-бета-лактамаз ни в одной из стран выявлено не было.

5. Для оптимизации протокола мультилокусного секвенирования-типирования штаммов A. baumannii было 14 новых праймеров, оптимизированы составы реакционных смесей и протоколы ПЦР, что позволило расширить возможности практического применения данного метода в микробиологических лабораториях.

6. Среди 14 изученных штаммов выявлено 16 новых аллельных вариантов различных генов; сами штаммы отнесены к 9 новым сиквенс-типам, 7 из которых принадлежат к известным эпидемическим клонапьным группам. При этом три из них являются возбудителями большого числа инфекций в зарубежных странах, две - в России и Беларуси.

7. В ближайшие годы в России и Беларуси следует ожидать стремительный рост резистентности к карбапенемам среди нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp. ввиду увеличения продуцентов приобретённых ОХА-карбапенемаз и циркуляции штаммов, имеющих эпидемические свойства.

Практические рекомендации

Для микробиологов

1. Проводить скрининг всех клинических штаммов Acinetobacter spp. на метапло-бета-лактамазы и приобретённые ОХА-карбапенемазы до определения чувствительности к антибиотикам.

2. Включить разработанную технологию ПЦР в алгоритм исследований Acinetobacter spp. в микробиологических лабораториях при лечебно-профилактических учреждениях и центрах Госсанэпиднадзора.

3. Микробиологическим лабораториям при лечебно-профилактических учреждениях и центрах Госсанэпиднадзора вести учёт результатов проведённых тестов на чувствительность к антибиотикам и предоставлять врачам суммарные данные о наиболее активных за определённый период антимикробных препаратах в отношении Acinetobacter spp. в каждом конкретном стационаре.

Для клинических фармакологов

4. Рассматривать имипенем, дорипенем, меропенем и цефоперазон/сульбактам в качестве препаратов эмпирической и этиотропной терапии нозокомиальных инфекций, вызванных Acinetobacter spp., во всех стационарах России.

5. Исключить из протоколов терапии нозокомиальных инфекций, вызванных Acinetobacter spp., незащищённые пенициллины и незащищённые цефалоспори-ны (II поколения, а в ожоговых отделениях и отделениях хирургической инфекции - также гентамицин и пиперациллин/тазобактам.

6. Обратиться с ходатайством в Федеральную службу по надзору в сфере здравоохранения и социального развития о внедрении на фармацевтический рынок России парентеральных форм полимиксина Б и колистина ввиду их высокой активности в отношении полирезистентных Acinetobacter spp.

Описок научных работ по теме диссертации

1. Martinovich A. Assessment of carbapenem resistance and presence of

acquired carbapenemases in Russian nosocomial isolates of Acinetobacter spp. / A.

Martinovich, O. Shevchenko, M. Edelstein, R. Kozlov. // Proceedings of the 18m

European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Barcelona, Spain,

2008 (P 1505).

2. Козлов P.C. Порщняння in vitro ефективносл цефтршсону й

цефтршсону/сульбактаму щодо БЛРС-продукуючих штамш амейства

Enterobacteriaceae. / P.С. Козлов, A.A. Мартинович, А.В. Дехнич // Пед1атр1я, акушерство та пнеколопя - 2009. - Vol. 71. № 2 - С. 50 - 52

3. Martinovich A. Ten-year resistance trends of nosocomial Acinetobacter spp. in Russia / A. Martinovich, N. Ivanchik, O. Kretchikova, G. Reshedko, E. Riabkova, M. Edelstein, R. Kozlov // Proceedings of the 19lh European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Helsinki, Finland, 2009 (P 1717).

4. Мартинович A.A. Анализ резистентности к карбапенемам и продукции приобретённых карбапенемаз нозокомиальными штаммами Acinetobacter spp. в России I А.А. Мартинович, М.В. Эйдельштейн, О.В. Шевченко, Р.С. Козлов. //Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. - 2009. -Т. 11. № 2-1 - С. 23 - 24.

5. Мартинович А.А. Динамика антибиотикорезистентности и эпидемиология инфекций, вызванных Acinetobacter spp. в России. / А.А. Мартинович. //Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. - 2010. - Т. 12. № 2- С. 96-104.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Микроорганизмы

A. baumannii A. Iwoffii

Acinetobacter baumannii Acinetobacter iwoffii Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas maltophilia

E. coli

К. pneumoniae P. aeruginosa S. maltophilia

Другие термины

ДНК

MAKMAX

ГОБ ГОНФБ ГОУ В ПО

МБЛ

МЛСТ

МО

мпк

НИИАХ

грамотрицательная бактерия грамотрицательная неферментирующая бактерия Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования дезоксирибонуклеиновая кислота

Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и

антимикробной химиотерапии

металло-бета-лакгамаза

мультилокусное секвенирование-типирование

микроорганизм

минимальная подавляющая концентрация Научно-исследовательский институт антимикробной химиотерапии

НЧ нечувствительный микроорганизм

КМКД ОХА карбапенемазы молекулярного класса й

ОРИТ отделение реанимации и интенсивной терапии

ПЦР полимеразная цепная реакция

Р резистентный микроорганизм

СГМА Смоленская государственная медицинская академия

УР умеренно-резистентный микроорганизм

Ч чувствительный микроорганизм

АТСС Американская коллекция типовых культур

ЕССМЮ Европейский конгресс по клинической микробиологии и

инфекционным болезням

вВ база данных о геноме микроорганзимов

1СААС Междисциплинарная конференция по антимикробным

препаратам и химиотерапии

ЫСВ! Национальный центр биотехнологической информации

врр. обозначение рода микроорганизмов

Формат 60x84/16. Тираж 100. Печ. листов 1. Заказ № 2118/1. Дата сдачи в печать 24.03.2010 г.

Отпечатано в ООО «Принт-Экспресс», г. Смоленск, проспект Гагарина, 21, т.: (4812) 32-80-70

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Нозокомиальные инфекции являются основной инфекционной проблемой любого современного стационара [220, 266]. Их возникновение неизбежно, а частота и тяжесть с годами только растут [215]. Особенно остро вопрос нозокомиальных инфекций стоит в отделениях со значительным потреблением антибиотиков, в первую очередь это отделения реанимации и интенсивной терапии, где назначение антимикробных средств встречается до 10 раз чаще, по сравнению с отделениями других профилей, а нозокомиальная инфекция развивается у каждого пятого пациента и является основной причиной летальности [35, 221]. Ежегодно только в России отмечается порядка 2,5 млн. нозокомиальных инфекций [3], хотя официально регистрируется не более 30 тысяч [9, 10]. Для назначения своевременной, а главное, адекватной терапии каждого инфекционного заболевания врач должен знать наиболее вероятную его этиологию и спектр чувствительности предполагаемого патогена к антимикробным средствам, которые варьируют не только в зависимости от города и стационара, но и между отделениями одной больницы [24].

Возбудителями нозокомиальных инфекций могут быть различные микроорганизмы как эндогенной, так и экзогенной природы [209]. В России, по данным современных исследований, ведущей группой возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ являются грамотрицательные неферментирующие бактерии, в частности Р. aeruginosa и Acinetobacter spp. (35% и 15% соответственно) [19]. Суммарно они опережают вторую по частоте встречаемости группу энтеробактерий (34,5%), представители которой до последних лет выделялись из клинического материала при нозокомиальных инфекциях наиболее часто [14, 23]. Постепенный, но стабильный рост встречаемости ацинетобактеров в структуре нозокомиальных патогенов [68], а также высокий уровень летальности от данных инфекций (от 30 до 75%) [102, 161, 199, 279] отмечается врачами и исследователями во всём мире [39, 40, 154,213,265].

Принимая во внимание тяжесть состояния пациентов и последствия развития любой инфекции, вполне объяснимо эмпирическое назначение пациентам антибиотиков широкого профиля. Однако случаи нерационального их назначения способствуют развитию полирезистентности микрофлоры стационара [24]. Особенно быстро активизировать и приобретать различные механизмы антибиотикорезистентности способны именно представители рода Acinetobacter [157]. И действительно, различные авторы отмечают выделение резистентных к трём и более группам антибиотиков нозокомиальных ацинетобактеров в ОРИТ в 40 и более процентах случаев [6, 20]. В то время как ещё 10 лет назад данные микроорганизмы считались чувствительными к подавляющему большинству препаратов [260]. Зарубежные исследования показывают, что ситуация в мире выглядит более плачевно. Полирезистентные ацинетобактеры в ОРИТ Европы встречаются в 75 и более процентах случаев [83, 171, 242, 243], в ОРИТ США в 50 и более процентах случаев [45, 217]. Для рационального эмпирического назначения действующих на настоящий момент антимикробных препаратов, а также для предупреждения снижения их активности необходимо выявление основных механизмов резистентности и способов их распространения в популяции микроорганизмов, постоянный мониторинг активности антимикробных средств на национальном уровне. Для возможности быстрого устранения возникающих в стационарах очагов инфекции и воздействия на пути передачи возбудителя необходимы точная и достоверная видовая идентификация микроорганизмов, установление характера инфекционной вспышки, а при наличии условий и субвидовая идентификация.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить с помощью современных методов генетическое разнообразие, динамику резистентности к антимикробным препаратам и распространённость карбапенемаз среди нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp., выделенных в отделениях с интенсивным потреблением антибиотиков, и разработать на этой основе рекомендации по оптимизации эмпирической и этиотропной терапии инфекций, вызванных этими микроорганизмами.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Оценить в динамике распространенность Acinetobacter spp. в общей структуре грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций.

2. Определить с помощью современных методов чувствительность Acinetobacter spp. к используемым и перспективным антимикробным препаратам и предложить на этой основе рекомендации по эмпирической и этиотропной терапии инфекций, вызванных данным возбудителем.

3. Разработать технологию ПЦР в реальном времени для детекции приобретённых карбапенемаз молекулярного класса D у Acinetobacter spp.

4. Выявить распространённость металло-Р-лактамаз и ОХА-карбапенемаз среди клинических штаммов Acinetobacter spp., нечувствительных к карбапенемам.

5. Оптимизировать протокол мультилокусного секвенирования-типирования Acinetobacter baumannii и с его помощью изучить генетическое разнообразие карбапенемазо-продуцирующих штаммов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые:

1. Организована система мониторинга карбапенеморезистентных штаммов Acinetobacter spp., вызывающих нозокомиальные инфекции в стационарах 21 города 7 федеральных округов Российской Федерации и 2 городов Беларуси

2. Дана оценка in vitro активности перспективных антимикробных препаратов в отношении нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp.

3. Разработан метод ПЦР в реальном времени для быстрого выявления генов приобретённых ОХА-карбапенемаз у Acinetobacter spp.

4. Изучена принадлежность карбапенеморезистентных штаммов Acinetobacter spp., вызывающих инфекции в стационарах России и Беларуси, к циркулирующим международным эпидемическим клонам.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

1. Организованная система мониторинга карбапенеморезистентных штаммов Acinetobacter spp. в стационарах России и Беларуси является одним из направлений работы Научно-методического центра Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по мониторингу антибиотикорезистентности.

2. Полученные фармакодинамические данные по активности различных классов и групп антимикробных препаратов позволяют прогнозировать резистентность нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp. в России и предложить рекомендации по этиотропной и эмпирической терапии инфекций, вызываемых данным родом микроорганизмов.

3. Разработанный метод ПЦР в реальном времени и оптимизация протокола мультилокусного секвенирования-типирования А. baumannii позволяет расширить возможности лабораторий центров

Госсанэпиднадзора и микробиологических лабораторий при лечебно-профилактических учреждениях по своевременному выявлению эпидемиологически опасных штаммов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Acinetobacter spp. является вторым по частоте неферментирующим грамотрицательным возбудителем нозокомиальных инфекций в отделениях с интенсивным потреблением антибиотиков многопрофильных стационаров России.

2. Выявленная у Acinetobacter spp. в России и Беларуси продукция приобретённых ОХА-карбапенемаз и принадлежность к новым и известным эпидемическим клональным группам является неблагоприятным прогностическим признаком распространения карбапенеморезистентности в ближайшие годы.

3. Перспективными препаратами для терапии инфекций, вызванных Acinetobacter spp., в настоящее время являются имипенем, дорипенем, меропенем и цефоперазон/сульбактам, а в будущем - колистин и полимиксин Б.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

Практические рекомендации, разработанные в диссертации, используются в работе медико-профилактических учреждений гг. Екатеринбурга, Новосибирска, Москвы, Краснодара, Минска, Смоленска. Основные положения работы излагаются на семинарах и циклах повышения квалификации врачей и курсах усовершенствования лаборантов в НИИ антимикробной химиотерапии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию», на конгрессах, конференциях и семинарах Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ), на практических занятиях и лекциях кафедры клинической фармакологии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию».

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты исследования представлены на Международном конкурсе научно-исследовательских работ по антимикробной химиотерапии, памяти члена-корреспондента РАМН, д.м.н., профессора JI.C. Страчунского (Смоленск, 2007 г.), 35-й конференции молодых ученых Смоленской государственной медицинской академии (Смоленск, 2007 г.), Научно-практическом семинаре «Бета-лактамазы: значение и методы выявления» (Смоленск, 2007 г.), Научно-практическом семинаре «Определение чувствительности к антибиотикам: практические аспекты и значение для клинической практики» (Смоленск, 2007 г.), XVIII Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (ECCMID, Барселона, 2008 г.), III Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2008), курсах усовершенствования лаборантов (Смоленск, 2008, 2009 гг.), циклах повышения квалификации врачей-бактериологов (Смоленск, 2008, 2009 гг.), циклах повышения квалификации клинических фармакологов (Смоленск, 2008, 2009 гг.), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009 г.), XIX Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (ECCMID, Хельсинки, 2009 г.), XI Международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии (Москва, 2009 г.), 37-й конференции молодых ученых Смоленской государственной медицинской академии (Смоленск, 2009 г.), XIX Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2009), 49-й междисциплинарной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (ICAAC, Сан-Франциско, 2009 г.), Научно-практическом семинаре «Молекулярная бактериология: идентификация, типирование и выявление антибиотикорезистентности»

Смоленск, 2009 г.), совместном заседании сотрудников кафедр госпитальной педиатрии с курсом неонатологии ФПК и 1JLL1C, клинической фармакологии, микробиологии, поликлинической педиатрии, терапии педиатрического и стоматологического факультета, терапии ФПК и ППС, общественного здоровья и здравоохранения, травматологии и ортопедии, урологии, факультетской терапии, сотрудников НИИ антимикробной химиотерапии ГОУ ВПО «Смоленская медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Смоленск, 2010 г.).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них ВАК рецензирумемых журналах - 2, в зарубежной печати - 4, в центральной печати - 2.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, который включает 27 отечественных и 257 иностранных источников. Материал иллюстрирован 15 таблицами, 35 рисунками, содержит 1 приложение.

выводы

Acinetobacter spp. является вторым по частоте встречаемости (15%) неферментирующим грамотрицательным патогеном в отделениях с интенсивным потреблением антибиотиков в 2006-2008 гг. в России, причём, количество вызванных им инфекций в отделениях реанимации и интенсивной терапии в России за последние 12 лет увеличилось в 2,3 раза и составило 16,3%.

Наибольшую in vitro активность в отношении нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp., выделенных в России, проявляют: колистин —» полимиксин Б —> имипенем —»• дорипенем —» цефоперазон/сульбактам —> меропенем —> нетилмицин, чувствительными к которым оказались 100% -» 99,7% -> 97,3% -> 92,7% 89,7% -» 85,5% 78,2% штаммов, соответственно.

Создание 6 новых праймеров и оптимизация состава реакционной смеси и протокола ПЦР в реальном времени позволили разработать способ выявления всех известных генов приобретённых ОХА-карбапенемаз.

Распространённость приобретённых ОХА-карбапенемаз среди карбапенеморезистентных штаммов Acinetobacter spp. в 2006-2008 гг. в России составила 18% (100% - ОХА-58), в 2008-2009 гг. - 100% (39,7% - ОХА-23; 46,5% - ОХА-40; 13,8% - ОХА-58). Распространённость ОХА-карбапенемаз в 2008-2009 гг. в Беларуси составила 94,6% (100% - ОХА-40). Металло-бета-лактамаз ни в одной из стран выявлено не было.

Для оптимизации протокола мультилокусного секвенирования-типирования штаммов A. baumannii было разработано 14 новых праймеров, оптимизированы составы реакционных смесей и протоколы ПЦР, что позволило расширить возможности практического применения данного метода в микробиологических лабораториях.

6. Среди 14 изученных штаммов выявлено 16 новых аллельных вариантов различных генов; сами штаммы отнесены к 9 новым сиквенс-типам, 7 из которых принадлежат к известным эпидемическим клональным группам. При этом три из них являются возбудителями большого числа инфекций в зарубежных странах, две — в России и Беларуси.

7. В ближайшие годы в России и Беларуси следует ожидать стремительный рост резистентности к карбапенемам среди нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp. ввиду увеличения продуцентов приобретённых ОХА-карбапенемаз и циркуляции штаммов, имеющих эпидемические свойства.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для микробиологов

1. Проводить скрининг всех клинических штаммов Acinetobacter spp. на металло-бета-лактамазы и приобретённые ОХА-карбапенемазы до определения чувствительности к антибиотикам и при выявлении любой карбапенемазы не рекомендовать терапию карбапенемами.

2. Включить разработанную технологию ПЦР в алгоритм исследований Acinetobacter spp. в микробиологических лабораториях при лечебно-профилактических учреждениях и центрах Госсанэпиднадзора.

3. Микробиологическим лабораториям при лечебно-профилактических учреждениях и центрах Госсанэпиднадзора вести учёт результатов проведённых тестов на чувствительность к антибиотикам и предоставлять врачам суммарные данные о наиболее активных за определённый период антимикробных препаратах в отношении Acinetobacter spp. в каждом конкретном стационаре.

Для клинических фармакологов

4. Рассматривать имипенем, дорипенем, меропенем и цефоперазон/сульбактам в качестве препаратов эмпирической и этиотропной терапии нозокомиальных инфекций при обнаружении или подозрении на Acinetobacter spp. во всех стационарах России.

5. Исключить из протоколов терапии нозокомиальных инфекций, вызванных Acinetobacter spp., незащищённые пенициллины и незащищённые цефалоспорины III поколения, а в ожоговых отделениях и отделениях хирургической инфекции - также гентамицин и пиперациллин/тазобактам.

6. Обратиться с ходатайством в Федеральную службу по надзору в сфере здравоохранения и социального развития о внедрении на фармацевтический рынок России парентеральных форм полимиксина Б и колистина ввиду их высокой активности в отношении полирезистентных Acinetobacter spp.