Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Морфологические и функциональные изменения в органах и тканях пушных зверей при хронической почечной недостаточности

На правах рукописи

МОТЫЛИНА НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

16.00.02 - Патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

МОСКВА 2009

003466495

Работа выполнена на кафедре незаразных болезней ФАО ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии».

Научный руководитель: Борис Вениаминович Уша,

заслуженный деятель науки РФ, академик РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты: Анатолий Анатольевич Белоусов,

доктор ветеринарных наук, профессор (ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова РАСХН)

Валерий Эдуардович Прусак-Глотов,

кандидат ветеринарных наук, доцент (ФАО ГОУ ВПО МГУПБ)

Ведущая организация: ГНУ научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева

Защита диссертации состоится «, л; 2009 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 212.149.03 при ФАО ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии», по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, д. 33

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета и на вебсайте www.mssab.ru

Автореферат разослан «. » ьивк&Ь 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, профессор/' Серёгин И.Г.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Основными причинами заболеваний почек незаразной этиологии у пушных зверей являются несбалансированное кормление, нефротоксич-ное воздействие многих препаратов, применяемых для профилактики заболеваний и повышения продуктивности животных (антигельминтные и инсектицидные средства, антибиотики группы аминогликозидов и цефалоспорина, статины, стероиды и др.), а также длительное поступление в организм токсических веществ с кормом (например, солей тяжелых металлов, пестицидов) (Kopczewski А. et а!., 1988; Поспишиль Ю.А., 1995; Майоров М.А., 2001; Nowakowicz-Debek В. et al,, 2007). Эти заболевания отрицательно влияют на продуктивные свойства, вызывают задержку линьки и могут привести к гибели зверя. Как правило, патология развивается у 2-3-летних самок пушных зверей маточного поголовья и 6-7-месячных самцов. В связи с этим возрастают потери при производстве пушной продукции. На сегодняшний день подробного изучения патоморфологаческих форм и функциональных изменений в организме пушных зверей при токсических поражениях почек не проводилось.

Известно, что при воздействии всех видов нефротоксичных веществ патологические изменения происходят, прежде всего, в почечных интерстиции и канальцах (Тареева И.Е., 1998, 2002; Шулутко Б.И., 2002). В свою очередь, тубулоинтерстици-альные процессы являются ведущим фактором в прогрессировании заболевания, развитии нефросклероза и как клинического проявления - хронической почечной недостаточности (ХПН) (Нестеров Д.В., 2000; Команденко Н.С., Шостка Г.Д., 2002; Байн-бридж Д., Эллиот Д., 2003). В патогенезе ХПН ключевым звеном является эндогенная интоксикация, или эндотоксикоз, при котором происходит накопление избытка продуктов нормального или извращенного обмена веществ и клеточного реагирования в тканях и биологических жидкостях организма (Мишнев О.Д., 2003; Новочадов В.В., 2005). При развитии ХПН в организме накапливаются вещества средней молекулярной массы (ВСММ), продукты расщепления пластического материала (продукты деградации белков, глико- и липопротеидов, фосфолипидов) и другие токсины (Смирнов A.B., 1997; Суворова Т.С., Вольвич К.В., 2000). Лабораторные исследования подтверждают негативное влияние этих веществ на функциональное состояние, морфологическое строение внутренних органов животных (селезенку, печень, желудочно-кишечный тракт, легкие, костный мозг) и кожный покров, особенно дерму (Родионова A.A., 1970; Уша Б.В., 1979; Гончаров H.A., 1983; Шахбазян С.Н., 1983; Абдуллаев С.П., 1989; Клечиков В.В., Береснева О.Н., 1993; Богдан Г.М., 1994; Школа Т.С., 2000; Popp J.-P., 1993).

В настоящее время лечение ХПН в условиях зверохозяйства малоэффективно. Связано это с высокой стоимостью лекарственных препаратов, отсутствием лекарственных форм, удобных для применения. Следовательно, весьма актуальна разработка доступных методов восстановительной терапии, направленной на коррекцию метаболических нарушений при различных формах заболевания. Наиболее перспективным методом лечения и профилакшки ХПН является использование в рационе животных биологически активных добавок растительного происхождения, обладающих сорбционным и антиоксидантным действиями. В этом аспекте представлялось интересным выявить возможные варианты метаболических реверсий при нефропатиях токсического характера и оценить влияние природных лечебных факторов на ведущие морфологические нарушения при данных патологических состояниях.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилось изучение морфофункциональных изменений в органах и тканях при хронической почечной недостаточности, обусловленной эндотоксикозом пушных зверей, а также определение степени обратимости этих изменений при применении смеси препарата «Бефунгин» и бобовой культуры нута.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить цитологические, гистологические и гистохимические особенности изменений, происходящих в почках, печени и коже песцов с хронической почечной недостаточностью, обусловленной токсическим поражением почек.

2. Выявить зависимость между показателями эндогенной интоксикации и морфофункциональным состоянием органов у животных при хронической почечной недостаточности.

3. Определить воздействие кормовой добавки, состоящей из смеси препарата «Бефунгин» и нута на организм животных при хронической почечной недостаточности и возможность её применения для коррекции метаболических нарушений.

Научная новизна. Впервые приведены морфометрические параметры и цитологические изменения на световом и электронно-микроскопическом уровнях тканей почек, печени и кожи у песцов с хронической почечной недостаточностью латентной и интермиттирующей стадий вследствие хронического токсического поражения почек. Изучено состояние белково-жирового обмена и показателей эндогенной интоксикации при данной патологии.

Установлена роль изменений соотношения фракций холестерина и уровня веществ средней молекулярной массы в развитии ранних стадий эндогенной интоксикации при токсическом поражении почек у песцов.

Научно доказана возможность коррекции обменных нарушений при хронической почечной недостаточности, при применении кормовой добавки с лечебно-профилактическим действием, состоящей из смеси бобовой культуры нут и препарата «Бефунгин».

Практическая значимость работы.

1. Обоснованы подходы к лабораторной диагностике хронической почечной недостаточности на основе измерения уровня показателей эндогенной интоксикации. Показано их значение в диагностике латентной стадии хронической почечной недостаточности у песцов.

2. Полученные морфометрические характеристики тканевых и клеточных структур органов песцов использованы в научных работах.

3. Доказана эффективность применения смеси на основе нута и «Бефунгина» в коррекции метаболических нарушений при комплексной терапии токсических поражений почек, сопровождающихся хронической почечной недостаточностью.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Морфофункциональные изменения в почках пушных зверей при хронической почечной недостаточности.

• Морфологические и биохимические изменения в организме животных при хронической почечной недостаточности.

• Эффективность применения комплекса на основе нута и «Бефунгина» в коррекции морфофункциональных изменений при хронической почечной недостаточности.

Связь исследований с научной программой. Тема работа являлась частью научно-исследовательского направления кафедры незаразных болезней «Разработка методов диагностики, лечения и групповой профилактики внутренних незаразных болезней животных с целью повышения качества и количества животноводческой продукции» (код 68.41.63)

Апробация работы. Материалы исследования доложены на Всероссийской научной конференции Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности с.-х. продукции (М., МГУПБ, 2004); V и VH Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., МГУПБ, 2004,2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в список ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 151 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований и практические предложения, выводы, приложения. Диссертация содфжит 14 таблиц и 49 рисунков. Список использованной литературы включает 176 источников, в том числе 124 отечественных и 52 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Экспериментальные исследования проводили в период с 2004 по 2008 гг. на кафедре Незаразных болезней и лаборатории ветеринарной клиники при МГУПБ, в племсовхозе «Пушкинский» Пушкинского р-на Московской области, в виварии ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова РАСХН, лаборатории электронно-микроскопических исследований ГУ НИИМЧ РАМН.

Материалы исследований. Для выявления клинико-морфологических форм токсических поражений почек с симптомокомплексом хронической почечной недостаточности у песцов проводили исследования в условиях зверохозяйства. Объектами исследования служили вуалевые песцы (Alopex Iagopus): самцы в возрасте 6 месяцев и самки из маточного поголовья в возрасте 2-3 года, подобранные по принципу аналогов. Общее количество животных составило 220 голов.

По результатам проведенных исследований опытных песцов разделили на две группы (по классификации Ниберле и Корса): 1-я группа - с хроническим тубулоин-терстициальным нефритом (ХТИН) с очаговым нефросклерозом, нефротическим синдромом, латентная стадия ХПН (16 самцов, 12 самок); 2-я группа - с хроническим тубулоинтерстициальным нефритом, диффузным нефросклерозом, интермитгарую-щая стадия ХПН (19 самок). В контрольную группу вошли животные без видимых клинических признаков заболеваний (10 самцов, 10 самок). Подопытных животных содержали при одинаковых условиях в отдельных клетках, согласно принятым в хозяйстве технологии и нормам. Ежедневно определяли клинико-физиологические показатели. Исследования крови и мочи проводшш в начале эксперимента, на 15-е, 30-е и 45-е сутки. На 45-й день исследования песцов выводили из эксперимента методом передозировки золетила.

В условиях экспериментальной клиники моделировали патологию по методу В.В. Новочадова (2001) путем последовательного введения гентамицина и лшгопо-лисахарида (ЛПС) S.typhi murium («Sigma», USA) на протяжении 90 суток. При та-

кой модели развивается эндотоксикоз с преимущественными нефросклеротически-ми изменениями в почках (дисметаболическая нефропатия). Клинически и морфологически это согласуется с типом хронического токсического тубулоинтерстициаль-ного нефрита, осложненного ХПН (Новочадов В.В., Писарев В.Б., 2005). Эксперимент ставили на 60 белых крысах-самках массой 250±11 г (возраст 5 месяцев). Контрольная группа состояла из 20 здоровых самок крыс.

Начиная с 90-х суток введение ЛПС прекращали, и животным начинали давать испытуемые лечебно-профилактические добавки. Для этого крыс с моделью дисметаболической нефропатии разделили на 4 опытные группы. 1-й группе животных в рацион кормления добавляли смесь из нута (20 г/кг массы) и «Бефунгина» (0,005 мл/кг); 2-й группе давали препарат «Канефрон» (0,15 мл/кг); животным 3-й группы - смесь из нута и «Бефунгина» и «Канефрон» в тех же количествах. Крыс 4-й группы не подвергали лечению. Добавки и препарат смешивали с кормом, давали животным утром, деля на порции, с контролем поедаемости.

До начала эксперимента, а также на 30-е, 60-е, 90-е и 111-е сутки у оглушенных углекислым газом животных брали кровь и внутренние органы.

Клинические и биохимические методы исследования. У песцов кровь для исследования брали из подкожной вены предплечья, у крыс - из желудочков сердца. При исследовании клинических показателей проб крови определяли количество эритроцитов и лейкоцитов унифицированным методом. Биохимические исследования сыворотки крови проводили на автоматическом анализаторе «MARS» (Швеция). Определяли: активность аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансфе-разы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), концентрацию общего холестерина (ОХ), холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП), триглицеридов (ТГ), креатинина, мочевины, общего билирубина, общего белка, альбуминов. Расчетным методом определяли: коэффициент Ритиса, А/Г коэффициент, концентрацию холестерина липопротеидов очень низкой плотности (ХС ЛПОНП) по формуле: ХС ЛПОНП - ТГ : 5, концентрацию холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП) по формуле: ХС ЛПНП = ОХ - (ХС ЛПВП+ХС ЛПОНП), коэффициент атерогенности (КА) по формуле: КА = (ОХ - ХС ЛПВП) : ХС ЛПВП, определяли соотношение ХС ЛПНП : ХС ЛПВП. В плазме крови определяли концентрацию веществ средней молекулярной массы (ВСММ) по методу М.Я. Малаховой (1995). Экстинкцию измеряли на двулучевом спектрофотометре «Сагу 50 Bio».

Анализ мочи проводили на автоматическом анализаторе «Uriscan S-300». Общий анализ мочи включал оценку физико-химических показателей (удельный вес, белок, глюкоза, билирубин, кровь, лейкоциты, уробилиноген, кетоны, нитриты) и микроскопическое исследование осадка.

Морфологические методы исследования. Для светоопгаческого и электронно-микроскопического исследований брали пробы внутренних органов (почки и печень) и участок шкурки с межлопаточной области у крыс, у песцов - с области огузка. Материал для гистологического исследования фиксировали в 10%-м нейтральном водном растворе формалина. Затем проводили обезвоживание кусочков исследуемых органов в спиртах, и заключение в парафин по общепринятой методике (Меркулов Г.А., 1969; Ромейс , 1969; Семченко В.В.и др., 2006). На роторном микротоме «Mi-crom HM 315» изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм. Срезы внутренних органов окрашивали гематоксилином Эрлиха и водно-спиртовым эозином, Суданом черным, пикрофуксином по Ван Гизон, ставили ШИК-реакцию. Изучение микроструктурных

препаратов и их фотографирование осуществляли на световом микроскопе «Axio Imager AI» (Carl Zeiss, Германия) с помощью видеокамеры «AxioCam MRc 5». Обработку изображения и проведение морфометрических измерений производили в программе AxioVision Rel.4.6.

Для электронно-микроскопического исследования кусочки органов фиксировали: в 2,5%-м растворе глутарового альдегида; 1,0%-м растворе четырёхокиси осмия. По завершении фиксации препараты обрабатывали по стандартной схеме с заливкой в смесь эпоксидных смол (Уикли Б., 1975; Миронов АА., Комиссарчик Я.Ю., 1994). Полутонкие и ультратонкие срезы изготавливали на улыратоме «LKB Ш». Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим-азур П-фуксином. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали в электронном микроскопе «JEOL JEM-100 СХII».

На срезах, 01фашенных гематоксилином и эозином, определяли следующие морфометрические характеристики. В почках: объемную долю (ОД) интерстиция мозгового и коркового слоев, %; среднюю площадь капилляров клубочка (Skk), мкм2; среднюю общую площадь клубочка (S0K), мкм2; капсулярное пространство как отношение S0K к Skk, усл.ед.: канальцевый индекс как отношение толщины стенки канальца к диаметру его просвета, усл.ед.; площадь ядер эпителия проксимальных и дисталь-ных канальцев (Ишк, S^), мкм2; % клубочков с признаками склерозирования (на срезах, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизон). В печени: объемные доли (ОД), %: центральных вен, триад, соединительной ткани, гепатоцитов, клеток Купфера, сину-соидов; среднюю площадь гепатоцитов (Sm) и клеток Купфера (S^), мкм2; а также % двухъядерных гепатоцитов. Морфометрическое исследование проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа (Автандилов Г.Г., 2002).

Всего было проведено 450 гистологических, 1143 гистохимических и 198 электронно-микроскопических исследований.

Полученные результаты обработаны статистически с использованием пакета программ Statstica 6.0, для оценки достоверности результатов использовали критерий Стьюдента, принятый для сравнения средних значений (Глотов Н.В. и соавт., 1982; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005).

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Результаты комплексного обследования песцов с хронической почечной недостаточностью

Результаты клинико-лабораторных исследований. При ежедневной оценке клинического состояния животных обеих опытных групп отмечены угнетение, малая подвижность, снижение аппетита, у единичных особей (2-3 головы) задержка линьки, при пальпации почек у животных 1-й группы выраженная болезненность в начале эксперимента.

Гематологические исследования в течение эксперимента проводили 4 раза. Наиболее характерные изменения по группам отмечали в конце эксперимента (табл. 1). У песцов подопытных групп отмечено увеличение количества лейкоцитов и уменьшение количества эритроцитов по сравнению с кошролем. В ходе исследований установлено достоверное уменьшение количества белка в крови животных опытных груш по сравнению с песцами контрольной группы. Отмечена абсолютная гапо-протеинемия, при этом снижение А/Г коэффициента свидетельствовало, что гипопро-

теинемия обусловлена, прежде всего, пшоальбуминемией. Достоверное увеличение концентрации мочевины и креатинина относительно контроля в начале эксперимента наблюдали только у песцов 2-й опытной группы. Повышение активности АлАТ, АсАТ и ЩФ, а также уровня билирубина в обеих опытных группах свидетельствует о развитии гепаторенального синдрома. Во 2-й группе животных мы наблюдали снижение активности АлАТ и АсАТ к концу эксперимента, ниже уровня аналогичных показателей у животных контрольной группы.

Таблица 1

Изменение показателей крови подопытных песцов в течение эксперимента, М±т

Показатели 1-е сутки 45-е сутки

Опытная группа 1 п=28 Опытная группа2 п=19 Контроль п=20 Опытная группа 1 п=28 Опытная группа 2 п=19 Контроль п=20

Эритроциты, 10и/л 8,0±0,5 6,8±0,5* 8,7±0,5 7,4±0,5* 6,1±0,5** 8,8±0,3

Лейкоциты, 107л 7,2±0,9* б,9±0,9 6,0±0,7 8,4±1,1** 10,2±1,0** 5,9±0,6

Белок, г/л 68,0±1,2* 64,1±2,0** 73,0±1,1 61,2±1,5** 59,2±1,9** 73,2±1,1

Альбумин, г/л 29,8±0,9** 25,7±1,7** 42,3±0,6 26,3±1,3** 21,3±1,1*в 42,4±0,6

А/Г коэффициент 0,78±0,01** 0,67±0,02** 1,38±0,02 0,75±0,01** 0,56±0,02** 1,38±0,02

Мочевина, ммоль/л 5,9±1,8 12,8±1,3*' 4,3±0,б 11,6±1,8** 22,8±1,7** 4,2±0,6

Креагинин, мкмоль/л 108±17 150±21* 93±11 198±20** 307±22** 91±12

Билирубин общий, мкмоль/л 7,9±1,8* 10,0*1,1** 5,2±0,8 \\A±2&*' 14,6±1,9** 5,0±0,9

АлАТ, МЕ/л 95,34±5,41* 66,82±3,63* 34,72±1,21 72,61±11,4* 28,52±2,35* 36,41±1,51

АсАТ, МЕ/л 65,23±2,12* 58,35±2,87* 41,63±1,52 88,90±7,41* 37,84±2,56* 44,87±2,10

Коэффициент Ритиса 0,68±0,45 0,87±0,71 1,25±0,14 1,13±0,95 1,30±0,68 1Д2±0,19

ЩФ,МЕ/л 71,5±5,1* 92,3±6,8* 42,4+3,3 106,2±7,3** 150,9±10,1** 43,3±3,7

Примечание: * р<0,05; ** р<0,001 достоверность различий с соответствующим показателем контрольной группы.

Мы наблюдали достоверные различия в концентрации веществ средней молекулярной массы (ВСММ) у животных обеих опытных групп относительно контроля. Как показали исследования сыворотки крови, у песцов наблюдалось выраженное повышение ВСММ с самого начала эксперимента (рис.1). В 1-й опытной группе отмечено повышение уровня ВСММ до 0,27±0,02 усл.ед в начале и 0,32±0,05 усл.ед. в конце эксперимента, во 2-й - 0,30±0,02 усл.ед. в начале и 0,45±0,08 усл.ед. в конце, прошв аналогичного показателя для контрольной группы 0,24±0,01 усл.ед.

□ Опытная группа 1 п=28 О Опытная группа 2 п=19

□ Контрольная группа п=20 ¡

I t

0,5 0,4 0,3 0,2 10,1

ВСММ, усл.ед.

45-е сутки

1-е сутки

Рис. 1. Динамика накопления веществ средней молекулярной массы в крови песцов

Как видно на рис. 2, у животных обеих групп наблюдается повышение количества ОХ, более выраженное к концу эксперимента. На 45-е сутки его уровень составил 7,21±0,33 ммоль/л в 1-й и 7,92±0,34 ммоль/л во 2-й опытных группах песцов. Анализ липидных фракций показал, что это происходит за счёт холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП), в то время как содержание холестерина липопротеидов высокой (ХС ЛПВП) и очень низкой (ХС ЛПОНП) падает (рис. 2). Так, уровень ХС ЛПНП в крови животных 1-й группы к концу эксперимента находится в пределах 3,36±0,15, 2-й группы - 4,73±0,18 ммоль/л. В контрольной группе эти значения находятся на уровне 2,82±0,08 ммоль/л. Концентрация ХС ЛПВП изменена следующим образом: в начале эксперимента определен уровень в пределах 4,19±0,07 ммоль/л у животных 1-й группы и 3,85±0,11 ммоль/л у животных 2-й группы. На 45-е сутки содержание ХС ЛПВП составило 3,77±0,14 и 3,15±0,20 ммоль/л соответственно в крови песцов 1-й и 2-й опытных групп. Уровень ХС ЛПОНП оставался на протяжении всего эксперимента в пределах 0,08±0,01 ммоль/л у животных 1-й и 0,07±0,01 ммоль/л - 2-й групп, в контрольной группе - 0,09±0,01 ммоль/л. Количество триглицеридов (ТГ) также снижается и составляет к концу эксперимента 0,36±0,08 в 1-й и 0,35±0,07 ммоль/л во 2-й группе против контрольных значений 0,48±0,05 ммоль/л (достоверные отличия обнаружены только во 2-й группе к концу эксперимента). Коэффициент ате-рогенности (КА) резко повышен. К концу эксперимента он составляет 0,91 ±0,11 в 1-й и 1,51±0,23 во 2-й экспериментальных группах, в контрольной группе - 0,36±0,05.

ОХ, ХСЛПВП, ТГ. ХС ЛПОНП, ХСЛПНП, КА ХС ЛПНП:

ммоль/л ммоль/л ммоль/л ммоль/л ммоль/л ХСЛПВП

И Опытная группа 1 п-26 а Опытная группа 2 л=19 □ Контрольная группа п=20

Рис. 2. Содержание различных фракций липидову песцов на 45-е сутки наблюдения

В связи с тем, что ХС ЛПОНП участвует в транспорте эндогенных ТГ (Камышников B.C., 2002), уменьшение его может привести к жировой инфильтрации печени с последующей дистрофией, что подтверждается в нашем случае морфологическими исследованиями. Уменьшение количества ХС ЛПВП приводит к накоплению ТГ в крови и увеличению КА.

У 85,1 % песцов опытных групп отмечено снижение рН мочи по сравнению с контролем. Проведенный количественный анализ белка в моче показал достоверное увеличение этого показателя до 0,5±0,2 г у 93,6 % песцов обеих опытных групп. Также наблюдались: микрогематурия (у 55,3 % животных), снижение относительной плотности мочи (у 89,3 % животных), глюкозурия (у 48,9 % песцов), в осадке присутствовало большое количество клеток почечного эпителия, зернистых и эпителиальных цилиндров, лейкоцитов (100 % животных).

Результаты морфологических исследований почек. Макроскопически почки животных контрольной группы имели правильную бобовидную форму, гладкую упругую поверхность, кровоизлияний на поверхности и под капсулой не обнаружено, капсула легко снимается. На разрезе корковый слой немного темнее мозгового, граница между корковым и мозговым слоями заметна. Стенка лоханки гладкая, упругая, не утолщенная, без кровоизлияний, сгустков и конкрементов не обнаружено.

Гистологическое исследование препаратов почек животных контрольной группы показало сохранность всех структурных элементов нефронов, сосудистого и стромального компонентов органов. Гистохимическое и цитологическое исследования эндотелия капиллярных клубочков, базальных мембран (БМ) и эпителиальных клеток почечных телец, канальцев, перитубулярных капилляров и интерстиция свидетельствовали об активности фильтрации, реабсорбции и кровоснабжения.

Проведенные морфологические исследования почек животных 1-й опытной группы позволили установить у них хронический тубулоинтерсгациальный нефрит (ХТИН) с очаговым нефросклерозом. Макроскопически почки увеличены в размере за счет отека интерстиция и воспаления, граница между корковым и мозговым слоями не заметна. Под капсулой и в корковом слое - петехиальные кровоизлияния.

Гистологическое исследование препаратов почек песцов 1-й опытной группы позволило выявить неравномерность распространения патологических изменений воспалительно-дистрофического характера. На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, обнаружены изменения гемодинамики в виде застойных явлений, которые проявлялись резким расширением междольковых артериол и капилляров, агрегацией содержащихся в них эритроцитов. В интерстиции коркового и мозгового слоев обнаружены очаговые инфильтраты, представленные лимфоцитами и макрофагами (рис. 3). Ткань паренхимы почек местами замещена и сдавлена очаговыми разрастаниями соединительной ткани. Преобладают перигломерулярный и периту-булярный типы склероза. Клубочки коркового слоя вне зон ингерстициального склероза увеличены в размерах. На уровне ультраструктурной организации в клетках таких клубочков незначительная вакуолизация цитоплазмы мезангицитов и по-доцитов, очаговое утолщение БМ капилляров. В цитоплазме эндотелиоцитов снижено, по сравнению с контролем, количество пиноцитозных пузырьков и кавеол.

Часть канальцев коркового и мозгового слоев замещена кольцевыми образованиями соединительной ткани (тубулярный фиброз). Выявлены участки с проявлениями регенерации эпителия канальцев. Они характеризовались своеобразным расположением нефроцитов - в два ряда. В эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев вне зон склероза интерстиция обнаружены резко выраженные явления зернистой, гиалиново-капельной, реже вакуольной и жировой дистрофии, очаговой субатрофии и атрофии (рис.3). Отдельные канальцы кистозно расширены, содержат белковые и зернистые цилиндры, эритроциты. Прицельное исследование ультраструктурной организации клеток проксимальных канальцев показало гетерогенность их функционально-мофологического состояния. В одних случаях была обнаружена гиперфункция эпиге-лиоцитов, которая характеризовалась появлением большого количества пиноцитозных пузырьков и вакуолей в апикальных отделах. В таких клетках наблюдались увеличение количества рибосом и полисом, выраженная складчатость базального лабиринта, увеличение размеров митохондрий с сохранением структуры и ориентации крист. В других канальцах наблюдалась частичная деструкция щёточной каёмки с разрушением апикальной плазмолеммы, уменьшение складчатости базального лаби-

ринта. В апикальной части эпиталиоцитов проксимальных канальцев содержалось мало вакуолей. Митохондрии в области базального лабиринта подвергались деструкции (рис. 4). Такие явления свидетельствуют о снижении функции реабсорбции. Сходные изменения происходили как в проксимальном, так и в дистальном отделах. В ряде случаев мы наблюдали значительные изменения ультраструктурной организации эндотелия перитубулярных капилляров, которые выражались в деструкции орга-нелл эпителиоцитов, разрушением тубулярной БМ и проникновением форменных элементов в просвет канальцев. По-видимому, с этим связано наличие микрогематурии у животных опытных групп (Шулутко Б.И., 2002).

В собирательных трубочках наблюдаются выраженные симптомы набухания и гидропической дистрофии.

Рис. 3. Хронический тубуло-интерстици-альный нефрит. Очаговая инфильтрация лимфоцитами и макрофагами, вакуольная дистрофия эпителия канальцев, десквама-ция эпителия Окраска гематоксилином и эозином. Об. 20, ок. 10

Рис. 4. Вакуольная дистрофия проксимальных отделов канальцев почки песцов. Набухание митохондрий, большое количество лизосом. Электронограмма. *5000

В склерозированном интерстиции обнаружены фибробласты в состоянии высокой и умеренной синтетической активности. В цитоплазме этих клеток выявлены многочисленные, часто расширенные, цистерны зернистого эндоплазматического ретикулума, полисомы и рибосомы, хорошо развитый пластинчатый комплекс. Вблизи фибробластов, в инвагинатах их цитоплазмы обнаружены множественные пучки коллагеновых волокон с характерной поперечной исчерченностью.

Во 2-й группе животных макроскопически почки характеризовались уменьшением размеров, поверхность их была неровной, на разрезе граница между корковым и мозговым слоями не выражена. Капсула снимается с трудом.

Морфологические изменения проявлялись более глубокими, по сравнению с 1-й группой, дистрофическими процессами в паренхиме органов с развитием диффузного нефросклероза. При анализе гистологических препаратов почек, окрашенных ликрофуксином по Ван Гизон, обнаружены обширные зоны склероза интерсти-ция, располагающиеся перитубулярно, перигломерулярно и периартериально (рис.5). Изменения кровеносных сосудов выражались в эластофиброзе артериол с формированием «луковичных структур». Кровенаполненность капилляров микроциркуля-торного русла почек снижена по сравнению с 1-й группой и контролем. Вокруг око-локанальцевых капилляров выявлены значительные разрастания соединительной

ткани. Значительная часть капиллярных клубочков почечных телец подвержена ишемическому сморщиванию. Изучение ультраструктурной организации эндотелия сморщенных клубочков показало развитие признаков некробиоза в эндотелиоцитах (вакуолизация цитоплазмы, разрушение мембранных органелл и уменьшение размеров ядер с повышением электронной плотности кариоплазмы). Между стенками капилляров и БМ канальцев обнаруживались пучки коллагеновых волокон.

Нарастают симптомы дистрофии и атрофии эпителия канальцев (рис. 5). При этом участки пролиферации клеток эпителия, в отличие от 1-й группы, отсутствуют. При цитологическом исследовании обнаружено, что эпителиоциты проксимальных извитых отделов на значительном протяжении утрачивали ворсинки щеточной каемки. Клетки нефротелия проксимального и дистального отделов содержали гетерогенные по своей форме ядра, как правило, с конденсированным хроматином и трудно дифференцируемым ядрышком, некоторые смещены к люминальному полюсу или подвергаются лизису. Другие органеллы часто в состоянии различной степени деструкции. Митохондрии уменьшены в размерах, с просветленным матриксом и де-структурированными кристами, мембраны некоторых имели разрывы. В цитоплазме клеток обнаружены вакуоли, содержащее белковые включения и липидные кагши.

Эпителий дистального отдела больше вовлечен в патологический процесс по сравнению с проксимальным. Некоторые клетки подверглись некробиотическим изменениям: размеры ядер уменьшены, цитоплазма гомогенизирована, мембранные органеллы фрагментированы (рис. 6). Эпителиоциты уплощены, распластаны по БМ. Часть клеток эпителия отслаивается от неравномерно утолщеной БМ.

По результатам морфомегрических исследований (табл. 2) тканей почек песцов установлено, что при хроническом токсическом поражении почек происходит достоверное увеличение объёмной доли интерстициальной ткани коркового вещества: в 1-й группе на 96,6 %, во 2-й - на 239,0 %. Доля интерстициальной ткани мозгового вещества также увеличивается, но в меньшей степени: в 1-й группе на 39,7 %, во 2-й - на 58,6 %. Площадь капилляров клубочков и общая площадь клубочков уменьшаются, при этом в 1-й группе одновременно наблюдается увеличение капсу-лярного пространства до 1,6±0,3 против 1,4±0,1 усл.ед. в контроле, по-видимому,

Рис. 5.Диффузный нефросклероз почки пес- рис. б. Атрофия дистшьных отделов ка-

ца. Атрофия эпителия проксимальных и нальцев почки песца. Гомогенизация цито-

дистальных отделов почечных канальцев. плазмы эпителиоцитов, эктопия ядрышка,

Окраска пикрофуксином. Об. 40, ок 10 кариопикноз. Электронограмма. *10000

Таблица 2

Данные морфометрических исследований почек песцов, М±т

Гистологические структуры почки Контроль Группа 1 Группа 2

ОД ткани интерстиция коры, % 5,9±0Д 11,6±0,4** 20,0±0,5***

ОД ткани интерстиция мозгового слоя, % 24,4±0,4 34,1±0,3** 38,7±0,6***

Вкк, МКМ^ 7667,3±95,7 6460,4±322,1* 4790,2±275,6*

ЗоюМЮГ' 10592,4±121,5 9758,5±43 8,0 5816,1±380,4**

Капсулярное пространство, усл.ед. 1,4±0,1 1,6±0,3** 1,2 ±0,1**

Канальцевый индекс, усл.ед. 1,(Ш),1 1,9±0,6* 0,5±0,3*

Зяпк.Мю/ 115,9±3,7 117,7±4,2 97,1±3,8*

ЗядвМкм^ 131,2±4,0 126,01:5,1 109,4±4,2*

% склерозированных клубочков 3±0,5 25,4±5,5*** 48,5±7,4***

Примечание: * р<0,05; ** р<0,01;*** р<0,001 достоверность различий с соответствующим показателем контрольной группы.

связанное с увеличением диуреза. Во 2-й группе происходит уменьшение капсуляр-ного пространства до 1,2 ±0,1 усл.ед. при активизации процессов склерозирования интерстиция. Канальцевый индекс меняется аналогично: в почках песцов 1-й группы резко увеличен до 1,910,6 усл.ед., 2-й - снижен до значения 0,5±0,3 усл.ед. Канальцевый индекс контрольных животных находится в пределах 1,0±0,1 усл.ед. Процент клубочков с признаками склероза наивысший в группе животных с интермиттирую-щей ХПН- 48,5±7,4, в группе с латентной ХПН - 25,4±5,5 %.

Морфологическое исследование печени песцов. Макроскопически печень животных контрольной группы красно-бурого цвета, поверхность гладкая, консистенция упругая, однородная. В желчных протоках не обнаружено конкрементов и признаков застоя желчи. На гистологических срезах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, определена сохранность архитектоники печеночных долек. Края их определялись по расположению печеночных триад. В цитоплазме гепатоцитов как перипортальной так и перицентральной зон при постановке ШИК-реакции обнаружены значительные отложения гликогена в виде глыбок, при окраске Суданом единичные мелкие капли жира. Обращает на себя внимание пролиферация Купферовых клеток, обнаруженная нами при исследовании препаратов печени, которая может быть связана с неполноценным кормлением песцов.

У песцов 1-й опытной группы в печени в 21,4 % случаев выявлено полнокровие печеночных долек, в 14,3 % - вакуольная, в 21,4 % - гидропическая и в 42,8 % -жировая дистрофии.

В первом случае макроскопически печень увеличена в размере, темно-красного цвета. На гистологических срезах выявляется гемостаз в капиллярах, расширение синусоидов и пространств Диссе, скопление в них форменных элементов крови. В перипортальных областях выявляются лимфоцитарные инфильтраты. Ге-патоциты имеют правильную многогранную форму. Ядра в некоторых гепатоцитах слабо окрашены (гипохромные) или не выявляются при исследовании под световым микроскопом. При цитологическом исследовании эндотелий капилляров печеночных долек имеет разрывы, в синусоидах и пространствах Диссе - скопления форменных элементов и белков. В гепатоцитах выявляются признаки зернистой дистрофии: умеренное расширение канальцев зернистого эндоплазматического ре-тикулума, увеличение размеров митохондрий.

Печень животных с паренхиматозной жировой дистрофией увеличена в размере, дряблой консистенции, желто-коричневого цвета. На срезах, окрашенных Суданом III, в цитоплазме гепатоцитов обнаруживаются мелкие вакуоли с жиром. Границы соседних клеток размыты, плохо различимы. В связи с изменением контуров и размеров печеночных клеток нарушено балочное строение печеночной дольки. Описанные микроструктурные особенности патологического процесса наиболее характерны для перипортальных клеток паренхимы печени. В печени выражена пролиферация клеток Купфера. При электронно-микроскопическом исследовании выявлены включения липидных капель (рис.7). Они свободно лежат в цитоплазме, либо располагаются в расширенных канальцах эндоплазматической сети. В отдельных гепатоцитах выявляются признаки атрофических явлений: мембранные органеллы (митохондрии, эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи) подвергаются деструкции и распаду с образованием псевдомиелиновых телец.

Как известно, жировая дистрофия является репаративной реакцией клеток печени при повреждении их экзо- или эндотоксинами, но при продолжительном воздействии факторов, вызвавших её развитие, приводит к гибели гепатоцитов (Непомнящих Д.Л. и др., 2006).

При макроскопическом исследовании печени животных 1-й группы с вакуольной и гидропической дистрофиями установлено некоторое увеличение органа в размерах. Консистенция печени дряблая, цвет - серовато-коричневый. Гистологическое исследование препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином показало следующее. Располагающиеся преимущественно в центральных зонах печеночных долек гепатоциты увеличены в размерах. Цитоплазма их бледнее по сравнению с неизмененными гепатоцитами в связи с наличием в ней вакуолей, заполненных жидкостью («баллонная» дистрофия). Остатки слабоэозинофильной зернистой цитоплазмы располагались глыбками вокруг ядер или вдоль клеточных мембран. При постановке ШИК-реакции обнаружено снижение содержания гликогена. Гепатоциты периферических зон долек практически не содержали вакуолей, цитоплазма их имеет ШИК-положительное окрашивание. Размер и форма гепатоцитов варьирует (полиморфизм). Выявлена гетерогенность ядер печеночных клеток. В не подвергнутых дистрофии клетках периферии долек встречались увеличенные слабоэозинофильные ядра. В ядрах гепатоцитов с признаками гидропической дистрофии видны признаки частичного или полного кариолизиса. При ультраструктурном исследовании выявлены гепатоциты, находящиеся на различных стадиях дистрофического изменения -от зернистой до вакуольной и гидропической дистрофии. В цитоплазме клеток видны вакуоли, границами которых служат мембраны шероховатого или гладкого эндо-плазматического ретикулума (рис. 8). Таким образом, ведущим процессом в печени песцов с гидропической дистрофией является редукция белоксинтетического ком-партмента. Процесс регенерации в таком случае будет проходить по извращенному типу - с развитием фиброза и потерей архитектоники органа (ЬаВгесдие Б., 1994).

Вследствие изменения размеров и формы гепатоцитов нарушено балочное строение печеночных долек. Выражена пролиферация клеток Купфера. При этом основная их часть сосредоточена на границе зон измененных и нормальных гепатоцитов. В перипортальных зонах выявляются обширные инфильтраты лимфоидны-ми клетками (лимфоциты и моноциты), которые полностью замещали печеночную ткань (очаги некрозов). В ряде случаев обнаружен склероз центральной вены.

У животных 2-й группы в печени обнаружены: билиарный цирроз, микро-нодуллярный монолобулярный цирроз и гидропическая дистрофия в сочетании с центральным и перигепатоцеллюлярным фиброзом. В последнем случае прослойки коллагеновых волокон между сохранившимися гепатоцитами тонкие (начальная стадия фиброза), располагаются преимущественно перицентрально. Гепатоциты в состоянии частичной или полной атрофии.

Рис. 7. Жировая дистрофия гепатоцитов песцов. Капли жира в цитоплазме клеток. Электронограмма. *5000

Рис. 8. Вакуольная дистрофия гепатоцитов песцов. Расширение канальцев гладкого и шероховатого эндоплазматического ретику-лума, кариопикноз. Электронограмма. »5000

Печень животных с циррозом уменьшена в размере. Поверхность органа зернистая. Цвет - серо-коричневый. На разрезе видны серо-белые прослойки соединительной ткани. На светооптическом уровне выявлено развитие грубоволокнистой соединительной ткани в виде септ, соединяющих портальные тракты и печеночные вены. При этом участки сохранившихся клеточных элементов паренхимы не содержали дифференцируемых при гистологическом анализе центральных вен и портальных трактов. Размер узелков паренхимы менее 3 мм. В гепатоцитах животных с данной патологией уменьшен объем цитоплазмы (дисплазия печеночных клеток). В центре узелков цитоплазма гепатоцитов в результате гидропических изменений слабо окрашена, ядра в некоторых клетках не выявляются. Соединительнотканные септы инфильтрованы лимфоцитарными клетками. При электронно-микроскопическом исследовании по ходу портальных трактов, в расширенных синусоидах и перисинусоидальных пространствах обнаружены многочисленные фибробласты и пучки коллагеновых волокон.

Согласно данным морфометрического исследования печени песцов (табл. 3), при нарастании симптомов эндотоксикоза и почечной недостаточности в печеночной ткани происходят следующие прогрессивные изменения: увеличивается доля центральных вен до 3,9±0,4 % у животных 1-й группы и уменьшается до 1,1±0,4 % - животных 2-й группы; увеличивается доля соединительной ткани (9,3±0,8 % в 1-й группе и 22,5±1,0 % - во 2-й), клеток Купфера (19,4±1,5 % и 21,6± 1,3 % соответственно). Одновременно происходит уменьшение объемной доли (4б,2±3,5 % в 1-й и 31,9±4,2 % - во 2-й группах) и средней площади (334,1±16,9 мкм и 307,0±18,6 мкм2 соответственно) гепатоцитов при увеличении площади клеток Купфера (785,8±47,3 и 822,5±46,9 мкм2). Уменьшено количество двухъядерных гепатоцитов - 3,7±0,5 %

в 1-й груше и 2Д±0,5 % - во 2-й, в контрольной группе этот показатель составил 5,4±03 %. Таким образом, наблюдается уменьшение количества функциональной площади органа и увеличения реактивной ткани, в том числе выполняющей деток-сицируюшую функцию (клетки Купфера).

Таблица 3

Данные морфометрических исследований печени песцов, М±ш

Гистологические структуры печени Контроль Группа 1 Группа 2

Объемные доли, %: - центральных вен 2,1±0,2 3,9±0,4* 1,1±0,4*

-триад 3,4±0,3 5,1±0,6* 6,2±0,6**

- соединительной ткани 2,2±0,4 9,3*0,8*** 22,5±1,0***

- гепатоцитов 60,5±3,3 46,2±3,5** 31,9±4,2***

- клеток Купфера 17,7±1,1 19,4±1,5 21,6±1,3*

-синусоидов 14,1±1,1 16,1±1,4 16,7±1,6

8га,мкм' 410,2±15,3 334Д±16,9** 307,<Ы8,6***

вкк, мкм' 692,0±17,4 785,8±47,3* 822,5±46,9**

% двухъядерных гепатоцитов 5,4±0,3 3,7±0,5* 2,1±0,5**

Примечание: * р<0,05; ** р<0,01; *** р<0,001 достоверность различий с соотаегсгвующим показателем контрольной группы.

Морфологическое исследование кожного покрова песцов. В коже животных контрольной группы не обнаружено отклонений на макроскопическом, све-тооптическом и ультраструктурном уровнях. Визуально в начале опыта (перед линькой) и в конце (после завершения линьки) шерстный покров был густой, блестящий, равномерной длины. На коже не обнаруживалось участков шелушения, покраснений и кровоизлияний. При гистологическом исследовании не обнаружено отклонений в состоянии клеточных элементов и межклеточного вещества.

При осмотре кожного покрова песцов 1-й и 2-й опытных групп обнаружены гиперемированные участки со следами расчесов. В 47,3 % случаев у песцов 2-й опытной группы выявлено шелушение и утолщение кожи. Были обнаружены участки поредения шерстного покрова, шерсть выглядела тусклой и взъерошенной.

При светооптическом исследовании выявлено утолщение рогового слоя кожи. Количество кровеносных и лимфатических сосудов увеличено, эндотелий набухший. Вокруг сосудов обнаруживались инфильтраты, состоящие из лимфоид-ных клеток, гистиоцитов, фибробластов, эозинофилов, единичных тучных и плазматических клеток. Клетки малытагиевого слоя вакуолизированы, ядра в состоянии пикноза. Обнаружена дезорганизация в расположении клеток шиповатого и базаль-ного слоев, исчезновение четкой границы между ними. Устья волосяных фолликулов расширены, заполнены роговыми пластинками. В клетках внутреннего корневого влагалища обнаруживались явления ороговения. Наблюдались набухание и гомогенизация мышц, поднимающих волос.

В дерме гистологически выявлялся отек, особенно интенсивно выраженный в сосочковом и вокруг сосудов ретикулярного слоев дермы. В некоторых наблюдениях, где отек дермы был значительным, обнаружено отслоение эпидермиса от подлежащих тканей с образованием щелевидных полостей. Коллагеновые волокна набухшие, разрыхленные, местами разъединены отечной жидкостью (рис. 9). Часть волокон окрашивалась пикринофильно (в желтоватый цвет), что свидетельствовало

о дезорганизации их поверхностного слоя. Эластические волокна были разрыхлены, утолщены, местами фрагментированы и истончены. При электронно-микроскопическом исследовании у всех животных наблюдалось расширение межфибриллярных пространств крупными вакуолями, накопление в них зернистых белковых масс (мукоидное набухание). Поперечная исчерченность коллагеновых волокон была сохранена. Цитоплазма клеток дермы, особенно фибробластов, часто была вакуолизирована (рис. 10). Цистерны эндоплазматического ретикулума расширены, митохондрии набухшие, с частично просветленным матриксом.

Рис. 9. Отёк сетчатого слоя дермы песцов с хронической почечной недостаточностью. Пикринофилия коллагеновых волокон. Окраска пикрофуксином. Об. 63, ок. 10

Рис. 10. Фибробласт дермы песцов. Набухание и фрагментация крист митохондрий, уменьшение количества рибосом. Электро-нограмма. хЮООО

Кроме отека и дистрофических процессов в дерме, в коже песцов 2-й опытной группы были обнаружены атрофические изменения, которые выражались в сглаживании гребешков сосочкового слоя, диффузном и очаговом истончении дермы. В таких областях наблюдалось уменьшение количества кровеносных и лимфатических сосудов, сужение их просветов. Внутренняя эластическая мембрана фрагментирована, эндотелий сосудов набухший с гипертрофией или, наоборот, пикнозом ддер. В толще дермы встречались склерозированные сосуды. В отдельных случаях наблюдали ограниченные и диффузные кровоизлияния.

Описанные изменения в морфологии кожного покрова подопытных животных в большей степени были выражены у животных с более высоким содержанием в крови ВСММ, ОХ и ХС ЛПНП.

2.2.2. Динамика морфофункциональных изменений в органах и тканях крыс с моделью дисметаболической нефропатии

Результаты клинико-лабораторных исследований. При моделировании дисметаболической нефропатии были получены результаты, свидетельствующие о прогрессивном развитии изучаемой патологии. Так, по результатам биохимических исследований сыворотки крови определяется постепенное накопление продуктов метаболизма (креатинина, мочевины, билирубина, ВСММ), а также повышение активности АлАТ, АсАТ и ЩФ, свидетельствующие о повреждении гепатоцитов. При изучении показателей липидного обмена выявлено увеличение содержания ХС ЛПНП и уменьшение ХС ЛПВП, что приводило к повышению индекса атерогенноста.

Результаты морфологических исследований. Гистологическая структура почек крыс на 30-е сутки моделирования дисметаболической нефропатии претерпевала изменения, затрагивающие, прежде всего, сосуды микроциркуляторного русла. На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, видны выраженное кровенаполнение капиллярных клубочков точечных телец, застой и гиперемия перитубулярной капиллярной сети. Полость капсулы почечных телец расширена. Эпителиальные клетки почечных канальцев мозгового слоя в состоянии шдропиче-ской дистрофии. В интерстиции имелись очаговые скопления клеток воспалительного характера, преимущественно, макрофагов. При электронно-микроскопическом исследовании эпителиоцигов обнаружено расширение канальцев эвдоплазматиче-ской сети, в цитоплазме - большое количество вакуолей и лизосом. Ядра клеток содержали большое количество эухроматина, т.е. находились в состоянии повышенной синтетической активности. Микроворсинки щёточной каёмки проксимальных канальцев удлинены и истончены. Интерстициальное пространство расширено вследствие отёка, с просветлением матрикса, разрыхлением волокон.

На 60-е супси в почках нарастали отёк и атрофические явления. Капиллярные петли примерно половины капиллярных клубочков почечных телец коллабированы, мочевое пространство таких клубочков резко расширено. В интерстиции наблюдались скопления фибробластов и макрофагов, заметно образование соединительной ткани. Выявлена десквамация щеточной каёмки, а также эпителия проксимальных и дистальных канальцев. На электронограммах клеток почки обнаружено уменьшение количества мембранных органелл эпигелиоцитов проксимальных и дистальных канальцев. Митохондрии клеток имели трубчатую структуру матрикса. Часть ядер находилась в состоянии кариопикноза. В просвете канальцев обнаруживалось большое количество детрита, состоящего из слущенного эпителия и мембранных органелл.

К 90-м суткам моделирования явления дезорганизации почечной ткани были наиболее выраженными. При окраске по Ван Гизон видно увеличение интерстици-альной прослойки органа, местами - мелкие очаги склероза. Рост соединительной ткани деформировал и замещал единичные нефункционирующие клубочки. На срезах, окрашенных Суданом Ш, заметно накопление капель жира в дистальных и проксимальных канальцах. При этом размеры и количество их находилось в прямой зависимости от сроков эксперимента, степени интоксикации и накоплением ТГ.

При морфометрии почек установлено достоверное увеличение объемной доли интерстиция коры к 90-м суткам эксперимента на 265 % (р<0,001), процент клубочков с признаками склероза составил 33,7±5,4 % (р<0,001). Характер изменения мор-фометрических параметров был аналогичным обнаруженным в почках песцов.

В печени крыс на 30-е сутки моделирования гистологически выявлялась жировая или вакуольная дистрофия гепатоцитов. В последнем случае цитоплазма клеток вблизи триад содержала крупные вакуоли, располагающиеся преимущественно перинуклеарно. Электронно-микроскопическое исследование таких клеток показало расширение каналов зернистого эндоплазматического ретикулума, набухание митохондрий с сохранением структуры крист. Выявлены очаги некроза гепатоцитов, в просвете капилляров - скопления клеток лимфондного ряда. Наблюдались расширение и отёк синусоидов. Количество и размеры клеток Купфера увеличены.

На 60-е сутки область щцропической дистрофии гепатоцитов расширялась, и охватывала все зоны печеночной дольки. ШИК-реакция показала снижение содержания гликогена в клетках. Окраска пикрофуксином по Ван Гизон выявила волокна

соединительной ткани, формирующиеся преимущественно вокруг триад долек печени, сдавливающие и деформирующие их. При цитологическом исследовании во многих гепатоцитах цитоплазма частично или полностью электроннопрозрачна, остатки пластинчатого комплекса в виде расширенных трубочек располагались пери-нуклеарно. Митохондрии имели гомогенную структуру матрикса, кристы не выявлялись. Ядра уменьшены в объеме, некоторые до состояния кариопикноза.

К 90-м суткам нарастали явления фиброза, при этом новообразовавшиеся тяжи соединительной ткани соединяли триады, приводя к деформации и дискомплексации балочной структуры печеночных долек. Соединительная ткань вокруг триад инфильтрирована лимфоидными и моноцитоподобными клетками. Выявлены очаш некроза и гидропического набухания гепатоцитов. Ультрастуктурное строение гепа-тоцитов не отличалось от такового животных на 60-е сутки моделирования, но патологические изменения наблюдались в большей части клеток.

В коже крыс на 30-е сутки моделирования исследуемой патологии наблюдалась незначительная вакуолизация клеток мальпигиевого слоя. В сосочковом слое дермы обнаруживались явления переполнения сосудов, разрыхления и отёка волоконных структур. На препаратах, окрашенных пикрофуксином, заметно неравномерное окрашивание коллагеновых волокон сосочкового и верхних участков сетчатого слоёв - наблюдалась тенденция к преобладанию желтой или желто-розовой окраски. Электронно-микроскопическое исследование показало наличие зернистых преципитатов в основном веществе дермы, набухание коллагеновых волокон.

На 60-е сутки эксперимента исследование гистологических препаратов кожи, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизон, показало расширение области желтоватого окрашивания слоёв дермы. На ультратонких поперечных срезах коллагеновых микрофибрилл видно, что они имели неодинаковый диаметр. Более выражен отек дермы, особенно вокруг сосудов сосочкового слоя, где наблюдались очаговые лим-фогистиоцитарные инфильтраты.

На 90-е сутки в эпидермисе наблюдалось утолщение рогового слоя, выраженная вакуольная дистрофия клеток мальпигиевого слоя. При окраске пикрофуксином волоконные структуры всех слоев дермы имели неравномерную розово-желтую окраску, располагались более рыхло. При электронно-микроскопическом исследовании коллагеновые фибриллы выглядели разволокненными. Такие явления соответствуют мукоидному набуханию, что является признаком нарушения обменных процессов и трофики в соединительной ткани кожи (Серов В.В., 1981). Исследование ультраструктурной организации фибробластов дермы показало уменьшение количества рибосом и полисом в цитоплазме клеток.

2.2.3. Клинические и морфологические показатели животных, получающих лечебно-профилактические препараты растительного происхождения

В результате лечения крыс с развившейся патологией были получены следующие результаты:

Биохимические исследования сыворотки крови показали наличие улучшения состояния всех групп животных, принимавших лечебные препараты и добавки (табл. 4). Так, отмечено снижение уровня ВСММ (более выраженное в группе животных №3, получавших «Бефунгин», нут и «Канефрон», и в наименьшей степени - в группе №2 получавшей только «Канефрон»), креатинина и мочевины (в наименьшей стеле-

ни - в группе животных №1, получавших нут и «Бефуншн», наибольшее снижение было достигнуто в группе №3).

Печёночные показатели были лучшими в группе №3 и худшими - в группе №2. Стабилизация содержания липидных фракций приводила к снижению коэффициента атерогенности во всех группах опытных животных. Наилучшие показатели были у животных группы №3 (табл. 4).

Морфологические исследования органов крыс показали приостанавливание процессов склерозирования паренхимы почек и печени, которые продолжали нарастать у животных, не подвергавшихся лечебному воздействию. Уменьшались дистрофические явления во всех исследуемых органах, что проявлялось в улучшении функционального состояния органелл клеток, уменьшении отёка межуточной ткани (табл. 5). В коже эти явления характеризовались уменьшением симптомов набухания волокон и повышением синтетической активности фибробластов кожи.

Таблица 4

Изменения биохимических показателей крови крыс в процессе лечения, М±т

Показатель Норма 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

ВСММ, усл. ед. 0,15±0,02 0,21±0,06* 0,29±0,08 0,19±0,05*** 0,36±0,05

Мочевина, ммоль/л 4,9±0,7 5,3±0,б* 4,7±0,6** 4,2±0,4*** 9,2±0,9

Креатинин, мкмоль/л 72,3±4,3 104,2±9,2** 87,4*6,5*** 91,3±9,7*** 167,5±12,4

Билирубин, мкмоль/л 2,1±0,4 5,8±1,б** 8,5±1,8 5,3±1,5** 10,4±2,9

АлАТ, МЕ/л 10,9±0,8 26,5±5,0** 31,4±6,3 16,2±3,4*** 34,1±6,4

АсАТ, МЕ/л 14,5±1,2 27,4±5,1 29,5±5,7 19,1±4,0*** 28,3±4,4

ЩФ,МЕ/л 89,4±7,2 109,4±13,1*** 358,7±20,8 88,5±14,5*** 417,5±33,1

ОХ, ммоль/л 1,1±0,10 1,5±0,31* 1,8±0,25 1,3±0,26** 2,3±0,33

ХС ЛПВП, ммоль/л 0,85±0,10 0,74±0,05** 0,66±0,07* 0,80±0,05*** 0,35±0,06

ТГ, ммоль/л 1,05±0,13 0,75±0,06* 0,69±0,08 0,98±0,07*** 0,57±0,06

ХСЛПОНП, ммоль/л 0,2б±0,04 0,16±0,03* 0,14±0,04* 0,20±0,03** 0,11±0,03

ХСЛПНП, ммоль/л 0,11±0,01 0,71±0,03** 1,56±0,04* 0,35±0,03*** 1,83±0,05

КА 0,39±0,12 1,03±0,12*** 1,52±0,34*** 0,63±0,10*** 5,4±0,47

ХС лпнп-.хс ЛПВП 0,13±0,01 0,99±0,20*** 1,62±0,13** 0,43±0,12*** 4,0±0,19

Таблица 5

Показатели морфометрии почек крыс при ХПН в процессе лечения, М±ш

Гистологические струюу-ры почки Норма 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

ОД ткани ингерстиция коры, % 4,0±0,3 14,5±13 9,240,9** 8,5±0,7*** 19,7±4,4

ОД ткани интерстиция мозгового слоя, % 17,4±1,5 33,010,6 28,5±3,4** 28,00,1** 38,9*4,6

Экк, МКМ^ 4724,6±59,3 5161,3*257,5 4791,4±1б4,4 3705,4±198,0* 54843±368Д

Бит, МКМ^ 5668,3±103,1 6438,7±276,0 6271,0*235,2* 4604,Ш10,5** 7067,4±410,5

Капсулярное пространство, усл.ед. 130,1 1,3±0Д** 1,4±0,1* 1,2±0,2*** 1,5=1=03

Канальцевый индекс, усл.ед. 0,9±0,1 1,2±0,2** 1,040,1*** 1,0±0,1*** 1,5*0,3

Э,™ мкм^ 1 ю,в±33 85,9±7,0 96,0=4,4** 98,5±3,7*** 79,3*4,5

вшк, мкм^ 131,9*4,5 112,0±4,5 119,5±6,5** 123,2*5,1*** 94,2*5,6

Примечание: * р<0,05; ** р<0,01; ***р<0,001 достоверность различий с соответствующим показателем контрольной (4-й) труппы.

выводы

1. Функциональные изменения при эндотоксикозе, обусловленном хронической почечной недостаточностью у песцов, сопровождаются повышением уровня ВСММ, ОХ, ХС ЛПНП, билирубина, ЩФ, АЛаТ, АСаТ, креатинина и мочевины. Увеличение содержания ВСММ, ОХ и ХС ЛПНП наблюдается в латентную стадию ХПН, т.е. предшествует достовфному повышению уровня креатинина и мочевины.

2. На ранних стадиях токсического поражения почек (латентная стадия ХПН) у песцов в почках преобладают воспалительные процессы (отёк межуточной ткани, макрофагальная инфильтрация интерстиция). В эпителиоцитах проксимальных почечных канальцев наблюдаются явления гиалиновой или вакуольной дистрофий. Встречаются очаги физиологической регенерации эпителия. При элеюронно-микроскопическом исследовании обнаружено удлинение и истончение ворсинок эпителия, накопление лизосом и дезорганизация мембранных органелл.

3. При переходе в интермитгирующую стадию ХПН в почках преобладают процессы склерозирования, в то время как воспалительные и отёчные явления затихают (диффузный нефросклероз). Процесс развития соединительной ткани идет по перитубулярному и перигломерулярому типу. Наблюдаются атрофия и жировая дистрофия эпигелиоцитов проксимальных и дистальных канальцев, набухание гломеру-лярных и тубулярных базальных мембран.

4. В латентную стадию ХПН объёмная доля интерстиция мозгового слоя увеличивается в среднем на 39,7 %, коркового слоя - на 96,6 %; капсулярное пространство увеличивается до 1,6±0,3; канальцевый индекс - до 1,9±0,6 усл.ед; процент склерозированных клубочков составляет 25,4±5,5 %. В интермитгирующую стадию ХПН объёмная доля интерстиция мозгового слоя увеличивается на 58,6 %, коркового - на 239,0 %; канальцевый индекс и капсулярное пространство уменьшаются до 1,2 ±0,1 и 0,5±0,3 усл.ед. соответственно, 48,5±7,4 % клубочков склерозировано.

5. При ХПН в печени песцов с хроническим тубулоинтерстициальным нефритом с очаговым склерозом интерстиция обнаружены: жировая дистрофия (в 42,8 % случаев), вакуольная и гидропическая дистрофии (14,3 % и 21,4 % случаев), расширение перисинусовдальных пространств с кровепереполнением печеночных долек (21,4 % случаев). У животных с диффузным нефросклерозом преобладают процессы атрофии гепатоцитов. Морфологически выявлены микронодуллярный цирроз, фиброз и перипортальный некроз. Площадь и объемная доля гепатоцитов уменьшена. По данным элеетронно-микроскопического исследования, большинство гепатоцитов находится в состоянии угнетения функции белоксинтезирующего аппарата.

6. В дерме подопытных животных обнаружены явления отека, преимущественно в сосочковом слое. Выявлены дистрофические и атрофические явления: разрыхление, истончение и пикринофилия коллагеновых, уменьшение количества эла-стиновых волокон. Элекгронно-микроскопически обнаружено мукоидное набухание волокон дермы, характеризующееся умеренными обратимыми изменениями. Установлено снижение синтетической активности клеток дермы, в частности, фибробла-стов. Данные изменения более выражены у животных с интермитгирующей ХПН.

7. Совместное применение смеси на основе препарата «Бефунган», бобовой культуры нут и «Канефрона» имеет выраженное гепато- и нефропротекгорное действие. Количество ВСММ крови снизилось на 47,2 %, креатинина - на 45,5 %, мочевины - на 54,3 %, билирубина - на 49,0 %, АлАТ - на 52,5 %, АсАт - на 32,5 %, ЩФ

- на 78,8 %, холестерина - на 43,8 %, ХС ЛПНП - на 80,9 % и индекса атерогенно-сти - на 88,3 %. Морфологически это выражается уменьшением симптомов дистрофических и атрофических процессов в почках, в печени - явлений жировой и вакуольной дистрофий. В коже исчезают явления мукоидного набухания коллагеновых волокон дермы, восстанавливается синтетическая активность фибробластов, расположение пучков сетчатого слоя становится более плотным.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для проведения диагностических мероприятий в зверохозяйстве при ХПН, а также научных работ разработаны рекомендации по определению степени эндогенной интоксикации при хронической почечной недостаточности (М: МГУПБ от 12.01.2009 г.).

Материалы исследования используются в учебном процессе на занятиях по курсу «Клиническая диагностика с рентгенологией» и «Внутренние незаразные болезни животных»

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мотылина Н.С. Морфологические изменения в коже пушных зверей при Афонической почечной недостаточности / Н.С. Мотылина, С.И. Хвыля, Т.С. Елизарова // Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности с.-х. продукции: Материалы 5-й международной научно-практической конференции. -М.: МГУПБ, 2004 - С. 181-183.

2. Мотылина Н.С. Морфологические и функциональные изменения в печени пушных зверей при хронической почечной недостаточности / Б.В. Уша, Т.С. Елизарова, Н.С. Мотылина // Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы: тезисы докладов Всероссийской конференции. - М.: ФГУ «ВГНКИ», 2005. - С. 150-152.

3. Мотылина Н.С. Применение метода морфометрии при исследовании функциональной гистологии почек у пушных зверей // Живые системы и биологическая безопасность населения: материалы V Международной научной конференции студентов и молодых ученых - М.: МГУПБ, 2006. - С. 359.

4. Мотылина Н.С.. Микроструктурный анализ в мясной промышленности / С.И. Хвыля, Н.С. Мотылина, В.А. Пчелкина // Мясные технологии. - 2008. - №4 (64).-С. 48-51.

5. Мотылина Н.С. Морфолошческие формы поражений почек и печени у пушных зверей // Ветеринария и кормление. - 2008. - №6. - С. 34-35.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ - алаиинаминотрансфераза

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

БАД- биологически активная добавка

БМ - базальная мембрана

ВСММ - вещества средней молекулярной массы

ЛПС - липополисахарид

ХИН - хроническая почечная недостаточность

ХТИН - хронический тубуло-интеретициальный нефрит

ИА - индекс атерогенности

ОД - объемная доля

ОХ - общий холестерин

ТГ - трнглицериды

ХС ЛПВП - холестерин липопротеидов высокой плотности

ХС ЛПНП - холестерин липопротеидов низкой плотности

ХС ЛПОНП - холестерин липопротеидов очень низкой плотности

ХПН - хроническая почечная недостаточность

ЩФ - щелочная фосфатаза

Sra - средняя площадь гепатоцитов

Skk - средняя площадь клеток Купфера

Skk - средняя площадь капилляров клубочка

S0K - средни общая площадь клубочка

вад, - площадь ядер эпителия да стальных канальцев

SmK - площадь ядер эпителия проксимальных канальцев

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" ОГР № 1067746281514 от 15.02.2006г. Москва, Талалихина, 33

Подписано к печати 06.02.2009г. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная № 1" 80г/м2. Печать трафаретная. Усл.печ.л. 1,50. Тираж 100. Заказ 274.

Пушное звероводство является одной из ведущих отраслей сельского хозяйства. Тем не менее, в настоящий момент оно переживает тяжелейший кризис. Значительная часть звероводческих хозяйств разорилась, оставшиеся - едва справляются с конкуренцией иностранных производителей. Связано это с высокой- себестоимостью производства пушнины в нашей стране. Чтобы поправить ситуацию, предпринимаются попытки снизить затраты на производстве продукции. Как наиболее простой вариант - применяют корма с низкой себестоимостью. В периодических изданиях последних лет активно пропагандируются дешевые источники питательных веществ - например; отходы рыбного, птичьего производства, и даже тушки забитых зверей: Недостаток необходимых компонентов кормов рекомендуется заменять БАДами, имеющими направленное действие. К сожалению, ценность рекомендуемых добавок для организма зверя- сводится в основном к улучшению внешнего вида и товарного качества шкурок. Их применение оказывается неэффективным в случае заболевания животного. Вместе с тем, изменившийся рацион, а также несоблюдение норм приготовления и хранения кормов, могут неблагоприятным образом сказаться на состоянии здоровья животных (Слугин B.C., 2004).

Заболевания почек относятся к наименее изученным заболеваниям пушных зверей. Основной причиной развития болезней почек незаразной этиологии у пушных зверей является несбалансированное кормление, неф-ротоксичное воздействие многих препаратов, применяемых для профилактики заболеваний и повышения продуктивности животных (антигельминт-ные и инсектицидные средства, антибиотики группы аминогликозидов и цефалоспорина, статинов, стероидов и др.), а также длительное поступление с кормом в организм токсических веществ (например, солей тяжелых металлов, пестицидов) (Kopczewski A. et al., 1988; Поспишиль Ю.А., 1995; Майоров М.А., 2001; Nowakowicz-Debek В. et al., 2007). Эти заболевания отрицательно влияют на продуктивные свойства, вызывают задержку линьки и могут привести к гибели зверя. Как правило, указанная патология развивается у 2-3-летних самок пушных зверей маточного поголовья и 6-7-месячных самцов. В связи с этим возрастают потери при производстве пушной продукции.

На сегодняшний- день подробного изучения патоморфологических форм и функциональных изменений в организме пушных зверей- при подобных поражениях почек не проводилось. В патогенезе большинства заболеваний одно из центральных звеньев принадлежит синдрому интоксикации (токсикозу) (Мишнев О.Д.и др.,2003; Новочадов В.В., 2005). Особое значение имеет эндогенная, интоксикация, или эндотоксикоз, при котором происходит накопление в тканях и биологических жидкостях организма избытка продуктов нормального или извращенного обмена веществ и клеточного реагирования. Источниками эндогенной интоксикации могут быть очаги воспаления в организме, зоны ишемии или деструкции тканей любой другой природы. Процесс усугубляется при нарушении выведения токсических веществ из организма в случае поражения почек и печени как центральных органов детоксикации. В свою очередь, накопившиеся эндогенные токсины влияют на структуру и функцию, тканей органов, тем самым, усугубляя патологический процесс. При развитии хронической почечной недостаточности (ХПН) в организме накапливаются вещества средней молекулярной массы (ВСММ), продукты расщепления пластического материала (продукты деградации белков, глико- и липопротеидов, фосфолипи-дов) и другие токсины (Смирнов A.B., 1997; Суворова Т.С., Вольвич К.В., 2000). Многие лабораторные исследования подтверждают негативное влияние этих веществ на функциональное состояние, морфологическое строение внутренних органов животных (селезенку, печень, желудочно-кишечный тракт, легкие, костный мозг) и кожный покров, особенно дерму (Родионова A.A., 1970; Уша Б.В., 1979; Гончаров H.A., 1983; Шахбазян С.Н., 1983; Абдуллаев С.П., 1989; Клечиков В.В., Береснева О.Н., 1993; Богдан

Г.М., 1994; Школа Т.С., 2000; Popp J.-P., 1993). Известно, что при воздействии всех видов нефротоксичных веществ патологические изменения происходят прежде всего в почечных интерстиции и канальцах (Тареева И.Е., 1998, 2002; Шулутко Б.И.,2002). В свою очередь, тубулоинтерстициальные процессы являются ведущим фактором в прогрессировании заболевания, развитии нефросклероза и как клинического проявления - хронической почечной недостаточности (Нестеров Д.В., 1997; Команденко Н.С., Шостка Г.Д., 2002; Байнбридж Д., Эллиот Д., 2003).

В терапии животных-компаньонов (кошек, собак) разработаны достаточно эффективные методы коррекции нарушений метаболизма при ХПН и лечения заболеваний, их вызвавших. Однако все эти приемы требуют наличия дорогостоящего оборудования, применения лекарственных средств с высокой себестоимостью и желательного нахождения животного в условиях стационара под непрерывным наблюдением ветеринарного врача (Байнбридж Дж., Элиот Дж., 2003). Соблюдение этих требований при лечении пушных зверей в условиях зверохозяйства практически невозможно. Поэтому на сегодняшний день весьма актуальна разработка доступных методов восстановительной терапии, направленной на коррекцию метаболических нарушений при различных формах заболевания. Наиболее перспективным направлением в лечении и профилактике хронической почечной недостаточности является использование биологически активных добавок в рационе животных сорбционного и антиоксидантного действия растительного происхождения (Лоншакова К.С., 1999). В этом аспекте представлялось интересным выявить возможные варианты метаболических реверсий при нефропатиях токсического характера и оценить влияние природных лечебных факторов на ведущие морфологические нарушения при данных патологических состояниях.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилось изучение морфофункциональных изменений в органах и тканях при хронической почечной недостаточности, обусловленной эндотоксикозом пушных зверей, а также определение степени обратимости этих изменений при применении смеси препарата «Бефунгин» и бобовой культуры нута.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить цитологические, гистологические и гистохимические особенности изменений, происходящих в почках, печени и коже песцов с хронической почечной недостаточностью, обусловленной токсическим поражением почек.

2. Выявить зависимость между показателями эндогенной интоксикации и морфофункциональным состоянием органов у животных при хронической почечной недостаточности.

3. Определить воздействие кормовой добавки, состоящей из смеси препарата «Бефунгин» и нута на организм животных при хронической почечной недостаточности и возможность её применения для коррекции метаболических нарушений.

Научная новизна. Впервые приведены морфометрические параметры и цитологические изменения на световом и электронно-микроскопическом уровнях тканей почек, печени и кожи у песцов с хронической почечной недостаточностью латентной и интермиттирующей стадий вследствие хронического токсического поражения почек. Изучено состояние белково-жирового обмена и показателей эндогенной интоксикации при данной патологии.

Установлена роль изменений соотношения фракций холестерина и уровня веществ средней молекулярной массы в развитии ранних стадий эндогенной интоксикации при токсическом поражении почек у песцов.

Научно доказана возможность коррекции обменных нарушений при хронической почечной недостаточности, при применении кормовой добавки с лечебно-профилактическим действием, состоящей из смеси бобовой культуры нут и препарата «Бефунгин».

Практическая значимость работы.

1. Обоснованы подходы к лабораторной диагностике хронической почечной недостаточности на основе измерения уровня показателей эндогенной интоксикации. Показано их значение в диагностике латентной стадии хронической почечной недостаточности у песцов.

2. Полученные морфометрические характеристики тканевых и клеточных структур органов песцов5 использованы в научных работах.

3. Доказана эффективность применения смеси на основе нута и «Бе-фунгина» в коррекции метаболических нарушений при комплексной терапии токсических поражений почек, сопровождающихся хронической почечной недостаточностью.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Морфофункциональные изменения в почках пушных зверей при хронической почечной недостаточности.

• Морфологические и биохимические изменения в организме животных при хронической почечной недостаточности.

• Эффективность применения комплекса на основе нута и «Бефунги-на» в коррекции морфофункциональных изменений при хронической почечной недостаточности.

Связь исследований с научной программой. Тема работы являлась частью научно-исследовательского направления кафедры незаразных болезней «Разработка методов диагностики, лечения и групповой профилактики внутренних незаразных болезней животных с целью повышения качества и количества животноводческой продукции» (код 68.41.63)

Апробация работы.

Материалы исследования доложены на Всероссийской научной конференции Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарносанитарного контроля и биологической безопасности с.-х. продукции (М., МГУ lib, 2004); V и VII Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., МГУПБ, 2004,2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах входящих в список ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 151 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований и практические предложения, выводы, приложения. Диссертация содержит 14 таблиц и 49 рисунков. Список использованной литературы включает 176 источников, в том числе 124 отечественных и 52 иностранных авторов.

3. выводы

1. Функциональные изменения при эндотоксикозе, обусловленном хронической почечной недостаточностью у песцов, сопровождаются повышением уровня ВСММ, ОХ, ХС ЛПНП, билирубина, ЩФ, АЛаТ, АСаТ, креатинина и мочевины. Увеличение содержания ВСММ, ОХ и ХС ЛПНП наблюдается в латентную стадию ХПН, т.е. предшествует достоверному повышению уровня креатинина и мочевины.

2. На ранних стадиях токсического поражения почек (латентная стадия ХПН) у песцов в почках преобладают воспалительные процессы (отёк межуточной ткани, макрофагальная инфильтрация интерстиция). В эпителиоцитах проксимальных почечных канальцев наблюдаются явления гиалиновой или вакуольной дистрофий. Встречаются очаги физиологической регенерации эпителия. При электронно-микроскопическом исследовании обнаружено удлинение и истончение ворсинок эпителия, накопление лизосом и дезорганизация мембранных органелл.

3. При переходе в интермиттирующую стадию ХПН в почках преобладают процессы склерозирования, в то время как воспалительные и отёчные явления затихают (диффузный-нефросклероз). Процесс развития соединительной ткани идет по перитубулярному и перигломерулярому типу. Наблюдаются атрофия и жировая дистрофия эпителиоцитов проксимальных и дистальных канальцев, набухание гломерулярных и тубулярных базальных мембран.

4. В латентную стадию ХПН объёмная доля интерстиция мозгового слоя увеличивается в среднем на 39,7 %, коркового слоя — на 96,6 %; капсулярное пространство увеличивается до 1,6±0,3; канальцевый индекс — до 1,9±0,6 усл.ед; процент склерозированных клубочков составляет 25,4±5,5 %. В интермиттирующую стадию ХПН объёмная доля интерстиция мозгового слоя увеличивается на 58,6 %, коркового - на 239,0 %; канальцевый индекс и капсулярное пространство уменьшаются до 1,2 ±0,1 и 0,5±0,3 усл.ед. соответственно, 48,5±7,4 % клубочков склерозировано.

5. При ХПН в печени песцов с хроническим тубулоинтерстициальным нефритом с очаговым склерозом интерстиция обнаружены: жировая дистрофия (в 42,8 % случаев), вакуольная и гидропическая дистрофии (14,3 % и 21,4 % случаев), расширение перисинусоидальных пространств с кровепереполнением печеночных долек (21,4 % случаев). У животных с диффузным нефросклерозом преобладают процессы атрофии гепатоцитов. Морфологически выявлены мик-ронодуллярный цирроз, фиброз и перипортальный некроз. Площадь и объемная доля гепатоцитов уменьшена. По данным электронно-микроскопического исследования, большинство гепатоцитов находится в состоянии угнетения функции белоксинтезирующего аппарата.

6. В дерме подопытных животных обнаружены явления отека, преимущественно в сосочковом слое. Выявлены дистрофические и атрофические явления: разрыхление, истончение и пикринофилия коллагеновых, уменьшение количества эластиновых волокон. Электронно-микроскопически обнаружено му-коидное набухание волокон дермы, характеризующееся умеренными обратимыми изменениями. Установлено снижение синтетической активности клеток дермы, в частности, фибробластов. Данные изменения более выражены у животных с интермитгирующей ХПН.

7. Совместное применение смеси на основе препарата «Бефунгин», бобовой культуры нут и «Канефрона» имеет выраженное гепато- и нефропротектор-ное действие. Количество ВСММ крови снизилось на 47,2 %, креатинина — на 45,5 %, мочевины - на 54,3 %, билирубина - на 49,0 %, АлАТ - на 52,5 %, АсАт

- на 32,5 %, ЩФ - на 78,8 %, холестерина - на 43,8 %, ХС ЛПНП - на 80,9 % и индекса атерогенности — на 88,3 %. Морфологически это выражается уменьшением симптомов дистрофических и атрофических процессов в почках, в печени

- явлений жировой и вакуольной дистрофий. В коже исчезают явления мукоид-ного набухашш коллагеновых волокон дермы, восстанавливается синтетическая активность фибробластов, расположение пучков сетчатого слоя становится более плотным.

4. практические предложения

Для проведения диагностических мероприятий в зверохозяйстве при ХПН, а также научных работ разработаны рекомендации по определению степени эндогенной интоксикации при хронической почечной недостаточности (М: МГУПБ от 12.01.2009 г.).

Материалы исследования используются в учебном процессе на занятиях по курсу «Клиническая диагностика с рентгенологией» и «Внутренние незаразные болезни животных»

1.5. Заключение

Как показал анализ литературных данных, проблема заболеваний почек, сопровождаемых симтомокомплексом хронической почечной недостаточности, является актуальной и разносторонне изучаемой у сельскохозяйственных животных и животных-компаньонов. Проводимые исследования затрагивают изучение патогенеза развития синдрома, сопутствующие осложнения, в том числе воздействие на все системы органов, методы диагностики и возможные методы лечения.

Доказано, что при ХПН нарушаются все виды обмена - белкового, жирового, углеводного, водно-солевого и минерального. Это может быть связано с развитием адаптационно-приспособительных реакций в организме, так и с патологическими изменениями внутренних органов, обусловленных прямым воздействием накопившихся в результате нарушения их элиминации токсичных продуктов метаболизма. Морфологическим крете-рием ХПН при хронических токсических поражениях почек считают развитие нефросклероза.

Имеются данные о морфофункциональных изменениях в печени животных и людей при ХПН, которые сопровождаются билирубинемией, ги-поальбуминемией, нарушением детоксицирующих функций и развитием разнообразных структурных повреждений. В последнем случае морфологическими методами выявляют развитие зернистой, вакуольной — на ранних стадиях ХПН и жировую дистрофию, инфильтраты и цирроз - на поздних стадиях ХПН и при нефротическом синдроме. Данные изменений печени при болезнях почек весьма ограничены, имеются результаты исследований печени у норок. Чаще всего у них диагностировали жировую дистрофию.

Литературные данные результатов исследований кожи при ХПН гораздо более скудны и свидетельствуют о развитии дерматитов, гиперкератозов и дистрофии волоконных структур дермы кожи. Присутствует лишь одно исследование, посвященное изучению кожных структур при мочекаменной болезни у норок. Оно свидетельствует о значительных структурных изменениях в коже животных, приводящих к снижению сортности шкурок.

Морфологические изменения в почках при токсическом поражении, обусловливающем развитие ХПН, затрагивают прежде всего систему канальцев и интерстиций. При отравлениях мико- и бактериальными токсинами, солями тяжелых металлов в основном диагностируют хронический тубуло-интерстициальный нефрит.

Диагностика ХПН основана на лабораторных и функциональных методах исследований. Используют медоды исследования мочи, клиренса креатинина, биохимических исследований крови. Основными показателя I ми при определении стадии ХПН принято считать концентрацию креатинина в сыворотке и скорость клубочковой фильтрации. В ветеринарии принято определять уровень мочесвины и креатинина. Доказана низкая токсичность указанных соединений. Большее значение при определении 1 прогноза заболевания и выраженности интоксикации имеют следующие показатели: концентрация веществ средней молекулярной массы (ВСММ), общего холестерина (ОХ) и липидных фракций. Степень исследования данных показатей при ХПН остается недостаточно исследованной для возможного использования их в экспериментальных работах и диагностике изучаемой патологии у пушных зверей.

В гуманной медицине и при лечении животных-компаньонов используются следующие методы лечения: консервативные (применение ингибиторов АПФ, нефропротекторов растительного происхождения, стати-нов, стероидов, сорбентов), активных (диализ) и хирургических (пересадка почки). К сожалению, все эти методы неприменимы в условиях хозяйства в связи с их высокой стоимостью и трудности манипуляций.

Наиболее оптимально введение препаратов per os. При этом эффективность действия и низкая себестоимость диктует необходимость разработки методов фитотерапии или применения биологически активных добавок с лечебными свойствами растительного происхождения.

Доказана гиполипидемическая и антиоксидантная активность препарата «Бефунгин» при болезнях печени, диабете. Недостаток микроэлементов, в частности, селена, при эндотоксикозах обусловливает необходимость применения природных источников этого микроэлемента при откорме и содержании пушных зверей. Селен обладает выраженным антиок-сидантным эффектом, усиливающимся в присутствии кобальта, входящего в состав «Бефунгина».

2. СОБСТВЕННБ1Е ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проводились в период с октября 2004 по май 2008 гг. на кафедре Незаразных болезней и лаборатории ветеринарной клиники при МГУПБ, в племсовхозе «Пушкинский» Пушкинского р-на Московской области, в виварии ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова РАСХН, лаборатории электронномикроскопических исследований ГУ НИИМЧ РАМН.

2.1. Материалы и методы исследования

Работа включала 2 этапа: 1-й этап — изучение патологии в условиях хозяйства (рис. 1) и 2-й этап — моделирование на лабораторных животных (рис. 2). Научно-производственные опыты в условиях хозяйства проводили на вуалевых песцах-самцах в возрасте 6 месяцев и самках из маточного поголовья в возрасте 2-3 года, подобранных по принципу аналогов.

Исследования на песцах заключались в выявлении клинико-морфологических форм токсических поражений почек с симптомоком-плексом хронической почечной недостаточности. Объектами исследования служили вуалевые песцы (А1орех кщориз): самцы в возрасте б месяцев и самки из маточного поголовья в возрасте 2-3 года, подобранные по принципу аналогов. Общее количество животных составило 220 голов.

По результатам проведенных исследований песцов опытной группы окончательно разделили на две группы (по классификации Ниберле и Кор-са): 1-я группа - с хроническим тубулоинтерстициальном нефритом с очаговым нефросклерозом, нефротическим синдромом, латентная стадия хронической почечной недостаточности (16 самцов, 12 самок); 2-я группа - с хроническим тубулоинтерстициальном нефритом, диффузным нефросклерозом, интермиттирующая стадия хронической почечной недостаточности (19 самок). В контрольную группу животных вошли животные без признаков отклонений в состоянии здоровья (10 самцов, 10 самок).

Подопытных животных содержали в отдельных клетках, согласно-принятым в хозяйстве технологии и нормам. Ежедневно определяли- кли-нико-физиологические показатели у песцов: температуру тела, двигательную активность, адекватность поведенческих реакций, сохранность аппетита, проводили пальпацию стенок мочевого пузыря, почек, определяли наличие характерных клинических признаков (отеки, нарушение акта мочеиспускания).

Пробы крови и мочи получали утром за 1-1,5 часа до кормления животных. Лабораторные исследования крови и мочи проводили в начале эксперимента, на 15-е, 30-е и 45-е сутки. На 45-й день исследования песцов выводили из эксперимента методом передозировки золетила, брали внутренние органы для морфологических исследований (рис.1).

Рис. 1. Схема эксперимента в условиях хозяйства.

Методика моделировании дисметаболической. нефропатии у лабораторных животных. В условиях экспериментальной клиники моделировали дисметаболическую нефропатию с явлением эндогенной интоксикации по методу В.В.Новочадова (74). Эксперимент ставили на 60 белых крысах-самках массой 250±11 гр (возраст 5 месяцев) (рис.2). Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе, свободном доступе к воде. Все манипуляции с животными проводили с соблюдением Правил гуманного обращения с животными. Для моделирования дисметаболической нефропатии крысам на протяжении 5 дней внутрибрюшинно ежедневно вводили раствор гентамицина из расчёта 20 мг/кг массы тела. Начиная с 6-го дня животным еженедельно вводили липополисахарид (ЛПС) S.typhi murium («Sigma», USA) 1 мг/кг массы тела. При такой модели развивается эндотоксикоз с преимущественными нефросклеротическими изменениями в почках (дисметаболическая нефропатия). Клинически и морфологически это согласуется с видом хронического токсического тубуло-интерстициального нефрита, осложненного ХПН (75). Контрольная группа состояла из 20 здоровых самок крыс. Животных из эксперимента выводили на 30-е, 60-е, 90-е и 111-е сутки в камере установки для эвтаназии углекислым газом фирмы VetTech. Начиная с 90-х суток введение ЛПС прекращали, и животным начинали давать испытуемые лечебно-профилактические добавки. Для этого животных с моделью дисметаболической нефропатии разделили на 4 опытные группы. 1-й группе животных в рацион кормления добавляли смесь из нута (20 г/кг массы) и «Бефунгина» (0,05 мл/кг); 2-й группе давали препарат «Канефрон» (0,15 мл/кг); животным 3-й группы смесь из нута и «Бефунгина» и «Канефрон» в тех же количествах. Крыс 4-й группы не подвергали лечению. Добавки и препарат смешивали с кормом, давали животным утром, деля на порции с контролем поедаемости.

До начала эксперимента, а также на 30-е, 60-е, 90-е и 111-е сутки у оглушенных в углекислотной камере животных брали кровь и внутренние органы.

Рис.2. Схема эксперимента на лабораторных животных.

Лабораторное исследование крови животных. У песцов кровь для исследования брали из подкожной вены предплечья в две пробирки, в одну пробирку для стабилизации добавляли 3,8% цитрат натрия в соотношении 1:9, а из крови второй пробирки готовили сыворотку. У крыс кровь брали из желудочков сердца, так же в две пробирки — с цитратом натрия и с активатором свёртывания (для исключения гемолиза) для приготовления сыворотки.

При исследовании клинических показателей проб крови применяли следующие методики:

Подсчет количества эритроцитов с использованием унифицированного метода подсчета в счетной камере Горяева.

Подсчет количества лейкоцитов проводили унифицированным методом в счетной камере Горяева.

Биохимические исследования проводили на автоматическом анализаторе MARS (Швеция).

Определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови проводили унифицированным методом Райтмана-Френкеля. Использовали реактивы "Ольвекс-FL-E" ALT-11 Кат.№: 001.011 100 определений при конечном объеме пробы 6,1 мл.

Принцип метода: а) L-аланин + а-кстоглутарат <Ал АТ> пировино-градная кислота + L-глутамат; б) фотометрическое определение содержания пирувата в пробе на основе реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

Определение активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в сыворотке крови проводили унифицированным методом Райтмана-Френкеля. С использованием реактивов AST-11 Кат. №: 002.011 определе- • ний при конечном объеме пробы 6,1 мл.

Принцип метода: а) L-аспартат + а-кетоглутарат <АсАТ> оксалоаце- • тат + L-глутамат б) фотометрическое определение содержания оксалоацетата в пробе на основе реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

Коэффициент Ритиса определяли расчетным методом как отношение АсАТ к АлАТ

Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови проводили унифицированным оптимизированным кинетическим методом с использованием набора реактивов «Витал-Европа», скомпонованным в соответствии с международными требованиями.

Принцип метода: n-нитрофенилфосфат с водой дает реакцию с образованием п-нитрофенола и фосфата. Количество образовавшегося в единицу времени n-нитрофенола, пропорциональное активности фермента, определяли по измерению оптической плотности образца в единицу времени при длине волны 405 нм. s

Определение концентрации общего холестерина (ОХ) в сыворот-' ке крови проводили унифицированным энзиматическим колориметрическим методом с использованием набора реактивов «Ольвекс-В», и скомпонованным в соответствии с международными требованиями CHOLESTEROL Кат.№: 013.012; CHOLESTEROL Кат.№: 013.022

Принцип метода: При гидролизе эфиров холестерина холестеролэсте-разой образуется свободный холестерин. Образовавшийся и имеющийся в пробе холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холесте-ролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием пероксидазы (POD) перекись водорода окисляет хромоген-ные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Определение концентрации холестерина липопротеидов высокой плотности (КС ЛПВП) в сыворотке крови проводили энзиматическим методом с иммуноингибированием без осаждения с использованием набора НГОЕ-холестерин-Витал-05/15 производства фирмы Vital Diagnostic. Регистрационное удостоверение: ФС 01014578/3587-06

Определение концентрации триглицеридов в сыворотке крови проводили энзиматическим колориметрическим методом с использованием набора Триглицериды-Витал-02/12/22 производства фирмы Vital Diagnostic.

Концентрацию холестерина липопротеидов очень низкой плотности в сыворотке определяли расчетным методом по формуле: ХС ЛПОНП = ТГ : 5,

Концентрацию холестерина липопротеидов низкой плотности в сыворотке определяли расчетным методом по формуле: ХС ЛПНП = ОХ - (ХС ЛПВП+ХС ЛПОНП), Коэффициент атерогенности определяли по формуле: КА = (ОХ - ХС ЛПВП) : ХС ЛПВП,

Определяли соотношение ХС ЛПНП : ХС ЛПВП - рассчётно

Определение концентрации креатинина в сыворотке крови проводили унифицированным псевдокинетическим двухточечным методом с использованием реактивов CREATININES Кат. № 004.007 набор реактивов относится к серии "Ольвекс-FL-E", скомпонованным в соответствии с международными требованиями.

Принцип метода: Метод основан на реакции Яффе. Измеряли скорость образования окрашенного комплекса креатинина с пикриновой кислотой в щелочной среде.

Определение концентрации мочевины проводили уреазным фе-нол/гипохлоритным методом с использованием набора Мочевина-Витал-01 производства фирмы Vital Diagnostic.

Определение концентрации общего и прямого билирубина в сыворотке крови проводили унифицированным методом Ендрассика-Ерофа. С использованием реактивов BILIRUBIN-TD Кат.№ 003.012. Метод, использованный в наборе реактивов, относится к серии «Ольвекс-FL-E», отличается от методов, используемых в ряде зарубежных стран, но является унифицированным в России.

Принцип метода: общий билирубин определяется на основе реакции с диазотированной сульфаниловой кислотой, после диссоциации неконъ-югированного (непрямого, свободного) билирубина при участии кофеинового реагента. Для определения содержания конъюгированного (прямого, связанного) билирубина из реакционной смеси исключается кофеиновый реагент. Концентрация неконъюгированного билирубина рассчитывается по разнице концентрации между общим и конъюгированным билирубином.

Определение концентрации общего белка в сыворотке крови проводили унифицированным биуретовым методом. Набор реактивов относится к серии "Ольвекс-FL-E", скомпонованной в соответствии с международными требованиями.

Принцип« метода: белок образует окрашенный комплекс с ионами меди в щелочной среде (сыворотке или плазме крови).

Определение концентрации альбумина в сыворотке крови проводили унифицированным колориметрическим методом с использованием набора Альбумин-Витал производства фирмы Vital Diagnostic.

А/Г коэффициент определяли рассчётно

Дня определения степени эндогенной интоксикации из стабилизированной крови, оставшейся после подсчёта эритроцитов и лейкоцитов, методом центрифугирования при 3000 об/мин. в течение 10 минут, получали плазму. Далее в полученной плазме определяли концентрацию Веществ средней молекулярной массы по методу М.Я.Малаховой (1995). Принцип метода заключается в осаждении крупномолекулярных частиц плазмы крови раствором ТХУ и регистрации спектральной характеристики водного раствора супернатанта при длинах волн 230-290 нм. Для этого к 1 мл надосадочной плазмы добавляли 20 % ТХУ (2:1) и центрифугировали 30 минут при 3000 об/мин. После осаждения белков к 0,5 мл надосадочной жидкости добавляли 4,5 мл дистиллированной воды. Определяли оптическую плотность раствора при длинах волн 230-290 нм против контроля -дистиллированной воды.

Экстинкция измерялась на двулучевом спектрофотометре Сагу 50 Bio. Общее содержание ВСММ определялось по формуле:

Количество ВСММ = Е230 +Е24о+ Е25о+--- +Е29о (усл. ед.)

Лабораторное исследование мочи животных. У песцов мочу собирали при естественном мочеиспускании в поддоны с решётками для исключения попадания каловых масс, а также непосредственно из мочевого пузыря во время забоя.

Сбор мочи у крыс осуществляли в метаболических клетках для грызунов-массой 150-250 гр. фирмы Techniplast. Мочу собирали у крыс до начала эксперимента, на 30-е; 60^е, 90-е и 111-е сутки эксперимента. Анализ мочи проводили на автоматическом анализаторе «Цшсап Э-ЗОО».

Общий анализ мочи включал оценку физико-химических показателей и микроскопическое исследование осадка. В условиях хозяйства химическое экспресс-исследование мочи проводили с помощью1 диагностических полосок фирмы «Лахема» - «ЭЕСА-фан». Данный экспресс-анализ мочи позволяет провести качественное определение кетонов, билирубина, нитритов; полуколичественное определение рН, относительной плотности мочи, белка, глюкозы, крови, уробилина, лейкоцитов. В условиях лаборатории анализ мочи проводили на автоматическом анализаторе «ипБсап 8300».

Микроскопическое исследование нативных препаратов мочевого осадка, полученного при центрифугировании 10 мл мочи в лабораторной центрифуге ЦЛН -2 ТУБ. 375. 4171. 73 в течение 7 мин при 2000 об/мин.

Микроскопию полученного осадка проводили на световом микроскопе с последующим увеличением х120, х400, х900. Отмечали наличие эритроцитов, лейкоцитов, цилиндров, слизи, микроорганизмов, морфологию эпителиальных клеток и структуру неорганизованного осадка.

Методики морфологических исследований органов и тканей подопытных животных. Для светооптического и электронно-микроскопического исследований у животных после забоя в течение 10 мин отбирали внутренние органы (почки и печень) и участок шкурки с области лопатки. Материал для гистологического исследования, полученный после убоя песцов, фиксировали в 10% нейтральном водном растворе формалина в течение 48 часов при комнатной температуре. После окончания фиксации и промывки органов в холодной проточной воде, проводили обезвоживание кусочков исследуемых органов в спиртах восходящей крепости (от 70° до 100°), после чего образцы заключали в парафин по общепринятой методике [Меркулов Г.А., 1969; Ромейс , 1969; Семченко В.В.и др., 2006]. В дальнейшем на роторном микротоме Microm HM 315 изготавливали срезы ткани органов толщиной 2-3 мкм. Срезы внутренних органов окрашивали гематоксилином Эрлиха и водно-спиртовым эозином, Суданом III, пикрофуксином по ван Гизон, ставили ШИК-реакцию. Препараты заключали под покровные стекла в полистирол.

Изучение микроструктурных препаратов и их фотографирование проводили на световом микроскопе «Axio Imager AI» (Carl Zeiss, Германия). Изображение выводили на экран компьютерного монитора с помощью видеокамеры AxioCam MRc 5. Обработку изображения и проведение морфометрических измерений производили в программе AxioVision Rel.4.6. Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [Автандилов Г.Г., 1996, 2002].

Полученные после аутопсии кусочки органов для электронно-микроскопического исследования помещали в 2,5% раствор глутарового альдегида на буфере Хенкса при +4°С. Время префиксации составляло 3 часа. По завершении префиксации препараты обрабатывали по следующей схеме [Б.Уикли, 1975; A.A. Миронов, Я.Ю.Комиссарчик, 1994]:

1. Отмывка от глутарового альдегида в среде Хенкса, две смены по 15 мин.

2. Постфиксация в 1%-ном растворе четырехокиси осмия на среде Хенкса с pH 7,4 - 3 часа

3. Ополаскивание в том же буфере 3*5 минут

4. Обезвоживание в 50% ацетоне 3x15 минут

5. Обезвоживание в 70% ацетоне 3x15 минут

6. Обезвоживание в 90% ацетоне 3x15 минут

7. Обезвоживание в 100% ацетоне 4x30 минут

8. Пропитка кусочков в смеси эпоксидная смола (все компоненты) -ацетон (1:1) - 12 часов

9. Выветривание кусочков от ацетона — 15 минут

10. Заливка в плоские ванночки в смесь эпоксидных смол

11. Полимеризация блоков при 48°С - 2 часа

12. Окончательная ориентация кусочков в ванночках

13. Полимеризация блоков при 60°С - 48 часов

Полутонкие и ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме «LKB III» (Sweden) традиционным способом. Полутонкие срезы окрашивали последовательно двумя красками, 1-я из которых содержала метиле-новый синий и азур II, 2-я - основной фуксин. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца.

Фотографирование подготовленных препаратов органов проводили на электронном микроскопе «JEOL JEM-100 СХ П».

На срезах окрашенных гематоксилином и эозином определяли следующие морфометрические характеристики. В почках: объемную долю (ОД) интерстиция мозгового и коркового слоёв, %; среднюю площадь кагу пилляров клубочка (SKK), мкм"; среднюю общую площадь клубочка (S0K), мкм ; капсулярное пространство как отношение S0K к SKK, усл.ед., канальце-вый индекс как отношение толщины стенки канальца к диаметру его просвета, усл.ед., площадь ядер эпителия проксимальных и дистальных канальцев (SflnK, SWK), мкм2, % клубочков с признаками склерозирования (на срезах окрашенных пикрофуксином по Ван Гизон). В печени: объемные доли (ОД), %: центральных вен, триад, соединительной ткани, гепатоци-тов, клеток Купфера, синусоидов, среднюю площадь гепатоцитов (Srn) и л клеток Купфера (Skk), мкм ; а также % двухъядерных гепатоцитов.

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа (Автандилов Г.Г., 1996, 2002).

Всего было проведено 450 гистологических, 1143 гистохимических и 198 электронно-микроскопических исследований.

Методы статистической обработки результатов. Достоверность полученных результатов, основных научных положений и выводов, подтверждается достаточно большим объемом проведенных исследований.

Для обработки полученных результатов использовали общепринятые статистические методы, а достоверность различий между контролем и опытными группами определяли по критерию Стьюдента (26, 74, 109), при помощи пакета программ 81а1з1лса 6.0.

Достоверность различия показателей, определенных параметрическими и непараметрическими методами, считалась подтвержденной при уровне значимости «р» не выше 0,05.

Учитывали значения V превышающие значения 1а, взятые из таблицы В.Ю. Урбаха «Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях». Нулевая гипотеза отвергается с вероятностью 0,95, расхождения между значениями до лечебного воздействия и значениями после него считали значимыми (достоверными). Если значения Г < Х.а, то, нулевая гипотеза не отвергается, расхождения между значениями до лечебного воздействия и значениями после него считали недостоверными.