Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Морфологическая характеристика популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец

На правах рукописи

УДК 619:615:579.871:57.012.4

ЛЕБЕДЕНКО ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ШКЮЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОПУЛЯЦИЙ ВОЗБУДИТЕЛЯ КАЗЕОЗНОГО ЛШЩЕНИТА ОВЕЦ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОМСК - 1997

Работа выношена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии института ветеринарной медицины Омского аграрного университета

Научные руководители : Заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, академик Н.М.Колычев; кандидат биологических наук, доцент Л.В.Гежес

Официальные оппоненты : доктор ветеринарных наук,

профессор Б. Я. Хаакин; доктор медицинских наук, профессор А. А.Обгольц

Ведущая организация : Казанская Государственная Академия

ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана

Защита диссертации состоится 1997 г. в

" ^ " часов на заседании диссертационного совета Д 120.48.01 при институте ветеринарной медицины ОмГАУ. ( 644007, Омск, ул.Октябрьская, 92)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан " ^¿?/>/7> 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент /^т/с^

Н.А.Королева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Возбудитель казеозного лимфаденита овец С.pseudotuberculosis известен с прошлого века ( Nocard.E 1988, 1892; Preis.H 18945 1397 ).

В последующий период времена изучались морфологические,куль-туральные, серологические и патогенные свойства С.pseudotuberculosis < Came Н.1939; Jolly R.J.1966; Ламихов К.Ф.1954; Заболот-ных М.В.19893 Трофимов И.Г. и др. 1990S Трофимов И.Г.,Колычев Н.М.1992).

Интерес к данному возбудители связан со значительным экономическим ущербом и широким распространением болезни в странах с развитым овцеводством. Не являются в этой отношении исключением и овцеводческие хозяйства Омской области < Заёолотных М.В. 1989; Трофимов И.Г. и др.1990).

Сведения, касающиеся характеристики возбудителя, в частности, его морфологии, требуют дальнейшего изучения и углубления. Об этом говорит констатация большинством исследователей ( Трофимов И.Г. и др.1990; Колычев Н.М., Зайолотны:; М.В.1991; Ощепков В.Г.и др.1991) полиморфизма и значительной Фенотипической вариабельности С. pseudotuberculosis без объяснения этих свойств и выявления закономерностей мк проявления.

3 последние годы ряд авторов ( Беляков Б.Д. и Др. 1985? Вос-кун С.Е. и ДР. 19В9; Гусев В. А. ..Бобровская Н.И. 19Q9; Павлова И.Б.и др.1990) показали, что популяции Различны« видов микроорганизмов представляют собой слслные развивающиеся и саморегулирующиеся системы. Очевидно, объяснение многих Фенотмпических свойств С.pseudotuberculosis следует искать на пути комплексны«, в том

числе и морфологических, исследований на клеточном и популяцион-ном уровне, что важно для разработки рациональным методов лечения и профилактики казеозного лимфаденита овец.

Регистрационный номер 01910053438.

Цель работы. Определение закономерностей развития возбудителя казеозного лимфаденита овец и комплексная морфологическая характеристика его на клеточном и популяционном уровне.

Задачи исследований:

- определить Фазы развития популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец;

- изучить морфологию популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец в различные периоды развития»

- выявить возможность и закономерность /1 - трансформации ин-тактных штаммов возбудителя казеозного лимфаденита овец!

- изучить ультраструктурную организацию бактериальным клеток, входящих в состав популяций Коринебактерии;

Научная новизна. Проведенные нами исследования позволили:

- получить комплексную морфологическую характеристику развития популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец в динамике»

- выявить наличие /1 - трансфармации и закономерности роста Л — колоний в различные периоды развития возбудителя;

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные сведения являются основой для исследования популяций возбудителя после воздействия Физико-химическими Факторами, усовершенствования методов лабораторной диагностики казеозного лимфаденита овец и правильной оценки эффективности лечебных препаратов и дезинфицирующих средств.

Результаты исследований используются в научно-исследователь-

- s -

екай Рабате и учебном процессе на каФедрах микробиологии, вирусологии и иммунологам, эпизоотологии Омского института ветеринарной медицины.

По результатам исследований оформлено два рационализаторски?! предложения.

Апробация равоты. Материалы диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-производственной конференции <Чебоксары, 1994), на научных конференциях преподавателей и аспирантов ОмГАУ (Омск, 1995, 1996 гг>.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи.

Ойьем и структура диссертации. Работа изложена на 1S5 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 3 графиками, 3 таблицами, Ё Фотографиями, 63 электроннограммами. Список используемой литературы составляет 180 источников, из них 50 иностранных.

Основные положения, эыносимые на защиту «

- морфологические закономерности развития популяций возбудите пя казеозного лимфаденита овец;

- субмикроскопическая организация С.pseudotubereulosis на клеточном и популяционном уровне;

- Л - трансформация интактных штаммов как закономерный этап развития возбудителя.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 1992-1995 гг. .на каФедре микробиологии, вирусологии и иммунологии института ветеринарной медицины Омского аграрного университета и в лаборатории электронной микроскопии Омского аграрного университета. Сканирующая электронная микроскопия проведена в лаборатории электронной микроскопии Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ).

Объектом исследований служили пять интактных штаммов возбудителя казеозного лимфаденита овец, относящиеся к различным Фено-типическим группам! 37 15 50 Б; 146 3; 74 Я} 13 й. Все штаммы выделены в овцеводческих хозяйствах Омской области (Заболотных м.в.1989; Трофимов И.г.' и др.1990). Два из них, 74 г? и 146 б , депонированы в ГНКИ< Заболотных И.В., Колычев Н.М.,Трофимов И.Г. 1991>.

В работе использованы традиционные бактериологические методы, Фазово-контрастная микроскопия, анализ Л - трансформации, сканирующая и трансмиссионная электронная микроскопия.

Проведены две серии опытов по представленной схеме.

ЛиоФилизиРованные музейные культуры стабилизировали путем многократных пассажей ( в среднем — пять) на мясо-пептонном агаре (МПА>, предварительно проконтролировав их вирулентность на мышах с целью определения жизнеспособности. Для этого заразили внутриб-рюшинно взвесью лиоФилизированных культур на Физиологическом растворе в дозе О,1 мл 50 белых мышей в возрасте одного месяца, весом около 18 гр. О чистоте культур судили по характеру роста на питательной среде и анализу маакаа. Видову» принадлежность изуча-

сх

ЕМ А О

пыт'ов

исследование культур на миллипороаых фильтрах

акали; роста

взвешивание

построение гршриков роста

сканирующая электронная микроскопия

выявление Ь-трансформаций

1

посев Ы к о л на о р е 9 у ьниковой

анали? роста фЕдаво-кокграстная микроскопия

анлли? и а } « о в

порфометрия ¿актериальмьк клеток

трансмиссионная электронная микроскопия

емыу. штаммов подтверждали путем посева на МПА с добавлением тел-лурита калия, являющейся диФФеренцировочной для данного возбудителя средой (Трофимов И.Г. и др.1990). После этого готовили материал для исследования по представленной выше схеме.

Бактериологический анализ включал традиционные методы s выращивание на МПА, приготовление мазков, окраску по Граму, световую микроскопию»

Для определения Фаз роста проводили посев культур на милли-порааые Фильтры "Владипор" МА МФА -4, которые помещали на поверхность МПА в чашках Петри. Для этого готовили бактериальную взвесь плотностью 10 единиц по оптическому стандарту мутности ( ОСМ ГИСК им. Л.А.Тарасовича). Приготовленную суспензию наносили с помощью Vari - пипеток в объеме 20 мкл на поверхность миллипоровых Фильтров. Чашки с посевами помещали в термостат при температуре 37' С на девять суток (срок наблюдения). Взвешивание миллипоровых фильтров с выросшими колониями проводили через 1,5; 2; 3,5} 4,5; 6; 8; Ю; 205 24; 28; 48; 72; 96; 120; 144; 168; 192; 216 часов После посева. Строили графики зависимости натурального логарифма биомассы (Un) от времени культивирования.

Для выявления Л - трансформации проводили посев культур вышеназванных штаммов на питательную среду, приготовленную на основе полусинтетической среды Школьниковой в модификации Дорожковой (1984). Готовили взвеси культур на Физиологическом растворе плотностью Ю единиц по оптическому стандарту мутности (ОСМ ГИСК им.Л.А.Тарасевича) из выращенных на МПА культур возбудителя различных возрастов: 2-х, 3-х, 6-ти, 7-ми,10- ти, 20-ти, 24-х, 28-ми, 48-ми, 72-х, 96-ти, 120-ти, 144-х, 168-ми, 192-х, 216- ти часовых.

Посев проводили методом укола вглубь среды в пробирках и культивировали в термостате при температуре 37' С. Наличие Л -культур подтверждали методом Фазово—контрастной микроскопии.

Материалом для просвечивающей (трансмиссионной! микроскопии служили колонии возйудителя, взятые через 20> 24, 28, 48, 120, 144 и 168 часов после посева на МПА.

Колонии Фиксировали 2,5 X -ным раствором глутарового альдегида на 0,1 М ФосФатном йуФере (рН 6,8-7,2) в течение двух часов, отмывали в трен сменах буфера по 15 минут, а затем доФиксиравали . if. - ным раствором четырехокиси осмия на том хе буфере в течение 15 - 18 часов.После оееоэояивания и проведения через промежуточные смеси образцы заключали в Эпон-812. Полимеризацию проводили при температуре 37', 48',60' С s течение суток при каждой из этих температур. Ультратонкие срезы готовили на ультратсме УМТП — 4, контрастировали ЗХ - ным раствором уранилацатата и цитратом свинца по E.S.Reynolds (1963); J.Н. Variable., R.Coggeshale (1965). Образцы исследовали в электронном микроскопе ЭМ - .125 при ускоряющем напряжении 75 КВ.

Для сканирующей электронной микроскопии культуры возбудителя выращивали на миллипорозых Фильтрах таким хе образом как и для определения Фаз роста. Образцы брали через 15, 30, 45, 60 минут, 2, 4, 43, 120, 144 часа после посева. Колонии Фиксировали в парах 5%~ ного Раствора глутарового альдегида в течение двух часов и в парам 4Х—наго раствора черырехокиси осмия в течение 10 часов по методу И. Б.Паеловой. ,Н.П.Тарабукиной (1983). Вырезали участки колоний на миллипороэых Фильтрах, наклеивали на держатели и напыляли в вакуумной установке Е - 102 (Япония) золотом. Образцы просматривали в электронном микроскопе " Hitachi-800" со сканирующей

электронной приставкой " Hitachi - 80Ю " при ускоряющем напряжении 75 KS.

Набор материалов осуществляли по программе " LEXICON" на принтере " CPF - 136 ".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Морфологическая характеристика популяций возбудителя казеовного лимфаденита овец

В процессе развития популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец выделили четыре Фазы:

1. Лаг-Фаза или Фаза покоя;

2. Логарифмическая Фаза;

3. Стационарная Фаза;

4. Фаза отмирания;

В результате проведенных опытов установили, что для популяций возбудителя характерен колебательный, неустойчивый рост и отсутствие четко выраженной логарифмической Фазы.

Микроскопия мазков и морфометрия бактериальных клеток показали их выраженный полиморфизм. В мазках из культур изученных нами штаммов присутствовали округлые, палочковидные и овоидные клетки, различающиеся по размерам и интенсивности окраски. Крупные палочковидные клетки имели размер 1,7-2,2 мкм в длину, шириной 1-1,2 мкм. Они располагались чаще всего, одиночно и окрашивались в темна-Фиолетовый цвет. Соотношение крупных клеток по штаммам: 74 R - 39,1%; 13 R - 41,3%; 50 S - 41,27.; 146 S - 42,67.; 37 I — 39,8% . Клетки в виде коротких палочек имели размер 1,2 - 1,6

• - и -

о

мкм в длину, шириной 0,85—1 мкм, окрашенные в Фиолетова-розовый цвет. По нашему мнению, эти клетки являлись переходными Фермами от крупны* палочковидных клеток к кокковидным.Соотношение этих клеток по штаммам •• 74 В - 55,5*/.; 13 К - 51,9 "/.; 50 5 - 56,2 7. ; 146 3 - 53,5 '/.% 37 I - 54,9% .' Кокковидные клетки окрашивались в розово-Фиолетовый цвет и имели размер 0,9 - 1,0 мкм в длину, шириной 0,55-0,65 мкм. Возможно, эти клетки являлись покоящимися особями, обеспечивающие переживание микроорганизма в неблагоприятных условиях среды. Соотношение таких клеток по штаммам следующее: 74 Я - 4,9Х; 13 Й - 6,4'/.; 50 3 - 2,1 У.; 146 9 - 3,5 У,; 37 I -4,9 7..

При росте на миллипоровых Фильтрах установлено, что в зависимости от принадлежности культур к I, Р, Б - вариантам , они образовывали характерные колонии, отличающиеся между собой определенным строением периферической части, окраской и оптическими свойствами. Предложено использовать этот метод в качестве дополнительного теста для внутривидовой дифференциации.

Л - трансформация интактных штаммов возбудителя казеозного лимфаденита овец

В проведенных нами исследованиях Л - формы возбудителя были получены путем посева культур вышеназванных штаммов на питательную среду, приготовленную на основе полусинтетической среды Школьниковой в модификации Дорожковой. Интенсивность Л - трансФормации определяли путем визуальной оценки роста Л -колоний. Рост колоний характеризовался появлением нежных хлопьев различной величины. Чаще всего, наблюдали облаковидный и в различной степе-

ни выраженный хлопьевидный рост.

Наиболее интенсивная Л - трансформация отмечена у штамма 74 К . Далее по степени выраженности роста Л - культур следовали: штамм 13 И - вариант, штаммы 50 и 146 .3 — вариант и штамм 37 I — вариант.

Из выращенных на среде Школьниковой культур готовили влажные препараты и исследовали в Фазово-контрастном микроскопе. Обнаруженные нами микроструктурные элементы были разнообразны по Форме, величине и оптической платности и представлены , в основном, скоплениями или отдельно расположенными зернистыми телами и шаровидными образованиями различной величины, независимо от Фено-типической принадлежности штаммов. По нашему мнению, Л - трансФормация интактных штаммов возбудителя является закономерным этапом их развития.

Сканирующая влектроннвя микроскопия популяций возбудителя казеоэного лимфаденита овец

При исследовании культур возбудителя методом сканирующей электронной микроскопии показано, что.развитие всех штаммов шло по одинаковому типу. В ранние сроки (15-60 минут) наблюдали интенсивное развитие тяжей различной формы и структуры, Формировавших своеобразную трехмерную сеть. Наряду с этим Формирующиеся колонии состоят из переплетающихся образований, вероятно каналов, имеющих различной величины вздутия. У всех изученных штаммов через два-четыре часа на разветвленном матриксе располагались значительные по размеру пласты клеток, которые чередовались с участками, содержащими небольшое количество бактерий и участками, в

которых шла реверсия. В стареющих культурах шли процессы автолиза и распада колоний.

Ультраструктурная организация ¿актериальмых клеток воавудителя каэеоэного лимфаденита овец в различные периоды развития

В составе популяций в различные Фазы развития встречались такие? клеточные варианты как! неизмененные клетки с типичной для

данного возбудителя ультраструктугой, делящиеся, атипичные, лизи-рованные клетки, Формы с дефектами клеточных стенок, бесструктурные зернистые шаровидные образования. Соотношение этих клеточных форм по штаммам следующее: 74 И - 29,1"/. > 14,87. ! 9,6Х ; 15,3% ; 19,5-/. 5 11,57.; 13 Р - 27 у.; 11,87.; 10,6 У.% 14,57. ; 25,6 7. ; 10,3 У. % 50 Э - 28,37. $ 14,5% ; 3,6 X? 7,5 7.5 19,37.;21,6 7.5 146 В -34,2.7. ; 18,47.; 107. ; 8,2 7. ; 14,3 7. 5 14,4 7..

В ранние сроки развития С 20-28 часов) преобладали клетки с неизмененной ультраструктурой. Микрокапсула выявлялась в виде хлопьев, рыхлых Фрагментов или тяжей, нередко связывающих бактерии друг с другом . Клеточная стенка имела хорошо выраженный наружный и внутренний осмисФильные слои, разделенные более узким осмиофоёным слоем. Периплазматическое пространство узкое, цито-плазматическая мембрана сливалась с плотной мелкозернистой цитоплазмой. На Фоне йолее светлой цитоплазмы иногда видно большое количество осмиоФильных пятен, являющихся результатом агломерации ривосом и полисом. ОсмиаФойная зона нуклеоида заполнена ДНК в виде клубка, тяжа, гранулы, рыклой структуры или представлена отдельными нитями.

Деление осуществлялось путем образования перегородок с четко выраженными слоями. Иногда наблюдалось асимметричное деление. Нередко видны Формы деления путем образования одной или нескольких перегородок, расположенных центрально, асимметрично или во в з аимнопер пендик у л яр ных плоскостях. Следующие друг за другом или одновременно множественные деления приводили к образованию неравноценных по размерам и структуре клеточных Форм. Обращали на себя внимание различные Формы а той или иной степени имеющие дефекты клеточных стенок. Чаще всего, наблюдалось резкое локальное утолщение и постепенное размывание клеточных стенок.

Во всех участках встречались бесструктурные зернистые шаровидные образования без клеточной стенки с разрыхленной поверхностью. Они образовывались несколькими путями:

- выделения через дефекты клеточных стенок Фрагментов цитоплазмы или ее отпа чковыв ания;

- смещения перегородки к одному из полюсов делящихся'клеток;

- последовательных трех или четырех делений;

- постепенного размывания или сползания клеточных стенок,

В некоторых клетках видны крупные волютиновые гранулы и внутрицитоплазматические мембранные структуры.

В 48 - ми часовых культурах наряду с клетками типичной для коринебактерий структурой, встречались формы с размывающейся клеточной стенкой и различной величины бесструктурные зернистые шаровидные образования без клеточной стенки.

Клеточная стенка гомогенна или разделена на слои, периплаз-матическое пространство хорошо выражено, цитоплазматическая мембрана плотно прилегала к цитоплазме. Нуклеоид располагался цент-

рально, имел угловатую, округлую или вытянутую Форму, ДНК выявлялась в виде клубка или рыхло расположенных нитей. Деление, в основном, осуществлялось путем образования центрально расположенной перегородки. Бесструктурные зернистые шаровидные образования Формировались аналогичными путями, описанными выше.

В поздние сроки развития ( пять-семь суток) для культур ко-ринебактерий характерно наличие разнообразных форм,. в том числе очень сложной структуры, и конгломератов клеток.

Клеточная стенка со слабим, нечетким разделением на слои. Наиболее характерные изменения в ее структуре! разрыхление, размывание, разрывы или резкое утолщение. Эти дефекты были начальными, захватывали значительную часть клеточной стенки или приводили к ее полной утрате. Периплазматическое пространство узкое или локально расширено. Во многих клетках видны процессы сжатия цитоплазмы с образованием бесструктурных полостей, в ней появлялись хлопья, зернистые компоненты, начинались процессы лизиса. В зависимости от плотности клеточной стенки и цитоплазмы бактерии выглядели по-разному! имели одинаковую плотность этих структур, более осмиофильную клеточную стенку и менее — цитоплазму, более ос-моФильную цитоплазму и менее - клеточную стенку. Нуклеоид заполнен клубком ДНК или вакуолизирован.

Деление симметричное и асимметричное. Перегородки были размыты или смещены к полюсу, отделяя лишь фрагмент цитоплазмы, имели ветвистую форму, шли полукругом или параллельно друг другу. В результате такого деления образовывались конгломераты клеток, различающиеся по Форме и величине. Сложные структуры образоэыва-лись не только в результате деления, но и являлись следствием слипания клеток с измененными дефектными клеточными стенками. В

пространствах между клетками находились бесструктурный зернистые шаровидные образования без клеточной стенки.

ВЫВОДЫ

1. В развитии популяций возбудителя казеознрго лимфаденита овец выделено четыре Фазы. Регистрируется колебательный, неустойчивый характер роста и отсутствие четко выраженной логарифмической Фазы.

2. Световая микроскопия и морфомвтрия бактериальных клеток . показали наличие выраженного полиморфизма. Полиморфизм данного возбудителя является характерным признаком, свидетельствующим о высокой динамичности популяций.

3. В зависимости от принадлежности культур к I, й, 3 - вариантам, штаммы при росте на миллипоровых Фильтрах, образовывали характерные колонии, морфологически различающиеся между собой строением периферической части, окраской и оптическими свойствами.

4. Показана наличие Л - трансформации в различные периоды развития популяций. Обращает на себя внимание присутствие Л -трансформированных клеток как в развивающихся, так и стареющих культурах.

5. Наиболее интенсивный процесс Л - трансформации отмечен у штаммов 74 и 13, относящихся к В - варианту, менее выраженный у штаммов 50 и 146, принадлежащих к 3 - варианту и штамма 37 I -варианта.

6. Фазово - контрастная микроскопия подтвердила наличие микроструктурных элементов, характерных для Л — культур,которые

были представлены скоплениями или отдельна расположенными зернистыми телами и шаровидными образованиями различной величины.

7. Методом сканирующей электронной микроскопии показана, что развитие всех штаммов идет по одинаковому типу, связанному с Формированием своеобразной трехмерной сети.

8. При трансмиссионной электронной микроскопии клеточный состав популяций представлен следующими вариантами! неизмененными, атипичными, лизированными клетками, Формами с дефектами клеточных стенок, бесструктурными шаровидными зернистыми образованиями без клеточной стенки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рационализаторское предложение " Способ выделения Л -форм возбудителя казеозного лимфаденита овец" 331 от 4.07.96 г, принятое Омским Институтом ветеринарной медицины.

2. Рационализаторское предложение " Способ культивирования возбудителя казеозного лимфаденита овец " 332 от 4.07.96 г, принятое Омским Институтом ветеринарной медицины.

3. Результаты исследований по ультраструктурной организации бзктериальных клеток возбудителя казеозного лимфаденита овец используются на каФедре микробиологии, вирусологии и иммунологии, эпизоотологии Омского Института ветеринарной медицины и рекомендуются для использования в других зооветеринарных учреждениях научного и учебного направления. ~

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Гехес Л.В.,Лебеденка Е.В. Л - трансформация возбудителя

каэеозного лимфаденита овец // Гигиена, ветсанитария и экология животноводства 5 Тез.докл.Всерос. науч-производсте. конф.- ¿994.-С.79.

2. Лебеденко Е.В. Морфологическая характеристика роста популяций возбудителя казеоаного лимфаденита овец // Морфология, Физиология, патология :л терапия животных и пушных зверей клеточного содержания: Сб.науч.тр.ОмГАУ.- Омск.- 1996.- С.286-289.

Сдано в печать 4.02.97. Формат 60x04/16. Бум.тип.М.З. Печать оФсетная. Печ.л.1.00. Тираж 70. Заказ 808. Картолитография ОмГАУ, Омск-Э, Сибаковская,4