Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Морфологическая характеристика популяций возбудителя казеозного лимафаденита овец

Г I и V' .ч

2 Ь МАР 1997

На правах рукописи

УДК 619:615:579.871:57.012.4

ЛЕБЕДЕНКО ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОПУЛЯЦИЙ ВОЗБУДИТЕЛЯ КАЗЕОЗНОГО ЛИШАДЕНИТА ОВЕЦ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОМСК - 1997

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии института ветеринарной медицины Омского аграрного университета

Научные руководители : Заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, академик Н.М.Колычев; кандидат биологических наук, доцент Л.Б.Гежес

Официальные оппоненты : доктор ветеринарных наук,

профессор Б. Я. Хайкин; доктор медицинских наук, профессор А. А.Обгольц

Ведущая организация : Казанская Государственная Академия

ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана

Защита диссертации состоится

А

1997 Г. В

" ^ " часов на заседании диссертационного совета Д 120.48.01 при институте ветеринарной медицины ОмГАУ. ( 644007, Омск, ул.Октябрьская, 92)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан "_" _ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Н.А.Королева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Возбудитель казесзного лимфаденита овец С.pseudotuberculosis известен с прошлого века ( Nocard.Е 1988, 1892; Preis.H 189451897 ).

В последующий период времени изучались морфологические,куль-туральные, серологические и патогенные свойства С.pseudotuberculosis ( Came Н.1939; Jolly R.Л.1966; Ламихов К.Ф.19545 Заболот-ных М.В.1989? Трофимов И.Г. и др. 1990s Трофимов И.Г.,Колычев Н.М. 1992).

Интерес к данному возбудители связан со значительным экономическим ущербом и широким распространением болезни а странах с развитым овцеводством. Не являются в этом отношении исключением и овцеводческие хозяйства Омской области < Заболотных М.В. 1989; Трофимов И.Г. и др.1990).

Сведения, касающиеся характеристики возбудителя, в частности, его морфологии, требуют дальнейшего изучения и углубления. Об этом говорит констатация большинством исследователей ( Трофимов И.Г. и др.1990S Колычев Н.М., Заболотных М.В»1991; Ощепков В.Г.и др.1991) полиморфизма и значительной Фенотипической вариабельности С.pseudotuberculosis без объяснения этих свойств и выявления закономерностей их проявления.

В последние годы ряд авторов ( Беляков В.Д. и др. 1985; Вос-кун С.Е. и др. 1989; Гусев В.А.,Бобровская Н.И. 1989; Павлова И.Б.и др.1990) показали, что популяции различных видов микроорганизмов представляют собой сложные развивающиеся и саморегулирующиеся системы. Очевидно, объяснение многих Фенотипических свойств С.pseudotuberculosis следует искать на пути комплексных, в том

числе и морфологических, исследований на клеточном и популяцион-ном уровне, что важно для разработки рациональных методов лечениг и профилактики казеозного лимфаденита овец.

Регистрационный номер 01710053438.

Цель работы. Определение закономерностей развития возбудителя казеозного лимфаденита овец и комплексная морфологическая характеристика его на клеточном и популяционном уровне.

Задачи исследований:

- определить Фазы развития популяций возбудителя казеозногс лимфаденита овец;

- изучить морфологию популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец в различные Периоды развития;

- выявить возможность и закономерность П - трансформации ин-тактных штаммов возбудителя казеозного лимфаденита овец;

- изучить ультраструктурную организации бактериальных клеток, входящих в состав популяций коринебактерий»

Научная новизна. Проведенные нами исследования позволили:

- получить комплексную морфологическую характеристику развития популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец в динамике;

- выявить наличие Л - трансформации и закономерности рост. Л - колоний в различные периоды развития возбудителя;

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные сведения являются основой для исследования популяций возбудител после воздействия Физико-химическими Факторами, усовершенствования методов лабораторной диагностики казеозного лимфаденита ове! и правильной оценки эффективности лечебных препаратов и дезинфицирующих средств.

Результаты исследований используются в научно-исследователь-

ской Работе и учебном процессе на каФедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии, эпизоотологии Омского института ветеринарной медицины.

По результатам исследований оформлено два рационализаторских предложения.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-производственной конференции (Чебоксары, 1994), на научных конференциях преподавателей и аспирантов ОмГАУ (Омск, 1795, 1996 гг).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи.

Обьем и структура диссертации. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 3 графиками, 3 таблицами, 8 фотографиями, 63 электроннограммами. Список используемой литературы составляет 180 источников, из них 50 иностранных.

Основные положения, выносимые на защиту i

- морфологические закономерности развития популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец;

- субмикроскопическая организация С.pseudotuberculosis на клеточном и популяционном уровне;

- /1 - трансформация интактных штаммов как закономерный этап развития возбудителя.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 1992-1995 гг. .на каФедре микробиологии, вирусологии и иммунологии института ветеринарной медицины Омского аграрного университета и в лаборатории электронной микроскопии Омского аграрного университета. Сканирующая электронная микроскопия проведена в лаборатории электронной микроскопии Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ).

Объектом исследований служили пять интактных штаммов возбудителя казеозного лимфаденита овец, относящиеся к различным Фено-тигмческин группам! 37 15 ЗО 3! 146 Б! 74 В; 13 к. Все штаммы выделены в овцеводческих хозяйствах Омской области (Заболотных М.В. 1989; Трофимов И.Г.' и др.1990). Два иа них, 74 Я и 146 Б , депонированы в ГНКИС Заболотных И.В., Колычев Н.М.,Трофимов И.Г. 1991).

В работе использованы традиционные бактериологические методы, Фазово-контрастная микроскопия» анализ Л — трансформации, сканирующая и трансмиссионная электронная микроскопия.

Проведены две серии опытов по представленной схеме.

ЛиоФилизированные музейные культуры стабилизировали путем многократных пассажей < в среднем — пять) на мясо-пептонном агаре (МПА), предварительно проконтролировав их вирулентность на мышах с целью определения жизнеспособности. Для этого заразили внутриб-рюшинно взвесью лиоФилизированных культур на Физиологическом растворе в дозе 0,1 мл 50 белых мышей в возрасте одного месяца, весом около 13 гр. 0 чистоте культур судили по характеру роста на питательной среде и анализу мазков. Видовую принадлежность изуча-

СХЕМА ОПЫТОВ

С. рзеи(1(^иЬегои1о515 оу1З штампы: 37 I, 13 Л, 74 П, 50 146 5

посеа на ИПЛ +

пиллипоровые фильтры

исследование культур на миллипоровых фильтрах

а н а л и ? роста

&9&еши0ание

построение графиков роста

сканирующая электронная микроскопия

выя & л е к и е

Ь-трансформаций

1

по о е в на о р в 9 у

и к о л ь ник о & о й

анали? фазоЗогшйщвстига

роста микроскопия

анализ па;к о в

порфопетрия вактериальньк клеток

т р ано п и о с ио н н а я электронная микроскопия

емых штаммов подтверждали путем посева на МПА с добавлением тел-лурита калия, являющейся диФФеренцировочной для данного возбудителя средой (Трофимов И.Г. и др.1990). После этого готовили материал для исследования по представленной выше схеме.

Бактериологический анализ включал традиционные методы : выращивание на МПА, приготовление мазков, окраску по Граму, световую МИКРОСКОПИЮ.

Для определения Фаз роста проводили посев культур на мипли-поровые Фильтры "Владипор" МА МФД -4, которые помещали на поверхность МПА в чашках Петри. Для этого готовили бактериальную взвесь плотностью 10 единиц по оптическому стандарту мутности( ОСМ ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Приготовленную суспензию наносили с помощью Vari - пипеток а объеме 20 мкл на поверхность миллилороеых фильтров. Чашки с посевами помещали в термостат при температуре 37' С на девять суток (срок наблюдения). Взвешивание миллипоровых фильтров с выросшими колониями проводили через 1,5; 2, 3,5; 4,55 6; 85 10} 20,- 24j 235 48; 725 96; 120; 1445 1685 1925 216 часов после посева. Строили графики зависимости натурального логариФма биомассы (1_п) от времени культивирования.

Для выявления Л - трансформации проводили посев культур вышеназванных штаммов на питательную среду, приготовленную на основе полусинтетической среды Шкальниковой в модификации Дорохковой (1934). Готовили взвеси культур на Физиологическом растворе плотностью Ю единиц по оптическому стандарту мутности (ОСМ ГИСК им.Л.А.Тарасевича) из выращенных на МПА культур возбудителя различных возрастов: 2-х, 3-х, 6-ти, 7-ми,10- ти, 20-ти, 24-х, 28-ми, 48-ми, 72-х, 96-ти, 120-ти, 144-х, 168-ми, 192-х, 216- ти часовых.

Посев проводили методом укола вглубь среды в пробирках и сльтивировали в термостате при температуре 37* С. Наличие Л -ультур подтверждали методом Фаэово-контрастной микроскопии.

Материалом для просвечивающей (трансмиссионной) микроскопии лужили колонии возбудителя, взятые через 20, 24, 28, 43, 120, 14 и 163 часов после посева на МПЙ.

Колонии Фиксировали 2,5 X -ным раствором глутарового альде— 1да на 0,1 М ФосФатном буфере (рН 6,8-7,2) в течение двух часов, гмывали в трех сменах буФера по 15 минут, а затем дофикеировали . ; - ным раствором четырехокиси осмия на том же буфере в течение 3-13 часов.После обезвоживания и проведения через промежуточ-je смеси образцы заключали в Эпон-812; Полимеризацию проводили »и температуре 37', 48',60' С в течение суток при каждой из этих ;мператур. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме УМТП - 4, знтрастировали 3% - ным раствором уранилацетата и цитратом свин-i по E.S.Reynolds (1763); J.Н.Venable., R.Coggeshale (1965). 06-1зцы исследовали в электронном микроскопе ЭМ - 125 при ускоряю-ím напряжении 75 КВ.

Для сканирующей электронной микроскопии культуры возбудителя цращивали на милпипоровых Фильтрах таким же образом как и для |ределения Фаз роста. Образцы брали через 15, 30, 45, 60 минут, , 4, 48, 120, 144 часа после посева. Колонии Фиксировали в парах ,- ного раствора глутарового альдегида в течение двух часов и в ipax 4Х-ного раствора черырехокиси осмия в течение 10 часов по тоду И.Б.Павловой.,Н.П.Тарабукиной (1983). Вырезали участки ко-)ний на миллипороаых Фильтрах, наклеивали на держатели и напыля-! в вакуумной установке Е - 102 (Япония) золотом. Образцы прос-1тривали в электронном микроскопе " Hitachi-BOO" со сканирующей

- lO -

электронной приставкой " Hitachi - 8010 " при ускоряющем напряжении 75 КВ.

Набор материалов осуществляли по программе " LEXICON" на принтере " CPF - 136

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Морфологическая характеристика популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец

В процессе развития популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец выделили четыре Фазы!

1. Лаг-Фаза или Фаза покоя;

2. Логарифмическая Фаза;

3. Стационарная Фаза; ,

4. Фаза отмирания;

В результате проведенных опытов установили, что для популяций возбудителя характерен колебательный, неустойчивый рост и отсутствие четко выраженной логарифмической Фазы.

Микроскопия мазков и морфометрия бактериальных клеток показали их выраженный полиморфизм. В мазках из культур изученных нами штаммов присутствовали округлые, палочковидные и овоидные клетки, различающиеся по размерам и интенсивности окраски. Крупные палочковидные клетки имели размер 1,7-2,2 мкм в длину, шириной 1—1,2 мкм. Они располагались чаще всего, одиночно и окрашивались в темно-Фиолетовый цвет. Соотношение крупных клеток по штаммам: 74 R - 39,IX; 13 R - 41,3%; 50 S - 41,2%; 146 S - 42,6Х; 37 I - 37,87. . Клетки в виде коротких палочек имели размер 1,2 - 1,6

мкм а длину, шириной 0,85-1 мкм, окрашенные в Фиолетово-розовыи цвет. Па нашему мнению, эти клетки являлись переходными Формами от крупных палочковидных клеток к каккавидным.Соотношение этих клеток по штаммам •• 74 Я - 55,5Х; 13 К - 51,9 7.5 50 3 - 56,2 7. ; 146 3 - 53,3 "/.", 37 I - 54,9% .' Кокковидные клетки окрашивались в розово-Фиолетовый цвет и имели размер 0,9 - 1,0 мкм в длину, шириной 0,55-0,65 мкм. Возможно, эти клетки являлись покоящимися особями, обеспечивающие переживание микроорганизма в неблагоприятных условиях среды. Соотношение таких клеток по штаммам следующее! 74 Я - 4,97.; 13 И - 6,47.5 50 3 - 2,1 7.; 146 Б - 3,5 У.; 37 I - 4,9 7..

При росте на миллипоровых Фильтрах установлено, что в зависимости от принадлежности культур к I, В, Э ~ вариантам , они образовывали характерные колонии, отличающиеся между собой определенным строением периферической части, окраской и оптическими свойствами. Предложена использовать этот метод в качестве дополнительного теста для внутривидовой дифференциации.

П - трансформация интактных штаммов воайудитвля казеозного лимфаденита овец

В проведенных нами исследованиях Л - Формы возбудителя были получены путем посева культур вышеназванных штаммов на питательную среду, приготовленную на основе полусинтетической среды Школьниковой в модификации Дорожковой. Интенсивность Л - трансФормации определяли путем визуальной оценки роста Л -колоний. Рост колоний характеризовался появлением нежных хлопьев различной величины. Чаще всего, наблюдали облаковидный и в различной степе—

ни выраженный . хлопьевидный рост.

Наиболее интенсивная Л - трансформация отмечена у штамма 74 Я . Далее по степени выраженности роста Л - культур следовали: штамм 13 Н - вариант, штаммы 50 и 146 .Б - вариант и штамм 37 I -вариант.

Из выращенных на среде Школьниковой культур готовили влажные препараты и исследовали в Фазово-контрастном микроскопе. Обнаруженные нами микроструктурные элементы были разнообразны по норме, величине и оптической плотности и представлены , е основном, скоплениями или отдельно расположенными зернистыми тепами и шаровидными образованиями различной величины, независимо от Фено-типической принадлежности штаммов. По нашему мнению, Л - трансФормация интактных штаммов возбудителя является закономерным этапом «х развития.

сканируют*« »лвктмннв* микроскопия популяций возбудителя казеоэного лимфаденита оаец

Пси исследовании культур возбудителя методом сканирующей электронной микроскопии показано, что,развитие всех штаммов шло по одинаковому типу, в ранние сроки (15-60 минут) наблюдали интенсивное развитие тяжей различной формы и структуры, Формировавших своеобразную трехмерную сеть. Наряду с этим Формирующиеся колонии состоят из переплетающихся образований, вероятно каналов, имеющих различной величины вздутия. У всех изученных штаммов через два-четыре часа на разветвленном матриксе располагались значительные по размеру пласты клеток, которые чередовались с участками, содержащими небольшое количество бактерий и участками, в

которых шла реверсия. В стареющих культурах шли процессы автолиза и распада колоний.

Ультраструктурная организация бактериальных клеток возбудителя кааеоаного лимфаденита евец в различные периоды развития

В составе популяций в различные Фазы развития встречались такие клеточные варианты как! неизмененные клетки с типичной для данного возбудителя ультраструктурой, делящиеся, атипичные, лизи-рованные клетки, формы с дефектами клеточные стенок, бесструктурные зернистые шаровидные образования. Соотношение этих клеточных Форм по штаммам следующее! 74 И - 29,1% ; 14,87. 5 9,6"/. ; 15,3% 5 19,5% 5 11,3X5 13 Я - 27 7.5 11,87.5 10,6 7.5 14,57. 5 25,6 7. 10,3 7. 5 50 в - 2В,37. 5 14,57. ; 3,6 7.5 7,5 7.5 19,37.521,6 146 5 -34,2.7. ; 18,47.5 107. 5 8,2 7. ; 14,8 7. ; 14,4 %.

В ранние сроки развития С 20-28 часов) преобладали клетки с неизмененной ультраструктурой. Микрокапсула выявлялась в виде хлопьев, рыхлых Фрагментов или тяжей, нередко связывающих бактерии друг с другом . Клеточная стенка имела хорошо выраженный наружный и внутренний осмисФильные слои, разделенные более узким осмиоФобным слоем. Периплазматическое пространство узкое, цито-плазматическая мембрана сливалась с плотной мелкозернистой цитоплазмой. На Фоне более светлой цитоплазмы иногда видно большое количество осмиоФильных пятен, являющихся результатом агломерации рибосом и полисом. ОсниоФобная зона нуклеомда заполнена ДНК в виде клубка, тяха, гранулы, рыхлой структуры или представлена отдельными нитями.

Деление осуществлялось путем образования перегородок с четко выраженными слоями. Иногда наблюдалось асимметричное деление. Нередко видны Формы деления путем образования одной или нескольких перегородок, расположенных центрально, асимметрично или во взаимноперпендикулярных плоскостях. Следующие друг за другом или одновременно множественные деления приводили к образованию неравноценных по размерам и структуре клеточных форм. Обращали на себя внимание различные Формы в той или иной степени имеющие дефекты клеточных стенок. Чаще всего, наблюдалось резкое локальное утолщение и постепенное размывание клеточных стенок.

Во всех участках встречались бесструктурные зернистые шаровидные образования без клеточной стенки с разрыхленной поверхностью. Они образовывались несколькими путями»

- выделения через дефекты клеточных стенок фрагментов цитоплазмы или ее отпочковывания;

- смещения перегородки к одному из полюсов делящихся'клеток;

- последовательных трех или четырех делений;

- постепенного размывания или сползания клеточных стенок;

В некоторых клетках видны крупные волютиновые гранулы и енутрицитоплааматические мембранные структуры.

В 48 - ми часовых культурах наряду с клетками типичной для коринебактерий структурой, встречались формы с размывающейся клеточной стенкой и различной величины бесструктурные зернистые шаровидные образования без клеточной стенки.

Клеточная стенка гомогенна или Разделена на слои, периплаз-матическое пространство хорошо выражено, цитоплазматическая мембрана плотно прилегала к цитоплазме. Нуклеоид располагался цент-

рально, имел угловатую, округлую или вытянутую Форму, ДНК выявлялась в виде клубка или рыхло расположенных нитей. Деление, в основном, осуществлялось путем образования центрально расположенной перегородки. Бесструктурные зернистые шаровидные образования Формировались аналогичными путями, описанными выше.

В поздние сроки развития ( пять-семь суток) для культур ко-ринебактерий характерно наличие разнообразных форм,. в том числе очень сложной структуры, и конгломератов клеток.

Клеточная стенка со слабым, нечетким разделением на слои. Наиболее характерные изменения в ее структуре! разрыхление, размывание, разрывы или резкое утолщение. Эти дефекты были локальными, захватывали значительную часть клеточкой стзнки VI.т.". приводили к ее полной утрате. Периплазматическое пространство узкое или локально расширено. Во многих клетках видны процессы сжатия цитоплазмы с образованием бесструктурных полостей, в ней появлялись хлопья, зернистые компоненты, начинались процессы лизиса. В зависимости от плотности клеточной стенки и цитоплазмы бактерии выглядели по-разному! имели одинаковую плотность этих структур, более осмиофильную клеточную стенку и менее - цитоплазму, более ос-мофильную цитоплазму и менее - клеточную стенку. Нуклеоид заполнен клубком ДНК или вакуолизирован.

Деление симметричное и асимметричное. Перегородки были размыты или смещены к полюсу, отделяя лишь фрагмент цитоплазмы, имели ветвистую форму, шли полукругом или параллельно друг другу. В результате такого деления образовывались конгломераты клеток, различающиеся по форне и величине. Сложные структуры образовывались не только в результате деления, но и являлись следствием слипания клеток с измененными дефектными клеточными стенками. В

пространствах между клетками находились бесструктурные зернистые шаровидные образования без клеточной стенки.

ВЫВОДЫ

1. В развитии популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец выделено четыре Фазы. Регистрируется колебательный, неустойчивый характер роста и отсутствие четко выраженной логарифмической Фазы.

2. Световая микроскопия и морФометрия бактериальных клеток . показали наличие выраженного полиморфизма. Полиморфизм данного возбудителя является характерным признаком, свидетельствующим о высокой динамичности популяций.

3. В зависимости от принадлежности культур к I, Б — вариантам, штаммы при росте на миллипоровых Фильтрах, образовывали характерные колонии, морфологически различающиеся между собой строением периферической части, окраской и оптическими свойствами.

4. Показано наличие Л - трансформации в различные периоды развития популяций. Обращает на себя внимание присутствие Л -трансформированных клеток как в Развивающихся, так и стареющих культурах.

5. Наиболее интенсивный процесс Л - трансформации отмечен у штаммов 74 и 13, относящихся к Я - варианту, менее выраженный у штаммов 50 и 146, принадлежащих к Б - варианту и штамма 37 I -варианта.

6. Лааово - контрастная микроскопия подтвердила наличие микроструктурных элементов, характерных для Л - культур,которые

были представлены скоплениями или отдельна расположенными зернистыми телами и шаровидными образованиями различной величины.

7. Методом сканирующей электронной микроскопии показана, что развитие всех штаммов идет по одинаковому типу, связанному с Формированием своеобразной трехмерной сети.

8. При трансмиссионной электронной микроскопии клеточный состав популяций представлен следующими вариантами! неизмененными, атипичными, лизированными клетками, Формами с дефектами клеточных стенок, бесструктурными шаровидными зернистыми образованиями без клеточной стенки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рационализаторское предложение " Способ выделения Л -форм возбудителя казеозного лимфаденита овец" 331 от 4.07.96 г, принятое Омским Институтом ветеринарной медицины.

2. Рационализаторское предложение " Способ культивирования возбудителя казеозного лимфаденита овец " 332 от 4.07.96 г, принятое Омским Институтом ветеринарной медицины.

3. Результаты исследований по ультраструктурной организации бактериальных клеток возбудителя казеозного лимфаденита овец используются на каФедре микробиологии, вирусологии и иммунологии, эпизоотологии Омского Института ветеринарной медицины и рекомендуются для использования в других зооветеринарных учреждениях научного и учебного направления.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Гежес Л.В.,Лебеденко Е.В. Л - трансфармация возбудител? каэеозного лимфаденита овец // Гигиена, ветсанитария и экологиг животноводства : Тез.докл.Всерос.науч-производств. кон«.- 1994.-С.79.

2. Лебеденко Е.В. Морфологическая характеристика роста популяций возбудителя казеозного лимфаденита овец // Морфология, Физиология, патология :л терапия животных и пушных зверей клеточного содержания: Сб.науч.тр.ОмГАУ.- Омск.- 1996.- С.286-239.

Сдано в печать 4.02.97. Формат 60x84/16. Бум.тип.N.3. Печать оФсетная. Печ.л.1.00. Тираж 70. Заказ 808. Картолитография ОмГАУ, Омск-8, Сибаковская,4