Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Морфо-функциональная характеристикарепаративной регенерации костной ткани у мелких домашних животных

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ _ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ рГ ^ () Д

2 1 ЛЯГ 2о03

На правах рукописи

КАМЫШКО Владимир Евгеньевич

Морфо-функциональная характеристика репаративной регенерации костной ткани у мелких домашних животных

16.00.02 —патология, онкология н морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва — 2000

Работа выполнена на кафедре внутренних незаразных болезней Московского Государственного университета прикладной биотехнологии

Научные руководители: Доктор ветеринарных наук,

заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАСХН, профессор УшаБ. В.

Кандидат ветеринарных наук, доцент Ватников Ю. А.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Доктор ветеринарных наук МГАВМнБ им. К.И. Скрябина, профессор Лукьяновский В.А Кандидат ветеринарных наук Митин В. Н.

Российский университет Дружбы народов

Защита состоится « 2.3 » и!>г! _2000 г.

в ¿5 " часов на заседании диссертационного совета Д 063.46.03 в Московском государственном университете прикладной биотехнологии (109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ.

Автореферат разослан « 5Г » с^Л; 2000г.

И. Г. Серегин

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент

тъ<г.т-% р

I. Общая характеристика работы

1.1.Актуальность проблемы. Механические повреждения и сопровождающие их воспалительные процессы вызывают у животных снижение привесов, удоев, приводят к преждевременным родам, развитию хирургической инфекции, другим осложнфениям и даже гибели животного. Особенности технологического содержания животных в условиях специализированных комплексов в определенной степени увеличили поражаемое«, скота незаразными болезнями, особенно травматизмом. (Белов А. Д., i960, 1967, 1973; Плахотин М. В., 1971, 1981; Лукьяновский В. А., Белов А. Д., Беляков И. М., 1984; Уша Б. В., Фельдштейн М.А., 1988, ¡997, 1998). По данным ветеринарного управления МСХ России незаразные болезни составляют 92-94 % от общей патологии животных, из них 40-42 % составляют хирургические болезни. Длительное болевое раздражение в области перелома, нарушение опороспособности и приема пищи (например, при переломах костей челюсти Ватников Ю. А., 1997)) снижают полноценность использования животных в хозяйственных и служебных целях, многопрофильность которых требует удовлетворения нужд в спортивном, служебном, специальном, сельскохозяйственном и декоративном животноводстве и собаководстве. Значительная роль здесь отводится МВД, МО, МЧС России, пограничной и таможенной службам.

Повышение интенсивности жизни в современных крупных городах, возрастание скоростей движения ведут не только к увеличению числа травматизма, но и утяжелению самой травмы (Митин В. Н., 1984). По данным РАСХН (1989) в Москве костный травматизм животных составил 12%, а в Санкт-Петербурге - 29,3% от всей незаразной патологии. Большое разнообразие видов переломов, их локализации, сочетанных повреждений вызывают необходимость детального изучения оперативных методов лечения и четких представлений морфологии репаративно-регенератнвных процессов в костной ткани при травмах.

Таким образом, главной задачей лечения переломов следует считать не только совершенствование методов механического соединения, но и изучение биологических законов заживления переломов, изыскание новых средств, ускоряющих репаратив-ную регенерацию и стабилизирующих состояние больного организма. Применение иммуностимулирующих препаратов, влияющих на течение травматической болезни, осуществление иммунного и морфологического контроля над процессами регенерации позволят улучшить состояние больного животного, и ускорит реабилитационный, постгравматичесхий период. (Мажуга П. М., 1968; Бабаева А. Г., 1977; Аскалонов А. А., 1984; Осипенко А. В., 1985; Базарный В. В., 1995; Гололобов В. Г., 1995; Козлов Ю.А., 1998 и др.)

1.2. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении морфофункционального процесса реларашвной регенерации костной ткани под воздействием иммунокорректоров различных классов на подопытных и спонтанно травмированных животных.

Нами были поставлены следующие задачи:

■ Охарактеризовать функции Т- и В-лимфоцитов, их субпопуляций и макрофалов в процессе репаративной регенерации и под воздействием иммунокорректо-ров различных классов.

• Изучить процесс репаративной регенерации костной ткани на примере подопытных и клинически больных животных в посттравматический период и дать морфофункциональную оценку костного регенерата под воздействием иммуно-корректоров.

■ Проанализировать морфологические и биохимические показатели крови клинически больных животных как прогностический фактор репаративного процесса под воздействием иммунокорректоров.

* Выявить и предложить к применению препарат, обладающий наилучшей регенераторной активностью.

■ Разработать и обосновать схему применения препарата-корректора.

1.3. Научная новизна. Впервые в процессе репаративной регенерации костной тканн изучены морфофункциональная характеристика костной ткани, иммунный статус, морфологические и биохимические показатели крови подопытных и клинически больных животных под воздействием иммунокорректоров различных классов. Выявлен препарат, обладающий выраженной активностью на регенерацию костной ткани. Предложена схема коррекции репаративной регенерации костной ткани у клинически больных животных.

1.4.Практические предложения. Препараты полиоксидоний, байпамун, проди-гиозан, миелопид могут применяться в посттравматическом периоде у животных, т.к. обладая иммуногенным свойством, вызывают выраженный иммунный ответ. Наилучшим препаратом, обладающим иммуногенным действием и оказывающим непосредственное влияние на репаративный процесс в костной ткани является полиоксидоний.

Применение полиоксидония у спонтанно-травмированных животных в дозе 10 мг/животное в ранний (3, 5, 7 дни) и отдаленный (35, 37, 40 дни) посттравматические периоды вызывает выраженный стабилизирующий эффект и непосредственное влияние на репаративный процесс в костной ткани. Проведение биохимических исследований наряду с рентгенологическими может носить прогностический характер.

1.5. Апробация результатов. Материалы по результатам диссертации доложены на шестой международной конференции по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных (1998г.); на международной научно-производственной конференции по вопросам ветеринарии и животноводства Казанской Государственной академии ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана (1998г.); на конференции московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина (1999г.).

1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

1.7. Положения, выносимые на защиту.

1. Оценка Т-, В-системы иммунитета и их субпопуляций в процессе репаративной регенерации под воздействием иммунокорректоров различных классов у подопытных животных.

3. Морфологический анализ репаративной регенерации костной ткани под воздействием препаратов-корректоров.

4. Морфофункциональный анализ статуса клинически больных животных в по-стгравматической период под воздействием байпамуна и полиоксидония.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 179 машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих раздел "материалы и методы", разборов экспериментальных и клинических данных, обсуждения заключения, общих выводов, списка литературы, включающего 168 отечественных и 94 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 21 диаграммами, 17 гистограммами и 7 рентгенограммами.

II. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы. Настоящая работа выполнена в 1996-1998 г.г. Экспериментальная часть и клинические исследования проведены в Московском государственном университете прикладной биотехнологии на кафедре незаразных болезней. Консультативная помощь оказана лабораторией иммунологии и генетики Всероссийского института гельминтологии им. К.И. Скрябина и московской ветеринарной клиникой «ВИТУС -ъ».

В основу исследований положены опыты на 180 подопытных (крысах) и 40 клинически больных животных (собаках) по изучению морфофункциональных изменений костной ткани, определению иммунного статуса подопытных животных после кортикотомии голени и динамики морфологического состава крови спонтанно травмированных животных. Изучено воздействие иммунокорректоров различных классов на репаратпвный процесс у обеих групп исследованных животных. Клинически больные животные поступали с травмами трубчатых костей из ветеринарной клиники «ВИТУС+», где они были подвергнуты стабилизации в пре- и постоперационный периоде применением стандартных схем противошоковой, противовоспалительной, противоинфекционной терапии. Операцию по поводу остеосинтеза проводили noBrinker W. О., Piermattei D. L. et al (1991). Подопытным животным с целью исследования репаративного процесса наносили травму голени по методу Лаврищевой Г. И., Оноприенко Г. А. (1996). Выделение лимфоцитов крови в градиенте плотности, впоследствии используемых в иммунологических тестах, выполняли по A. Boyum (1968).

Определение количества Т-лимфоцитов (E-рок) проводили в реакции спонтанного розеткообразовання с эритроцитами кролика по методу S. Limatibul et al (1978), идентификацию В-клеток (ЕАС-рок) проводили по методу N. S. Mendes et al (1973), фагоцитарную активность макрофагов (НСТ-тест) — по A. Segal (1984). Морфологический и биохимический анализы крови проводили по методу Меньшикова В. В. (1987).

Для гистологических исследований динамики регенеративных процессов костной ткани образцы фиксировали в течение 48 часов 10-15% раствором нейтрального формалина. Декальцинацию проводили 5% раствором азотной кислоты при комнатной температуре (18-22 С°) в течение 7-14 дней. Срезы изготавливали на микро-томе-криостате МК-28 толщиной 8-10 мхм. Для дифференциации соединительных

тканей использовали метод окраски по Ван-Гизон (Меркулов Г. А., 1969). Исследование и микрофотографирование проводили с помощью светового микроскопа при увеличении в 400 раз.

Контроль за постоперационным состоянием подопытных и спонтанно травмированных животных осуществляли по клиническим признакам, принятым в ветеринарной ортопедии и посредством рентгенологического исследования на аппарате «Toshiba».

Результаты исследований обрабатывали статистически по методу Стыодента (Ур-бахВ. Ю„ 1963).

Препараты, применяемые для коррекции иммунного ответа и ре-паративной регенерации костной ткани.

- Полиоксидоний — отечественный синтетический иммуномодулятор нового поколения. N-оксидированное производное полиэтиленпиперазина или производное N-оксиалифатических полиамннов, обладающих широким спектром фармакологического действия и высокой иммуностимулирующей активностью (журнал "Фарматика", №б, 1996г.).

- Байпамун-С/К (Bayer) — Одна доза содержит суспензии: вирус Рагарох ovis, штамм D1701 (химически инактивированный) в количестве не менее 10.6.45 GKID 50, полиген в качестве стабилизатора 25,0 мг.

- Продигиозан— препарат культуры бактерий Вас. prodigiosum.

. - Миелопид — препарат надосадочной жидкости культуры костномозговых клеток свиней. Содержит иммуномодуляторы костного мозга - миелопепти-ды(Новиков Д.К., Новикова В.И., Деркач Ю.Н. и др., 1998).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Изучение иммунного статуса подопытных крыс с травмой боль-шеберцовон кости н в процессе ее репаративной регенерации. В опыт подобраны животные по принципу аналогов весом — 230±28,7 грамм, общим количеством девять голов. Крыс разделили на две группы. Первая группа — животные с травмой голени — пять голов. Вторая — четыре головы составили контрольную группу (интактную). Исследования проводили на 1; 3; 5; 7; 10; 13; 15; 20 дни. Кровь в количестве 1 мл. брали из венозного синуса внутреннего угла глаза с помощью инсулинового шприца. Изучение иммунного статуса проводили путем анализа Т- и B-системы иммунитета и макрофагов.

2.2.1.1. Динамика абсолютного количества Е-рок периферической крови крыс (кл/мкл). В первый день исследования у животных испытуемых групп мы не обнаружили достоверных различий (количества Е-рок) в периферической крови. Эти значения находились в пределах 998,5±297,6 - 1136,6±199,3 кл/мкл. На следующий день, после нанесения травмы количество Е-рок в опытной группе (первой) снизилось и было в 2,31 раза ниже, чем в группе, не подвергшейся травме.

Иммунодефишггаое состояние с небольшими колебаниями мы наблюдали в первой группе вплоть до десятого дня. В этот период количество Т-лимфоцитов находилось в пределах от 843,5±58,2 на третий день и 1102,3±76,9 (кл/мкл) - на десятый день, что во всех случаяк было достоверно ниже, чем в контрольной группе. Тринадцатый день выявил рост Т-клеток в группе животных с травмой голени. В этот день количество Т-клеток в периферической крови увеличилось до 1686,1±283,4 кл/мкл, при показаниях в интакгной группе 1257,8±172,7 кл/мкл. После некоторого падения общего показателя Т-лимфоцитов на пятнадцатый день, мы вновь наблюдали усиление рецепторной активности в первой фуппе на двадцатый день к окончанию эксперимента.

В дальнейшем, для более глубокого анализа показатели периферической крови мы рассматривали в виде Т-клеточных субпопуляций.

2.2.1.2. Динамика содержания теофиллннрезистентиых лимфоцитов (ТФР-рок, кл/мкл). Иммунодефицит клеток-хелперов отмечен нами в первые два дня наблюдений. Выявлено достоверное снижение количества теофиллинрези-стентных лимфоцитов в травмированной группе по отношению к контролю (328,2±41,2 и 545,2±54,8 кл/мкл, соответственно). После незначительного подъема ТФР-рок на пятый день произошло резкое снижение хелперных влияний в первой группе по отношению к контролю. Следует отметить достоверное увеличение тео-филлинрезистентных клеток к заключительному двадцатому дню, когда их количество составило 967,6±144,3 кл/мкл, что было достоверно выше показателей в интакгной группе.

2.2.1.3. Динамика содержания теофиллинчувствительных лимфоцитов (ТФЧ-рок, кл/мкл). Установлено угнетение ТФЧ-рок с первого по десятый дни исследований. Количество клеток-супрессоров у животных травмированной группы на десятый день исследований находилось в пределах 484,6±49,7 кл/мкл, при показаниях в интакгной группе 670,4±129,2 кл/мкл. В последующие дни наблюдалась тенденция накопления клеток-супрессоров. Резкий подъем количественных показателей Т-супрессоров отмечался на тринадцатый день опыта. Показатели роста супрессии составили в опытной группе 1418,7±269,1 кл/мкл, при показаниях в контрольной группе 579,2±24,7 кл/мкл. Уровень теофиллинчувствительных клеток оставался достаточно высокий до окончания эксперимента.

2.2.1.4. Динамика количества В-лнмфоцнтов (ЕАС-рок). Травматическое воздействие на животных первой группы вызвало снижение В-клеточной активности, начиная с третьего дня наблюдений до тринадцатого. В этот день показатели количества В-клеток в опытной группе вплотную приблизились к показателям контрольной группы, достоверных отличий в этот день не наблюдали (534,3±54,2; 507,9±43,б кл/мкл, соответственно). Только на двадцатый день показатель первой группы превзошел таковой в контрольной группе, а числовые значения в этот день были на уровне 737,7±183,9 (I) и 687,5±97,9 кл/мкл - в интакгной группе.

2.2.1.5. Динамика фагоцитарной активности макрофагов (НСТ-тест). На следующий день после травмы мы установили снижение уровня макрофагаль-ного звена по отношению к контролю. Количество НСТ-положительных клеток отмечено на уровне 64,7±8,8 кл/мкл, при показаниях контрольной группы 89,4±24,8 кл/мкл. В травмированной группе состояние дефицита макрофагального звена держалось до седьмого дня эксперимента. С десятого по пятнадцатый дни показа-

ния опытной группы находились на уровне контроля. Двадцатый день не выявил различий макрофагалыюй активности в опыте и контроле.

2.2.2. Изучение иммунного статуса подопытных крыс под воздействием иммунокорректоров байпамун и мнелопид.

В опыте задействовано четыре группы крыс, подобранных по принципу аналогов количеством двадцать голов. С целью изучения влияния иммунокорректоров различных классов на процесс репаративной регенерации костной ткани, после нанесения травмы голени первой группе крыс вводили байпамун подкожно в дозе 0,5 мл на голову трехкратно через день. Второй группе - мнелопид в дозе 3 мг/гол под кожу. Третьей группе травмированных животных препарат не назначали. Четвертая группа оставалась интактной.

2.2.2.1. Динамика абсолютного содержания Е-рок (кл/мкл.). Исходные данные изучения Е-розеткообразования были определены в интервале 973,7± 191,4 - 1136,б±199,3. После нанесения травмы исследуемым животным, показатели в первых трех группах снизились и выявили достоверное иммунодефицитное состояние по отношению к интактной группе. После введения иммунокорректоров, установлено усиление активности розеткообразования у лимфоцитов крови опытных животных первой группы (1116,2±234,9 кл/мкл). Количество Т-клеток во 2-ой группе составило 987,4*297,9; и 872,8^74,9 кг/мкл в третьей. Третья инъекция также способствовала поддержанию лимфоцнтарной активности в группах, получивших иммунокорректоры, хотя количественные показатели несколько снизились по сравнению с предыдущим днем. (1 группа - 1272,7±391,2; 2 группа - 1642,3±162,1; 3 группа - 1102,8±76,9, разница достоверна). Показания контроля отмечены на уровне 11348,9±116,2 кл/мкл. Тринадцатый день выявил достоверное усиление активности Т-лимфоцитов в третьей группе (1686,1±283,4 кл/мкл), что в 2,87 раза выше, чем в интактной группе и в 1,89 раз, чем во второй группе. Также, в тринадцатый день выявилось достоверное увеличение Т-розетко-образующих клеток в опытных группах по отношению к контролю. С пятнадцатого по двадцатый день отмечена тенденция снижения Т-клеточной активности в первых двух группах и достигли показателей контрольной (1369,2±598,7 кл/мкл).

2.2.2.2. Динамика теофнллинрезистентных лимфоцитов (ТФР-рок, кл/мкл). Травма вызвала достоверное снижение хелперной активности в первых трех группах. Значения данных групп распределились следующим образом 140,1±53,8 - 1; 228,7^47,7 - 2; 328,2±41,2 - 3; 545,2±54,8 - 4 кл/мкл. Увеличение хелперной активности установлено на седьмой день исследований после повторной инъекции иммунокорректоров. Тринадцатый день эксперимента выявил снижение хелперньгх влияний по отношению к контролю во всех группах травмированных животных. Увеличение показателей ТФР-рок зарегистрировано нами во второй группе на пятнадцатый день. Абсолютное содержание клеток, обогащенных хелперной активностью, в группе составило 1162,8±234,7, при показаниях 49б,8±124,7 в контрольной, и 465,1±26,7 кл/мкл в третьей опытной группе.

2.2.2.3. Динамика абсолютного содержания теофиллинчувствителъных лимфоцитов (ТФЧ-рок, кл/мкл). Травма активизировала Т-клеточное звено, обогащенное супрессорной активностью. Так, показатели в первой группе с

402,6±87,2 увеличились до 842,6±153,7 кл/мкл; во второй - с 443,9±94,3 до 668,1± 187,7 кл/мкл. Инъекция иммунокорректоров вызвала снижение ТФЧ-рок в двух, примированных препаратами группах (431,4±9б,2; 469,1±82,9 кл/мкл, соответственно), по отношению к контролю (594,6±86,2 кл/мкл). Седьмой день выявил усиление ТФЧ-рок во всех опытных группах. Резкий перепад супрессорных влияний отмечен нами в первой опытной группе при достаточно ровных контрольных показателях. Граф!гческие изменения динамики Т-супрессоров во второй группе проявились накоплением активности с седьмого до тринадцатого дня эксперимента.

2.2.2.4. Динамика абсолютного содержания ЕАС-рок (кл/мкл). Третий день исследований после травмы выявил снижение рецепторной активности В-клеток во всех травмированных группах. При этом показатель интактной группы на третий день был на уровне 507,8±18,8 кл/мкл. Данные трех опытных групп были достоверно ниже контроля. Инъекции байпамуна и миелопида стимулировали увеличение количества В-лимфоцитов в двух первых группах до седьмого (II) и десятого (I) дней наблюдений. Тринадцатый, пятнадцатый и двадцатый дни не обнаружили достоверных различий между первыми опытными группами. Функциональная характеристика В-клеточного звена третьей группы проявились иммунодефи-цитным состоянием с момента травмы до тринадцатого дня наблюдений.

2.2.2.5. Динамика фагоцитарной активности макрофагов (НСТ-тест, кл/мкл). Травма, нанесенная опытным животным, способствовала угнетению макрофагального звена иммунной системы. Введение препаратов вызвало макро-фагальную активность в первых двух группах. На протяжении всего эксперимента, премированные иммунокорректором группы занимали достаточно высокое положение по отношению к интактаым животным.

2.2.3. Изучение иммунного статуса подопытных животных под действием иммунокорректоров полиоксидония н проднгиозана.

В опыте использованы четыре группы крыс, подобранных по принципу аналогов в количестве двадцати голов. После нанесения травмы голени первой группе животных вводили полиоксидоний в дозе 0,3 мл на голову трехкратно с интервалом в один день. Второй группе животных вводили продигиозан в дозе 0,5 мл на голову по указанной схеме. Третьей травмированной группе препарат не назначали. Четвертая группа оставалась интактной.

2.2.3.1. Динамика абсолютного содержания Е-рок (кл/мкл). Перед началом эксперимента мы не обнаружили достоверных отличий в клеточном составе лимфоцитов во всех группах животных. В первых двух группах, следует отметить снижение графических показателей на третий день исследований. Так в первой группе обнаружено 624,7±126,7 кл/мкл., во второй 711,6±139,9, что достоверно отличалось от показаний контрольной группы (1232,7±157,9 кл/мкл). Введение препаратов-корректоров усилило клеточную активность в двух первых группах. Отмечена стойкая возрастающая тенденция в первой опытной группе на десятый день эксперимента. С тринадцатого дня зарегистрировано снижение абсолютного количества Е-рок в данной группе. Усиление Т-клеточной активности установлено и во второй группе к пятнадцатому дню. Количество Е-рок составило 2023,8±338,7 кл/мкл, что достоверно отличалось как от первой, так и других групп, сменившееся

к двадцатому дню падением. В этот день во второй группе отмечены самые низкие значения 1068,0±488,7 кл/мкл при показаниях первой - 1604,7±383,4, и интактной-1369,2±98,7 кл/мкл.

2.2.3.2. Динамика абсолютного содержания теофиллипрсзнстентных лимфоцитов (ТФР-рок (кл/мкл)). Подъем хелперной активности отметили лишь после введения иммунокорректоров. Отмечен уверенный подъем концентрации ТФР-рок в первой группе после введения полиоксидония. Наибольшее количество клеток - хелперов обнаружено на десятый день эксперимента (941,5± 156,9 кл/мкл), что достоверно отличалось от других групп. На пятнадцатый день показатели первой группы снизились, но оставались на уровне интактной группы (529,9±369,4; 696±30,9 кл/мкл, соответственно). Лимфоцитарная активность крови крыс, премированных иродигиозаном, проявилась лишь на седьмой день к повторному введению препарата. Абсолютное количество ТФР-рок составило 966,7± 152,7 кл/мкл.

2.2.3.3. Динамика абсолютного содержания теофиллинчувствнтельных лимфоцитов (ТФЧ-рок, кл/мкл). Увеличение абсолютного количества ТФЧ-рок отмечено с пятого дня опыта в группах, примированных иммунокорректорами. Наивысший пик супрессорнои активности отмечен в первой группе на десятый день. Количество ТФЧ-рок установлено на отметке 1425,7±223,8, что достоверно отличалась от других испытуемых групп. На протяжении всего эксперимента количество клеток, обогащенных супрессорнои активностью, в первой группе занимало достаточно высокое графическое положение до окончания эксперимента. Начиная с пятого дня' наблюдений документировано стойкое увеличение ТФЧ-рок во второй группе. На протяжении всего опыта показатели второй группы были несколько ниже по отношению к первой, хотя на седьмой, тринадцатый и пятнадцатый дни достоверной разницы между данными группами не обнаружено.

2.2.3.4. Динамика абсолютного содержания ЕАС-рок (кл/мкл). Усиление активности В-лимфоцитов мы наблюдали в первых двух группах на момент первой инъекции иммунокорректоров. Количество В-клеток в первой группе на пятый день находилось в пределах 792,3±311,7 кл/мкл, а во второй группе — 652,1±155,7 кл/мкл. Седьмой день наблюдений выявил усиление пролиферации В-лимфоцитарного звена в группе, получавшей полиоксидоний. Количество В-лимфоцитов в крови животных второй группы продолжало увеличиваться и достигло своего максимального значения к пятнадцатому дню эксперимента. Количество В-клеток. в этот период составило 663,7±193,2 кл/мкл. Уровень ЕАС-рок в первой группе снизился, хотя и оставался в пределах контрольных значении на протяжении седьмого и десятого дней исследований. В дальнейшем ходе эксперимента активность в первой группе возрастала практически до последнего дня наблюдений. Абсолютное содержание ЕАС-рок в этой группе на двадцатый день составило 860,7± 162,3 кл/мкл.

2.2.3.5. Динамика содержания мононуклеарных фагоцитов (НСТ-тест).

Наиболее заметные изменения макрофагальных влияний под воздействием травмы и последующей иммунокоррекции наблюдались в первой половине эксперимента. Пятый день выявил увеличение количества макрофагов в первой группе, это увеличение продолжалось до тринадцатого дня. После чего нами отмечено снижение способности захвата клетками фагоцитируемых частиц. До конца эксперимента ко-

личественные показатели не отличались от значений интактной группы. Динамические изменения фагоцитарной активности во второй группе начались с депрессии макрофагального звена. Количественные значения достоверно отличались от контрольной группы. Седьмой, десятый и тринадцатый дни опыта выявили усиление фагоцитирующей способности мононукяеаров, что сменилось угнетением количественных показателей к пятнадцатому дню, но уже к двадцатому дню нами установлено достоверное увеличение количества клеток по отношению к первой и отсутствие различий с интактной группой (19,7±32,7 — II, 103,6±25,8 — интактная).

2.2.4. Морфогенез костной ткани после частичной кортнкотомии у лабораторных крыс под действием иммунокорректоров полкоксидония и

байпамуна.

В опыте задействованы три группы крыс, которым была нанесена травма голени путем частичной кортнкотомии. В каждой группе находилось по шесть голов. Суть кортикотомии заключалась в следующем: в верхней трети диафиза наносили поперечную чрезнадкостнич]гую насечку на всю толщину кортикальной пластинки половины окружности верхней трети диафиза при сохранении периоста на всем протяжении кости.

Первая группа животных была контрольной. Второго группе животных вводили полиоксидоний. Третьей группе - байпамун в известных дозах трехкратно на 2, 5, 8 дни после перелома. Эутаназию животных проводили передозировкой эфирного наркоза на 7, 10, 13, 15, 20, 25, 30, 35-й дни. Материал для гистологического изучения фиксировали в нейтральном формалине.

2.2.4.1. Гистологические исследования процесса заживления поврежденной костной ткан и (контрольные образцы). В костной ране на 7 день опыта отмечалось проявление репаративной регенерации в виде образования фиброзной ткани, не полностью заполняющей диастаз, образовавшейся в результате кортикотомии. Щель между отломками кости частично заполнена волокнистой, богатой ретикулиновыми волокнами тканью, в которой наблюдались тканевые кисты, а также, наряду с обычными капиллярами, большое количество тонкостенных с широкими просветами до 100 мкм сосудистых полостей типа синусоидов. Среди фибробластическнх элементов фиброретикулярной ткани обнаруживаются макрофаги и лимфоидные клетки. К 10-му дню костная ткань отломков лишена остеоци-тов, часть сосудистых каналов умеренно расширена. Пучки колла'геновых волокон фиброзной ткани межотломкового регенерата продольно однонаправлено ориентированы, регенерат полностью заполняет межотломковую щель. На 13 день наблюдений микроскопические исследования сращения диафизарного перелома показали, что в межотломковой щели выявляется фиброретикулярная ткань с наличием примитивных балок, заполняющая часть канала. Репаративный остеогенез на 15-й день наблюдении характеризуется формированием предварительной соединительнотканной мозоли, состоящей из фиброретикулярной ткани, полностью заполняющей диастаз между костными отломками. Определяется образование примитивных костных балок, поверхность которых покрыта остеогенными клетками. В зоне повреждения отмечается интенсивная пролиферация остеобластов, но прежде всего пери- и эндостальной части. Сформированное остеоидное вещество содержит сеть капилляров с широкими просветами, заполненных кровью. Одновременно форми-

руется сеть костных балок преимущественно эндостального окостенения. Морфогенез заживлення на 20 день опыта характеризуется образованием тонкой не перекрывающей межотломковую щель периостальной мозоли, одновременно увеличивается зона эндостального окостенения. В остеогенной фиброретикулярной ткани регенерата выявляются малообызвествленные костные балки, число которых возрастает в процессе заживления раны. К 25 дню определяется утолщение периостальной мозоли, перехватывающей межотломковую щель, при этом значительное возрастание объема пери- и эндостальной мозоли, сформированных из более зрелых остеоидных структур и остеогенных клеток в различной стадии их дифференциации, чем в предыдущие сроки. Через 30 дней после перелома в межотломковой щели выявляется незрелая интермедиарная костная мозоль. Пери - и эндостальная мозоль сформирована из сети костных балок со зрелыми структурами. На 35 день опыта формируется зрелая костная ткань регенерата, однако процесс перестройки костной ткани обнаруживается в более поздние сроки.

2.2.4.2. Гистологические исследования процесса заживлення поврежденной костной ткани под воздействием полиоксндония. Динамика остео-генеза имеет существенные отличия от вышеописанной для контрольных образцов. На 7 день наблюдения заполнение диастаза осуществляется преимущественно на основе периосталького остеогенеза, пучками продольно ориентированных коллаге-новых волокон. Фиброзная ткань замещает собой пространство в окружности места перелома, соединяя концы костной раны кортикального диафизарного слоя. Новообразованная фиброретикулярная ткань пронизана сосудистыми полостями неправильной формы и различных размеров от 70 до 100 мкм синусоидного типа, заполненных кровью. Толщина фиброзного регенерата перехватывающего межотломко-■ вую щель составляет в среднем 600 мкм. Десятый день наблюдения характеризуется образованием в периостальной фиброретикулярной ткани примитивных костных балок. Интенсивно происходящий в этот срок репаративных процесс осуществляется в большем объеме за счет эндостального остеогенеза. При этом резко увеличивается сеть балок эндостального костеобразования, ширина зоны последнего составляет 270 мкм. Остеобласты отчетливо выявляются и покрывают балки остео-идного вещества. Диастаз между отломками заполнен фиброзноретикулярной тканью, содержащей сеть капилляров, заполненных кровью. Репаративная регенерация на 13-й день характеризуется образованием небольшой периостальной мозоли отломков смыкающейся и перекрывающей межотломковую щель, объем периостальной мозоли, сформированной из более зрелых костных балок, незначителен, ширина ее составляет 50мкм. На эндостальной поверхности кортикальной пластинки выявляется густая сеть костных балок, более зрелых по сравнению с таковыми на предыдущий срок. Ширина зоны эндостального окостенения возрастает до 300 мкм. Заполнение межотломкового диастаза осуществляется остеоидной тканью, формирующейся на основе эндостального остеогенеза. В межотломковой щели появляются незрелые костные балки, начинающие формировать интермедиарную костную мозоль сформированной тканн, выявляется сеть сосудов. Пятнадцатый день репаративного остеогенеза характеризуется утолщением периостальной мозоли, перекрывающей межотломковую щель. Объем периостальной мозоли возрастает, ширина ее составляет более 100 мкм. Пери- и эндостальная мозоли сформированы из сети костных балок с более зрелыми остеонными структурами по сравнению с

предыдущими сроками. Диастаз заполняется сетью костных балок, менее зрелых, чем в периостальной и эндостальной мозоли. Остеобласты выявляются в толще перекладин и покрывают балки остеоидного вещества. Сосудистые каналы кортикального слоя расширены. К двадцатому дню происходящий репаративный процесс характеризуется образованием интермедиарной костной мозоли, сформированной из зрелой костной ткани с характерным пластинчатым строением. При этом дальнейшего роста периостальной мозоли не отмечается, т.о. этот этап репаративного остеогенеза можно характеризовать как созревание костной ткани. Костные структуры регенерата выглядят достаточно зрелыми, в них располагаются остеоциты, отростки которых выявляются в глубине балок. Двадцать пятый день исследования репаративного остеогенеза характеризуется перестройкой сформировавшихся структур костной ткани, т.к. в сросшейся кости структура кортикального слоя в зоне сращения не вполне соответствует таковой в компактной кости. Балки костного вещества интермедиарной мозоли перестраиваются, утолщаются, подвергаются ла-кунарной резорбции при участии многоядерных клеток остеокластов. Отмечается редукция периостальной костной мозоли. В костномозговом канале сохраняется густая сеть балок эндостальной костной мозоли, однако, в отдельных участках выявляются островки жирового костного мозга. Сосудистые каналы расширены .

2.2.4.3. Гистологические исследования процесса заживления костной ткани под воздействием байпамуна. При исследовании морфогенеза костной раны с применением байпамуна установлено, что характер местной регенеративной реакции не отличается от таковой в серии с полиоксидонием, однако динамика процесса имеет свои особенности. В межотломковой ¡цели незрелая интермедлар-ная костная мозоль выявляется к двадцатому дню. Пери- и эндостальная мозоль сформирована из сети костных балок со зрелыми костными структурами. Формирование интермедиарной мозоли из зрелой костной ткани отмечается к 25 дню регенерации. Регенерат отличается от костной ткани лишь беспорядочным расположением костных перекладин, граннцы пластинок не резко когггурированы. Костные структуры включают сформировавшиеся остеоциты. Заключительный этап морфогенеза характеризуется перестройкой вновь образованной ткани, разрушением первичных остеонов, образованием больших пространств и полостей резорбции, пролиферацией остеокластов, частичной редукцией костной мозоли, развитием новой генерации остеонов. Сосуды расширены, кровенаполненны .

2.2.5. Морфологические показатели периферической крови собак в процессе репаратнвной регенерации под воздействием полиоксидоння и байпамуна.

В опыте использовали 40 собак различных пород в возрасте от двух до пяти лет весом 16-35 кг. Животные поступали в клинику после полученных травм, сопровождавшихся переломом трубчатых костей. Операцию назначали после предварительной стабилизации состояния животного. Оперативное вмешательство для создания стабильно-функционального остеосинтеза выполняли по известным методикам через интрамедуллярный остеосинтез. Все поступающие животные были разделены на три группы. Для стимуляции процесса регенерации костной ткани первой группе (15 голов) инъецировали байпамун в дозе 1 мл/гол на 5,7,10 и 35,37,40 дни - одна доза по аннотации). Второй группе животных из 15 голов инъецировали

полиоксидошш в дозе 10 мг/гол в/м. Схема и доза введения препарата соответствует аннотациям и диапазону терапевтических доз (Д.К. Новиков, В.И. Новикова, 1998; P.M. Хаитов, Б.В. Пинепш с соавт. 1998; журнал "Фармацевтика", №6, 1996). Инъекции проводили трехкратно в первые тридцать дней и трехкратно в последующие тридцать дней болезни. Третья группа животных (10 голов) стимуляции не подвергалась.

2.2.5.1. Морфологические показатели периферической крови собак.

Анализируя показатели периферической крови больных травматической болезнью собак следует отметить, что все компоненты лейкоцитарной формулы находились в пределах физиологической нормы. Отмечено увеличение палочкоядерных нейтро-филов во всех изучаемых группах до двадцатого дня наблюдений (см. таблицу 1).

2.2.5.2. Динамика содержания общего белка в сыворотке крови собак (63,0-81,0 г/л) . Исследования биохимическими тестами проводили в испытуемых группах, сравнивая показатели с общепринятой нормой. Количество белка в крови было установлено на уровне 57,8±8,4 у первой группы, 61,0+19,3 — у второй и 57,6±13,2 г/л у третьей, при показаниях контроля 63,0±81,0 г/л. После проведения операции концентрация белка в испытуемых группах снизилась по сравнению с первым днем исследования^, Наименьшее количество белка было установлено во второй группе прооперированных животных — 53,7+12,2 г/л, наибольшее — в третьей группе (56,8±9,3). Троекратное введение иммунокорректоров привело к увеличению содержания общего белка в сыворотке крови первых двух групп. На десятый день нами отмечено увеличение концентрации белка в группах с иммуно-корректорами. Концентрация общего белка поднялась в 1,1 раза в первой группе и в 5,1 - во второй. Количественный показатель (68,9+19,8 и 73,9+12,2) общего белка ■в двух первых группах достиг физиологической нормы и находился в этом диапазоне до окончания исследования.

2.2.5.3. Динамика содержания альбумина в сыворотке крови собак (34,0-45,0 г/л)* Трехдневное снижение сывороточного альбумина было компенсировано на десятые сутки исследований. Так, количество альбумина в первой группе составило 38,3+12,5 г/л, а во второй группе - 42,6+8,2 г/л. Значение двух первых групп находилось в пределах физиологической нормы (34,0±45,0 г/л). К тридцатым суткам альбуминовый показатель данной группы достиг физиологической нормы (35,3+10,8 г/л). Повторное трехкратное введение иммунокорректоров усилило сывороточный альбуминовый ответ в двух первых группах. Примечательно отметить, что наибольший количественный показатель определяли в группе премированной полиоксидонием (46,8+12,7 г/л). Увеличение количества альбуминов в первых двух группах продолжалось до пятидесятого дня наблюдений. Постепенное снижение белковой альбуминовой фракции наметилось к шестидесятому дню. все показатели находились в пределах физиологической нормы. В третьей группе мы наблюдали постепенное увеличение альбумина до последнего дня исследований.

2.2.5.4. Динамика содержания альфа-глобулиновон фракции в сыворотке крови собак (3,0-6,5 г/л)* Первоначальные показатели альфа-глобулиновой фракции находились на верхнем пределе физиологической нормы (3,0±6,5 г/л). Оперативное вмешательство привело к повышению концен

' - физиологическая норма по Занаднюк И.П., Занаянюк В.И. с соавт (1983) и далее *

ТАБЛИЦА 1

Морфологические показатели периферической крови собак, перенесших

травму кости и подвергшихся воздействию иммуномодуляторов.

Дии Группы Лейкоциты, %-Ю /л Лимфоц иты, % Лейкоциты, %

Нейгрофнлы, % Моноц иты Эозино-филы

Палоч-коядер-иые Сегмеи-тоядерные

1 I 9,7±1,3 22,7±3,4 7,9±3,9* 53,7±4,9 2,1±0,9 2,3±0,8

II 8,9±2,4 23,9±3,7 6,4±2,4* 58,8±5,9 2,6±0,7 2,6±0,8

III 8,4±0,9 22,3±3,6 7,6±2,2 62,7±3,9 2,8±0,8 2,7±0,9

3 I 10,6±3,8 31,б±2,8 10,1±4,2* 43,7±6,8 2,1±1,1 2,9±0,8*

II 11,7±2,7 30,8±3,6 9,8±2,6* 31,4±7,2 2,3±0,9 5,6±2,7*

Ш 8,4±0,8 27,8±2,8 9,б±3,8 73,8±4,9* 2,2±0,4 9,7±1,б

10 I 9,4± 0,9 26,4±3,2 6,7±2,0* 52,7^4,2 2,4±0,9 3,7±1,0*

II 7,3±1,3 28,7±1,7 9,3±1,9* 59,8*3,8 3,6±1,2 6,8±2,0*

III 8,6±0,8 31,6±3,7 8,7±3,2 68,8±2,3 2,1±0,4 14,6±2,7

20 I 9,6±1,3 33,4±3,2 6,6±1,6* 74,6*5,7* 2,7±1,2 8,2±1,3

II 6,4±0,7 36,8±3,6 5,3±0,9* 71,8*6,9* 3,9±1,3 7,1±2,4

III б,7±0,б 29,7±3,9 б,4±1,9 61,9±2,9 2,8±2,0 8,3±2,3

30 I 6,7±0,4 27,3±1,7 3,2±0,8 69,6±8,9 4,1±0,7 2,6±0,7

II 8,4±1,2 31,4±3,7 2,4±0,8 71,9±9,1 5,0±1,6 7,4±2,4

III б,5±0,8 37,6±2,7 5,2±1,2 66,7 ±3,0* 1,9±3,6 6,7±1,4

50 I 10,2±1,3 33,6±4,2 3,6±0,7 73,8±3,7* 1,7±0,4 2,5±0,7

II И,3±2,7 32,7±1,7 2,9±0,8 69,4±2,8 2,4±1,2 4,4±1,2

III 6,7±0,9 34,2±1, б 4,2±1,9 11,Ш,6 1,8±3,7 9,Ш,5

60 I 9,8±0,4 28,б±1,9 4,4±0,6 63,2±3,3 3,7±1,2 4,7±1,3

II 8,6±0,9 24,7±2,9 3,9±0,7 56,8±4,8 2,9±0,9 5,8±1,8

III 7,3±0,8 24,8±3,2 4,0±1,8 64,2±3,1 2,4±3,1 8,4±1,9

I группа - Байпамун; III группа - без препарата;

II группа - Полиоксидоний; IV группа - контроль

* Р<=0,05 достоверно по отношению к контролю

трации данной фракции во всех группах и превысило физиологическую норму. Применение иммунокорректоров нивелировало подъем альфа-глобулиновой фракции. Достаточно высокий показатель оставался в jpynne лишенной иммунокорректоров (16,8±5,9г/л) на десятый, и ()5,3±3,6г/л) на двадцатый день. Дальнейший рост прекратился лишь к тридцатому дню наблюдений. После чего наметилась стойкая тенденция к снижению а - глобулинов в третьей группе. Наблюдение за группами премированными байпамуном и полиоксидонием выявили снижение а -глобулиновой фракции уже на десятый день (12,0=t5,7- I группа; 8,2±2,8 - II группа). В дальнейшем выраженное приближение к физиологической норме отмечено во второй группе животных. К двадцатому дню нами документирован показатель а - глобулиновой фракции , находящийся в пределах физиологической нормы (7,1±1,7 г/л - 20—; 5,Ш,9 г/л - 601 день наблюдений). В группе животных после применения байпамуна мы так же определяли достоверно низкий показатель по сравнению с контрольной группой. Следует отметить, что показатель а - глобулиновой фракции в данной группе приблизился к физиологическому интервалу только к пятидесятому дню, что не отличалось от показателя контрольной группы. (7,0±2,7 -1 группа; 6,4±3,7 -III группа.

2.2.5.5. Дннамнка содержания бета-глобулиновон фракции в сыворотке крови собак (3,2-6,2 г/л)* При изучении ß-глобулиновой активности сыворотки крови спонтанно травмированных животных нами установлен постепенный подъем ß-глобулинов до десятого дня наблюдений (9,0±3,3 г/л) в третьей группе. Двадцатый день также документирован достаточно высоким показателем (7,7±0,4 г/л) по сравнению с первыми группами. Накопление ß-глобулиновой фракции прекратилось к тридцатому дню. Количественный показатель ß-глобулнновой белковой фракции в первых двух группах после применения иммунокорректоров находился в пределах физиологической нормы до окончания эксперимента.

2.2.5.6. Динамика содержания гамма-глобулнновой фракции в сыворотке крови собак. (10,5-20,7 г/л)* При исследовании гамма-глобулиновой белковой фракции нами установлено стойкое достоверное увеличение количественного показателя во второй группе (Полиоксидоний). Начиная с десятого дня исследований, отмечено увеличение количества гамма-глобулинов с 11,5±3,9 г/л (первый день) до 23,7±4,7 г/л (пятидесятый день). В течение трех (тридцатый, пятидесятый н шестидесятый) дней наблюдалось удержание количества данной фракции в верхних пределах по отношению к первой, третьей и контрольной группам. Достоверную разницу между второй и третьей группами определяли на всем протяжении опыта.

2.2.5.7. Динамика содержания щелочной фосфатазы в сыворотке крови собак (10,6 - 100,0 г/л)* Первое достоверное отличие между двумя первыми группами обнаружено на десятый день после начала наблюдений. Трехкратное введение иммунокорректоров способствовало резкому подъему показателя щелочной фосфотазы во второй группе (Полиоксидоний). Значение этой группы достоверно отличалось от первой группы (138,0±23,6 г/л против 123,7±12,6 г/л). Такая тенденция увеличения показателей второй группы по отношению к первой сохранялась практически до конца исследований. Динамическое изменение показателей ферментативной активности сыворотки крови у животных третьей группы установлены нами, начиная с двадцатого дня наблюдений. Постепенное накопление щелоч-

ной фосфотазы обусловило проявление пика концентрации только к тридцатому дню наблюдений.

2.2.5.8. Клиннко-рентгенологические показатели стадийности остеоге-неза клинически больных животных. Первый день исследований рентгенографически документировал полный косой перелом средней трети диафиза голени со смещением по ширине. Отек и дефигурацию конечности. После стабильно-функционального остеосинтеза на рентгенограмме голени животного определяется восстановление анатомической оси голени из-за введения металлического штифта. Конгруэнтность отломков после репарации удовлетворительная, зона повреждения костной ткани в месте перелома от ОД до 0,3 см. На десятый день в области перелома просматривается иежотломковая щель резорбции и скудная периостальная реакция. Двадцатый день выявил бурное развитие периостальной мозоли по обеим сторонам кортикального слоя. На тридцатый день обнаружено развитие пароос-сальной мозоли и заполнение межкортикальной щели интермедиарной костной мозолью. Пятидесятый день характеризуется утратой параоссальной мозоли, и выраженным ростом интермедиарной. Определяется формирование костномозгового канала. Шестидесятый день характеризуется полным созреванием костной мозоли на месте перелома.

2.2.5.9. Опороспособносгь. Полная опороспособность конечности после операции и применения полиоксидония восстанавливалась к 50-60-му дням наблюдений. При использовании байпамуна сроки сдвигались и обеспечение опороспособ-ности конечности происходило к 70-77-му дням наблюдений. При отсутствии стимуляции нарушение опороспособности в виде хромоты опирающейся конечности продолжалось до 90-110-го дня.

III. Обсуждение результатов.

Исследованием установлено угнетение всех звеньев иммунитета в первый период после травмы. Так общее количество Е-рок было снижено по отношению к контролю начиная с третьего дня наблюдений. Такое состояние иммунной системы мы документировали до десятого дня эксперимента. До тринадцатого дня определили депрессию (исключение пятый день) со стороны клеток-хелперов, а до десятого -клеток обогащенных супрессорной активностью, что подтверждают Аскалонов А. А., Гордиенко С. И. (1981) и Дерябин И. И., Салюткнн Б. А. (1982). Мы предполагаем, что снижение рецепгорной активности Т-лимфоцитов связано с усиливающимся постгравматическим катаболизмом, возникшим в результате дефицита кислорода, нарушения микроциркуляции и сосудистой адгезии лимфоцитов. Увеличение ТФР-рок на пятый день и последующее его снижение мы склонны рассматривать как классический пример индукции иммунного ответа, реализующегося через Т-хелпер. После достаточно длительной депрессии Т-клеточного звена произошло его увеличение, которое проявилось усилением супрессорной активности к 13-му дню. Пик активности Т-супрессоров сменился некоторым снижением, хотя графический показатель был документирован достоверно выше показаний интактной группы. Иммунодефицит со стороны B-системы и системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) в нашем случае проявился снижением абсолютного количества ЕАС - рок до тринадцатого дня и макрофагов в НСТ-тесте до седьмого дня. Такое состояние

мы склонны отнести за счет невозможности адекватного взаимодействия Т-клеточного субпопуляционного звена с В-клеткой, нарушения онкогического давления и выраженного катаболизма.

В процессе экспериментов нами установлена определенная зависимость моно-цитарно-макрофагальной реакции при повреждении и восстановлении костной ткани. В первые дни после перелома голени у крыс снижается функциональная активность клеток СМФ. Это подтверждает Ермолаевич Е. Ю. (1993); Корнева Е. А., Шхинск Э. К. (1988); Набаулин Р. Р. (1991); 0№а1^ег А., ВеуеЬог С. е1 а1. (1990); иегЬоеГ 1.(1990).

Наиболее выражены реакции со стороны СМФ в период образования соединительнотканной зоны роста, и ее замещения новообразованной костной тканью. Гистологически в этот период обнаруживается фиброретикулярная ткань. Участие макрофагов в восстановительных процессах костной ткани осуществляется путем непосредственного контакта с клетками-мишенями, а также посредством секреции растворимых медиаторов костообразования.

В первые периоды после травмы на основании наших данных представляется возможным выделение неспецифических изменений, которые проявляются угнетением некоторых функциональных свойств клеток. Специфические же свойства характерны для периода активного костообразования, когда между костными отломками интенсивно протекает процесс формирования регенерата определенной структуры. Полученные нами данные позволяют предположить активное участие в этом лимфоцитов, которые способны вступать в межклеточную кооперацию с ос-теогенными, махрофагальными и фибробластическими клетками. Подтверждением тому служит пик лимфоцитарной активности во второй половине травматической болезни. В нашем опыте с использованием иммунокорректоров различных классов установлено их влияние на все изученные звенья иммунитета. Так, утерянная способность ТФР-рок к третьим суткам восстанавливалась, начиная с пятого дня наблюдений, т. е. после первичного применения иммунокорректора. Примечательно отметить, что сравнительный анализ названных препаратов с более изученным миелопидом показал сходную и даже более мощную ответную реакцию со стороны отдельных звеньев иммунной системы. Накопление клеток-хелперов в стимулированных группах приходилось на 5 и 7 сутки. В этот же период, обусловленный введением иммунокорректоров, мы наблюдали снижение супрессии и незначительный подъем до уровня показателен кош-роля. По нашему мнению, это произошло в результате перераспределения лимфоцитарных маркеров в сторону клеток, обогащенных хелперной активностью. Развитие иммунного ответа при стимуляции бай-памуном и миелопидом в постгравматический период развивалось по пути классического каскада иммунных превращений. Стимуляция показала состоятельность иммунной системы и возможность адекватного ответа на эндогенный и экзогенный иммунокорректоры. Следующие десять дней эксперимента выявили снижение хел-перных влияний и усиление в эти же сроки супрессорной активности. Такое перераспределение явилось следствием способности организма реагировать на процесс регенерации. Следует отметить, что супрессорное звено не стимулированной группы также реагировало в этот период. При анализе супрессорного звена достаточно ярко проявляются тенденции контроля над патологическим процессом. Подтверждением тому является ответная реакция со стороны В-системы. Мощное накопле-

кие ЕАС -рок в периферической крови на протяжении десяти дней сменяется снижением В-клеточной активности до уровня интактной группы. Наряду с этим, в группе животных, лишенной иммунокоррекцни, мы наблюдали медленное накопление В-лимфоцитов до окончания эксперимента. Повышенная супрессивная активность в данной группе на тринадцатый день не оказала практически никакого воздействия на В-клеточное звено. На наш взгляд, мы стали свидетелями дисбаланса в кооперативных взаимодействиях между ВиТ системами. Нам представляется, что неспособность Т- супрессоров влиять на В-клетку происходит через несостоятельность мембранных рецепторов Т-клетки, возможно таковыми являются рецепторы к ^ С В-клетки. Вероятно, это обусловлено сложностью интегративной функции иммунной системы, в которой каждый параметр сам по себе является результатом непосредственного, либо косвенного влияния других параметров, в результате чего связи, выявляющиеся между показателями, могут быть обусловлены сложной цепью взаимодействий мевду самыми разнообразными компонентами (Понякина И. Д., 1985).

Макрофагальная реакция в стимулированных группах восстанавливалась сразу же после первичной инъекции. Иммунный ответ на миелопид и байпамун показал близкие значения, достоверно отличающиеся от группы, лишенной иммунокоррек-торов. Наибольшая макрофагальная реакция выражалась увеличением графического показателя на десятый и пятнадцатый дни. По-видимому, с одной стороны это связано с активизацией клеток хеяперов в обозначенный период, с другой не исключено самостоятельное участие СМФ в процессе репаративной регенерации. Анализируя действие миелопида, мы констатируем, что его влияние на остеогенез было минимальным и отличалось по интенсивности проявления от байпамуна.

Эксперименты, проведенные с полиоксидонием и проднгиозаном, показали ярко выраженное проявление иммунного ответа после их введения. Следует отметить достаточно быструю реакцию периферической крови подопытных животных на введение полиоксидония. Практически во всех тестах, проведенных нами, наиболее яркое графическое отображение принадлежит полиоксидонию. Установлен режим стимуляции Т - и В-систем и макрофагов в группах животных, презентиро-ванных полиоксидонием. Такое состояние, на наш взгляд, объясняется следующим. Все природные антигены, вызывающие стимуляцию иммунокомпетентных клеток, взаимодействуют с ними по классическому пути через главный комплекс гистосовместимости (НЬА) и ген иммунного ответа, находящийся в нем, т. е., вся цепь иммунного ответа, а равно и взаимодействие с клетками костного регенерата, начинается с предоставления информации Т-хелпером. Так как природные иммуностимуляторы несут на себе антигенные детерминанты вирусов, бактерий и др., то и ответ будет специфическим в первую очередь и уже потом каскад иммунологических превращений переместится на локальный очаг костной ткани. В то же время применение синтетического препарата, по нашему мнению, приведет к активизации неспецифического иммунитета. Возможно и та клетка-«мишень», на поиски которой направлены усилия исследователей - клетка родоначальник репа-ративного процесса скорее будет задействована в этапы регенерационного процесса.

На фоне иммунокоррекции полиоксидонием мы отмечали усиление хелперных влияний с начала введения препарата, усиление активности В-клеточного звена и

макрофагов. Наши данные согласуются с исследованиями, проведенными в области хирургии Патютко М. Ю. (1996), Хаитовым Р. М., Щельциной Т. Л., Бутьковым А. А. с соавт. (1997), Хаитовым Р. М., Пинегиным Б. В. (1998), Козловым Ю. А. (1998). В нашем опьгге мы получили усиление репаратнвной регенерации тканей у подопытных животных и скорейшее нивелирование раневых осложнений, что подтверждено гистологически. Ускорение репаративного процесса, на наш взгляд, заключено в усилении макрофагальных влияний через элиминацию мертвых и чужеродных частиц в регенерате, а также непосредственным участием в восстановительном процессе через кооперативные взаимоотношения с фибробластами.

Применение продигиозана показало адекватную, хотя менее выраженную реакцию. В экспериментах мы получили усиление регенеративных процессов по отношению к контролю, но данный препарат уступил по интенсивности влияния поли-оксидонию и банпамуну. На наш взгляд, экзогенный иммунокорректор продиогизан может использоваться в коррекции постоперационного периода, но на репаратив-ный процесс костной ткани он оказывает менее выраженное влияние.

Результаты предыдущих опытов выявили значительное влияние полиоксидония и байпамуна на репаратнвный процесс. Данные препараты хорошо переносятся животными, влияют на иммунокомпетентные клетки и усиливают репаративный процесс в костной ткани. Проведенные гистологические исследования позволили выявить более тонкие механизмы оптимизации остеорепарации с помощью имму-нокорректоров полиоксидония и байпамуна.

При сравнительном изучении динамики репаративного остеогенеза контрольной и опытной групп животных отмечены значительные ускорения процесса регенерации костной ткани в группах с использованием иммунокоррееторов. При этом наибольшая активность процесса отмечалась в группе премированной полиоксидони-ем. В этой группе опытных животных, в отличие от контрольной, наблюдалось более раннее реактивное развитие ангиогенеза в ответ на действие повреждающих факторов с последующим восстановлением регионарной васкулярной сета. Уже на 7-ой день после травмы отмечалось образование предварительной соединительнотканной мозоли, при этом диастаз полностью заполнялся фибринозным регенератом. В зоне повреждения отмечалась более активная пролиферация остеобластов и, прежде всего, в пери- и эндоосте. В результате чего формирование эндо- и перио-стальной мозоли осуществлялось в более короткий срок по сравнению с контрольной группой животных. Этот период характеризуется сбалансированным, кооперативным взаимодействием всех составляющих иммунной системы. Нами установлено увеличение В-лимфоцитов и макрофагов. Такое состояние мы объяснили системным действием полиоксидония, способного через медиаторы регулярных механизмов иммунитета воздействовать на регулягорные и эффекторные возможности тканевых и циркулирующих фагоцитов крови, что согласуется с работами Патютко М. Ю. (1996), Хаитова Р. М„ Пинегина Б. В. (1998), Козлова Ю. А. (1998). Подтверждением этому служит появление коллагеновых волокон в ранний по сравнению с контролем период. Мы рассматриваем это как способность кооперативного взаимоотношения макрофага и фибробласта, продуцирующего коллаген. Тринадцатый, пятнадцатый дни формирования костного регенерата под воздействием полиоксидония характеризуются образованием периостальной мозоли, этому периоду соответствует достаточно высокий уровень Т-клеточных субпопуляций, увеличение

В-лимфоцитов и макрофагов, по сравнению с контролем. Этому периоду соответствует появление остеобластов, продуцирующих щелочную фосфатазу. Интенсивно происходящий в этот период репаративный процесс характеризуется заполнением межотломкового диастаза остеоидной тканью с малообезыствленными костными белками, число которых и степень их зрелости постоянно нарастает и к 20 дню приводит к формированию интермедиарной мозоли, состоящей нз костной ткани, отличающейся от зрелой лишь беспорядочным расположением костных балок. Этап репаративного процесса с 15 по 20 день после травмы можно охарактеризовать как созревание костной ткани, о чем свидетельствует отсутствие дальнейшего роста эндо- и периосгальной мозоли и формирование в ране костной ткани с характерным пластинчатым строением. Двадцатый и двадцать пятый дни, согласно гистологическим данным, характеризуется формированием костных балок со зрелыми остеогенными структурами и образованием интермедиарной мозоли и характерным пластинчатым строением. Костные структуры регенерата достаточно зрелые, в них располагаются остеоциты, отростки которых отмечаются в глубине балок. Иммунная реакция в этот период стихает. По-видимому, это происходит в результате появления клеток, несущих регенеративную информацию и отсутствия ан-тигенно-направленных структур. Некоторые колебания иммунокомпетентлых клеток мы склонны отнести за счет вспомогательных функций, необходимых для восстановления утраченных костных структур.

Более быстрое формирование костной мозоли не может быть до конца реализованным без участия многоядерных клеток остеокластов, способствующих резорбции органических и неорганических компонентов костной ткани. На наш взгляд, появление остеокласта в костном регенерате связано с генетически детерминированной регенеративной информацией. Выявление остеокластов на заключительном этапе формирования регенерата говорит о последовательности развития и пролиферации всех компонентов регенеративного процесса. Влияние Т-В-систем и СМФ на появление остеокластов, по нашему мнению, не вызывает сомнений, т.к. регуляторная и эффекторная система задействована на всех этапах восстановительного процесса. Появление остеокластов в нашем опыте сопровождается формированием островков костного мозга. Мы не исключаем костно-мозгового происхождения данной популяции.

Проведенные гистологические исследования позволили установить, что характер местной репарагивной реакции на травму в группах с использованием имму-нокорректоров не имеет существенных отличий, но динамика процесса заживления имеет свои особенности. Так, в группе опытных животных, премированных байпамуком, активность репаративного процесса несколько ниже, по сравнению с группой животных, в которой использовался полиоксидоний, что несколько удлиняло сроки заживления травмы. Формирование зрелой костной ткани, заполняющей диастаз, отмечалось лишь к 25-му дню после травмы, в то время как в группе животных, премированных полиоксцдонием, этот процесс завершился уже на 20-й день. По нашему мнению, более выраженное влияние полиоксидония на репаративный процесс обусловлено природой препарата, способностью стимулировать весь каскад иммунологических превращений в обход гена иммунного ответа (Петров Р. В., Хаитов Р. М., 1988).

Данные гистограммы коррелируют с динамическими изменениями иммунного статуса и биохимического анализа крови спонтанно травмированных животных. Анализ приведенных данных показывает, что усиление Т- и В-лимфоцитарного звена и макрофагов отмечается в группе, премированной полиоксидонием, до 1315 дней наблюдения. В этот же период отмечается подготовительный регенерат и образование интермедиарной костной мозоли. Наряду с этим, физиологически адаптированная реакция сывороточных белков и щелочной фосфатазы дают основание утверждать о влиянии пояиоксидония на репаративный процесс. Закладка базисных клеток регенерата (фибробластов и преостеобластов и др.), способствующая дальнейшему прогрессированию репаративного процесса осуществляется в более короткие сроки под воздействием пояиоксидония. Не исключено, что стимулированные полиоксидонием иммунокомпетентные клетки имеют специфическую направленность и несут на своей мембране рецепторы, способствующие пролиферации клона клеток, несущих генетически детерминированную регенераторную информацию.

Применение морфологического и биохимического анализов параллельно с рентгенографией у клинически больных животных, на наш взгляд, оправдано за счет доступности проведения их в лабораториях ветеринарных клиник. Это дает более полную картину процессов, происходящих не только локально, но и в организме в целом. Оправдано исследование и на фоне иммунокоррекции, так как при помощи данных тестов можно осуществлять контроль за течением репаративного процесса.

По мнению Денисова А. Б. и Белопольского А. А. (1980), сывороточные белки способствуют восстановлению костной ткани, стимулируя пролиферацию костных клеток. В проведенном нами эксперименте, мы наблюдали снижение общего белка, альбумина, и щелочной фосфатазы в первые дни после травмы и достаточно быстрое восстановление их активности после стимуляции полиоксидонием и байпа-муном. На наш взгляд, снижение сывороточных компонентов происходит в результате быстро развивающегося катаболизма. Распад главных компонентов жизнеобеспечения тем сильней, чем тяжелее травма. Восстановление физиологической нормы под действием иммунокорректоров происходит, по-видимому, за счет стимулирования моноцитарно-макрофагалыгаго звена и элиминации ставших чужеродными агентов.

Исследование индикаторов гепато-депрессивного синдрома показало наличие гипопротеинемии, гипоальбуминемии у пострадавших в результате травм животных.

На рентгенологических снимках определяется появление периостальной реакции, что коррелирует с появлением в сыворотке крови ферметов щелочной фосфатазы и снижением количества острофазных белков. Утрата периостальной мозоли и формирование интермедиарной мозоли соответствует активности щелочной фосфатазы и окончанию наблюдений.

Сравнительный анализ биохимических тестов и рентгенологических исследований соответствует фазности проявления сывороточных компонентов крови и рентгенологической картины проявляющихся в условиях стабильно-функционального остеостаза голени под воздействием иммунокорректоров.

Исследования у-глобулиновой фракции и щелочной фосфатазы показали, что животные, стимулированные иммунокорректорами, ускоряют накопление у-глобулиновой фракции и ферментативной активности остеобластов. По нашему мнению это связано с поддержанием баланса сывороточных компонентов крови и своевременной элиминацией недоокисленных продуктов и аутоантигенов в области раны через обеспечение локального объекта кислородом и системой мононук-леарных фагоцитов. В данном случае это подтверждается и активностью щелочной фосфатазы, т.е. ускоренная «зачистка» места для новообразованных клеток регенерата, и появление клеток активно секретируюицих фермент. Мы склонны считать, что поддержание гомеокинеза сывороточных компонентов напрямую связано с функциональной активностью макрофагальиого звена. Восстановительный процесс, т.е. появление первоначального клеточного фундамента идет через активизацию протеолитических ферментов, взаимосвязи между фибробластическими и макрофагалышми клетками, посредством эффекторных и регуляторных механизмов иммунитета, достаточным обеспечением кислородом, активизацией биоэнергетических процессов, синтез ДНК, т.е. создание платформы для развертывания анаболических процессов.

Таким образом, введение иммуностимуляторов в посттравматический период оказывает стабилизирующее действие на организм животного. Происходит усиление иммунного ответа, проявляющегося во взаимодействии всех звеньев иммунной системы и в особенности макрофагальиого звена и подтверждается гистологически. Воздействие препаратов байпамун и полиоксидоний на клинически больных животных проявляется нивелированием острой фазы травматической болезни и ускоренным проявлением анаболических процессов в ранний и отдаленный посттравматический период с закладкой остеогенного регенерата.

Из четырех испытанных нами препаратов особое внимание заслуживает отечественный синтетический препарат полиоксидоний. Препарат обладает системным действием и выраженным влиянием на течение репаративного ос-теогенеза.

IV. ВЫВОДЫ

1. Травма голени у подопытных животных вызывает состояние иммунодефицита со стороны основных популяций иммунокомпетентных клеток до 7-13 дня наблюдений,

2. Иммунокоррещия препаратами различных классов вызывает выраженный иммунный ответ с момента первой инъекции, проявляющейся в течение 20 дней постгравматического периода.

3. Байпамун, продигиозан, миелопид стабилизирует процессы заживления, но уступают по силе иммунного ответа и влиянию на регенеративный процесс в костной ткани, по сравнению с полиоксидонием.

4. Использование препарата полиоксидоний, по сравнении с другими группами, приводит к скорейшему образованию соединительнотканной мозоли в межот-ломковом регенерате формирующейся к 10"* дню.

5. Появление стационарной мозоли в межотломковой зоне кортикотомированной голени крыс под воздействием полиоксидония происходит к 15-20** дням ис-

следования, после применения байпамуна — к 25ш дню, а в контрольной группе процесс регенерации заканчивается к 30-3 5м1 дням наблюдений.

6. Применение иммунокорректоров полиоксидония и байпамуна в посттравматическом периоде у спонтанно травмированных животных ускоряет репаратив-ный процесс в костной ткани и оказывает влияние на биохимические показатели сыворотки крови у собак. Динамика данных изменений может носить прогностический характер для клинической практики.

7. Лучшим средством для восстановления поврежденной ткани является полиок-сидоний. Выраженный стабилизирующий и репаративный эффект которого проявляется при трехкратном применении в дозе 10 мг/гол. в первые 10 дней постгравматического периода (3, 5, и 7 дни) и аналогичным введением с 30й по 40^ день болезни (35,37 и 40 дни).

8. Опороспособность конечности животных при стабильно-функциональном ос-теосинтезе под воздействием полиоксидония восстанавливалась к 50-60^ дням наблюдения (при применение байпамуна — к 70-77щ дням, у контрольной группы — к 90-110Ш дням исследований).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Камышко В.Е., Лухании А.Е. Особенности лечения переломов у кошек// тезисы VI международной конференции по проблемам мелких домашних животных, 28-30 января 1998 года, Москва, с. 41

2. Жавнис С. Э., Камышко В. Е., ШколаТ, С. Синдром нарушения обмена веществ у домашних животных// Сб. тр. международной научно-производственной конференции по вопросам ветеринарии и животноводства Казанской Государственной академии ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана, 1998, с. 29-30

3. Камышко В. Е., Ватников Ю. А. Клеточные факторы иммунитета при костной травме// Актуальные проблемы ветеринарной науки. Тезисы докл. МВА им. К. И. Скрябина.-М.: МВА им. К. И. Скрябина, 1999, с. 115.